HU204566B - Process for producing expressive vector with disulfide-isomerase-coding dns, transformed microorganismus and disulfid-isomerase polypeptide - Google Patents
Process for producing expressive vector with disulfide-isomerase-coding dns, transformed microorganismus and disulfid-isomerase polypeptide Download PDFInfo
- Publication number
- HU204566B HU204566B HU882775A HU277588A HU204566B HU 204566 B HU204566 B HU 204566B HU 882775 A HU882775 A HU 882775A HU 277588 A HU277588 A HU 277588A HU 204566 B HU204566 B HU 204566B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- ala
- amino acid
- pdi
- acid sequence
- microorganism
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
- C12Y503/04—Intramolecular oxidoreductases (5.3) transposing S-S bonds (5.3.4)
- C12Y503/04001—Protein disulfide-isomerase (5.3.4.1), i.e. disufide bond-forming enzyme
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás fehéqe-diszulfíd-izomerázaktivitással rendelkező polipeptid és ehhez alkalmazható mikroorganizmus és vektor előállítására.
Ismert, hogy a diszulfidkötések fontos szerepet játszanak a fehérjék konfigurációjának megőrzésében és hatá- 5 suk kifejezésében. Eukariótasejtekben a diszulfidkötések az endoplazmatikusretikulumban képződnek, a fehérjetranszláciőval egy időben vagy közvetlenül az után [J. Bioi. Chem. 257,8847 (1982) J. A diszulfidkötések nem enzimatikus úton in vitro is kialakíthatók, de az átalakulás 10 rátája alacsonyabb, mint in vívó, és az m. vitro körülmények eltérnek az in vivő körülményektől. A fentiek alapján Anfinsen és munkatársai feltételezték, hogy a diszulfidcserélő fehérje néven ismert molekula hatással lesz a diszulfidkötések in vivő kialakítására [J. Bioi. Chem. 15 238,628 (1963)]. Bár ez a feltételezés hipotézis maradt, különböző eukariótákból olyan enzimeket izoláltak, amelyek redukált és felgombolyított -ribonukleázzal (mindkettő inaktív forma) reagálva elősegítik a ribonukleázt aktiváló valódi diszulfidkötések képzését jBioche- 20 mistry, 20,6594 (1981), Biochem. J. 213,225 (1983), Biochem. J. 213,245 (1983)]. A felgöngyölített ribonukleáz, amely redukcióval és ismételt oxidációval állítható elő denaturáló körülmények között, az aktív ribonukleáz négy pár diszulfídkötésének véletlenszerű rekombinálá- 25 sával kialakult különböző molekulák keveréke [Biochem. J. 213,235 (1983)]. Az inaktív ribonukleázt aktiváló enzimet fehérje-diszulfid-izomeráznak (PDI, EC 5.3.4.1) nevezik, ami egy dimer molekula, amely két azonos, egyenként52 000-62 000 közötti mőltömegúalegy- 30 ségből áll, izoelektromos pontja 4,0-45 [Trends in Biochem. Sci. 9,438 (1984), Methods in Enzymol. 107,281 (1984)]. Feltételezhető, hogy a korábban ismert fehérfediszulfid-redukíáz (más néven glutatíon-inzulin-transzhidfogenáz, EC 1.8.4.2) azonos a PDI-vel [Eur. J. Bio- 35 chem. 32,27 (1973), Biochemistiy 14,2115 (1975)].
Edman és munkatársai 1985-ben patkánymáj PDI komplementer DNS-t klónoztak és meghatározták teljes bázisszekvenciáját [Natúré, 317, 267 (1985)]. A patkánymáj PDI 489 aminosavból és egy szignálpep- 40 tidből áll, amely a fehérje N-terminális végéhez csatlakozik, és 19 aminosavból áll. Vannak olyan szakaszai, amelyek homológok az Escherichia coli tioredoxinnai [Eur. J. Bio. Chem. 6,475 (1968), Proc. Nat. Acad. Sci.
USA 72, 2305 (1975), Methods in Enzymol. 107, 295 45 (1984)], amely számos oxidációs-redukciós reakció, így a ribonukleotid-reduktáz reakció kétoldali, vagyis az N-tenninálishoz és a C-terminálíshoz közeli támadáspontú. kofaktora. Mindegyik szakasz tartalmaz olyan homológ szekvenciát, amely két ciszteint tártál- 50 mázó (Trp-Cys-Gly-Cys-Lys) egységet tartalmaz, amely feltehetőin diszulfid- és szulfhídrilcsere alapján katalizálja a PDI-reakciót. Ismert az is, hogy az Escherichia coli tioredoxin PDI-aktivitással rendelkezik, ha szubsztrátumként redukált vagy felgöngyölített ribo- 55 nukleázt alkalmazunk [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83,
7643 (1986)].
A PDI többek között felhasználható Escherichia coli-ból nyert rekombináns fehérjék összehajtogatására.
A géntechnológia gyors fejlődésének köszönhetőén le- 60 hetővé vált eukaríőta-fehérjék nagy tömegű előállítása
Escherichia coli segítségével, de az így nyert rekombináns fehérjékből hiányozhatnak a valódi diszulfidkötések, vagy rosszul kialakított diszulfídkötéseket tartalmazhatnak [EMBO Journal, 4, 775 (1985): Genetic Engineering, 4. kötet, Williamson R, 127 (1983)]. A megfelelő diszulfídkötéseket tartalmazó aktív rekombináns fehérje előállításához hajtogatásra van szükség. Ez a folyamat megvalósítható kémiai úton redox pufferban végzett oxidációs-redukciós reakciókkal, azonban az in vívó hatású PDI alkalmazása megfelelő diszulfídkötések speciális kialakításához sokkal előnyösebb. A PDI alkalmazása különösen nagy számú diszulfidkötést tartalmazó rekombináns fehérjék esetében előnyös. Lehetséges az is, hogy PDI-kódológént viszünk be a transzformált Escherichia coli-ba és a sejten belül ezzel reagáltatjuk a rekombináns fehérjét.
Az ismert PDI-előállítások hátránya, hogy a kiindulási anyag nehezen hozzáférhető és a kinyerhető PDI mennyisége korlátozott. Szükség van tehát olyan eljárásra, amely lehetővé teszi nagy tisztaságú PDI tömegtermelését. Patkánynál és szarvasmarhánál már klónozták a PDI-géneket [Natúré, 317,267 (1985)], de eddig még nem ismert tisztított aktív PDI előállítása PDI-gének Escherichia coli-ban történő kifejezésével· Nem ismert továbbá PDI az említett eukariótasejtektől eltérő eukariótasejtekkel történő klónozása sem.
Vizsgáltuk a T3 megkötőfehérje (T3 binding protein, rövidítve T3BP) biológiai hatását és fehérjekémiai tulajdonságait, amelyek speciális kötést létesítenek a T3 pajzsmirigy-hormonnal (3,3’,5-trijőd-tironin, rövidítve T3). A T3BP emlős sejtek membránjában és citoplazmájában, a T3 receptor a sejtmagban található. Vizsgálataink során megfelelő antitestet állítottunk elő szarvasmarha májsejtmembránból nyert tisztított T3BP ellen [Horiuchi, R. és Yamauchi, K.: Gunma Symposia on Endocrinology, 23 (Center of AcademicPublication Japan, Tokyo, VNU Science Press, BV, Utrecht), 149166 (1986)] és a T3BP-t kódoló gént különböző géntechnikai eljárásokkal klónoztuk. Azt találtuk, hogy a fenti anti-T3BP antitest alkalmazásával kapott szarvasmarhamáj T3BP cDNS kódolja a szarvasmarha PDI-fehérjét (PCT/JP87/00 058 sz. nemzetközi szabadalmi bejelentés, 1987. január 28.).
Áz emberrel közeli rokonságban lévő állatok fehérjéi aminosavszekvenciájukban általában különösen jó homológiát mutatnak az emberi fehérjékkel szemben, valamint a kodon pontmutációjából származó különböző aminosavak eloszlásában. Ebből airal lehet következtetni, hogy az említett szarvasmarha T3BP (PDI) gén DNSszekvenciája megfelel a humán PDI-gén DNS- szekvenciájának. Azt találtuk, hogy a humán PDI előállítható, ha humán sejtekből humán PDI-gént klónozunk, amelynek során DNS-mintaként a szarvasmarha PDI-gén egy részét alkalmazzuk, az adott humán PDI-gént tartalmazó rekombináns DNS-t előállítjuk, és a DNS transzformálásával kapott transzfoimánsokat tenyésztjük.
A találmány tárgya tehát eljárás a 3. ábra szerinti aminosavszekvencíát tartalmazó polipeptid előállítására, az ábrán
HU 204566 Β
Z jelentése Alá vagy MetAla,
X jelentése Alá vagy Pro, oly módon, hogy a fenti aminosavszekvenciát kódoló bázisszekvenciát hordozó és replikálható vektorral transzformált mikroorganizmust tenyésztünk, a tenyészetben a polipeptidet felhalmozzuk és feltárjuk.
Az oltalmi kör kiterjed a 3. ábra szerinti aminosavszekvenciát kódoló bázisszekvenciát hordozó és replikálható vektorral transzformált mikroorganizmus és az említett vektor előállítására.
A találmány tárgya továbbá eljárás eukarióta-szervezet természetes típusú diszulfidkötést tartalmazó fehérjéjének előállítására, oly módon, hogy az eukariótaszervezet prokariótasejt által előállított fehérjéjét a 3. ábra szerinti aminosavszekvenciát tartalmazó polipeptiddel reagáltatjuk, az ábrán
Z jelentése Alá vagy MetAla,
X jelentése Alá vagy Pro.
A 3. ábra szerinti aminosavszekvenciát kódoló bázisszekvenciaként előnyösen alkalmazható az 5. ábrán megadott szekvencia. Az 5. ábrán a szekvenciát kettős sorokban adjuk meg, ahol a felső sor az aminosavszekvenciát és az alsó sor a bázisszekvenciát mutatja. Különösen előnyösen alkalmazható az 5. ábra szerinti bázisszekvencia 104-1573 közötti része, ahol a 104 a +1 aminosavat kódoló kodon első bázisa és az 1573 a +490 aminosavként szereplő Leu-t kódoló kodon 3. bázisa. Előnyös továbbá az 5. ábra szerinti bázisszekvencia 104-1573 közötti része egy ATG transzlációs startkodonnal vagy 5’ végétől felfelé a bázisszekvencia 50-103 közötti részével kiegészítve, ahol az 50 a -18 aminosavként szereplő Met-et kódoló kodon első bázisa és a 103 a -1 aminosavként szereplő Asp-t kódoló kodon 3. bázisa.
Példaként említhető az a bázisszekvencia, amelyben az 5. ábra szerinti bázisszekvencia 104-1573 közötti részéhez az 5’ végtől felfelé GAC vagy ATGGAC kapcsolódik; az 5. ábra szerinti bázisszekvencia 107— 1573 szakasza; valamint az 5. ábra szerinti bázisszekvencia 107-1573 közötti szakasza, amelyhez az 5’ végtől felfelé ATG kacsolódik.
A találmány szermti eljárással előállítható humán PDIpolipeptidre példaként említhető a Z helyén Ala-maradékot tartalmazó 3. ábra szerinti polipeptid; a Z helyén MetAla-maradékot tartalmazó 3. ábra szermti polipeptid; N-terminálisan az 5. ábra szermti -18 és -1 közötti aminosavszekvenciával kiegészített 3. ábra szermti polipeptid; N-terminálisan Asp- vagy MetAsp-maradékkal kiegészített 3. ábra szerinti polipeptid; 5. ábra szermti +1 Ala-maradékkal kiegészített 3. ábra szerinti polipeptid; valamint Met-maradékkal helyettesített 5. ábra szerinti+1 Ala-maradékkal kiegészített 3. ábra szermti polipeptid.
A peptid alkalmazható cukorral kapcsolt glikoprotein vagy más polipeptiddel kapcsolt fehérje formájában.
A találmány szermti humán PDI-polipeptidet kódoló bázisszekvenciát hordozó kifejező vektor előállítható például úgy, hogy (i) humán PDI-t kódoló mRNS-t izolálunk, (ii) az RNS-ből egyszálú komplementer DNS-t (cDNS), majd kétszálú DNS-t szintetizálunk, (iii) az adott komplementer DNS-t fágba vagy plazmidba visszük be, (iv) a kapott rekombináns fágot vagy plazmidot gazdasejtbe transzformáljuk, (v) a kapott transzformánst tenyésztjük, majd a kívánt DNS-t hordozó fágot vagy plazmidot megfelelő módszerrel, így anti-T3BP antitest alkalmazásával immunoassay-módszerrel vagy folthibridizációval vagy radioaktív jelzésű minta segítségével telephibridizációval elválasztjuk a transzformánstól, (vi) a kívánt kiónozott DNS-t kihasítjuk a fágból vagy plazmidból, és (vii) a klónozott DNS-t a promotortól lefelé egy hordozóhoz ligáljuk.
A humán PDI-t kódoló mRNS különböző, humán
PDI-t termelő sejtekből, így humán májsejtekből és méhlepénysejtekből előállítható.
Az RNS a humán PDI-t előállító sejtekből előállítható például a guanidin-tiocianát módszerrel [Chirgwin, J. M. és munkatársai: Biochemistry, 18, 5294 (1979)].
A kapott RNS-t templátként alkalmazva reverz transzkriptáz segítségével szintetizáljuk a cDNS-t, például Okayama, H. és munkatársai módszerével [Mól. Cell. Bioi. 2, 161 (1982) és ugyanitt 3, 280 (1983)] vagy Gubler U. és Hoffmann, B. J. módszerével (Gene, 25,263 (1983)], majd a kapott cDNS-t plazmidba vagy fágba visszük be.
A cDNS beépítésére alkalmazható plazmidokra példaként említhető az Escherichia coli-ból származó pBR322 plazmid [Gene, 2,95 (1977)], a pBR325 plazmid [Gene, 4, 121 (1978)], a pUCl2 plazmid [Gene, 19, 259 (1982)] és a pUC13 plazmid [Gene, 19, 259 (1982)], valamint a Bacillus subtilis-ből származó pUBllO plazmid [Biochem. Biophys. Rés. Commun, 112, 678 (1983)], továbbá bármely olyan plazmid, amely az adott gazdasejtben replikálódik. A cDNS beépítésére alkalmazható fág vektora példaként említhető a Xgt 11 (Young, R. és Davis, R.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1194 (1983)], valamint bármely olyan fágvektor, amely az adott gazdasejtben szaporodik.
A cDNS-nek a plazmidba történő beépítésére alkalmazható például Maniatis, T. és munkatársai módszere [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 239 (1982)]. A cDNS-nek a fágvektorba történő beépítésére alkalmazható például Hyunh, Τ. V. és munkatársai módszere (DNS Cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985)]. A kapott plazmidot vagy fágvektort megfelelő gazdasejtbe, így Escherichia coli-ba vagy Bacillus subtilis-be visszük be.
Escherichia coli-ként alkalmazható törzsek a K12 DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60, 160 (1968)], a JM103 [Nucl. Acids Rés. 9, 309 (1981)], a JA221 [J. Mól. Bioi. 120,517 (1978)], a HB101 [J. Mól. Bioi. 41, 459 (1969)] és C600 [Genetics, 39,440 (1954)].
Bacillus subtilis-ként alkalmazható törzs például az MI 114 [Gene, 24, 255 (1983)] és a 207-21 [J. Biochem. 95,87 (1984)].
A gazdasejtplazmiddal történő transzformálása megvalósítható például a kalcium-klorid módszerrel és a
HU 204566 Β kalcium-klorid/rubídium-klorid módszerrel [Maniatis,
T. és munkatársai: Molecular CIoning, Cold Spring
Harbor Laboratory, 249 (1982)]. Ugyanígy a fágvektor az Escherichia coli-ba bevihető például in vitro módszerrel.
A kapott transzformánsből a kívánt klónt a szokásos módszerrel, például telephibridizáíással [Gene, 10, 63 (1980)], folthibridizálással [Science, 196, 180 (1977)] vagy DNS-bázisszekvencia meghatározás módszerével [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560 (1977), Nucl. Acids Rés. 9,309 (1981)] választjuk ki.
Ezzel az eljárással olyan mikroorganizmust kapunk, amely a humán PDI-t kódoló bázisszekvenciát tartalmazó klónozott DNS-t tartalmazó vektort hordozza.
Az Escherichia cotí K12 DH 5A/P T3BP-3 által hordozott Ρ T3BP-3 plazmid, lásd 1. példa,, olyan DNS-t tartalmaz, amely humán PDI-t kódoló báziszszekvenciát tartalmaz. A 4. ábra az adott DNS restrikciós enzimes hasítóhelyeit mutatja. A 4. ábra szerint az adott DNS teljes hosszúsága mintegy 2,4 kbp, és Bam- í Hl, EcoRl, Clal, HindHI és PstI restrikciós enzimekkel fragmensekre hasítható.
A plazmidot vagy a fágvektort ezután izoláljuk a mikroorganizmusból. Az izolálás megvalósítható például lúgos extrakciós módszerrel [Bimbóim, H. C. és í munkatársai: Nucl. Acids Rés. 1,1513 (1979)].
Az említett plazmid vagy fágvektor, amely a humán PDI-t kódoló bázisszekvenciát tartalmazó DNS-t hordozza, felhasználható önmagában vagy szükség esetén restrikciós enzimekkel végzett emésztés után. 2
A klónozott gén kifejezéséhez megfelelő hordozó (vektor) promotortől lefelé eső helyére ligálható, és így kifejező vektort kapunk.
Vektorként alkalmazható a fent említett Escherichia coli eredetű plazmid (például pBR322, pBR325, 3 pUC12, pUC13, pöp781), Bacillus subtilis eredetű plazmid (például pUB 110, pTM5, pC194), élesztő eredetű plazmid (például pSH19, pSH15, pGLD906, pGLD906-l, pCDX, pKSV-10), bakteriofág, így λ-fág, valamint állati vírus, így retrovírus vagy vakcinavírus. 4'
Az említett gén 5’ végén transzlációs startkodonként ATG-t és 3’ végén transzlációs zárókodonként TAA-t, TGA-t vagy TAG-t tartalmazhat. Ágén kifejezéséhez egy promotort kapcsolunk az említett géntől felfelé eső helyhez. Promotoiként a találmány értelmében bánnely olyan 4í promotor felhasználható, amely az említett gén kifejezéséhez alkalmazott gazdasejthez alkalmazható.
Ha a transzformáláshoz alkalmazott gazdasejt Escherichia coli, előnyösen trp-promotort, lac-promotort, recpromotort, XPl promotort, vagy Ipp-promotort alkalma- 5C zunk. Ha a gazdasejt Bacillus subtilis, promotoiként előnyösen SPOI promotort, SP02 promotort vagy penP promotort alkalmazunk. Ha a gazdasejt élesztő, promotorként előnyösen PHO5 promotort, PGK promotort, GAP (GLD) promotort vagy ADH-promotort alkalmazunk. 55 Előnyösen úgy járunk el, hogy gazdasejtkéntEscherichia coli-t és promotorként tip-promotort vagy ZPl promotort használunk.
Ha gazdasejtként állati sejtet használunk, promotorként alkalmazható többek között SV40 származékpro- 60 motor vagy retrovírus promotor. Előnyösen alkalmazható az SV40 származékpromotor.
Az így előállított vektort, amely a 3. ábra szerinti bázisszekvencíát kódoló DNS-t hordozza, használjuk a transzformáns előállításához.
Gazdasejtként alkalmazhatók például prokarióták, így Escherichia coli, vagy Bacillus subtilis és Aktinomicetes-félék, valamint eukarióták, így élesztő, gomba és állati sejtek.
Az Escherichia coli és Bacillus subtilis törzsekre példaként említhetők a fent leírt törzsek, élesztőtörzsekre példaként említhető a Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-llAés DKD-5D, állati sejtekre példaként említhető a majom COS-7 sejt és Vero-sejt, a ΐ 5 kínaihörcsög CHO-sejt és az egér L-sejt
A transzformáció Escherichia coli esetében megvalósítható például a Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69,2110 (1972) vagy a Gene 17, 107 (1982) helyen leírt módszerrel, a Bacillus subtilis esetében például a Molec. 20 Gene Génét 168, 111 (1979) helyen leírt módszerrel, élesztősejtek esetében például a Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75,1929 (1978) helyen leírt módszerrel, és állati sejtek esetén például a Virology 52,456 (1973) helyen leírt módszerrel. Ezzel az eljárással a 3. ábra szerinti ’5 bázisszekvenciát hordozó vektorral transzformált transzformánsokat kapunk.
Az Escherichia coli, Bacillus subtilis, Actinomycetes, élesztő- vagy gombasejt transzformálásával kapott transzformánsok tenyésztéséhez folyékony tápközeget 10 alkalmazunk, amely tartalmazza az adott transzformáns növekedéséhez szükséges anyagokat, például szénforrást, nitrogénforrást, és szervetlen tápanyagokat. Szénfoirásként alkalmazható például glükóz, dextrin, oldható keményítő és szacharóz, niírogénfonúsként például szer5 vés vagy szervetlen vegyület, így ammóniumsó, nitrátső, kukoricalekvár, pepton, kazein, húskivonat, szójababkivonat és burgonyakivonat. Szervetlen tápanyagként alkalmazható például kalcium-klorid, nátrium-dihidrogénfoszfát és magnézium-klorid.
A tápközeg pH-értéke előnyösen 5-8 között van.
Escherichia coli alkalmazása esetén tápközegként előnyösen alkalmazható az M9 tápközeg, amely glükózt és kazaminosavakat tartalmaz [Miller: J. Exp. Mól. Génét. 431, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)].
A tenyésztést általában mintegy 14-43 ’C közötti hőmérsékleten mintegy 3-24 órán keresztül végezzük szükség esetén levegőztetés és/vagy kevertetés közben.
Bacillus subtilis alkalmazása esetén a tenyésztést általában mintegy 30-40 ’C hőmérsékleten mintegy ) 6-24 órán keresztül végezzük szükség esetén levegőztetés és/vagy kevertetés közben.
Élesztő alkalmazása esetén tápközegként előnyösen alkalmazható a Burgholder-féle minimum tápkőzeg [Bostian, K. L. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci.
’ USA 77,4505 (1980)] és módosított alacsony Pi-tartalmú változata [Biochem. Biophys. Rés. Commun. 138, 268 (1986)]. A tápközeg pH-értéke előnyösen 5-8 között van. A tenyésztést általában mintegy 20-35 ’C hőmérsékleten mintegy 24-72 órán keresztül végezzük kívánt esetben levegőztetés és/vagy kevertetés közben.
HU 204 566 Β
Állati sejtek alkalmazása esetén tápközegként előnyösen alkalmazható a MEM-tápközeg [Science, 122, 501 (1952)], a DMEM-tápközeg [Virology 8, 396 (1959)], az RPMI 1640 tápközeg [J. Am. Med. Assoc. 199, 519 (1967)] és a 199 tápközeg [Proc. Soc. Ex. Bioi. Med. 73, 1 (1950)], amelyek további adalékként mintegy 5-20 tömeg% magzati borjúszérumot tartalmazhatnak. A tápközeg pH-értéke előnyösen 6-8 között van. A tenyésztést általában mintegy 30-40 “C hőmérsékleten mintegy 15-60 órán keresztül végezzük, szükség esetén levegőztetés és/vagy kevertetés közben.
A találmány szerinti humán PDI-fehérje intracellulárisan vagy extracellulárisan termelődik és felhalmozódik. Az intracelluláris PDI extrahálása a szokásos módszerekkel megvalósítható, például tenyésztés után a sejteket ismert módon összegyűjtjük, majd fehérjédénaturálót, így guanidin-hirdokloridot vagy karbamidot vagy felületaktív anyagot, így triton-X-100-at tartalmazó pufferban szuszpendáljuk, és az így kapott felülúszót, amely a humán PDI-t tartalmazza, centrifugáljuk, vagy eljárhatunk úgy is, hogy a sejteket üveggyöngyökkel, ultrahangos kezeléssel vagy enzimes, így lizozimos kezeléssel vagy fagyasztás-felolvasztás módszerrel roncsoljuk, majd a kapott felülúszót, amely a humán PDI-t tartalmazza, centrifugáljuk.
Az extracellulárisan előállított humán PDI elválasztására és tisztítására a szokásos módszereket alkalmazzuk. Példaként említhető az oldékonyság-külőnbségen alapuló módszer, így kisózás vagy oldószeres kicsapás, a molekulatömeg különbségen alapuló módszer, így a dialízis, ultraszűrés, gélszűrés és SDS-poliakrilamidgélelektroforézis, ioncserés kromatográfia, amely specifikus affinitáson alapuló módszer, így az affinitáskromatográfia, a hidrofób jelleg különbségén alapuló módszer, így reverz fázisú nagy teljesítményű folyadékkromatográfia, az izoelektromos pont különbségén alapuló módszer, így az izoelektromos elektroforézis, valamint a specifikus abszorpción alapuló módszer, így a hidroxiapatit-kromatográfia. Előnyösen alkalmazható az ioncserés kromatográfia, amelynek során a humán PDI savas fehérjeként kötődik. Az ioncserés kromatográfiai előnyösen dietil-amino-etil-cellulózzal vagy karboxi-metil-cellulózzal végezzük.
A kapott humán PDI-fehérje aktivitását a redukált és feltekercseit ribonukleáznak aktív ribonukleázzá történő átalakítási rátájának mérése alapján határozzuk meg [Biochem. J. 159 377 (1976), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7643 (1986), Methods in Enzymology 107, 281 (1984), J. Bíol. Chem. 234,1512 (1959)].
A találmány szerinti humán PDI-fehérje a fehérjék szulfhidril-diszulfid cserebomlását katalizálja, amely a legstabilabb természetes típusú diszulfidkötések képződéséhez vezet. Közelebbről, a fehérje oldott oxigén, oxidált glutation (GSSG) - redukált glutation (GSH) elegy vagy redukálószer, így ditiotreitol (DTT), 2-merkapto-etanol vagy aszkorbinsav jelenlétében a redukált fehérjével reagálva katalizálja a természetes diszulfidkötések képződésének reakcióját vagy a diszulfidkötéseket, előnyösen nem természetes típusú diszulfídkötéseket tartalmazó oxidált fehérjével reagálva katalizálja a természetes típusú diszulfidkötések visszaalakulását.
Ennek megfelelően molekulájában diszulfidkötéseket tartalmazó fehéije géntechnológiás előállítása során, elsősorban abban az esetben, ha a rekombináns DNS-t tartalmazó gazdasejtként prokariótát, így Escherichia coli-t, Bacillus subtilis-t vagy Bacillus brevis-t alkalmazunk, a humán PDI-fehérje felhasználható a természetes diszulfidkötések hatékony kialakítására. A diszulfidkötéseket tartalmazó fehéq'e lehet citokin, így interferon-a, interferon-β, interferon-γ, interleukin-1, interleukin-2, B-sejt növekedési faktor (BGF), B-sejt differenciálódási faktor (BDF), makrofágaktiváló faktor (MAF), limfotoxin (LD), és tumomekrózis- faktor (TNF), fehérjehormon, így transzformáló növekedési faktor (TGF), eritropoietin, hámsejt növekedésfaktor (EGF), fibroblaszt növekedésfaktor (FGF), inzulin és humán növekedési hormon, patogén mikrobiológiai antigén fehérje, így hepatitis B vírus antigén, enzimek, így peptidáz és lizozim, valamint vérfehérje- komponens, így humán szérumalbumin és immunglobulin.
A fenti célból tisztított vagy részlegesen tisztított PDI-fehérjét alkalmazunk. A felhasználás során a PDIfehérjét közvetlenül az említett, intracellulárisan vagy extracellulárisan előállított és felhalmozott fehérjével vagy annak tisztított standard mintájával reagáltatjuk. Eljárhatunk úgy is, hogy a reakciót egy olyan transzformánsban hajtjuk végre, amelyet a kívánt fehéq'ét kódoló rekombináns DNS-sel és a PDI-fehérjét kódoló rekombináns DNS-sel fertőztünk.
A leírásban és a rajzokban a kővetkező rövidítéseket alkalmazzuk:
| PBS | foszfátpuffersó-oldat |
| DNS | dezoxiribonukleinsav |
| cDNS | komplementer dezoxiribonukleinsav |
| A | adenen |
| T | timin |
| G | guanin |
| C | citozin |
| RNS | ribonukleinsav |
| mRNS | messenger ribonukleinsav |
| dATP | dezoxi-adenzon-trifoszfát |
| dTTP | dezoxi-timidin-trifoszfát |
| dGTP | dezoxi-guanozin-trifoszfát |
| dCTP | dezoxi-citidin-trifoszfát |
| ATP | adenozin-trifoszfát |
| EDTA | etilén-diamin-tetraecetsav |
| SDS | nátriura-dodecil-szulfát |
| Gly | glicin |
| Ala | alanin |
| Val | valin |
| Leu | leuein |
| Ile | izoleucin |
| Ser | szerin |
| Thr | treonin |
| Cys | cisztein |
| Met | metionin |
| Glu | glutaminsav |
| Asp | aszparaginsav |
| Lys | lizin |
HU 204566 Β
Arg arginin
His hisztidin
Phe fenil-alanin Tyr tirozin
Trp triptofán
Pro prolin
Asn aszparagin
Gin glutamin.
A találmány szerinti PDI-fehérje aminosavszekvenciája részlegesen (legfeljebb 5%) módosítható, például más aminosavak addíciójával, aminosavak kiiktatásával és helyettesítésével.
Az ábrák ismertetése:
Az 1. ábra a 2. referenciapéldában előállított és pT3BP-l-ben és pT3BP-2-ben kiónozott cDNS sematikus hasítási téricépét mutatja. Az 1(1). ábrában a pT3BP-l-ben klónozott cDNS és a (2) ábrában a pT3BP-2-ben klónozott cDNS látható. Az A, Ε, Η, P és S rövidítések jelentése rendre AatH, EcoRI, HindU, PvuH és Sspl, a fekete négyzet a tisztított T3BP fehéqe tripszines peptid hasításából származó aminosavszekvenciájának megfelelő szakaszt jelöli.
A 2. ábra a 2. referenciapéldában előállított és pT3BP-2-ben klónozott cDNS bázisszekvenciáját és az ennek megfelelő aminosavszekvenciát mutatja.
A 3. ábra a humán PDI aminosavszekvenciáját mutatja.
A 4. ábra az 1. példában előállított és pT3BP-3-ban kiónozott cDNS sematikus hasítási térképét mutatja. A B, C, Ε, H és P rövidítések jelentése rendre BamHI, Clal, EcoRI, Hindin és PstI.
Az 5. ábra az 1. példában előállított és pT3BP-3-ban klónozott cDNS bázisszekvenciáját és az ennek megfelelő aminosavszekvenciát mutatja.
A 6. ábra a humán PDI-gén állati sejtben történő kifejezésére szolgáló plazmid előállításának vázlatát mutatja.
A 7. ábra a humán PDI-génnel beoltott COS-7 sejtek által szintetizált humán PDI fluoreszcens antitestmódszerrel történő kimutatásának eredményét (fluoreszcens fotomikrográfia) mutatja. A 7. ábrában (1) a PDI-gént tartalmazó sejt morfológiájának megfelelő fluoreszcens fotomikrográfia és (2) a gén nélküli kontrollsejt morfológiájának megfelelő fluoreszcens fotomikrográfia eredményét mutatja.
A 8. ábra a humán PDI-gén Escherichia coli-ban történőkifejezéséhez szükséges plazmid előállításának vázlatát mutatja.
A 9. ábra az Escherichia coli-ban előállított humán ' PDI immunokicsapásos módszerrel felvett elúciós mintáját mutatja. Az ábrában B és D DHl/pTB766-nak és MM294/pTB766-nak, míg A és C a DHl/ptrp781-nek és MM294/ptrp781-nek felel meg.
A 10. ábra a humán PDI-gén élesztőben történő £ kifejezéséhez szükséges plazmid előállításának vázlatát mutatja.
A11. ábra a PDI SDS-políakrilamid-gélelektroforézísnek az eredményét mutatja. 1 és 2 a tisztított PDInek és a jelölt fehérjének felel meg. £
A12. ábra a tisztított PDI UV-abszoipciós spektrumát mutatja.
A találmány tárgyát közelebbről az alábbi példákkal mutatja be anélkül, hogy az oltalmi kör a példákra korlátozódna.
1. referenciapélda (boq'úmáj mRNS-bóI származó cDNS előállítása) Boq'úmájból guanidin-iztiocianát módszerrel kivon10 juk az RNS-t [Chirgwin, J. M. és munkatársai: Biochemistry, 18,5294 (1979)]. Az RNS-ból oligo dT cellulóz oszlopkromatográfiásan poli(A)-RNS-t tisztítunk [Aviv és Leden Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69,1408 (1972)].
A poIi(A)-RNS-t templátként alkalmazva cDNS-t állíí tünk előGubler, U. és Hof6nann, B. J. módszerével (Gene, 25, 263, 1983), majd a cDNS-hez EcoRI szakaszt adunk Huynh, Τ. V. és munkatársai módszerével [DNA Cloning I, a practical approach, 1, 49 (1985)], végül a cDNS-t Agt 11-ben az EcoRI helyhez kiónozzuk.
)
2. referenciapélda (borjú PDI cDNS-t tartalmazó plazmid izolálása és bázisszekvenciájának meghatározása)
1. referenciapélda szerinti Xgt 11 cDNS-sel fertőzött ί Escherichia coli Y1096-ot L-tápkőzegű lágy agariemezre visszük fel. A foltok megjelenése után IPTG-t (izopropil-tiogalaktozid) tartalmazó nitrocellulóz-szűrőt helyezünk a lemezre és 3 órán keresztül inkubáljuk. A nitrocellulóz-szúrőt ezután elválasztjuk és TBS-pufferral (50 mmól/1 Trisz, pH-7,9, 150 mmól/I NaCl) mossuk, majd 3 tőmeg%-os zselatinoldatba merítjük.
Az így kezelt nitrocellulóz-szúrőt T3 kötőfehéq’e elleni antitest (anti-BLTsR) [Horiuchí, R. és Yamauchi, K.: Gunma Symposia on Endrocrinology, 23, P. 149 (1986)] oldatába merítve antigén-antitest reakciónak vetjük alá. A szűrőt ezután desztilállált vízzel és TBSpufferral mossuk, és a pozitív színű Xgt 11 T3BP-1 kiónok kiválogatásához szekunder antitesttel kezeljük. A Xgt 11 T3BP-l-ben lévő cDNS-t EcoRI-gyel hasítjuk, majd apUC19 plazmídban [Gene, 33,103 (1985)] az EcoRI helyre kiónozzuk és így pT3BP-l plazmidot kapunk. Az adott plazmídban levő cDNS-szakasztEcoRI és PvuH restrikciós enzimekkel hasítva kapott fragmenst DNS-próbaként felhasználva átvizsgáljuk az 1. példában leírt cDNS-klőntár 5405 kiónját és így kiválasztjuk a pozitív klőnokat.
Az így kapott kiónok egyikéből, név szerint Xgt 11 T3BP-2-bÓl SacI-KpnI segítségével kihasítjuk a cDNS-t, majd a pUC19 plazmídban az SacI-KpnI helyre klónozzuk és így pT3BP-2 plazmidot kapunk. (A Xgt 11T3BP2-be klónozott cDNS 5’ terminális EcoRI felismerőhelyét roncsoltuk.) E.coli KI2 DH5X-t pT3BP-2 plazmiddal transzformálunk, a kapott E.coli K12 DH5A/pT3BP-2 transzformánsból a pT3BP-2 plazmidot extraháljuk és lúgos módszerrel [Bimbóim, H. C. és Doly, I: Nucl. Acids Rés., 11, 1513 (1979)1 tisztítjuk. A plazmídban lévő cDNS-szakasz teljes hossza mintegy 2,8 kbp. Az 1. ábra a cDNS-szakasz vázlatos hasítási térképét mutatja.
A fenti cDNS-szakasz bázisszekvenciáját a didezoxinukleotid-lánc terminációs módszerrel [Messing, J.
HU 204 566 Β és munkatársai: Nucl. Acids Rés. 9, 309 (1981)] meghatározzuk. A 2. ábra a meghatározott bázisszekvenciának megfelelő aminosavszekvenciát mutatja.
A kapott polipeptid aminosavszekvenciája több, mint 90%-os homológiát mutat a patkány PDI-vel, de nem mutat homológiát tiroxinkötő globulin (TBG), tiroxinkötő prealbumin (TBPA) vagy C- erbA fehérje aminosavszekvenciájával, amelyek alkalmasak a pajzsmirigyhormon megkötésére.
A pT3BP-2 plazmidot hordozó Escherichia coli K12 DH5a/pT3BP-2 IFO 14563 szám alatt az Institute fór Fermentation, Osaka (IFO) és a FERM BP-1595 szám alatt a Fermentation Research Institute (FRI), Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan helyeken van letétbe helyezve.
A pT3BP-l-ben hordozott cDNS EcoRI-Pvuü fragmense előállítható úgy is, hogy a pT3BP-2-t először KpnI-gyel és Sacl-gyel, majd ezután EcoRI-gyel és PvuII-vel kezeljük.
1. példa (humán PDI cDNS-t tartalmazó plazmid izolálása és bázisszekvenciájának meghatározása)
Humán méhlepény mRNS (Toyobo Co., Ltd. Japan) alapján Escherichia coli Y1096 segítségével előállított Xgt 11 cDNS-tárat négy darab lágy agarlemezre viszünk fel mintegy egyszer 105 klón/lemez mennyiségben, és ezt nitrocellulóz-szűrőre (Millipore’s HATF-szúrő) visszük. A szűrőn lévő fágokat 0,5 n nátrium-hidroxid-oldattal roncsoljuk és a feltárt és denaturált fág DNS-t a szárítás alatt a szűrőn immobilizáljuk (Maniatis és munkatársai: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 320, 1982). Ettől külön a 2. referenciapélda szerinti pT3BP-l plazmidban található cDNS-szakasz EcoRI és Pvull restrikciós enzimmel történő hasításával kapott DNS-fragmenst a Nick- transzlációs módszerrel (Maniatis és munkatársai idézett müve, 109) 32P-ral megjelöljük.
A hibridizációs reakciót a jelzett minta és a DNSimmobilizált szűrő között 42 ’C hőmérsékleten 16 órán keresztül végezzük egy 10 ml-es elegyben, amely a jelzett minta mellett 5’SSPE-t (0,9 mól/1 NaCl, 50 mmól/1 nátrium-foszfát-puffer, pH=7,4, mmól/1 EDTA), 50 tömeg% formamidot, 5«Denhardt-oldatot, 0,1 tömeg% SDS-t és 100 mikrogramm/ml denaturált lazacsperma DNS-t tartalmaz. A reakció után a szűrőt kétszer 2«SSC-0,l tömeg% SDS-oldattal (bSSC-0,15 mól/1 NaCl és 0,015 mól/1 nátrium-citrát) szobahőmérsékleten 30 percen keresztül mossuk, majd kétszer l«SSC-0,l tömeg% SDS-oldattal 68 ’C hőmérsékleten 30 percen keresztül tovább mossuk. A kimosott szűrő megszárítása után felvesszük a radioautogrammot, és megjelöltük a mintával reagált kiónokat. Az így kapott klónból, vagyis a Xgt 11T3BP-3 klónból Davis és munkatársai módszerével (Davis és munkatársai: Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980) extraháljuk a fág DNS-t.
A Xgt 11 T3BP-3-at EcoRI segítségével 50 mmól/1 NaCl, 100 mmól/1 Trisz-HCl (pH-7,5), 7 mmól/1
MgCl2 és 7 mmól/1 2-merkapto-etanol összetételű pufferben 37 ’C hőmérsékleten 60 percen keresztül emésztjük és az agarózgél-elektroforézissel kapott cDNS-t a pUC19 plazmidban az EcoRI helyre klónozzuk T4 DNS-ligáz segítségével 50 mmól/1 TriszHCl (pH-7,9), 10 mmól/1 MgCl2,20 mmól/1 ditiotreitol és 1 mmól/1 ATP összetételű pufferben 16 ’C hőmérsékleten 16 órán keresztül, melynek során pT3BP-3 plazmidot kapunk. E.coli K12 DH5a törzset transzformálunk a pT3BP-3 plazmiddal 50 mmól/1 CaCl2 jelenlétében 0 ’C hőmérsékleten 20 perc alatt, majd a sejteket 45 másodpercen keresztül 42 ’C hőmérsékleten hőkezeljük. A kapott transzformáns ból, vagyis az E.coli 112 DH5a/pT3BP-3-ból a lúgos extrakciós módszerrel [Bimboium, H. C. és Doly, J.: Nucl. Acids Rés. 11, 1513 (1979)] extraháljuk, és megtisztítjuk a pT3BP-3 plazmidot. A plazmidban lévő cDNS-szakasz teljes hossza mintegy 2,4 kbp. A 4. ábra a cDNS-szakasz vázlatos hasítási térképét mutatja.
A fenti cDNS-szakasz bázisszekvenciáját didezoxinukleotid-lánc terminációs módszerrel (Messing, J. és munkatársai: Nuc. Acids Rés. 9, 309,1981) határozzuk meg. Az 5. ábra a meghatározott bázisszekvenciából levezetett aminosavszekvenciát mutatja.
A polipeptid aminosavszekvenciája több, mint 90%os homológiát mutat a patkány PDI-vel, de semmilyen hasonlóságot nem mutat a tiroxinkötő globulin (TBG), a tiroxinkötő prealbumin (TBPA) vagy C-erbA fehérje aminosavszekvenciájával, amelyek képesek a pajzsmirigyhormon megkötésére.
A pT3BP-3 plazmidot hordozó Escherichia coli K12 DH5a törzset (Escherichia coli K12 DH5a/pT3BP-3) IFO 14610 szám alatt az IFO-nál és FERM BP-1841 szám alatt (a FERM P-9386 számból átalakítva) az FRI-nél deponáltuk.
2. példa (állati sejtekhez alkalmazható kifejező plazmid előállítása)
A pT3BP-3 plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel kezeljük 50 mmól/1 NaCl, 100 mmól/1 Trisz-HCl (pH=7,5) 7 mmól/1 MgCl2 és 7 mmól/1 2-merkaptoetanol összetételű pufferben 37 ’C hőmérsékleten 60 percen keresztül, és így 25 kbp nagyságú cDNS-t (4. ábra) különítünk el. Ettől külön a 63 282/1986. számú japán közrebocsátási iratban ismertetett pTB106 plazmidban lévő interleukin-2 génszakasz 5’ végén lévő PstI hasítási hely és 3 ’ végén lévő BamHI hasítási hely átalakításával és az interleukin- 2 génszakasz kiiktatásával kapott pTB389 plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel kezeljük 50 mmól/1 NaCl, 100 mmól/1 Trisz-HCl (pH-7,5), 7 mmól/1 MgCl2 és 7 mmól/1 2-merkapto-etanol összetételű pufferben 37 ’C hőmérsékleten 60 percen keresztül, majd az 5’ végen levő foszfátcsoportot bakteriális lúgos foszfatázzal 1 mól/1 Trisz-HCl (pH-8,0) és 1 mmól/1 MgSO4 öszszetételű pufferben 25 ’C hőmérsékleten 30 perc alatt lehasítjuk. A kapott fragmenst és a fenti cDNS-t Öszszekeverjük és T4 DNS-ligázzal 50 mmól/1 Trisz-HCl
Ί
HU 204566 Β (pH-7,9), 10 mmől/1 MgCl2,20 mmől/I ditiotreitol és 1 mmól/1 ATP összetételű pufferben 16 ’C hőmérsékleten 16 órán keresztül ligáljuk. így pTB745 plazmidot (6. ábra) kapunk.
3.példa (humán PDI-t kódoló gén kifejezése állati sejtben)
Majom COS-7 sejteket kitenyésztünk egyrétegű tenyészet formájában 10 tömeg% magzati boqúszérumot tartalmazó DMEM-közegben, majd a közeget azonos friss közegre cseréljük. 4 órával a közeg kicserélése után 10 pg pTB745 plazmid DNS-t tartalmazó kalcium-foszfát-gélt állítunk elő a szokásos módon (Graham és munkatársai: Virology 59, 466, 1973), és a tenyészethez adjuk. így pTB745-tel fertőzött COS-7 sejteket kapunk. További 4 óra elteltével a sejteket glicerinnel kezeljük, és a pTB745-teI fertőzött COS-7 sejteket 0,5 tömeg% magzati borjuszérumot tartalmazó közegben továbbtenyésztjük.
óra elteltével apTB745-tel fertőzött COS-7 sejte- 2 két 3,5 tömeg% formaiint tartalmazó PBS segítségével szobahőmérsékleten 15 percen keresztül fixáljuk, majd 0,1 tömeg% szaponint tartalmazó PBS segítségével szobahőmérsékleten 10 percen keresztül kezeljük, és 4 ’C hőmérséldeten 2 órán keresztül antiboqu T3BP 2 nyúlantitesttel reagáltatjuk. A reagálatlan antitestek PBS-sel történő alapos kimosása után a sejteket egy éjszakán keresztül FITC jelölésű antinyúl IgG juhantitesttel reagáltatjuk, és a sejteket fluoreszcens mikroszkóp segítségével figyeljük. Az eredményeket a 7. ábra 3 tartalmazza. A kontroll COS-sejtekhez viszonyítva lényegesen nagyobb fluoreszcencia figyelhető meg azokban a sejtekben, amelyekbe humán PDI-gént ültettünk, ez arra utal, hogy a COS-sejtekben humán PDIfehérje színtetizálődott. 3í
4. példa (humán PDI-gén Escherichia coli-ban történtő kifejezéséhez szükséges plazmid előállítása)
Az 1. példa szerint előállított és humán PDI cDNS-t 4( tartalmazó pT3BP-3 plazmidot Aval restrikciós enzimmel kezeljük 6 mmól/1 Trisz-HCl (pH=7,9), 60 mmól/1 NaCl, 10 mmól/1 MgCl2 és 6 mmól/12-merkapto-etanol összetételűpufferben 37 ’C hőmérsékleten 16percen keresztül, és így 0,85 kbp nagyságú DNS- fragmenst ka- 4£ púnk, amely tartalmazza a humán PDI-t kódoló szakasz első felét Ezt a DNS-fragmenst 10 mmól/1 Trisz-HCl (pH-8,0), 5 mmól/1 MgCl2, 33 pmól/I dATP, 33 pmól/l dCTP, 33 pmól/l dGTP és 33 pmől/l dTl'P összetételű pufferben 37 ’C hőmérsékleten 30 percen keresztül 50 DNS-polimerázzal (Klenow-fragmens) reagáltatjuk és így az Aval hasítási helyet tompa véggé alakítjuk. Ezt a DNS-fragmenst T4 DNS-ligáz jelenlétében 50 mmól/l Trisz-HCl (pH-7,9), 10 mmól/1 MgCl2,20 mmóW ditiotreitol és 1 mmól/1 ATP összetételű pufferben 16 ’C hőmérsékleten 16 órán keresztül foszforilezett szintetikus oKgonukleotidokkal (5’ AA1TCTATGGCGC 3’ és 5’ GCGCCA1AG 3’) ligáljuk, majd EcoRI restrikciós enzimmel kezeljük 50 mmól/I NaCl, 100 mmól/1 Trisz-HCl (pH-7,5), 7 mmól/1 MgCl2 és 7 mmól/I 2-merkapto-etanol összetételűpufferben 37 ’C hőmérsékleten 60 percen keresztül, végül Clal restrikciós enzimmel kezeljük 10 mmól/1 Trisz-HCl (pH-8,0), 7 mmól/1 MgCl2, 50 mmól/1 NaCl és 0,01% boqüszérum-albumin összeté5 telű pufferben 37 ’C hőmérsékleten 60 percen keresztül, így θ>49 kbp méretűDNS-fragmenst kapunk. Ettől külön a pT3BP-3 plazmidot Clal restrikciós enzimmel kezeljük 10 mmól/1 Trisz-HCl (pH-8,0), 7 mmól/1 MgCfe, 50 mmól/I NaCl és 0,01% boquszérum-albumin ősszeíé10 telű pufferben 37 ’C hőmérsékleten 60 percen keresztül, majd Pstl restrikciós enzimmel kezeljük 150 mmól/I NaCl, 20 mmól/1 Trisz-HCl (pH-7,5) és 10 mmól/I MgCl2 összetételű pufferben 37 ’C hőmérsékleten 60 percen keresztül, és így 1,47 kbp nagyságú DNS-ftag15 menst kapunk, amely tartalmazza aPDI-tkódoló szakasz második felét A TRP-promotort tartalmazó ptrp 781 plazmid DNS-ét (Kurookawa, T. és munkatársai: Nucl. Acids Rés., 11,3077-3085,1983) EcoRI restrikciós enzimmel kezeljük 50 mmól/l NaCl, 100 mmól/1 Trisz-HCl ’O (pH“73), 7 mmól/1 MgCl2 és 7 mmól/12-merkapto-etanol összetételű pufferben 37 ’C hőmérsékleten 60 percen keresztül, majd Pstl restrikciós enzimmel kezeljük 150 mmól/1 NaCl, 20 mmól/1 Trisz-HCl (pH-7,5) és 10 mmól/1 MgCl2 összetételűpufferben 37 ’C hőmérsék5 létén 60 percen keresztül, és mintegy 3,2 kbp méretű DNS-fragmenst izolálunk, amely tartalmazza a trp-promotort, a tetraciklin-rezisztenciagéntés aieplikáciős origót. Ezt a 3(2 kbp méretű EcoRI-PstI DNS-fragmenst az említett 0,49 kbp méretű EcoRI-Clal DNS-fiagmenssel, amely tartalmazza a humán PDI-t kódoló gént, és az 1,47 kbp méretű Clal-PstI DNS-fragmenssel ligáljuk T4 DNS-ligáz segítségével 50 mmól/1 Trisz-HCl (pH-7,9), 10 mmól/1 MgCl2,20 mmól/1 ditiotreitol és 1 mmól/1 ATP összetételű pufferben 16 ’C hőmérsékleten 16 órán ke5 resztül, amelynek során humán PDI-t kifejező pTB766 plazmidot (8. ábra) kapunk. Escherichia coliK12 DH1 és MM294 törzseket transzformálunk a kapott plazmiddal 50 mmól/1 CaCl2 jelenlétében 0 ‘C hőmérsékleten 20 percen keresztül, majd a sejteket 45 másodpercen keresztül ) 42 ’C hőmérsékleten hőkezeljük, amelynek során pTB766 plazmidot hordozó transzformánsokat, nevezetesen Escherichia coli K12 DHl/pTB766-ot és MM294/pTB766-ot kapunk.
A pTB766 plazmidot hordozó Escherichia coli K12 ϊ MM294 törzset (Escherichia coli MM294/pTB766) IFO 14611 szám alatt az IFO-nál és FERM BP-1842 szám alatt (a FERMP-9391 számból) azFRI-nél deponáltuk. A ptrp 781 plazmidot hordozó Escherichia coli K12 DHI törzset (Escherichia coli DHl/pttp 781) IFO 14546 szám alatt az IFO-nál és FERM BP-1591 szám alatt (a FERM P-9055 számból) az ERI-nél deponáltuk.
5. példa (Escherichia coli 35S-metioninnal történő jelölése és immunkicsapásos reakciója)
A pTB766 plazmidot hordozó Escherichia coli
MM294 vagy DHI törzset 8 pg/ml tetraciklint, 0,2 tömeg% kazaminosavat és 1 tömeg% glükózt tartalmazó M9 tápközegben 37 ’C hőmérsékleten tenyésztjük. Miután a tenyészet zavarossága Klett- Summerson fotoe8
HU 204566 Β lektrikus koloriméterrel (Klett MFG. Co. Inc., USA) 54. számú filteren keresztül mérve elérte a 200-as szintet, 25 pg/ml koncentrációban IAA-t (3P-indolil-akrilsav) adunk hozzá. 2 óra elteltével 15 pCi/ml aktivitásig 35S-metionint adagolunk, és a következő 30 perc alatt jelöljük a szintetizált fehérjét. A jelölés után a sejteket összegyűjtjük és a tenyészközeg egyötöd térfogatának megfelelő mennyiségű 10 mmól/1 Trisz-HCI-oldatban (pH=8,0) 0,15 mól/1 nátrium-klorid-oidattal és 10 tömegük szacharózoldattal mossuk. A szuszpenzióhoz 1 mmól/1 fenil-metil-szulfonil-fluoridot (PMSF), 0,2 mól/1 nátrium-kloridot, 10 mmól/1 EDTA-t és 150 mikrogramm/ml lizozimot adunk. Az elegyet 0 ’C hőmérsékleten egy órán keresztül reagáltatjuk, majd 31 ’C hőmérsékleten 2 percen keresztül melegítjük és rövid ideig (mintegy 10 másodperc) ultrahanggal kezeljük. A terméket centrifugálva sejtextraktumot kapunk. A sejtextraktumhoz antiborjú T3BP nyúlantitestet (Horiuchi, R. és Yamauchi, K.: Gunma Symposia on Endocrinology, 23, 149, 1986) adunk és 4 ’C hőmérsékleten egy éjszakán keresztül reagáltatjuk. Ezután Staphylococcus sejteket (A fehérje) adunk hozzá és a teljes elegyet 0 ’C hőmérsékleten 3 órán keresztül állni hagyjuk. Ez idő alatt az antigén-antitest konjugátum a sejtekhez kötődik. A sejteket centifugálással 5 mmól/1 EDTA, 150 mmól/1 nátrium-klorid, 0,05 tömegük Nonidet P-40 (Shell Oil) és 1 mg/ml ovalbumin 50 mmól/1 Trisz-HCl-ben (pH-7,4) felvett oldatával ismételten mossuk, majd 100 ’C hőmérsékleten 5 percen keresztül elektroforézisminta előállításához alkalmazott oldattal (2 tömegük SDS, 5 tömegük 2-merkapto-etanol, 0,001 tömegük bróm-fenol-kék és 10 tömegük glicerol 0,0625 mól/1 Trísz-HCl-ban, pH-6,8) kezelve eluáljuk a konjugátumot. A kapott immunocsapadékot 10-20% gradiensű SDS-poliakrilamidgél elektroforézissel analizáljuk. Az elektroforézis után a gélt 5 tömeg%-os triklór-ecetsav-oldattal fixáljuk és fluorográfiás módszerrel radioautogramot veszünk fel. A 9. ábrán mutatott eredményekből látható, hogy a kívánt méretű (mintegy 60 kD) PDI-t mindkét kifejező plazmidot hordozó törzs, vagyis az Escherichia coli DHl/pTB766 és MM294/pTB766 törzs szintetizálta.
6. példa (humán PDI-gén élesztőben történő kifejezéséhez szükséges plazmid előállítása)
Az 1. példa szerint előállított és humán PDI cDNSt tartalmazó pT3BP-3 plazmidot SacI restrikciós enzimmel kezeljük 6 mmól/1 Trisz-HCl (pH-7,5), mmól/1 MgCl2 és 6 mmól/1 2-merkapto-etanol öszszetételű pufferben 37 ’C hőmérsékleten 60 percen keresztül, és T4 DNS-polimerázzal reagáltatva tompa végűvé alakítjuk. A kapott hasítási termékhez GGTCGACC szekvenciájú Sáli linkért kapcsolunk T4 DNS-ligáz segítségével 50 mmól/1 Trisz-HCl (pH-7,9), 10 mmól/1 MgCl2,20 mmól/1 ditiotreitol és 1 mmól/1 ATP összetételű pufferben 16 ’C hőmérsékleten 16 órán keresztül. A ligáit terméket Sáli restrikciós enzimmel kezeljük 150 mmól/1 NaCl, 6 mmól/1 Trisz-HCl (pH-7,9), 6 mmól/1 MgCl2 és 6 mmól/1
2-merkapto-etanol összetételű pufferben 37 ’C hőmérsékleten 60 percen kersztül, majd Clal restrikciós enzimmel kezeljük 10 mmól/1 Trisz-HCl (pH=8,0), 7 mmól/1 MgCI2,50 mmól/1 NaCl és 0,01% borjúszérum-albumin összetételű pufferben 37 ’C hőmérsékleten 60 percen keresztül, és így 0,65 kbp nagyságú DNS-fragmenst kapunk. A 2. példa szerinti pTB745 plazmid DNS-ét Seal restrikciós enzimmel kezeljük 100 mmól/1 NaCl, 6 mmól Trisz-HCl (pH=7,5), 6 mmól/1 MgCl2 és 6 mmól/1 2-merkaptoetanol összetételű pufferban 37 ’C hőmérsékleten 60 percen keresztül, majd Clal restrikciós enzimmel kezeljük 10 mmól/1 Trisz-HCl (pH=8,0), 7 mmól/1 MgCl2, 50 mmól/1 NaCl és 0,01% borjúszérum-albumin összetételű pufferben 37 ’C hőmérsékleten 60 percen keresztül, és így 3,8 kbp nagyságú DNS-fragmenst kapunk. A pGLD906 plazmid (Biochem. Biophys. Rés. Commun., 138, 268,1986) DNS-ét Sáli restrikciós enzimmel kezeljük 150 mmól/1 NaCl, 6 mmól/1 Trisz-HCl (pH=>7,9), 6 mmól/1 MgCl2 és 6 mmól/1 2-merkapto-etanol összetételű pufferben 37 ’C hőmérsékleten 60 percen keresztül, majd Seal restrikciós enzimmel kezeljük 100 mmól/1 NaCl, 6 mmól/1 Trisz-HCl (pH-7,5), 6 mmól/1 MgCl2 és 6 mmól/1 2-merkapto-etanol összetételű pufferben 37 ’C hőmérsékleten 60 percen keresztül és így 6,2 kbp nagyságú DNS-fragmenst kapunk. Ezt a DNS-fragmenst a fent említett két DNS-fragmenssel ligáljuk T4 DNS-ligáz segítségével 50 mmól/1 Trisz-HCl (pH-7,9), 10 mmól/1 MgCl2, 20 mmól/1 ditiotreitol és 1 mmól/1 ATP összetételű pufferben 16 ’C hőmérsékleten 16 órán keresztül, amelynek során az élesztőben történő kifejezéshez alkalmas pTB767 plazmidot kapjuk (10. ábra). Az AH22R' törzset a fenti plazmiddal transzformáljuk 50 mmól/1 CaCl2 jelenlétében 0 ’C hőmérsékleten 20 percen keresztül, majd a sejteket 45 másodpercen keresztül 42 ’C hőmérsékleten hőkezeljük. így pTB767 plazmidot hordozó élesztőtörzset vagyis Saccharomyces cerevisiae AH22R' /pTB767 törzset kapunk.
A pTB767 plazmidot hordozó Saccharomyces cerevisiae AH22R törzset (Saccharomyces cerevisiae AH22R'/pTB767) IFO 10425 szám alatt az EFO-nál és FERM BP-1843 szám alatt (a FERM P-9603 számból) az FRI-nél deponáltuk.
7. példa (élesztő jelölése 35S-metioninnal és immunkicsapásos reakciója)
A pTB767 plazmidot hordozó AH22R' élesztőtörzset alacsony Pi-tartalmú közegben (Biochem. Biophys., Rés. Commun. 138,268,1986) tenyésztjük 37 ’C hőmérsékleten egy éjszakán keresztül, majd a szintetizált fehérje megjelöléséhez 20 mikroCi/ml 35S-metionint adagolunk. A jelölés után a sejteket összegyűjtjük és 0,15 mól/1 nátrium-kloriddal mossuk és a tenyészközeg egyötöd térfogatát kitevő 7 mól/1 guanidin- hidrokloridot adunk hozzá. A sejteket 0 ’C hőmérsékleten egy órán keresztül roncsoljuk, majd 10 000 fordulatszámnál 10 percen keresztül centrifugáljuk. A felülúszót 10 mmól/1 Trisz-HCl-t
HU 204566 Β (pH=»8,O), 1 mmól/1 EDTA-t, 200 mmól/1 nátrium-kloridot és 1 mmól/1 PMSF-et tartalmazó oldattal szemben dializáljuk. Ehhez a sejtextraktumhoz antiborjú T3BP nyúlantitestet (lásd az 5. példát) adunk és az 5. példában leírt módon űnmuncsapadékot nyerünk, amelyet SDSpoh'akrilamidgél elektroforézissel és radioautográfiásan analizálunk. Az eredmények szerint a kifejező plazmidot hordozó AH22R'/pTB767 éleszíőtöizs specifikus polipeptidet szintetizált, vagyis a humán PDI-élesztóben is előállítható.
Az alkalmazott alacsony Pi-tartalmú tápkőzeg öszszetétele 1 literre számolva:
KC1 l,5g
Glükóz 20 g
Aszparagin 2g
L-hisztidin 100 mg
KI (1 mg/ml) 100 mikroliter
MgSO4*7H2O (500 mg/10 ml) 10 ml
CaCl2*2H2O (330 mg/10 ml) 10 ml
Nyomelemoldat (a) I ml
Vitaminoldat (b) 1 ml
Nyomelemoldat (a) összetétele 1 literre számolva: CuSO4*5H2O 40 mg
FeSO4*7H2O 250 mg
MnSO4*4H2O 40 mg (NH4)3P04*12Mo03*3H20 20 mg
ZnSO4*7H2O 310 mg.
Vitaminoldat (b) összetétele 1 literre számolva: Ihozitol 10 g
Tiamin 200 mg
Pűidoxin 200 mg
Kalcium-pantotenát 200 mg
Niacin 200 mg
Biotin 2 mg,
8. példa (Escherichia coli MM294/pTB766 törzsből származó PDI tisztítása)
A pTB766 kifejező plazmidot tartalmazó Escherichia coli MM294 törzset (4. példa) 1 liter tápközegben 37 °C hőmérsékleten 11 órán keresztül tenyésztjük, ahol a tápközeg 5 mg/I tetraciklint, 10 g/1 Bactotriptont, 5 g/1 Bacto-élesztőextraktumot és 5 g/1 nátríum-kloridot tartalmaz. A tenyészetet 20 liter M9 közegbe visszük, amely 2 mg/1 Bl-vitamint, 10 g/1 glükózt és 10 g/1 kazaminosavat tartalmaz, és kevertetés és levegőztetés közben 37 °C hőmérsékleten további órán keresztül tenyésztjük. Ezután a sejteket (385 g nedves tömeg) centrifugálással összegyűjtjük és felhasználásig -80 °C hőmérsékleten tároljuk.
A sejteket (30 g nedves tömeg) 150 ml 20 mmól/1 Trisz-HCl-pufferben (pH-7,4) szuszpendáljuk, amely 0,15 mől/l nátrium-kloridot, 10 mmól/I EDTA-t, mmól/1 PMSF-et és 0,1 mmól/1 (p-amidino-fenil)metánszulfonil-fluorid HCl (APMSF) tartalmaz. A szuszpenzíót 0 °C hőmérsékleten négyszer 1 percen keresztül ultrahanggal besugározzuk, majd centrifugáljuk. így 156 ml nyers extraktumot kapunk.
A nyers extraktumot Cellulofine GCL-2000-SF oszlopra (Seikagaku Kogyo Co., Ltd., Tokió, Japán) (6*102 cm, 2880 ml) visszük, amelyet előzőleg 0,15 mól/1 nátrium-kloridot, 1 mmól/1 kalcium-kloridot 5 és 0,1 mmól/1 APMSF-et tartalmazó 10 mmól/1 nátrium-foszfát-pufferral (pH=6,8) egyenlítünk ki. Az oszlopot a fenti pufferral eluáljuk és a PDI-t tartalmazó eluátumot (325 ml) összegyűjtjük.
Az így kapott eluátumot hidroxi-apatít-oszlopra 10 (Biorad., Califomia, USA) (1,5*14 cm, 25 ml) viszszük, amelyet előzőleg 0,145 mól/1 nátrium-kloridot, 1 mmól/1 kalcium-kloridot és 0,1 mmól/1 APMSF-et tartalmazó 10 mmól/1 nátrium-foszfát-pufferrel (pH=6,8) egyenlítünk ki. Az oszlopot a fenti pufferral 15 mossuk és lineárisan változó nátrium-foszfát koncentrációval eluáljuk. Ehhez 200 ml 300 mmól/1 nátrium-foszfát-puffert (pH=6,8) adunk 200 ml 10 mmől/1 nátrium-foszfát-pufferhez (pH-6,8). A PDI-t tartalmazó eluátumokat összegyűjtjük.
Az eluátumokat egy éjszakán keresztül 0,1 mmól/1 APMSF-et tartalmazó 10 mmól/I nátrium-foszfátpufferral (pH-6,8) szemben dializáljuk. A dializált oldatot DEAE-Toyopearl oszlopra (Tosoh, Tiokió, Japán) (1,5*15 cm, 26,5 ml) visszük, amelyet előzőleg a 25 fenti pufferral egyenlítettük ki. Az oszlopot a fenti pufferral mossuk és lineárisan változó nátrium-klorid koncentrációval eluáljuk. Ehhez 200 ml 10 mmól/1 nátrium-foszfát-puffert (pH-6,8), amely 0,5 mól/1 nátrium-kloridot és 0,1 mmól/1 APMSF-et tartalmaz, 30 adunk 200 ml 10 mmól/I nátrium-foszfát-pufferhez (pH-6,8), amely 0,1 mmól/1 APMSF-et tartalmaz. A PDI-t tartalmazó eluátumokat összegyűjtjük. A PDI-t tartalmazó frakciókat 0,1 mmól/1 APMSF-et tartalmazó 10 mmól/1 nátrium-foszfát-pufferrel (pH-6,8) 35 szemben dializáljuk. A dializált oldatot DEAE-NPR HPLC-oszlopra (Tosoh, Tokió, Japán) (0,46*3,5 cm) visszük, amelyet előzőleg 0,09 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 10 mmól/1 nátrium-foszfát-pufferral (pH=6,8) egyenlítünk ki. A fehérjéket 0,09 mől/l és 40 0,39 mól/1 közötti változó nátrium-klorid koncentrációban eluáljuk 30 perc alatt. A PDI-t tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és szűréssel sterilizáljuk. Fehérjekoncentráciő 106 mikrogramm/ml, össztérfogat 17,1 ml, összfehérje 1,8 mg.
A kapott készítmény SDS-poliakrilamidgél elektroforézis szerint homogén (11, ábra).
9. példa (Escherichia coli MM294/pTB766 törzzsel előállított PDI tisztításának alternatív módszere)
A 8. példa szerint előállított 30 g E.coli sejtet 160 ml mmól/1 Trisz-HCl-pufferben (pH«7,4) szuszpendálunk, amely 0,15 mól/1 nátrium-kloridot, 10 mmól/1 EDTA-t, 1 mmól/1 PMSF-et és 0,1 mmól/1 APMSF-et tartalmaz; A sejteket 0,25-0,5 mm átmérőjű üveggyöngyökkel 0 °C hőmérsékleten 30 percen keresztül roncsoljuk. A szuszpenziót centrifugáljuk és a felülúszőt (84 ml) összegyűjtjük.
A felülúszőt a 8. példában leírt módon tisztítva homogén PDI-készítményt kapunk. Fehérjekoncent10
HU 204566 Β ráció 111 mikrogramm/ml, össztérfogat 9,0 ml, összfehérje 1,0 mg.
10. példa (PDI peptidkémiai jellemzése)
A 8. példában előállított PDI-preparátummal a következő peptidkémiai analíziseket végezzük el.
(1) Móltömeg-meghatározás
A PDI-t redukáló körülmények között SDS-poliakrilamidgél elektroforézisének (Natúré, 227, 680, 1970) vetjük alá és a fehérjéket Coomassie Brilliant Blue R-250 segítségével megfestjük. A PDI egyetlen sávot mutat, amelynek móltömege mintegy 55 000 (11. ábra).
(2) Aminosav-összetétel meghatározása
Az aminosav-összetételt 6 n sósavban 110 °C hőmérsékleten 4 tömeg% tioglikolsav jelenlétében 24,48 és 72 órán keresztül végzett hidrolízis alapján határozzuk meg. Az aminosav-analízist ninhidrinmódszerrel Hitachi Amino acid analyzer model 835 berendezésen végezzük. A Ser és Thr értékeket a 0 idejű hidrolízisnek megfelelő extrapolálással, és a Η-Cys értéket (fél risztéin) ciszteinsavként perhangyasavas oxidálás után végzett 24 órás hidrolizálás alapján határoztuk meg. A mért aminosav-összetétel megfelel annak, amely a cDNS-bázisszekvencia alapján következtethető volt. Az eredményeket a 2. táblázat mutatja.
| Aminosav | A maradékok száma molekulánként | A cDNS-szekvencia alapján számolható érték |
| Asp/Asn | 54,4 | 57 |
| Thr | 21,8 | 23 |
| Ser | 21,2 | 23 |
| Glu/Gln | 70,7 | 69 |
| Pro | 20,5 | 21 |
| Gly | 29,5 | 29 |
| Ala | 46,6 | 44 |
| H-Cys | 5,5 | 6 |
| Val | 31,1 | 29 |
| Met | 4,5 | 5 |
| De | 21,5 | 23 |
| Leu | 415 | 41 |
| Tyr | 11,9 | 12 |
| Phe | 34,0 | 33 |
| Lys | 46,6 | 47 |
| His | 11,7 | 11 |
| Arg | 13,6 | 13 |
| Trp | 4,5 | 5 |
(3) N-terminális aminosavszekvencia meghatározása 102 mikrogramm (1,85 nmól) PDI-szekvencia analízisét gázfázisú fehérjeszekvenciálóban (model 470A, Applied Biosystems, Califomia, USA) végezzük. A fenil-tio-hidantion (PTH) aminosavat HPLC segítségével Micropak SP-ODS oszlopon (Varion, USA) határozzuk meg.
A 3. táblázatban megadott mért szekvencia 20 cikluson keresztül azonos volt a cDNS-ből levezethető szekvenciával. A 8. és 13. számú maradékot nem határoztuk meg.
Meghatározott PTH-aminosav
| Ciklus | Maradék | pmól | A cDNS-szekvenciából levezethető aminosav |
| 1 | Met | 373 | (Met) |
| 2 | Ala | 720 | Ala |
| 3 | Pro | 277 | Pro |
| 4 | Glu | 319 | Glu |
| 5 | Glu | 379 | Glu |
| 6 | Glu | 353 | Glu |
| 7 | Asp | 303 | Asp |
| 8 | - | - | His |
| 9 | Val | 271 | Val |
| 10 | Leu | 581 | Leu |
| 11 | Val | 333 | Val |
| 12 | Leu | 638 | Leu |
| 13 | - | - | Arg |
| 14 | Lys | 227 | Lys |
| 15 | Ser | 92 | Ser |
| 16 | Asn | 257 | Asn |
| 17 | Phe | 330 | Phe |
| 18 | Ala | 615 | Ala |
| 19 | Glu | 334 | Glu |
| 20 | Ala | 669 | Ala |
(4) C-terminális aminosav
151 mikrogramm (2,75 nmól) PDI C-terminális aminosavját hidrazinolízissel (J. Biochem. 59, 170, 1966) lehasítjuk, majd aminosav-analízissel meghatározzuk. A C-terminális aminosav a mérés szerint leucin, a feltárás 46%-os.
(5) UV-abszorpciós spektrum
A PDI UV-abszorpciós spektruma 10 mmól/1 nátrium-foszfát-pufferben (ρΗ=·6,8) felvéve 280 nm-nél mutat abszorpciós csúcsot (12. ábra).
11. példa (feltekercselt ribonukleáz, RNáz kibontása PDI-vel)
A 8. példában előállított homogén PDI-készítmény enzimaktivitását feltekercselt RNáz kioldásában mérjük ditiotreitol (DTT) jelenlétében. A feltekercselt RNáz-t Hillson és munkatársai módszerével (Methods in Enzymology, 107,281-284,1984) állítjuk elő borjúhasnyál-mirigy RNáz-ból kiindulva.
Az RNáz aktivitását Kalnisky és munkatársai módszerével (J. Bioi. Chem. 234, 1512-1516, 1959) határozzuk meg, szubsztrátumként élesztő poli-RNS-t alkalmazva.
A vizsgálathoz alkalmazott A puffer összetétele 100 mmól/1 nátrium-foszfát-puffer (pH-7,8), amely 10 mmól/1 EDTA-t tartalmaz, a B puffer összetétele 0,2 mól/1 nátrium-acetát-puffer (pH-5,0), a C puffer összetétele 0,1 mól/1 nátrium-acetát-puffer (pH-5,0).
mikroliter PDI-t (111 mikrogramm/1), 168 mikroliter A puffért és 2 mikroliter 1 mmól/1 DDT-t tartalmazó mérőcsövet 30 °C hőmérsékletű vízfürdőbe he11
HU 204566 Β lyezünk és 5 percen keresztül elóinkubáljuk. A mérőcsőhöz 20 mikroliter 0,5 mg/ml feltekercseit RNáz-t adunk és az egész reakcióelegyet 30 'C hőmérsékleten tartjuk 60 percen keresztül. Areakciót 800 mikroliter B puffer adagolásával állítjuk le.
A reakcióelegyben lévő kibontott és aktív RNáz-t az alábbi módon határozzuk meg:
200 mikroliter reakcióelegyet centrifugacsőbe öntünk és 5 percen keresztül 37 °C hőmérsékleten előinkubáljuk. A centrifugacsőben lévő reakcióelegyhez 5 percen keresztül 37 °C hőmérsékleten előinkubált 200 mikroliter 1 tömeg%-os élesztő poli-RNS-t adunk és az egész reakcióelegyet 4 percen keresztül 37 °C hőmérsékleten tartjuk. 200 mikroliter 25 tömeg%-os perklőrsavoldatot adunk hozzá, amely 0,75 tömeg% uránium-acetátot tartalmaz, és a teljes reakcióelegyet jeges-vizes fürdőben 5 percen keresztül inkubáljuk, maj'd 16 000 fordulatnál 5 percen keresztül centrifugáljuk. A felülúszót desztillált vízzel 30-szorosára hígítjuk és meghatározzuk a 260 nm-nél mérhető abszorpciót.
A PDI1 ·10'5 mól/l DTT jelenlétében kioldja a feltekercselt RNáz-t. A feltekercselt RNáz mintegy 25%-a aktív és kioldott RNáz-zá alakult a megadott körülmények között (4. táblázat).
| Adalék | RNáz-aktivitás (%) |
| nincs | 0,9 |
| PDI | 0,9 |
| DTT | 4,4 |
| PDI+DTT | 24,9 |
12. példa (feltekercselt rekombináns interleukin-2, rIL-2, kioldása PDI-vel)
8. példa szerinti PDI-t adunk feltekercselt rIL-2 oldathoz és a feltekercselt rIL-2 kioldását az IL-2 aktivitás növekedésében határoztukmeg.
Feltekercselt rIL-2-t állítunk elő Brawning és munkatársai módszerével (Anal. Biochem. Biophys. Res. Commun. 130,692-699,1985) kiindulva. Ismert, hogy a feltekercselt rIL-2 alacsony biológiai aktivitást mutat (Brawning és munkatársai: Anal. Biochem. 155,123128,1986).
Az IL-2 biológiai aktivitását módosított MTT-mődszeirel NKC3 egérsejteken határozzuk meg (Tada és munkatársai: J. Immunoi. Methods, 93,157-165,1986).
150 mikroliter 200 mikrogramm/ml feltekercselt rIL-2-t adunk mérőcsövekhez, amelyek különböző mennyiségű PDI-t (végső koncentráció 0,0,74,1,85 és 3,70 mikrogramm/ml) 1000 mikroliter 30 mmól/1 Trisz-acetát-puffert (pH-9,0), 30 mikroliter I mmól/1 DTT-t és 2850 mikroliter végső térfogatig szükséges desztillált vizet tartalmaznak. A teljes reakcióelegyet 18 órán keresztül 30 °C hőmérsékleten inkubálj’uk. Az IL-2 aktivitást a módosított MTT-módszerrel határozzuk meg minden mérési csőnél.
A natív rIL-2 a PDI-koncentráció növekedésével együtt növekszik (5. táblázat).
| 5 | PDI-koncentráció (mikrogramm/ml) | aktív IL-2 koncentráció (mikrogramm/ml) |
| 0 | 1,28 | |
| 0,74 | 2,37 | |
| 10 | 1,85 | 2,77 |
| 3,70 | 3,02 |
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
Claims (13)
1. Elj'árás a 3. ábra szerinti aminosavszekvenciáj'ú polipeptid előállítására, ahol az ábrán Z jelentése Alá vagy MetAIa,
X jelentése Alá vagy Pro, ) azzal jellemezve, hogy a tárgyi kör szerinti aminosavszekvenciát kódoló bázisszekvenciát hordozó replikálható vektorral transzformáit mikroorganizmust tenyésztünk, a tenyészetben a polipeptidet felhalmozzuk és kinyerjük. (Elsőbbsége: 1987.10.05.) ί
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Escherichia coli-t tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1987.10.05.)
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan, 3. ábra szerinti aminosavszekvenciájú polipeptid előállítására, ahol
Z jelentése MetAIa,
X jelentése Alá vagy Pro, azzal jellemezve, hogy a tárgyi kör szerinti aminosavszekvenciát kódoló bázisszekvenciát hordozó replikálhatő vektorral transzformált mikroorganizmust tenyésztünk, a tenyészetben a polipeptidet felhalmozzuk és kinyerjük. (Elsőbbsége: 1987.10.05.)
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy transzformált mikroorganizmusként Saccharomyces cerevisae AH22R7pTB767 törzset (IFO 10425, FERM BP-1873) tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1987. 09.18.)
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan, 3. ábra szerinti, aminosavszekvenciájú. polipeptid előállítására, ahol
Z jelentése Alá vagy MetAIa,
X jelentése Alá, azzaljellemezve, hogy a tárgyi kör szerinti aminosavszekvenciát kódoló bázisszekvenciát hordozó replikálhatő vektorral transzformált mikroorganizmust tenyésztünk, a tenyészetben a polipeptidet felhalmozzuk és kinyerjük. (Elsőbbsége: 1987.06.01.)
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy transzformált mikroorganizmusként Escherichia coli MM294/pTB766 törzset (IFO 14611, FERM BP1842) tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1987.06.01.)
7. Eljárás 3. ábra szerinti aminosavszekvenciát kódoló bázisszekvenciát hordozó replikálható vektorral transzformált mikroorganizmus előállítására, ahol az ábrán
HU 204566 Β
Z jelentése Ala vagy MetAIa,
X jelentése Ala vagy Pro, azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmust a tárgyi kör szerinti vektorral transzformáljuk. (Elsőbbsége: 1987.10.05.)
8. A 7. igénypont szerinti eljárás olyan, 3. ábra szerinti aminosavszekvenciát kódoló bázisszekvenciát hordozó replikálható vektorral transzformált mikroorganizmus előállítására, ahol
Z jelentése Ala vagy MetAIa,
X jelentése Ala, azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmust a tárgyi kör szerinti vektorral transzformáljuk. (Elsőbbsége: 1987.06.01.)
9. Eljárás 3. ábra szerinti aminosavszekvenciát kódoló bázisszekvenciát hordozó és mikroorganizmusban replikálható vektor előállítására, ahol az ábrán
Z jelentése Ala vagy MetAIa,
X jelentése Ala vagy Pro, azzal jellemezve, hogy a 3. ábra szerinti aminosavszekvenciát kódoló bázisszekvenciát tartalmazó DNS-t viszünk be egy mikroorganizmusban replikálható vektorba. (Elsőbbsége: 1987.10.05.)
10. A 9. igénypont szerinti eljárás olyan, 3. ábra szerinti aminosavszekvenciát kódoló bázisszekvenciát hordozó és mikroorganizmusban replikálható vektor előállítására, ahol Z jelentése Ala vagy MetAIa,
X jelentése Ala, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-t visszük be a mikroorganizmusban replikálható vektorba. (Elsőbbsége: 1987.06.01.)
11. Eljárás eukariótaszervezet természetes típusú diszulfidkötést tartalmazó fehérjéjének előállítására, azzal jellemezve, hogy az eukariótaszervezet prokariótasejt által előállított fehérjéjét 1. igénypont szerint előállított, 3. ábra szerinti aminosavszekvenciát tartalmazó polipeptiddel reagáltatjuk, ahol az ábrán
Z jelentése Ala vagy MetAIa,
X jelentése Ala vagy Pro.
(Elsőbbsége: 1987.10.05.)
12. A11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan 3. ábra szerinti aminosavszekvenciát tartalmazó polipeptidet alkalmazunk, ahol
Z jelentése Ala vagy MetAIa,
X jelentése Ala.
(Elsőbbsége: 1987.06.01.)
13. A11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakciót redukálószer jelenlétében végezzük.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13862887 | 1987-06-01 | ||
| JP23549287 | 1987-09-18 | ||
| JP25114487 | 1987-10-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT47974A HUT47974A (en) | 1989-04-28 |
| HU204566B true HU204566B (en) | 1992-01-28 |
Family
ID=27317710
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU882775A HU204566B (en) | 1987-06-01 | 1988-05-31 | Process for producing expressive vector with disulfide-isomerase-coding dns, transformed microorganismus and disulfid-isomerase polypeptide |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5700678A (hu) |
| EP (1) | EP0293793B1 (hu) |
| JP (1) | JP2803089B2 (hu) |
| CA (1) | CA1341390C (hu) |
| DE (1) | DE3882593T2 (hu) |
| FI (1) | FI882516A (hu) |
| HU (1) | HU204566B (hu) |
| IL (1) | IL86455A0 (hu) |
| NO (1) | NO882385L (hu) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0509841A3 (en) * | 1991-04-18 | 1993-08-18 | Tonen Corporation | Co-expression system of protein disulfide isomerase gene and useful polypeptide gene and process for producing the polypeptide using its system |
| DE4113750A1 (de) * | 1991-04-26 | 1992-10-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verbesserung der renaturierung bei der sekretion von disulfidverbrueckten proteinen |
| US5496719A (en) * | 1992-05-27 | 1996-03-05 | Kabushiki Kaisha Toyota Chuo Kenkyusho | Polypeptide from Humicola insolens possessing protein disulfide isomerase activity gene encoding the same |
| US6291205B1 (en) * | 1992-06-12 | 2001-09-18 | Merck & Co., Inc. | Method of increasing production of disulfide bonded recombinant proteins by saccharomyces cerevisiae |
| DK76893D0 (hu) | 1993-06-28 | 1993-06-28 | Novo Nordisk As | |
| US5663304A (en) * | 1993-08-20 | 1997-09-02 | Genentech, Inc. | Refolding of misfolded insulin-like growth factor-I |
| US5639635A (en) * | 1994-11-03 | 1997-06-17 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
| US5789199A (en) * | 1994-11-03 | 1998-08-04 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
| AU2660397A (en) * | 1996-04-05 | 1997-10-29 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells |
| US6083715A (en) * | 1997-06-09 | 2000-07-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells |
| US6521421B1 (en) | 1997-07-16 | 2003-02-18 | Genencor International, Inc. | Expression vectors encoding Bacillus subtilis disulfide bond isomerase and methods of secreting proteins in gram-positive microorganisms using the same |
| AU8489598A (en) * | 1997-07-16 | 1999-02-10 | Genencor International B.V. | Increasing production of proteins in gram-positive microorganisms |
| EP2050762A3 (en) | 1998-03-10 | 2009-07-08 | Genentech, Inc. | Human cornichon-like protein and nucleic acids encoding it |
| US20030059884A1 (en) * | 1998-04-01 | 2003-03-27 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
| US20020127618A1 (en) | 1998-09-21 | 2002-09-12 | Jeff Gray | Diagnostic assays for detection of cryptosporidium parvum |
| WO2000040746A1 (en) * | 1999-01-08 | 2000-07-13 | Medical Analysis Systems, Inc. | Compositions and methods for stabilizing thiol-containing biomolecules |
| JP3734634B2 (ja) * | 1999-03-03 | 2006-01-11 | ヒゲタ醤油株式会社 | タンパク質の活性化方法及び該装置 |
| KR100414182B1 (ko) * | 2001-07-02 | 2004-01-07 | 대한민국 | 누에 배양세포로부터 분리한 프로테인 디설피드이소머레이즈를 코딩하는 ｃＤＮＡ 유전자의 염기서열 및그의 연역 아미노산 |
| US9057061B2 (en) | 2003-12-23 | 2015-06-16 | Novozymes Biopharma Dk A/S | Gene expression technique |
| GB0329722D0 (en) | 2003-12-23 | 2004-01-28 | Delta Biotechnology Ltd | Modified plasmid and use thereof |
| GB0329681D0 (en) | 2003-12-23 | 2004-01-28 | Delta Biotechnology Ltd | Gene expression technique |
| US8637435B2 (en) * | 2007-11-16 | 2014-01-28 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Eukaryotic cell display systems |
| JP2011514157A (ja) * | 2008-02-20 | 2011-05-06 | グライコフィ， インコーポレイテッド | 蛋白質生産用ベクター及び酵母株 |
| JP5731827B2 (ja) * | 2008-03-03 | 2015-06-10 | グライコフィ， インコーポレイテッド | 下等真核生物中での組換えタンパク質の表面ディスプレイ |
| US8067339B2 (en) | 2008-07-09 | 2011-11-29 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Surface display of whole antibodies in eukaryotes |
| ES2699434T3 (es) * | 2008-10-31 | 2019-02-11 | Wyeth Llc | Purificación de proteínas ácidas utilizando cromatografía de hidroxiapatita cerámica |
| US11981541B2 (en) | 2021-09-15 | 2024-05-14 | P.I.P. Lift LLC | Lifting device |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4904602A (en) * | 1985-11-27 | 1990-02-27 | Repligen Corporation | Thioredoxin shufflease and use thereof |
| EP0509841A3 (en) * | 1991-04-18 | 1993-08-18 | Tonen Corporation | Co-expression system of protein disulfide isomerase gene and useful polypeptide gene and process for producing the polypeptide using its system |
-
1988
- 1988-05-20 IL IL86455A patent/IL86455A0/xx unknown
- 1988-05-27 JP JP63130968A patent/JP2803089B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-05-27 FI FI882516A patent/FI882516A/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-05-28 EP EP88108570A patent/EP0293793B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-05-28 DE DE88108570T patent/DE3882593T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-05-31 CA CA000568193A patent/CA1341390C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-05-31 HU HU882775A patent/HU204566B/hu not_active IP Right Cessation
- 1988-05-31 NO NO882385A patent/NO882385L/no unknown
-
1992
- 1992-11-25 US US07/982,138 patent/US5700678A/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-06-26 US US08/882,877 patent/US5874247A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL86455A0 (en) | 1988-11-15 |
| US5700678A (en) | 1997-12-23 |
| HUT47974A (en) | 1989-04-28 |
| EP0293793A2 (en) | 1988-12-07 |
| FI882516A0 (fi) | 1988-05-27 |
| DE3882593T2 (de) | 1993-11-18 |
| EP0293793B1 (en) | 1993-07-28 |
| CA1341390C (en) | 2002-10-01 |
| DE3882593D1 (de) | 1993-09-02 |
| FI882516A (fi) | 1988-12-02 |
| EP0293793A3 (en) | 1990-05-16 |
| JPH02460A (ja) | 1990-01-05 |
| JP2803089B2 (ja) | 1998-09-24 |
| NO882385D0 (no) | 1988-05-31 |
| NO882385L (no) | 1988-12-02 |
| US5874247A (en) | 1999-02-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU204566B (en) | Process for producing expressive vector with disulfide-isomerase-coding dns, transformed microorganismus and disulfid-isomerase polypeptide | |
| Shapiro et al. | Expression of Met-(− 1) angiogenin in Escherichia coli: conversion to the authentic< Glu-1 protein | |
| Anderluh et al. | Cloning, sequencing, and expression of equinatoxin II | |
| Shirano et al. | Low temperature cultivation of Escherichia coli carrying a rice lipoxygenase L‐2 cDNA produces a soluble and active enzyme at a high level | |
| Nagata et al. | Gene cloning and sequence determination of leucine dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus and structural comparison with other NAD (P)+-dependent dehydrogenases | |
| Rhyner et al. | Characterization of the human calmodulin-like protein expressed in Escherichia coli | |
| Schmidheini et al. | Yeast allosteric chorismate mutase is locked in the activated state by a single amino acid substitution | |
| US4987070A (en) | Use of a 97 amino acid leader sequence from the E. coli B-galactosidase gene for the production of hanp and hptc as fusion proteins | |
| US4904602A (en) | Thioredoxin shufflease and use thereof | |
| PT871718E (pt) | Produção de carboxipeptidase b recombinante, activa sob o ponto de vista enzimático. | |
| Hum et al. | Expression of active domains of a human folate-dependent trifunctional enzyme in Escherichia coli | |
| Padilla et al. | High-level expression of fully active human glutaredoxin (thioltransferase) in E. coli and characterization of Cys7 to Ser mutant protein | |
| Shenoy et al. | Effect of mutations at Met‐88 and Met‐90 on the biotination of Lys‐89 of the apo 1.3 S subunit of transcarboxylase | |
| EP0277563A1 (en) | Polypeptide and production thereof | |
| US5700659A (en) | Polypeptide possessing protein disulfide isomerase activity gene encoding the same and process for producing the same | |
| McFARLAN et al. | Purification, characterization and revised amino acid sequence of a second thioredoxin from Corynebacterium nephridii | |
| de Lamotte-Guéry et al. | Structural and functional roles of a conserved proline residue in the alpha2 helix of Escherichia coli thioredoxin. | |
| Bürgisser et al. | Expression and characterization of recombinant human and rat liver 6‐pyruvoyl tetrahydropterin synthase: Modified cysteine residues inhibit the enzyme activity | |
| Sandberg et al. | Escherichia coli glutaredoxin: cloning and overexpression, thermodynamic stability of the oxidized and reduced forms, and report of an N-terminal extended species | |
| WO1995001425A1 (en) | Compositions comprising protein disulfide redox agents | |
| CN113061590A (zh) | 藻毒素降解酶及复合材料与应用 | |
| JPH05192163A (ja) | イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子 | |
| CA2240392C (en) | Multimer forms of interleukin-16 (il-16), process for the preparation and use thereof | |
| Iwakura et al. | Dihydrofolate reductase from Bacillus subtilis and its artificial derivatives: expression, purification, and characterization | |
| JPH06327489A (ja) | 遺伝子操作による生物活性β−ＮＧＦの生産方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |