HU202591B

HU202591B - Process for producing antibiotic bu-3420t and pharmaceutical composition comprising such antibiotic

Info

Publication number: HU202591B
Application number: HU893026A
Authority: HU
Inventors: Hiroaki Ohkuma; Masataka Konishi; Kiyoshi Matsumoto; Toshikazu Oki; Yutaka Hoshino
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1988-06-10
Filing date: 1989-06-09
Publication date: 1991-03-28
Also published as: ZA894393B; JPH02117676A; HUT52163A; KR900000482A; NO892328D0; EP0350623A2; IL90548A0; HU205932B; HU901778D0; NZ229460A; EP0350623A3; AU3633889A; HUT57774A; YU118589A; PT90806A; DK283489D0; IL90548A; DK283489A; MY104032A; PT90806B

Description

A találmány tárgya eljárás az új, baktériumellenes, gombaellenes és daganatgátló hatású (I) képletű BU-3420T antibiotikum, valamint e vegyületet hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására.

A BU-3420T szerkezetvizsgálata azt mutatta, hogy két konjugált helyzetű hármaskötést (konjugált „diin”-egységet) tartalmaz. E szokatlan szerkezeti egységet újabban fedezték fel az eszperamicinekben [J. Am. Chem. Soc. 109, 3462 (1987)] és a kalichemicinekben [J. Am. Chem. Soc. 109,3466 (1987)], amelyek rendkívül hatásos daganatgátló antibiotikumok. Ezeket az antibiotikumokat egy Actinomadura törzs (lásd a 4 675 187 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást), illetve egy Micromonospora törzs (Program and Abstracts of 26th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1986 szeptember, 227. kivonat) termeli.

Úgy vélik, hogy az eszperamicin A[, illetve A₂ azonos a 4 530 835 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közölt CL-15775A, illetve B antibiotikumokkal. Az eszperamicinek továbbá szerkezeti rokonságban vannak a 4 578 271 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban ismertetett WS-6049A, illetve B antibiotikumokkal. A CL-1577A vagy B egyik fragmentumát, amelyet CL-1577-B₄-nek jelölnek, a 4 661 353 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közölték; az eszperamicin Aj vagy A₂ fragmentumait - amelyek BBM-1675C és D jelöléssel láttak el - a 2 179 649 A számú publikált nagy-birtanniai szabadalmi bejelentésben ismertették.

A BU-3420T antibiotikum gombák, Gram-negatív, Gram-pozitív és anaerob baktériumok számos csoportjával szemben gátló hatású, emellett in vitro és in vivő daganatgátló hatást mutat, továbbá kiindulási anyagul szolgálhat a BU-3420T fokozott hatású, (II) képletű triacetátjának ecetsavanhidrides acetilezéssel történő előállítására. Ez utóbbi eljárás külön szabadalmi bejelentésünk tárgyát képezi.

A BU-3420T antibiotikumot úgy kapjuk, hogy egy BU-3420T-t termelő Micromonospora chersina törzset asszimilálható szén- és nitrogénforrást tartalmazó vizes tápközegben, merített kultúrában, aerob körülmények között addig tenyésztünk, amíg a mikroorganizmus a tenyésztőközegben lényeges mennyiségű BU-3420T-t termel, majd a BU-3420T-t a tenyésztőközegből elkülönítjük.

A találmány azoknak a gyógyászati készítményeknek az előállítására is vonatkozik, amelyek segítségével emlős gazdaegyedek baktériumos, gombás fertőzései vagy rákos daganatai kezelhetők. Ezek a gyógyászati készítmények a BU-3420T baktérium-, gomba- vagy daganatgátló hatású mennyiségét gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyaggal összekeverve tartalmazzák.

A találmány révén lehetővé válik gazdaállatok baktériumos vagy gombás fertőzéseinek kezelése, amely abban áll, hogy a gazdaállatnak BU-3420T vagy e vegyületet tartalmazó gyógyászati készítmények gombaellenes vagy antibakteriális hatású mennyiségét adagoljuk.

A találmány révén végül lehetővé válik daganatnövekedés gátlásának megvalósítását emlős gazdaállaton oly módon, hogy a gazdaállatnak a BU-3420T-t vagy e vegyületet tartalmazó gyógyászati készítmény daganatgátló hatású mennyiségét adagoljuk.

A rajz rövid magyarázata:

Az 1. ábra a BU-3420T (Kbr-ban felvett) infravörös elnyelési színképét mutatja.

A találmány szerint a BU-3420T antibiotikumot egy új BU-3420T termelő Micromonospora chersina törzs fermentációjával állítjuk elő. Az előnyösen termelő organizmus új Micromonospora chersina törzs, amelyet a továbbiakban Micromonospora chersina M956-1 törzsnek nevezünk. E törzset az indiai Gujarat államban gyűjtött talajmintából izoláltuk. Az M956-1 törzs biológiailag tiszta tenyészetét az American Type Culture Collection (ATCC) gyűjteményében (Washington, D. C.) helyeztük el, és ATCC 53710 sorszámmal vették fel a mikroorganizmusok állandó gyűjteményébe. Az M956-1 törzset főbb jellemzői alapján a Micromonospora nemzetségbe soroltuk; az M956-1 törzsön és rokon fajokon végzett összehasonlító vizsgálatok arra utalnak, hogy e törzs sajátságai a következők. Morfológiai jellemzők:

Az M956-1 törzs 0,5 pm méretű vegetatív micéliumot alkot, amely hosszú, erősen elágazó, nem fragmentált. Légmicélium nem alakul ki, azonban egyes közegekben alkalmilag kezdetleges léghifák figyelhetők meg. Az egyes spórák a vegetatív hifákon vannak. Pásztázó elektronmikroszkópos felvételek azt mutatják, hogy a spórák 1,2-1,8 pm méretű gömbök, amelyek nyeletlenek, vagy hosszabb-rövidebb monopodiális spóratartókon helyezkednek el, és nyalábokat képeznek. A spóratartó csúcsán párosán vagy hármasban elhelyezkedő, különálló spórát is megfigyelhetők. A spórák felületén rövid, tompa tüskék figyelhetők meg.

A tenyészet jellemzői:

Az M956-1 törzs szaporodása a 2. számú és 4. számú ISP közegben és a Bennett-agaron mérsékelt, míg bármely Czapek-féle szaccharóz-nitrát-agar táptalajon igen lassú, ugyanígy az 5. és 7. számú ISP közegekben is. A vegetatív micélium színtelen vagy halvány narancssárga, spóraképződés után halványszürkére vagy feketére változik. A 2. számú ISP közegben és a Bennettagarban sűrű spóratömeg képződik.

Melanoid, vagy más - felismerésre alkalmas - pigmentek nem termelődnek. Egy hónap elteltével 28 ’C hőmérsékleten, a Czapek-féle szaccharóz-nitrát-agaron és a 4. számú ISP közegben egy fluoreszkáló, sárga, diffundáló pigment képződik. Az M956-1 törzs tenyészeti jellemzőit az 1. táblázatban foglaltuk össze. Fiziológiai jellemzők:

Tenyésztési (szaporodási) hőmérséklettartománya 18 ’C-tól 49 ’C-ig terjed. 15 ’C-on és 50 ’C-on nem figyelhető meg szaporodás; a szaporodás optimálisan 37 ’C és 44 ’C között megy végbe. A zselatint elfolyósítja, a keményítőt hidrolizálja. 3%-os nátrium-klorid jelenlétében tolerancia (tűrőképesség) figyelhető meg, 4% nátrium-klorid esetében viszont tolerancia nem jelentkezik. Tirozináz-aktivitása negatív.

Az azonosításra alkalmas cukrokat a Pridham-Gottlieb-féle szervetlen közegben az alábbiak szerint hasznosítja: L-arabinózban, D-xilózban, szaccharózban, melibiózban, raffinózban és oldható keményítőben pozitív; glicerinben, D-arabinózban, D-ribózban, L-ramnózban, cellulózban, inozitban és D-mannitban negatív; laktózban és szalicilban jelentéktelen. A fenti szervetlen kö-23

HU 202 591 Β

1. táblázat

Az M956-1 törzs és a rokon Micromonospora globosa faj tenyészetének jellemzői

A közeg	*
Szaccharóz-nitrát-	G
-agar (Czapek-Dox-agar)	VM SL DP
Tripton-élesztőki-	G
vonat-agar	VM
(1. számú ISP)	SL DP
Élesztőkivonat-malá-	G
takivonat-agar (2. számú ISP)	VM SL DP
Zabliszt-agar	G
(3. számú ISP)	VM SL DP
Szervetlen sók/kemé-	G
nyítő/agar	VM
(4. számú ISP)	SL DP
Glicerin-aszpara-	G
gin-agar	VM
(5. számú ISP)	SL DP
Pepton-élesztőkivo-	G
nat-agar	VM
(5. számú ISP)	SL DP
Tirozin-agar	G
(7. számú ISP)	VM SL DP
Glükóz-aszparagin-	G
-agar	VM SL DP
Agar-táptalaj	G VM SL DP
Bennett-agar	G VM SL DP

Az M956-1 törzs

A Micromonospora globosa faj gyenge színtelentől halvány narancssárgáig (70) csekély; olajszürke (113) színtelen, később halványsárga (86) gyengétől mérsékeltig halvány narancssárga (70) gyér; szürkés-olajszínű (Ú0) szürkéssárga (90) kedvező színtelentől halványsárgáig (89) bőséges; olajfekete (114) mérsékelten olajbama (95) gyenge színtelentől halvány narancssárgáig (73) mérsékelt; sötét szürkés-sárgásbama (81) nincsen mérsékelt halvány narancsszínű (52) gyér, halvány barnásszürke (63) színtelen, később halványsárga (86) mérsékelt színtelen gyér; sötét olajbama (96) nincsen gyenge színtelen gyér; szürkés sárgásbarna (80) nincsen mérsékelt színtelen mérsékelt; olajfekete (114) nincsen csekély színtelentől halvány narancssárgáig (73) csekély; sötét szürkés-sárgásbama (81) nincsen gyenge színtelen nincsen halványsárga (89) mérsékelt mély narancssárga (69) bőséges; fekete nincsen mérsékelt halvány narancssárga (70) nincsen _s színtelen, később halvány narancssárga (70) mérsékelt mély narancssárga (72) nincsen nincsen mérsékelt mély narancsszínű (51) mérsékelt; szürkésbamától (61) mély-olajbamáig (96) nincsen gyenge színtelentől élénk narancssárgáig (66) mérsékelt; szürkés-sárgásbarna (80) nincsen mérsékelt erősen narancsszínű (50) nincsen színtelen, később élénksárga (86) mérsékelt színtelen gyér; sötét szürkés-sárgás-bama (81) nincsen gyenge mély-narancssárga (69) nincsen nincsen gyenge halvány narancssárga (73) gyér; szürkés-sárgásbarna (80) nincsen gyenge színtelentől halvány sárgásbarnáig (76) csekély; szürkés-sárgásbarna (80) nincsen mérsékelt mély-narancsszínű (51) nincsen halvány narancssárga (73) mérsékelt mély narancssárga (69) gyér; fekete nincsen

Megjegyzések a táblázathoz:

A megfigyeléseket 28 ’C-on 3 hétig tartó inkubálás során végeztük.

A zárójelbe tett szám a színre vonatkozik az ISC-NBC jelölés szerint. ♦Rövidítések: G = szaporodás; VM = a vegetatív micélium színe;

SL = spóraképződés; DP = diíTundáló pigment.

HU 202 591 Β zegben kapható eredményektől eltérően Luedemann-féle szerves közegben raffinózt nem hasznosít. Az a-galaktozidáz aktivitása pozitív, β-xilozidás és -mannozidáz aktivitása negatív. Az M956-1 törzs fiziológiai jellemzőit a 2. táblázatban foglaltuk össze.

2.táblázat ₍

Az M956-1 törzs fiziológiai jellemzői Hidrolízis:

Zselatiné Keményítőé A tej konjugálása Peptonizálás	+ +
Enzimtermelés
Nitrát-reduktáz	+,-*
Tirozináz	-
Tolerancia:
0,01 %-os lizozim	+
1-3% NaCl	+
4% NaCl	—
5,5-10,5 pH	+
Hőmérséklet
Szaporodási tartomány 18-49 ’C Optimális szaporodás 37-44 ’C
Nincsen szaporodás 15	’C-on és 50 ’C-on
Felhasználás:**	PG	LD
Glicerin	—	-
D-Arabinóz	—
L-Arabinóz	+	+
D-Xilóz	+	+
D-Ribóz
L-Ramnóz	—
D-Gal aktóz	+	+
D-Fruktóz	+	+
D-Mannóz	+	+
L-szorbóz	—	—
Szaccharóz	+	+
Laktóz	+	+
Cellobióz	+	+
Melibióz	+	+
Trchalóz	±	+
Raffinóz	+	-
D-Melezitóz	—
Oldható keményítő	+	+
Cellulóz	-	-
Dulcit	-	-
Inozit	—	-
D-Mannit	—	—
D-Szorbit	—	-
Szalicin	±	±
Enzimaktivitás:
a-Glükozidáz	+
β-Glükozidáz	+
a-Galaktozidás	+
β-Galaktozidáz	+
β-Xilozidáz	-
a-Mannozidáz	—

Megjegyzések a táblázathoz:

* A Czapek-féle szaccharóz-nitrát táplevesben pozitív, a pepton-nitrát táplevesben negatív ** Az alapközegek jelölése: PG = Pridham-Gottliebféle szervetlen közeg (9. számú ISP közeg); LD - Luedemann-féle élesztőkivonat-kalcíum-karbonát közeg

A sejt kémiája:

Az M956-1 törzs tisztított sejtfala mezo-diamino-pimelinsavat és glicint tartalmaz, 3-hidroxi-diamino-pimelinsavat nem tartalmaz. A teljes sejt-hidrolizátum és a tisztított sejtfal glükózt és mannózt könnyen kimutatható mennyiségben, a xilózt és arabinózt nyomokban tartalmazza. Ennek alapján a törzs sejtfala Q. típusú, teljes sejtcukortartalma D-típusú.

A sejt foszfolipidekként foszfatidil-glicerint, foszfatidil-inozitot és foszfatidil-etanol-aminokat tartalmaz, tehát P-II típusú. A tömegszínkép szerint fő menakinonjai az MK-9 (H4) és MK-10 (H4). A glikolát-próbája pozitív; ennek alapján a törzs a peptidoglikánban glikolil-muraminsavat tartalmaz.

Toxonómiai leírás:

Luedemann [Genus Micromonospora Orskov 1923, 846-855. old. a következő helyen: R. E. Buchanan és N. E. Gibbons (kiadók): Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8. kiadás; The Williams and Willkins Company, Baltimore (1974)], valamint Kawamoto és munkatársai [J. Bacteriol. 146, 527 (1981); valamint Agric. Bioi. Chem. 47, 203 (1983)] leírása szerint a Micormonospora nemzetség rendszerezése során az M956-1 törzs osztályozása szempontjából a következő jellemzők lényegesek:

1. Tompa, rövid, tüskés spóra; 2. a sejtfalban mezo-diamino-pimelinsav van jelen a 3-hidroxi-származék nélkül; 3. a sejtfalban glükóz és mannóz nagy mennyiségben, xilóz és arabinóz csak nyomokban található; 4. a vegetatív micélium színtelen, vagy színe halványsárgától enyhe sárgás-narancsszínig terjed, diagnosztikus értékű pigmentjei nincsenek; 5. a cukrok közül a melibióz és raffinóz felhasználása pozitív, a D-mannité, L-ramnózé, D-arabinózé és D-ribózé negatív; 6. a glükozidázok aktivitása: az α-galaktozidázé pozitív, a β-χϊlozidázé és α-mannozidázé negatív.

Az M956-1 törzsnek 23 Micromonospora-fajtól megkülönböztető jellemzőit a 3. táblázatban mutatjuk be. A spóraképződés utáni feketedésen kívül a legtöbb Micromonospora-fajt jellemzi a határozott intra- vagy extracelluláris pigmentálódás, amely minden egyes törzsben különböző kromogén vegyületekből áll. Ezzel szemben az M956-1 törzs, az M. globosa, M. inositola, M. aurantiaca és M. echinospora subsp. pallida csak enyhén sárgás-narancsszínű vegetatív micéliumot alkot, tehát nem kromogén típusú. A 4. táblázat mutatja, hogy a fenti 4 faj több jelentős eltérést mutat az M956-1 törzstől.

Az M. chalcea és az M956-1 törzs közös jellemzője, hogy nyalábos monopodiális spóratartója van, diagnosztikai jellegű pigmentje nincsen, fluoreszkáló sárga pigmentet képez, továbbá hasonló a cukorhasznosításuk és a sejtfalösszetételük. Az M. chalcea az M956-l-től mint termelő törzstől abban különböztethető meg, hogy spóráin a tüskék sokkal kisebbek, narancsvöröstől vörösbamáig terjedő színű vegetatív micéliumot képez,

HU 202 591 Β

Luedemann-közegben a raffinózt hasznosítja; a cellulózt lebontja, és 45 *C hőmérsékleten nem képes szaporodásra.

Mindezek alapján úgy tekintjük, hogy az M956-1 törzs a Micromonospora nemzetség új faja, és elnevezéseként a Micromonospora chersina sp. nov. nevet javasoljuk (a „chersina” a „khersinos” gí^ög szóból származik, amely „száraz vidéken élő”-t jelent és arra a szavannás vegetációra utal, ahol ez az organizmus honos).

3. táblázat

Az M956-1 törzs és 23 más Micromonospora-faj megkülönböztető jellemzői

Spóra tüske	DAP-	Xü.	Sejtfal¹¹¹ Arab.	Glu.	Főmena- kinon*²	Mel. Raf. Mtl hasznosítása*³
	izomer

M956-1 törzs	+	Mező	+	+	++++	MK9(H4) MKHXH4)	+	+ -
M. globosa	-	Mező	+	+	++++	MKHXH4)	+	+	-
M. fusca, M. Chalcea	-	Mező	++++	++	+-++++	MK10(H4)/ND
és melanosporea							+	+	-
M. carbonacea és	-	Mező és				MK9(H4)/
további 4 faj*⁴		3-	++++	++++	++-++++	MK10	+	+	-
		-hidroxi				(H4)
M.rosariaésM.	-	Mező	++++	+,++	++++,-	MK10(H4)/ND
inositola							+		+
M. coerulea	—	Mező	++++	++	-	ND	+	+	+
M. narashinoensis és	-	Mező	++++	++	-,++	MK10(H4,H6)
M. purpureochromogenes							+	+	-
M. echinospora és to-	+	3-	++++	++,++++		MK10(H4)/
további 8 faj*⁵		-hidroxi			—(-+++	MK10(H6)/	-	-	-

MK12(H4,

6,8)

Megjegyzések a táblázathoz:

¹¹ DAP = diamino-pimelinsav; Xil = xilóz; Arab. = arabinóz; Glu. = glükóz ^x2MK10(H4)/ND = egy vagy két fajban MK-10(H4) van jelen, egy továbbiról nincsenek adatok, MK9(H4)MK10(H4):MK-9(H4) vagy MK-10(H4) ’³Mel. = melibióz; Raf. = raffinóz; MŰ. = D-mannit ^x4M. megalomicea subsp. nigra, M. carbonacea subsp. aurantiaca, M. Halophytica subsp. nigra és M. parva ^x5M. echinospora subsp. ferruginea, M. echinospora subsp. paílida, M. purpurea, M. sagamiensis, M. grisea, M.

olivasterospora, M. zionensis és M. inyoenisis

4. táblázat

Négy micromonospora faj - amelyek színe szaporodásuk során az M956-1 törzséhez hasonló - megkülönböztetőjellemzői

Különbségek az M956-1 törzstől 50

M. globosa A spóra felülete durva; fő-menakinonja az MK-10(H4); a glikolátpróba negatív; a 2. számú ISP-közegben és agar-táptalajon a micélium 55 színe narancssárga; a laktózt hasznosítja; β-xilozidázra pozitív;

’C-on szaporodásra nem képes.

M. inositola Spórafelülete szemölcsös; sejtfalában mező- és 3-hidroxi-diamino-pimelin- 60 savat tartalmaz, a sejtfalban a xilóz nagy mennyiségben van jelen, glükóz nincsen. Micéliumának színe narancssárga; a D-mannitolt hasznosítja; szaporodási hőmérséklettartománya: 25-40 *C; β-xilozidázra pozitív.

M. aurantiaca A gyér spóraképződés következtében nicsen sötét színe; az L-ramnózt és D-mannitot hasznosítja; a cellulózt elbontja, 45 ’C-on szaporodásra nem képes.

M. echinospora Sejtfalában 3-hidroxi-diamino-pimesubsp. paílida linsavat és nagy mennyiségű xilózt tartalmaz; fő menakinonja az MK-12; cukorhasznosítási profilja különböző (a melibiózt és raffinózt nem hasznosítja, az L-ramnózt hasznosítja), ’C-on szaporodásra nem képes.

Nyilvánvaló, hogy a jelen találmány nem korlátozódik a fentiekben leül, különösen előnyös M956-1 törzsre, vagy a fenti leírásoknak teljes mértékben megfelelő organizmusokra. A találmány különösen vonatkozik más BU-3420T-t termelő variáns vagy mutáns törzsekre, amelyek a szokásos módon - például iöntgenbesugárzással, ibolyántúli besugárzással, nitrogén-mustárokkal

HU 202 591 Β való kezelés útján, fágokkal való kölcsönhatások útján -állíthatókelő.

BU-3420T előállítása

A találmány szerint a BU-3420T antibiotikumot a BU-3420T-t termelő Micromonospora chersina sp. nov. tenyésztésével, azaz a Micromonospora chersina M956-1 törzs (ATCC 53710), vagy annak valamilyen variánsa vagy mutánsa tenyésztésével, merített kultúrában, aerob körülmények között, vizes tápközegben állítjuk elő. A termelő organizmust asszimilálható szénforrást - például L-arabinózt, D-xilózt, szaccharózt, melibiózt, raffinózt vagy oldható keményítőt - tartalmazó tápközegben tenyésztjük. A tápközegnek asszimilálható nitrogénforrást - például hallisztet, peptont, szójalisztet, mogyorólisztet, gyapotmaglisztet vagy kukoricaáztató folyadékot - is kell tartalmaznia. A közegbe szervetlen tápsókat is adhatunk; ilyen sók lehetnek például a szokásos, nátrium-, kálium-, ammónium-, kalcium-, foszfát-, szulfát-, klorid-, bromid-, nitrát-, karbonát- és hasonló ionokat tartalmazó sók.

A BU-3420T bármely hőmérsékleten termelhető, amelyen az organizmus kielégítően szaporodik: 18 ’Ctól 49 ’C-ig terjedő hőmérséklettartományban; előnyösen körülbelül 28 *C hőmérsékleten dolgozunk.

A fermentációt lombikokban vagy különböző űrméretű laboratóriumi vagy ipari fermentorokban hajthatjuk végre. Ha a fermentációt tartályokban végezzük, akkor kívánatos egy vegetatív oltvány (inokulum) előállítása tápfolyadékban úgy, hogy a tenyésztőközeg kis térfogatát ferdeagaros vagy talajkultúrával vagy az organizmus liofilizált tenyészetével beoltjuk. Az így kapott aktív inokulumot aszeptikus körülmények között visszük át abba a fermentáló tartályba, ahol a BU-3420T nagy léptékű fermentációját végezzük. A vegetatív inokulum előállítására alkalmazott közeg lehet ugyanaz, mint amelyet a tartályban (tankban) alkalmazunk, vagy lehet attól különböző azzal a feltétellel, hogy abban az antibiotikumot termelő organizmus kedvezően szaporodik.

A BU-3420T optimális termelődését általában körülbelül 3-4 napos inkubálási időtartammal érhetjük el. Az antibiotikum termelődését a papírlemezes-agardiffúziós próbával ellenőrizhetjük, aminek során vizsgálati organizmusként (tesztorganizmusként) 8,0 pH-értéken Bacillus subtilis-t alkalmazunk.

A BU-3420T elkülönítése és tisztítása

A BU-3420T & fermentléből a szokásos elkülönítési és tisztítási eljárásokkal - például oldószeres extrakcióval és kromatográfiával - izolálható. Az alábbi 4 példában a BU-3420T lényegében tiszta formában történő előállítására előnyös elkülönítési és tisztítási eljárást írunk le.

A BU-3420T triacetátja úgy kapható, hogy a BU-3420T-t valamilyen acetilezőszerrel - például ecetsavanhidriddel közömbös (inért) szerves oldószerben acetilezzük.

A BU-3420Tfizikai-kémiai tulajdonságai

A BU-3420T kék színű, amorf, szilárd anyag, triacetátja narancsszínű tűs kristályokat alkot. A BU-3420T oldódik dimetil-szulfoxidban, dimetil-formamidban és dioxánban, kevéssé oldható kloroformban, etil-acetátban, metanolban és etanolban; vízben és n-hexánban oldhatatlan. Acetátja szerves oldószerekben, például kloroformban, metanolban és etanolban sokkal jobban oldódik. A BU-3420T összegképletét C₃₀H₁₉NO,-nek találtuk. Szerkezetét a mikroanalízisen kívül tömegszínképével, valamint a BU-3420T színképének összehasonlító elemzésével állapítottuk meg. A vegyület fizikai-kémiai adatait az 5. táblázatban összegeztük. A BU-3420T IR-színképe (lásd az 1. ábrát) 3420,3350,2930, 1660,1630,1587,1480,1385,1300,1280,1180 és 785 cnr'-nél elnyelési sávokat mutat. Az 1630 cm^-nél mutatkozó karbonil-sáv kinoncsoportra utal. A BU-3420T ‘H-NMR-színképe egy metilt (δ 1,25 ppm), egy OCH₃ot (3,79 ppm), három metint (3,55,4,78 és 5,04 ppm), két olefmes (6,05 és 6,07 ppm) és három aromás protont (7,62 x 2 és 8,03 ppm) mutat. D₂O hozzáadására két további proton δ 9,41 és 12,37 ppm) eltűnik.

5. táblázat

A BU-3420T fizikai-kémiai tulajdonságai

BU-3420T

Külleme:	kék, amorf por
op. (boml.)	208-210 *C
[a]£	+270 * (c = 0,01, DMF)
UVX_nm(e)	-
MeOH-ban:	240 (8300), 287 (váll), 395 (2600), 568 (4200), 597 (4100)
0,01 n Hcl +
MeOH-ban:	239 (8300), 284 (váll), 394 (4000), 563 (3600),600(3300)
0,01 nNaOH +
MeOH-ban:	216 (15500), 246 (23000), 274 (váll), 394 (3700), 597 (10200), 641 (10500)
Összegképlet:	C30H19NO9
Szekunder ion-
tömegspektrum:	M/z 538 (M+M)⁺

Vékonyréteg-kromatogramm: szilikagélen, xilol/metiletil-keton/metanol 5:5:1 térf./térf. arányú elegyével kifejlesztve a BU-3420T R_rértéke 0,40.

Szerkezetmeghatározás

A BU-3420T UV-színképe közömbös oldatban abszorpciós maximumot mutat 240,287,395,568 és 597 nm-nél. Az elnyelés és alkálikus oldatban mutatkozó eltolódás az ε-rodomicinon tulajdonságaihoz hasonlít [J. Antibiotics 33,1331 (1980); és J. Antibiotics 33. 1341 (1980)].

A BU-3420T antibiotikum biológiai hatása

A baktérium- és gombaellcnes hatások in vitro vizsgálata.

A BU-3420T egyes baktériumok elleni minimális gátló koncentrációit (rövidítve; MIC-értékeit) agar-sorozat-hígításos módszerrel határoztuk meg. Tápagart (Eiken) és GAM-agar-táptalajt (Nissui) alkalmaztunk az aerob, illetve anaerob baktériumok esetében. A 6. táblá-611

HU 202 591 Β zat mutatja a BU-3420T antibiotikum in vitro antibakteriális hatását kanamicin A-val és klindamicinnel összehasonlítva. Gram-pozitív aerob baktériumokkal szemben a BU-3420T antibiotikum igen erős hatást mutatott, míg Gram-negatív organizmusok valamivel kevésbé voltak érzékenyek e hatóanyaggal szemben. A találmány szerinti vegyület hatásosabb volt a klindamicinnél anaerob Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumokon. Egyes olyan baktériumok, amelyek kanamicinnel és klindamicinnel szemben ellenállók voltak, ezzel a találmány szerinti vegyűlettel szemben érzékenyeknek bizonyultak.

Az in vivő hatás és az akut toxicitás vizsgálata A BU-3420T in vivő hatását Staphylococcus aureus

Smith kórokozóval fertőzött egereken állapítottuk meg. Az egereket intraperitoneálisan fertőztük a kórokozó 5%-os, sertés-gyomomyálkával készült szuszpenziójával [ezt az American Laboratory cégtől (Omaha, Neb.) szereztük be], amelyet a halálos dózis százszorosában adagoltunk. A BU-3420T vegyületet intramuszkulárisan adagoltuk az egereknek közvetlenül a baktériumfertőzés előtt. Az egereket ezután 5 napon át figyeltük az 50%-os védőhatású dózis (PD_M érték) megállapítása céljából. A 7. táblázatból látható, hogy a BU-3420T kedvező in vivő hatást mutatott, PD^-értékét 0,13 mg/kg-nak találtuk. Egereknek intramuszkulárisan 5 mg/kg dózisban adagolva a BU-3420T semmiféle toxikus tünetet nem idézett elő.

6. táblázat

A BU-3420T aerob organizmusok elleni antibakteriális spektruma

Aerob organizmusok _MIC (gg/ml)_

BU-342CT Kanami- KlindacinA micin

Staphylococcus aureus

209 P	0,000013	0,2
Smith	0,000025	0,8
A2023*	0,000025	100
BX1633”	0,000025	0,8
Α15097=	0,000025	0,8

Staphylococcus epidermidis

D153	0,0000063	0,4
A22152*	0,00005	12,5
Enterococcus faecalis
A9612	0,0004	25
Micrococcus luteus
1001	0,0008	3,1
Bacillus subtilis
PCI-219	0,0000063	0,2
Escherichia coli
NIHJ	0,05	1,6
Juhi	0,05	6,3
A20665*	0,05	>100
A9624*	0,05	>100
A20341-l^b	0,2	6,3
Enterobacter cloacae
A9659	0,05	3,1

6. táblázat folytatása

Aerob organizmusok MIC (gg/ml)

BU-3420T Kanami- KlindacinA micin

Klebsiella pneumoniae

Dll 0,0063 ,0,4

A20680* 0,1 >100

Pseudomonasaeruginosa

A9930 0,025 25

Proteus vulgáris

A9436 0,0063 0,4

Proteus mirabilis

A9554 0,013 3,1

Morganella morganii

A9553 0,0063 3,1

Serratia marcescens A20222 0,1 6,3

Anaerob organizmusok

Clostridium difficile

Α2\6Ί5^Λ 0,0063 >100

Clostridium perfringens

A9635	0,025	0,025
Propionibacterium acnes
A21933	0,013	0,4
Peptostreptococcus anaerobius
A21905	0,1	0,4
Bacteroides fragilis
A22693	0,2	0,05
A22534^b	0,1	0,8

Megjegyzések a táblázathoz:

* Kanamicinnel szemben ellenálló ^b Ampicillinnel szemben ellenálló ^c Meticillinnel szemben ellenálló ^d Klindamicinnel szemben ellenálló

Az alábbi 7. táblázat a BU-3420T antibiotikum Staphylococcus aureus fertőzések elleni hatásosságát szemlélteti:

7. táblázat

A BU-3420T in vivő hatása egerek intraperitoneális Staphylococcus aureus Smith fertőzésére; a hatóanyagot intramuszkulárisan, egyszer adagoltuk
Dózis (mg/kg, i.m.)	Túlélők aránya a vizsgált állatokhoz viszonyítva
2,5	5/5
0,63	5/5
0,16	3/5
0,04	0/5
0,01	0/5

-713

HU 202 591 Β

A fenti adatok alapján a BU-3420T PD₅₀ értéke intramuszkuláris adagolás után 0,13 mg/kg.

A BU-3420T daganatgátló hatása

A BU-3420T antibiotikum in vitro mutatott citoxicitását több rágcsálótumoron és humán daganatsejttörzsön vizsgáltuk; in vivő daganatos egereken vizsgáltuk a daganatgátló hatást Összehasonlító vegyületként mind az in vitro, mind az in vivő kísérletekben mitomicin C-t alkalmaztunk. B16-F10 (rágcsáló melanóma), P388 (rágcsáló leukémia), P388/VCR (vinkrisztinnel szemben rezisztens P388) és Moser (emberi vastagbélvégbél-karcinóma) sejteket dúsított Éagle-féle minimál táptalajon, amelyet 10% borjúmagzatszérummal és 60 gg/ml kanamicinnel egészítettünk ki, a logaritmikus fázisig tenyésztettünk; a HCT-116 (emberi végbélkarcinóma) sejteket 10% borjúmagzatszérummal, 100 gg/ml penicillinnel és 100 gg/ml streptomicinnel kiegészített Maccoy-féle 5 A közegben tenyésztettük, majd a sejteket összegyűjtöttük, és 96- vagy 24-üreges szövetkultúra-lemezre oltottuk 1,5 χ 10⁵,1,2 χ 10⁴,2,5 χ 10⁵ és 3 χ 10⁵sejt/ml koncentrációban. A vizsgálandó hatóanyagokat a lemez üregeiben előzőleg helyeztük el. Ezután 37 ’C hőmérsékleten 72 órán át 95% levegőt és 5% széndioxidot tartalmazó, nedvesített atmoszférában inkubáltunk. A B16-F10, Moser és HCT-116 ellen mutatott citotoxikús hatást az élő sejteknek 0,006%-os neutrálvörös-oldattal történt megfestése után 540 nm hullámhosszon kolorimetriásan határoztuk meg. A p388 és P388/VCR sejtek ellen kifejtett citotoxikus hatást az élő sejtek számlálásával határoztuk meg. Eredményeinket a 8. táblázatban összegeztük. A BU-3420T mind a rágcsáló-tumor ellen, mind az emberi daganattörzs ellen jelentős citotoxikus hatást fejtett ki. Jóllehet az emberi daganatsejtek, a Moser és HCT-116 sejtek valamivel rezisztensebbnek adódtak a mitomicin C-vel szemben, mint a rágcsáló daganatsejtek (B16-F10), viszont 6-12-szer érzékenyebbeknek bizonyultak a BU-3420T hatásával szemben. A BU-3420T a vinkrisztinnel szemben érzékeny és ellenálló P388 sejtekkel szemben azonos citotoxikus hatást mutatott.

Meghatároztuk a BU-3420T gátló hatását makromolekulák (DNS, RNS és fehérje) szintézisére in vitro kísérletben. Tenyésztett L1210 sejteket (5 χ 10⁵ sejt/ml) BU-3420T-vel 37 ’C-on 15 percig előinkubáltunk. A tenyésztőelegyhez izotóposán jelzett prekurzort - ³H-timidint, ¹⁴C-uridint, vagy ³H-leucint - adtunk, és az inkubálást 60 percig folytattuk. Ezután mosást végeztünk hűtött 5%-os diklór-ecetsavval, majd a tumorsejtek savban oldhatatlan frakciójának radioaktivitását folyadékszcintillációs számlálóban határoztuk meg. Amint a 9. táblázatból látható, a BU-3420T a DNS-szintézist körülbelül 500-szor, illetve 100-szor erősebben gátolta, mint az RNS-, illetve fehérjeszintézist.

A BU-3420T antibiotikum daganatgátló hatását in vivő daganatos CDF, egereken állapítottuk meg. Nőstény CDF! egereket 0,5 ml 10%-os B16 melanóma-sejtpéppel intraperitoneálisan oltottunk. A vizsgálandó vegyületeket intraperitoneálisan adagoltuk az egereknek az alábbi kezelési rend szerint: az 1., 2. és 3. napon naponta egyszer (QD x 3); az 1., 5. és 9. napon naponta egyszer (Q4D x 3); és az 1-9. napon naponta egyszer (QD x 9). Amint a 10. táblázatból látható, a BU-3420T antibiotikum határozottan kedvezően hatott a P388 daganatsejtek gátlására széles dózishatárok között, bár T/C értéke alacsony szinten maradt, a maximális T/C érték 135%-nak adódott. A hatóanyag legalább 10-szer hatásosabb a mitomicin C-nél a minimális hatásos dózis alapján. A B16 daganatsejtek esetében a BU-3420T vegyület megközelítőleg azonos eredményeket adott a P388 sejtekkel szemben elért eredményeivel (11. táblázat).

8. táblázat

In vitro citotoxicitás rágcsáló és emberi daganatsejtekkel szemben

Vegyület	IC5o(pg/nil)
B16-F10 P388	P388/ /VCR	Moser	HCT-116
BU-3420T	0,0052	0,0004 0,0004	0,00085 0,00042
MitomicinC 0,5	ND	ND	1,2	0,8

’ND = nem vizsgáltuk

9. táblázat

A makromolekula-szintézis gátlása L1210 leukémiasejtekben

Vegyület	IC5o(gg/ml)
DNS	RNS	Fehéije
BU-3420T	0,018	9,2	1,5
Mitomicin C	1,7	>100	>100

70. táblázat

A P388 leukémiasejtekre kifejtett daganatgátló hatás intraperitoneális adagolás után (i.p.)

Vegyület	. *1 Dózis (mg/kg/ní	MST*²ip) (nap)	T/C (%)	Testtömegváltozás a 4. napon (g)
BU-3420T	1,0	13,5	135*³	-0,5
	0,5	13,0	130'³	0,0
	0,25	13,5	135*³	+0,8
	0,13	13,0	130*³	+0,8
	0,063	13,0	130*³	+0,3
	0,031	13,0	130*³	+1,0
Mitomicin C	3,0	20,0	200’³	-1,0
	1,0	13,5	135’³	+0,5
	0,3	14,0	140*³	+1,0
	0,1	11,5	115	+1,8
Vivőanyag	-	10,0	-	+2,4

QD x 3 i.p.

’² átlagos túlélési idő *³ szignifikáns daganatgátló hatás (T/C >125%).

77.táblázat

A B16 melanómasejtekre kifejtett daganatgátló hatás (i-P·)

Vegyület	Dózis¹ MST² (mg/kg/nap) (nap)	T/C (%)	Testtömeg változás a
			5. napon (g)

BU-3420T 1,0 21,5 159’³ -0,5

0,5 18,5 137*³ -0,5

-815

HU 201 591 Β

11. táblázat folytatása

Vegyület	_ , . »i Dózis (mg/kg/na	MST*²p) (nap)	T/C (%)	Testtömeg változás a 5. napon (g)
	0,25	18,5	137*³	+0,8
	0,13	16,5	122	+0,8
	0,063	19,0	14 P	+0,8
	0,031	16,5	122	+1,0
Mitomicin C	2,0	30,0	222^	+0,5
	1,0	20,5	152*³	+1,0
	0,5	18,0	133*³	0,0
	0,25	15,0	111	+0,8
Vivőanyag	-	13,5	—	+1,0

ⁿ QD x 9, i.p. a BU-3420T esetében;

Q4D x 3, i.p. a mitomicin C esetében ’² átlagos túlélési idő *³ szignifikáns daganatgátló hatás (T/C >125%).

Látható, hogy a BU-3420T antibiotikum erős antibakteriális hatással rendelkezik, tehát emlősök és más állatok ezen organizmusok által előidézett betegségének kezelésére alkalmasak. Ezen túlmenően e hatóanyag az antimikrobiális hatóanyagrác más, szokásos alkalmazási területein is felhasználható, például orvosi és fogorvosi eszközök fertőtlenítésére.

A daganatgátló hatás in vitro és in vivő vizsgálati eredményei arra utalnak, hogy a BU-3420T antibiotikum terápiásán alkalmazható emlős gazdaegyedek rosszindulatú daganatainak gátlására.

A találmány révén tehát lehetővé válik baktériumos vagy gombás fertőzésben szenvedő gazdaállat terápiás kezelése, ami abban áll, hogy e gazdaállatnak a BU3420T antibiotikum, illetőleg az ezt a vegyületet tartalmazó gyógyászati készítmény antibakteriális vagy gombaellenes hatás szempontjából hatásos mennyiségét adagoljuk.

A találmány révén lehetővé válik továbbá emlősök rosszindulatú daganatai növekedésének a gátlása, ami abban áll, hogy az emlős gazdaegyednek a BU-3420T antibiotikum, illetőleg az ezt a vegyületet tartalmazó gyógyászati készítmény daganatgátlás szempontjából hatásos mennyiségét adagoljuk.

A találmány révén lehetővé válik továbbá olyan gyógyászati készítmény előállítása, amely a BU-3420T antibiotikum antibakteriális vagy gombaellenes hatású mennyiségét közömbös, gyógyászati szempontból elfogadható vivő- vagy hígítószerrel együttesen tartalmazza.

Végül a találmány révén lehetővé válik olyan gyógyászati készítmény előállítása, amely a BU-3420T antibiotikum daganatgátló hatású mennyiségét közömbös, gyógyászati szempontból elfogadható vivő- vagy hígítószerrel együttesen tartalmazza.

A gyógyászati készítmények más antimikrobiális vagy daganatgátló hatású anyagokat is tartalmazhatnak, és bármely gyógyszerformában előállíthatók, amely a kívánt adagolási mód szempontjából megfelel. Ilyen készítmények például az orális adagolásra alkalmas szilárd készítmények, így a tabletták, kapszulák, pilulák, porok és szemcsék; az orális adagolásra alkalmas folyékony készítmények, igy az oldatok, szuszpenziók, szirupok és elixírek; valamint a parenterális adagolásra alkalmas készítmények, így a steril oldatok, szuszpenziók és emulziók A készítmények előállíthatók továbbá steril, szilárd formában is, amelyek közvetlenül felhasználás előtt steril vízben, fiziológiás konyhasóoldatban vagy más alkalmas steril, befecskendezhető közegben oldhatók.

Antimikrobiális célra a BU-3420T antibiotikumot, illetőleg az e hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítményt úgy adagoljuk, hogy a hatóanyag koncentrációja az adott, kezelést igénylő organizmusra vonatkozó legkisebb gátló koncentrációnál nagyobb legyen. Daganatgátló hatás esetében a BU-3420T antibiotikum optimális adagját és adagolási rendjét egy adott emlős gazdaegyed esetére a tapasztalt szakember könnyen meghatározhatja. Nyilvánvaló, hogy az alkalmazott hatóanyag adagja a kiszerelt készítménytől, az alkalmazás módjától és helyétől, valamint a kezelésre szoruló gazdaegyedtől és betegségtől függ. Ennek megítéléséhez számos olyan tényezőt kell figyelembe venni, amelyek a hatóanyag hatását módosítják, ilyenek: a kor, testsúly, nem, étrend, az adagolás ideje, az adagolás módja, a kiválasztás sebessége, a beteg állapota, gyógyszerkom binációk, esetleges érzékenységi reakciók és a betegség súlyossági foka.

A találmányt az alábbi, nem korlátozó jellegű példákban részletesen ismertetjük.

1. példa

BU-3420T előállítása fermentációval Fetdeagar tenyészetben jól szaporodó M956-1 Micromonospora törzset alkalmazunk 5 darab 500 ml térfogatú Erlenmeyer-lombik oltására, amelyekbe 1% laktózt, 3% oldható keményítőt (a Nichiden Kagaku cégtől szerezhető be), 1% hallisztet (a Hokuyo Suisan cégtől szerezhető be), 0,6% kalcium-szulfát-dihidiátot és 0,5% kalcium-karbonátot tartalmazó oltóközeget helyeztünk el, és a pH értékét sterilizálás előtt 7,0-ra állítjuk. A lombikokat 32 *C hőmérsékleten 7 napig 200 percenkénti fordulatszámú forgó rázóasztalon rázzuk, majd a lombikokból származó 500 ml alikvot tenyészetet 20 literes keverős fermentorba oltunk, amely 12 liter második oltóközeget tartalmaz. Ez az oltóközeg 1(5% oldható keményítőből, 0,5% glükózból, 1% cukorrépamelaszból, 1% hallisztből és 0,5% kalcium-karbonátból és desztillált vízből áll (pH értéke 7,0). A fermentációt 28 ‘C-on 92 órán át 250 fordulat/perc sebességű keveréssel, és percenként 12 literes levegőztetéssel végezzük. A második oltóközegből 2 litert egy 200 literes fermentortartályba viszünk át, amely 120 liter azonos összetételű közeget tartalmaz, mint a fentebb leírt második oltóközeg. A fermentációt 28 *C hőmérsékleten 73 órán át 250 fordulat/perc sebességű keveréssel, percenként 120 liter levegő bevezetésével végezzük. A fermentlében termelődött antibiotikumot nbutanollal extraháljuk, és papírlemez-agardiffúziós módszerrel, tesztorganizmusként Bacillus subtilis alkalmazásával (pH 8,0) vizsgáljuk. Az antibiotikum rendkívül lassan termelődik, maximális mennyisége 1 gg/ml marad.

-917

HU 202 591 Β

2. példa

BU-3420T elkülönítése és tisztítása Az összegyűjtött 220 liter térfogatú fermentlevet (lásd az 1. példát) 6 n sósavoldattal 2,0 pH-ra állítjuk, 80 liter n-butanolt adunk hozzá, és az elegyet 2 órán át keverjük, majd a keveréket szerves és vizes fázisra különítjük egy Sharpless centrifugával (a Kokusan cég 4A jelű gyártmánya). A 68 liter térfogatú szerves kivonatot azeotróposan betöményitjük vákuumban (alkalmaiig vizet adunk hozzá), s így 1 liter vizes koncentrátumot kapunk. A leülepedett csapadékot dekantálással elkülönítjük, 2 liter metanolban oldjuk, és a vizes sziklettel egyesítjük. Az egyesített oldatot Diaion HP-20 oszlopra töltjük (a Mitsubishi Kaséi cég gyártmánya, 010 x 65 cm), amelyet 70%-os vizes metanollal előkezelünk. Előbb 80%-os vizes metanollal mossuk, majd az aktív terméket 80%-os vizes acetonnal eluáljuk. Az eluátumot 120 ml-enként frakciókba gyűjtjük, és ezeket papírlemezen, tesztorganizmusként Bacillus subtilis PCI 219 alkalmazásával vizsgáljuk. Az aktív frakciókat összegyűjtjük, és vákuumban bepároljuk. így 62 g sötétbarna, olajszerű maradékot kapunk, amelyet Sephadex LH-20 oszlopon (04 x 40 cm) kifejlesztő oldószerként metanolt alkalmazva kromatografálunk. Az eluátumot egyrészt biológiai vizsgálattal (B. subtilis PCI 219), másrészt vékonyréteg-kromatográfiával (VRK-val) szilikagélen vizsgáljuk (kifejlesztőszerként xilol/metil-etil-keton/metanol 5:5:1 térf./térf. arányú elegyét alkalmazva az R_rérték 0,40); az aktív frakciókat vákuumban bepároljuk, s így 56 mg sötétkék, szilárd anyagot kapunk, amelyet preparatív vékonyréteg-kromatográfiával szilikagélen (Kieselgel 60 F^, Merck) tovább tisztítunk, a kromatogramm kifejlesztésére xilol/metil-etil-keton/metanol 5:5:1 térf./térf. arányú elegyét használjuk. A lemezről a 0,40 R_rértékkel jelentkező kék csíkot lekapaijuk, és dioxánnal extraháljuk. A kivonatot bepárolva, 5,7 mg egységes, kék színű BU-3420T terméket kapunk, melynek fizikai-kémiai tulajdonságai az előzőekben ismertetett adatoknak felelnek meg.

3. példa

A fermentációs eljárás előnyös kiviteli módja

A) Fermentáció rázólombikban Micromonospora chersina M956-1 törzset (ATCC

53710) kémcsövekben lévő, élesztőt és malátakivonatot tartalmazó agar-táptalajra viszünk. A közeg 1,0% malátakivonatot, 0,4% élesztőkivonatot, 0,4% dextrózt, 1,5% agar-agart és 0,15% kalcium-karbonátot tartalmaz desztillált vízben. A ferdeagar táptalajt az oltvánnyal együtt 2 hétig 28 *C hőmérsékleten inkubáljuk. Termelés céljára alkalmas inokulum előállítása céljából a ferdeagar-tenyészet felületi részét 500 ml-es Erlenmeyer-lombikba visszük át, amelybe 100 ml, 1,0% laktózt, 3,0% dextrint, 1,0% hallisztet, 0,5% kalcium-karbonátot, 0,6% réz-szulfátot és 1 mg/liter nátrium-jodidot tartalmazó desztillált vizes, steril közeget helyeztünk, a vegetatív tenyészetet 28 ’C-on 7 napig 250 fordulat/perc sebességű forgó-rázóasztalon inkubálunk. Az így kapott vegetatív tenyészetből (üledéke 8%, pH-értéke 7,5) 5 ml-t 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban lévő 100 ml termelőközegbe viszünk át, amely 1,5% keményítőt, 0,5% glükózt, 1,0% cukorrépa-melaszt, 1,0% hallisztet,

0,5% kalcium-karbonátot, 0,005% réz-szulfátot és 5 mg/liter nátrium-jodidot tartalmaz desztillált vízben. A termelőközeget 4-6 napon át 250 fordulat/perc sebességű forgó-rázóaszutalon inkubáljuk. így a HPLC-elemzés alapján 120-144 óra alatt 4,5-5,0 pg/ml antibiotikum termelődik.

B) Fermentáció tartályban ml fagyasztott, M956-1 (ATCC 53710) törzsből származó vegetatív tenyészetet használunk 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban lévő 100 ml olyan vegetatív közeg (a továbbiakban: VM-1) oltására, amely 1% laktózt, 3,0% dextrint, 1,0% hallisztet, 0,5% kalcium-karbonátot és 0,6% kalcium-szulfátot tartalmaz. A vegetatív közeget 5 napig 28 ’C-on 250 fordulat/perc sebességű forgórázóasztalon inkubáljuk. Az így kapott tenyészetből (10% üledék, pH-értéke 7,1) 25 ml-t 2 literes Vitro-edénybe viszünk át, amelybe 500 ml, 1,5% keményítőt, 0,5% glükózt, 1% cukorrépa-melaszt, 1% hallisztet és 0,5% kalcium-karbonátot desztillált vízben tartalmazó vegetatív közeget (a továbbiakban VM-2) helyeztünk. E vegetatív közeget 96 órán át 28 ’C-on 250 fordulat/perc sebességű forgó-rázóasztalon inkubáljuk. Az így kapott tenyészetet (üledéke 12%, pH-értéke 7,4) aszeptikusán egy New Brunswick Microgen fermentorba visszük át, amely 10 liter termelőközeget tartalmaz. A termelőközeg 1,0% keményítőből, 0,5% Pharmamedia-ból, 0,1% kalcium-karbonátból, 0,005% réz-szulfátból, 0,5 mg/liter nátrium-jodidból és desztillált vízből áll. A mikroorganizmust az alábbi paraméterek megtartásával tenyésztjük: a keverő fordulatszáma 250 fordulat/perc, a hőmérsékletet 30 ’C-ra szabályozzuk, és percenként 10 liter levegőt vezetünk be. Az antibiotikum termelése 96-110 óra után éri ei a maximumát, amely a HPLCelemzés alapján 2,8 pg/ml.

Egy másik kísérletünkben 5 ml fagyasztott, M956-1 (ATCC 53710) törzsből származó vegetatív tenyészetet oltunk Erlenmeyer-lombikban lévő 100 ml VM-1 vegetatív közegbe. E vegetatív közeget 28 ’C-on 5 napon át 250 fordulat/perc sebességű forgó-rázóasztalon inkubáljuk. Az így kapott tenyészetből (üledéke 10%, pH-értéke 7,1) 70 ml-t Vitro-edényben lévő 1400 ml VM-2 vegetatív közegbe viszünk át, és 28 ’C-on 96 órán át 250 fordulat/perc sebességű forgó-rázóasztalon inkubáljuk. Az így kapott vegetatív közeget aszeptikusán 50 liter névleges térfogatú Biolofitte fermentorban lévő 30 liter termelőközegbe visszük át, amely 1,5% keményítőt, 0,5% glükózt, 1,0% cukorrépa-melaszt, 1,0% hallisztet, 0,5% kalcium-karbonátot és 5 mg/liter nátrium-jodidot tartalmaz desztillált vízben. A habzás gátlására habzásgátló szert alkalmazunk. A mikroorganizmust az alábbi paraméterek megtartásával tenyésztjük: a keverő fordulatszámát 250 fordulat/percre, a hőmérsékletet 30 ’C-ra szabályozzuk és 10 literijére sebességgel levegőztetünk. Az antibiotikum termelése a HPLC-elemzés alapján 120-144 óra alatt érte el a 2,4 pg/ml maximális értéket.

4. példa

Az elkülönítés és tisztítás előnyös kiviteli módja

A BU-3420T antibiotikumnak a fermentléből történő kinyerésére és tisztítására lényegesen egyszerűsített eljárást dolgoztunk ki, amelyet a következő vázlattal szemléltetünk.

-1019

HU 202 591 Β

A tisztítás vázlata

Szűrlet

Fermentlé pH-értcke7,2

Extraháló oldószer: etil-acetát Dicalite-on szűrjük

Vizes

A fázisokat elkülönítjük szerves

A micéliumoKat elvetjük

Kormatográfia Dicalite-on

Hexán

B toluol metanol

Sephadex LH-20

1:1 kloroform/metanol elegy

25-40 frakciók

Folyadékkromatográfia vákuumban

Kloroform

2% metanol/kloroform

3% metanol/kloroform |

5% metanol/kloroform | Gyűjtjük BU-3420T

Módszerek és anyagok

Az összes oldószerek reagens-tisztaságúak voltak, és ezeket további tisztítás nélkül alkalmazzuk. Az etil-acetátot, hexánt, toluolt, metanolt és kloroformot a Fisher Scientific Company cégtől szereztük be ÁCS minőség- 5 ben. A tetrahidrofurán stabilizálószertől mentes, nagy tisztaságú oldószer (gyártója: American Burdick and Jackson Laboratories, Inc.). Víz céljára házilag ionmentesített vizet alkalmazunk, amelyet Bamstead Nanopure IID3700 Series töltetű ionmentesítő rendszeren vezet- 10 tünk át (így ASTM, CAP, NCCISI típusú, reagens-tisztaságú vizet kaptunk). Az ammónium-acetátot ACSHPLC reagens minőségben a Fisher Scientific Company cégtől szereztük be. A Dicalite a Grefco, Inc. cég (Torrance, Kalifornia) által előállított diatomaíöld. 15

Vékonyréteg-kromatogiáfia (VRK)

A VRK-vizsgálatokat szilikagéllel előre bevont GHLF lemezeken végezzük (előállítója az Analtech cég, méretük: 2,5 cm x 10 cm, a réteg vastagsága 0,25 mm). 20 A lemezeket 6,4 cm külső átmérőjű, 11,5 cm magasságú üveghengerekben fejlesztjük ki (gyártó: a Whatman,

Inc. cég). Az edényeket Whatman #4 minőségű szűrőpapírral béleljük, 10 ml, 1 rész metanolt és 9 rész kloroformot tartalmazó elegyet töltünk bele és a lemez behe- 25 lyezése előtt egyensúlyozzuk. A kifejlesztett lemezeket levegőn szárítjuk és permetező reagens alkalmazása nélkül, látható fényben vizsgáljuk.

Elemzés túlnyomásos (HPLC) folyadékkromatográfiával

Elemzés céljára HPLC-rendszerünket az alábbi komponensekből állítjuk össze: Waters Associates Model 6000A oldószeradagoló szivattyú; Hewlett-Packard 1040A HPLC detektorrendszer, amelynek alkatrészei: HP95B számítógép, HP9121 hajtótárcsa, 7470A kijelző és 2225A vékonysugaras kinyomtató; Water Associates Model U6K injektor; Q-BEX #10015 ODS (10 μ) oszlop (belső átmérője 4,6 mm, hosszúsága 30 cm). A komponenseket 1,6 mm külső átmérőjű, 0,23 mm belső átmérőjű rozsdamentes acélcsövekkel kötjük össze. Eluálószerként 55 rész 0,1 mólos ammónium-acetát oldat és 45 rész tetrahidrofurán elegyét alkalmazzuk, amelyet 2 ml/perc áramlási sebességgel szivattyúzzuk a rendszerbe.

A nyers A kivonat előállítása liter nyers fermentlevet, amelynek pH-értéke 7/2 (előállítását a 4. példában leírt általános eljárással végezzük) egyenlő térfogatú (35 liter) etil-acetáttal keverünk össze egy polipropilénből készült tartályban, és levegővel hajtott keverő alkalmazásával 2 órán át kever11

-1121

HU 202 591 Β jük. A szuszpenzióhoz 4 nagy merítókanálnyi (körülbelül 2 kg) Dicalite-t keverünk és az így kapott keveréket kosaras centrifugán szűrjük. A szűrletet az egymással nem elegyedő két fázisra hagyjuk elkülönülni, majd a fázisokat elválasztjuk. Az etil-acetátos fázist vákuumban forgóbepárló készülékben bepárolva 84,2 g sötétkékeszöld A maradékot kapunk.

Az A maradék kromatografálása Dicalite-on

84,2 g fenti A maradék, 200 ml kloroform és 100 g Dicalite összekeverésével 500 ml-es gömblombikban pépet készítünk. Alapos átkeverés után a pépet vákuumban forgóbepárlón szárazra pároljuk. Az így kapott maradékot száraz állapotban „flash” kromatográfiás oszlopra visszük (amelynek belső átmérője 4,1 cm, hossza 46 cm). Az eluálást 21 kPa nitrogénnyomással kezdjük, és a következő eluáló sorozatot alkalmazzuk: 3 liter hexán, 1 liter toluol és 1 liter metanol. A toluolos eluátumot forgóbepárlón vákuumban szárazra párolva 214,2 mg B maradékot kapunk.

A B maradék kromatografálása Sephadex LH-20-οη Spectrum Liquid chromatography típusú oszlopot (amelynek belső átmérője 2,5 cm, hossza 70 cm) 80 g Sephadex LH-20 géllel töltünk (előállítója a Pharmacia Fine Chemicals, N. J.), amelyet előzőleg 24 órán át 500 ml 1:1 térf./térf. arányú kloroform-metanol eleggyel duzzasztottunk. Az oszlopot az ágyra számítva háromszoros térfogatú eluálószerrel éjszakán át egyensúlyozzuk, utána a fenti B maradékot 10 ml 1:1 térf./térf. aranyú kloroform-metanol elegyben oldva az oszlop tetejére visszük, és az eluálást 1,5 ml/perc áramlási sebességgel, a mozgó fázissal kezdjük. 260 ml kezdeti előfrakció után 86, egyenként 10 ml térfogatú frakciót gyűjtünk. Minden egyes frakcióból 2-3 μΐ térfogatú alikvot részt VRK segítségével vizsgálunk. A 25-40. frakciókat összegyűjtjük és vákuumban bepároljuk. így 7,3 mg C maradékot kapunk.

A C maradék vákuumban végzett folyadékkromatográfiája

Zsugorított Büchner üvegszűrőt (Kontes Scientific Classware K-954100 Büchner tölcsér, átlagos pórusmérete 10-15 mikron, 15 ml térfogatú) 4 cm magasságig VRK-minőségű száraz szilikagéllel (Silica Gél 60, cat #7730, E. Merck, Darmstadt, NSZK) töltünk. Az adszorbenst a gravitáció hatása alatt enyhe kopogtatással ülepedni hagyjuk, majd vákuum alkalmazásával egyenletes, tömött, kemény masszát kapunk. A vákuumot megszüntetjük és az adszorbensre 30 ml kloroformot öntünk, majd ismét vákuumot adunk a rendszerre, és az oszlopot szárazra szívatjuk.

7,3 mg tömegű C maradékot kis mennyiségű szilikágélen előzetesen adszorbeálunk és egyenletes eloszlásban az oszlop tetejére visszük. Az eluálást enyhe vákuumban kezdjük, és az alábbi eluáló sorozatot alkalmazzuk: 500 ml kloroform, 200 ml, 2% metanolt tartalmazó kloroform, 200 ml, 3% metanolt tartalmazó kloroform, és 200 ml, 5% metanolt tartalmazó kloroform. A 2% metanolt tartalmazó és a 3% metanolt tartalmazó kloroformos frakciók a VRK-elemzés alapján egyetlen bíborvörös foltot adnak, amelynek Rfértéke 0,35. E frakciókat összegyűjtjük és vákuumban bepároljuk. így 1,3 mg BU-3420T antibiotikumot kapunk.

A BU-3420T fizikai és kémiai tulajdonságai A fentiek szerint izolált BU-3420T fizikai és színképi jellemzői az alábbiak:

Külleme: amorf, bíborszínű, szilárd Analízise vékonyréteg-kromatográfiával:

Oldószcrrcndszer R_rérték

Kloroform/metanol 9:1 0,35

Kloroform/metanol 5:1 0,54

Xilol/metil-etil-keton/metanol 5:5:1 0,53

UV színképe: Hivatkozási szám: 8727115

Hewlett Packard 8452A Diódé Array spektrofotométer Koncentráció: 1,25 x 1O³ g/100 ml Oldószer metanol λ™ (EJ* Semleges 597 nm 112

568 nm 118 395 nm 64 285 nm váll 238 nm 342

A HPLC-elemzés:

Mozgó fázis Retenciós idő

55% 0,1%-os ammónium-acetát oldatot és 45% tetrahidrofuránt tartalmazó elegy 5,4 perc

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás az (I) képletű BU-3420T antibiotikum előállítására, azzaljellemezve, hogy a Micromonospora chersina ATCC 53710 törzset, vagy annak valamely variánsát vagy mutánsát asszimilálható szén- és nitrogénforrást tartalmazó vizes tápközegben, merített kultúrában, aerob körülmények között tenyésztjük majd a BU-3420T-t a tenyésztőközegből elkülönítjük.
2. Eljárás antibakteriális, gombaellenes és daganatgátló hatású gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított (I) képletű BU-3420T antibiotikumot a gyógyszerkészítésben szokásos hígító-, vivő- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítjuk.