HU201805B - Process for producing uk-61689 antibiotic in microbiological way as well as pharmaceutical preparations containing the agent - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás az új UK-61689 antibiotikum mikrobiológiai úton történő előállítására. Ezt a kokddiumos fertőzés elleni, policiklusos savas étert eddig csak kémiailag lehetett előállítani. Közelebbről meghatározva, a találmány tárgya eljárás az UK-61689 antibiotikum germentatív úton történő előállítására Actinomadura roserufa ATCC 53 666 törzzsel, illetve Actinomadura roseorufa ATCC 53 665, ATCC 53 664 és ATCC 53 674 mutánstörzsekkeL

Az Ep-0169011 számú európai szabadalmi bejelentés (közzétével 1986. január 22-én) leírja az UK58852 antibiotikumot. Ezt a policiklusos étert Actionomadura rosoerufa Huang. sp. nov., ATCC 39 697 törzs süllyesztett aerob tenyészetével állítják elő vizes tápközegben.

Az UK-61689 monoglikon policiklusos savas étert az (I) képlet jellemzi.

Előállítását a 255 335 számú európai nyilvánosságrahozatali irat (1982.02.03.) ismertet a (Π) általános képletű UK-58852 diglikon policiklusos éter (R, R¹=H) szelektív savas hidrolizisével. Az említett szabadalmi bejelentésben leírt eljárás szerint az UK-58852 nátriumsóját ekvivalens mennyiségű ptuolulszulfonsawal hidrolizálják acetonitril/víz elegyében szobahőmérsékleten.

Magának az UK-58852-nek, ennek a különösen kokddium ellenes, hatékony antibiotikumnak az előállítását az EP-169011 számú európai szabadalom (közzétéve 1986. január 22-én) írja le. Ezt az antibiotikumot az Actinomadura roseorufa Huang sp. nov. ATCC 39 697 süllyesztett aerob tenyészetével állítják elő vizes táptalajhoz. Az UK-58852 mellett két rokonszerkezetű minor komponens is keletkezik, melyek kokddiozissal szemben hatásos antibiotikumnak bizonyultak. A két minor komponens: a (Π) általános képletű CP-70228, ahol R jelentése hidrogénatom és R¹ jelentése metilcsoport; illetve a CP-70828, ahol R és R¹ jelentése egyaránt metilcsoport

A találmány tárgya az UK-61689 antibiotikum mikrobiális előállítására, mely abból áll, hogy az Actinomadura roseorufa ATCC 53 664, 53665, 53674 vagy 53 666 törzset vizes táptalajon tenyésztjük, előnyösen süllyesztett tenyészetben, aerob körülmények között Az UK-61689 hatásos kokcidium ellenes antibiotikum, kémiai szerkezetét illetően policiklusos savas éter. Különösen jelentősek az Actinomadura roseorufa ATCC 53 666 törzsből származó ATCC53 674, és az ATCC 53 665 mutánsok, melyek a61689 antibiotikum mellett UK-58852 antibiotikumot is termelnek, illetve az ATCC 53 665 egyik mutánsa, az Actinomadura roseorufa ATCC53 664 törzs, mely lényegében UK-58852-től mentes UK-61689 antibiotikumot termel.

Az UK-61689-et és az UK-58852-t termelő mikroorganizmusokat az Actionomadura roseorufa FD-27684 (ATCC 53. 666) új törzs mutációjával nyertük, melyet Yamae VÚlage-i (Kamamato, Japán) talajmintából izoláltak. Mutagén anyagként N-metil-N’-nitro-guanidint (NTG) használtunk. A kezelt mikroorganizmusok különálló telepeit vizsgáltuk meg az UK-61689 antibitoikum-termelés szempontjából. Az eljárás abból áll, hogy az ATCC 53 666 törzset süllyesztett tenyészetként vizes táp2 talajban tenyésztjük aerob körülmények között, 28 ’C hőmérsékleten rázatva. Kinövesztéshez bármilyen alkalmas táptalajt használhatunk. A táptalaj elkészítésénél 1 liter vízhez adunk 10,0 g cerelóz-t, 5,0 g kukoricakeményítőt, 5,0 g kukoricalekvárt, 5,0 g NZ Amine YTT készítményt (enzimatikusan emésztett kazein, Humko Sheffield Chemical Co., Inc.) és 0,002 g kobalt-kloridot, nátrium-hidroxiddal a táptalaj kémhatását pH = 7,0 értékre állítjuk be, és 800 milliliterenként Fembahc edényekbe mérjük szét. Autoklávban történő sterilizálás után az edényeket ferdeagaros tenyészet szuszpenziójával vagy fogyasztva tárolt vegetatív micéliummal oltjuk be és 28 ’C hőmérsékleten rázatjuk 200 fordulattal percenként 8 napon át. 50 ml kivétet teflon szövethomogenizátorban elhomogenizálunk, majd ultrahanggal fragmentálunk. A fragmentált micéliumot centrifugáljuk, a tápközegtől mentesre mossuk és 300 ml-es Erlenmeyer lombikban 50 ml friss táptalajban szuszpendáljuk. A sejtszusZpenziót rázatással 32 ’C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át, majd a sejteket ismét lecentrifugáljuk és 50 ml trisz(hidroxi-metil)-amino-metán/maleát pufferben, pH = 9,0, szuszpendáljuk. A szuszpenzió megfelelő kivett mennyiségét 750-1500 mcg/ml NTGvel kezeljük egy órán át 34 ’C hőmérséldetű vízfürdőben rázatva percenként 250-300 fordulatszámmal. A mutagén kezelés után a sejteket centrifugáljuk, steril vízzel a mutagenizáló szertől mentesre mossuk, és friss táptalajt tartalmazó lombikban növesztjük 32 ’C hőmérsékleten rázatva percenként 200 fordulatszám mellett. Három napos tenyésztés után a tenyészlevet homogenizáljuk és ultrahangos kezelésnek vetjük alá, majd egy kivéttel hígítási sorzatot készítünk, amit szilárd táptalajokra kenünk ki. A lemezeket 28 ’C hőmérsékleten inkubáljuk, amíg a különálló telepek megfelelő nagyságot nem érnek el ahhoz, hogy ferdeagarra vigyük át őket. A lemezeket és a ferdeagart ATCC 172 számú táptalajból készítjük, mely literenként 1,0 g N-Z Amin Type A komponenst (Humko Sheffiel Chemical Co., Inc.) tartalmaz. A ferdeagarral oltott tenyészetet 28 ’C hőmérsékleten növesztjük ki. 1014 nap elteltével a tenyészetek vizsgálatra készek. Ehhez 300 milliliteres Erlenmeyer lombikokban levő 25 ml táptalajt oltunk be. Alkalmas például az alábbi összetételű táptalaj: 1 liter vízben 45,0 g cerelóz, 10,0 g szöjaliszt, 15,0 g kukoricalekvár, 0,1 g mangán-szulfát-víz, 0,1 g magnézium-szulfát-7víz, 0,002g kobalt-klorid és 3,0 g kalcium-karbonát; a táptalaj kémhatását pH=7,0-re állítjuk be. A táptalajokat 30 percen át 121 ’C hőmérsékleten autoklávozva sterilizáljuk, majd az egyes ferdeagar tenyészetekről készült szuszpenzióval oltjuk be, és New Brunswick rázógépen rázatjuk 7 napon át 28 ’C hőmérsékleten. Az FD-28454 mutánst (ATCC 53 674) úgy detektáltuk, hogy a teljes tenyészet metil-izobutil-keton extraktumát vékonyrétegkromatográfiával vizsgáltuk. A szilikagél lemezen kifejlesztett kromatogramot vanillines reagenssel permetezzük le, és 5 percen át 100 ’C hőmérsékleten tartjuk. Az eluens 9 rész kloroformot és 1 rész metanolt tartalmaz. Rf értékek: UK-61689:0,3 körüli; UK-58852: 0,65 körüli. Az (gy kapott mutáns tenyészete UK-61689 és UK-58852 keverékét ter-2HU 201805 Β meli, a két antibiotikum aránya a tenyésztési körülményektől függően valamennyire változik. Az így kapott mutáns morfológiai tulajdonságai és tenyészetének jellemzői lényegében az itt leírt A.roseorufa ATCC 53 666 törzs tulajdonságaival azonosak. A mutáns megkülönböztető tulajdonsága, hogy olyan UK-61689 és UK-58852 keveréket képes termelni, melyben az UK-61689 a főtermék. A mutáns tenyésztésére és az UK-61689 antibiotikum kinyerésére lényegében olyan körülményeket használunk, melyeket előzőleg a poliéter típusú antibiotikumot termelő tenyészeteknél már alkalmaztak. Példaként említhetjük a 4361649 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmat. A tenyésztést előnyösen vizes süllyesztett táptalajban végezzük aerob körülmények között 24-36 ’C hőmérsékleten kevertetve. A tényészethez használt táptalaj asszimilálható szénforrást - például cukorokat, keményítőt vagy glicerint - és szerves nitrogénforrást például kazeint, enzimmel emésztett kazeint, szójadarát, gyapotmag-darát, földimogyoró-darát, búza síkért, szójalisztet vagy hallisztet - tartalmaz. Előnyös növekedési anyagokat - például gabonakivonatot, hallisztet, gyapormag-darát, élesztőkivonatot, stb. - és ásványi sókat - például nátrium-kloridot, kalcium-karbonátot -, valamint nyomelemeket - például vas-, magnézium-, réz-, cink-, kobalt- és mangánsókat - is alkalmazni. Ha a fermentáció alatt túlzott habzás lépne fel, habzásgátlóként például növényi olajakat vagy szilikonokat adhatunk a tenyészethez. A süllyesztett tenyészet levegőztetéséhez előnyös, ha percenként a fermentlé térfogatának 0,5-2-szeresét kitevő steril levegőt buborékoltatunk át a fermentleven. A kevertetéshez a szokásosan alkalmazott keverőket használhatjuk. A kevertetés sebessége az alkalmazott keverő típusától függ. Rázott lombiknál a kevertetés általában percenkénti 150-300 fordulatszámmal történik, fermentornál a percenkénti fordulatszám rendszerint 300-1700. Az átoltásoknál és a kinövesztés alatt természetesen aszeptikus körülményeket kell biztosítani.

Az antibiotikum-termeléshez szükséges oltóanyagot a ferdeagaron kinövesztett tenyészetből vagy a tenyészetből vagy tenyészet megnedvesített micéliumszuszpenziójával beoltott, Roux edényben készített kultúrákból nyeljük. A szilárd táptalahoz vagy a Roux edényben való tenyésztéshez ATCC 172 tápközeget használunk. A mutációs eljárásnál előzőekben említett folyékony táptalaj alkalmas a vegetatív micéliumok kinövesztéséhez, melyeket aztán majd lefagyasztunk. A tenyészettel rázott lombikot vagy inokulum-edényt olthatunk be; az anokulum-edény beoltható a rázott lombikról is. A rázott lombikokban a maximális növekedést rendszerint 4-8 nap alatt étjük el, míg süllyesztett inokulum-edényekben a legkedvezőbb idő általában 4-5 nap.

A fermentáció alatt az antibiotikum-termelést vékonyrétegkromatográfiával követjük nyomon. A kromatogram kvalitatív kiértékeléséhez a lemezt vanillines reagenssel permetezzük le, amint azt az előzőekben már ismertettük. Eljárhatunk úgy is, hogy a kifejlesztett kromatogram Bacilus subtilis tesztorganizmust tartalmazó agy-szívkivonatos agart rétegezőnk, és 16 órás 37 ’C hőmérsékleten történő inkubálás után vizuálisan értékeljük az antibiotikumok jelenlétét. A vékonyrétegkromatográfiás analízist felhasználhatjuk a fermentléből nyert nyers vagy tisztított termék minősítésére is. A fermentlé UK-61689 termékének és UK 58 852 melléktermékének mennyiségi meghatározására HPLC módszert használunk. A kromatografálást ez esetben egy 10 cmx4,6 mm méretű „mikrobore” C-18 oszlopon végezzük, eluensként 0,01M anunónium-karbonát/acetonitril/metil-alkohol 40:200:760 arányú elegyét használva. A detektálás törésmutató-detektor segítségével történik.

Az itt leírt mutánsok által termelt UK 61 689 antibiotikum a micéliumban és a tápfolyadékban halmozódik fel vagyis a szüretien teljes fermentlé extrahálásával nyerhető ki. Az extraháláshoz használt szerves oldószer lehet péládul kloroform, etilacetát, metil-izobutil-keton vagy butil-alkohol. Az extrahálást előnyös semleges kémhatásnál végezni. Hogy az emulzióképződés okozta nehézségeket elkerüljük, eljárhatunk úgy is, hogy a micéliumot előzetesen elválasztjuk, majd a micéliumot és a micéliummentes fermentlevet külön-külön extraháljuk szerves oldószerrel. Az extraktumot bepároljuk, és a betöményített oldatot kromatografáljuk.

Az antibiotikum kinyerésére az alábbiakban egy konkrét tipikus példát adunk meg: A mutáns teljes fermentlevét metil-izobutil-ketonnal extrabáljuk. Csökkentett nyomáson bepárolva az extraktumot vöröses olajat kapunk. Ezt etil-acetátban oldjuk, és szilikagéloszlopra visszük. Az oszlopra vitt anyagot etil-acetáttal eluáljuk, az eluátumot vékonyrétegkromatográfiával analizáljuk. Az UK-61689 antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük és szárazra pároljuk. A kapott terméket diizopropil-éterben kristályosítva tisztítjuk az antibiotikumot.

Az antibiotikumot kinyerhetjük a micéliumhoz kötve, ha a teljes fermentlevet bepároljuk, például porlasztásos szárítással; vagy a micéliumot szűréssel vagy centrifugálissal elválasztva, a hozzákötött és a köztitérben magával vitt antibiotikumhoz juthatunk hozzá.

A fent elírt FE-28454 (ATCC 53 674) mutánsát, az egy-telep izolátum FD-28454 előállításánál ismertetett módon. Az eljárás során egy további mutáns, az FD-28499 (ATCC 53664) jelű keletkezett, mely az Actinomadura roseorufa ATCC 53 666 és természetesen az először keletkezett mutáns morfológiái tulajdonságait és tenyészetének jellemzőit mutatja. Az FD-28499 mutáns azonban különbözik az FD-28454 és FD-28474 mutánsoktól, amennyiben az UK-58852 antibiotikumtól csaknem mentes (maximum 1%) UK-61689 antibiotikumot termek Az FD-28499 mutánst hasonló módon tenyésztjük, mint az először leírt FD-28454 mutánst, és az UK61689 antibiotikumot az előzőekben leírt módon nyerjük ki.

Ez utóbbi mutánst, mely a Pfizer Inc. törzsgyűjteményében FD-28499 azonosító jellel szerepel az FD-28454 és FD-28474 mutánsokat, valamint a kiindulási FD-27684 mikroorganizmust a Budapesti Egyezmény feltételei között letétbe helyeztük az Amerikai Törzsgyűjteményben (American Typre Culture Collection, Rockville, Maryland, USA).

-3HU 201805 Β

Az említett törzsek Actinomadura roseorufa 53 664, ATCC 53 674, ATCC 53 665, illetve ATCC 53 666 azonosító jelöléseket kapták.

Az FD-27684, FD-28474 és FD 28499 törzsek rendszertani meghatározását L.H.Huang végezte az alábbiak szerint:

A ferde agárról a törzseket ATCC 172 táptalajra oltjuk és négy napon át 28 ’C hőmérsékleten rázatjuk. 20 percen centrifugálás után a sejteket steril desztillált vízzel mossuk háromszor, majd az Ac tinomycetes-ek meghatározására általánosan használt táptalajokra oltunk.

A tenyészeteket 28 ’C hőmérsékleten növesztjük ki, és az értékelést különböző idő elteltével, leginkább 14 nap múlva végezzük. A színek megnevezésére az általánosan használt terminológiát használjuk, de pontosabb a színmeghatározás, ha a Color Harmony Manual (negyedik kiadás) színskálájával való összehasonlításra támaszkodunk. A teljes-sejt aminosav analízise Becker és munkatársai módszerével történik [Appl. Microbiol., 12: 421-423 (1964)]. A teljes-sejt cukrait Lechevalier eljárásával [J.Lab.Clin. Med., 71: 934-944 (1968)] és Staneck és Roberts módszerével [AppLMicrobiol. 28: 226-231 (1974)] határozzuk meg. Összehasonlítási mikroorganizmusként az Actinomadura roseorufa ATCC 39 697 törzset használták.

A tenyészetek tulajdonságainak meghatározásaihoz az alábbi táptalajokat és módszereket használjuk:

1. ) Tripton/élesztőkivonatos táptalaj (ISP1 közeg, Difco);

2. ) Élesztőkivonat/malátakivonatos agar (ISP2 tápközeg, Difco);

3. ) Zablisztes agar (ISP3 tápközeg, Difco);

4. ) Szervetlen só/keményítős agar (ISP4 tápközeg, Difco);

5. ) Glicerin/aszparaginos agar (ISP5 tápközeg, Difco);

6. ) Pepton/élesztőkivonat/vasas gar (ISP6 tápközeg, Difco);

7. ) Szacharózos Czapek agar - S.A. Walksman, the Actinomycetes, 2. kötet; 1. tápközeg; 328. oldal, 1961:

8. ) Glükóz/aszparaginsav agar - A.A. Waksman, The Actinomycetes, 2. kötet. 2. tápközeg, 328. old;

9. ) Bennett-féle agar - SA.. Waksman, idézett mű, 30. tápközeg; 331. oldal;

10. ) Emerson-féle agar - S A. Waksman, idézett mű, 28. tápközeg; 331. oldal;

11. ) Nutrient agar - S A. Waksman, idézett mű, 14. tápközeg, 330. oldal;

12. ) Gordon és Smith-féle tirozinos agar - R.E. Gordon és M.M.Smith, J. Bacteriol., 69: 147-150 (1955);

13. ) Kazeines agar - R.E. Gordon, idézett cikk;

14. ) Kalcium-malátos agar - S.A. Waksman, Bacteriol. Rec., 21:1-29 (1957(;

15. ) Zselatin - R.e.Gordon és J.M. Mihm, J. Bacteriol., 73:15-27 (1957);

16. ) Keményítő - R.E.Gordon és J.M.Mihm, idézett cikk;

17. ) Szerves nitrátos táptalaj - R.E.Gordon és J.M.Mihm. idézett cikk;

18. ) Dextróz/nitrátos táptalaj - SA.Waksman, idézett mű, 1. táptalaj, melyben 3 g dextröz szerepel a 30 g szacharóz helyett és az agart elhagyjuk;

19. ) Burgonya/sárgarépás agar - M.P.Lechevalier, ILab.and ClinicalMed., 71:934-944 (1968), de a következő módosítással: 30 g burgonya, 2,5 g sárgarépa és 20 g agar.

20. ) 2%-os csapvizes agar;

21. ) Ganze-féle 1. számú ásványisós agar G.F.Gauze és munkatársai, Problems in the classifivation of antagonistic Actinomycetes (angol kiadás), 13. oldal (1957);

22. ) Gauze-féle 2. számú szerves komponensű agar - G.F.Gauze, idézett mű;

23. ) Lefölözött tej - Difco;

24. ) Cellulózhasznosítás:

a) H.LJensen, Proc.Linn.Soc.N.S.W. 55: 231248 (1930);

b) M.Levin és H.W.Schoenlein, A compilation of culture média, 2511. számú táptalaj, (1930);

25. ) Szerves savak hasznosítása - R.E.Gordon és munkatársai, INt.J.Syst.Bacteriol., 24: 54-63 (1974);

26. ) Savtermelés szénhidrátokból-R.E.Gordon és munkatársai (1974), idézett cikk;

27. ) Hippurát és eszkulin hidrolízise -R.E.Gordon és munkatársai (1974); idézett cikk;

28. ) Adenin, hipoxantin, xantin és karbamid lebontása - R:E.Gordon és munkatársai (1974), idézett cikk;

29. ) Lizozim-rezisztencia - R.E.Gordon és munkatársai (1974), idézett cikk;

30. ) Szénhidráthasznosítás - C-2 táptalaj, H. Nonomura és Y.Ohara, J.Ferment. Technoi., 49:887894(1971);

31. ) Hőmérsékleti igény-ATCC Culture collection catalogue 15. kiadás, 608. oldal (1982), ATCC 172 táptalaj.

Az FD-27684 (ATCC 53666) törzs tenyészetek leírása:

Élesztőkivonat/malátakivonatos agáron - jó növekedés, vöröses rózsaszíntől vörösig (6 l/2ia, 7ia, 6ia); kiemelkedő, ráncos telep fehér légmicélumokkal; fonák oldal vörös (7ia); oldható festékanyag nincs.

Zablisztes agaron - mérsékelt növekedés, krémszínű (2ca), gyengén kiemelkedő, sima, különálló telepek; légmicéliumok nincsenek vagy elszórtan, fehérek; fonák oldal krémszínű (2ca); oldható színanyag nincs.

Szervetlen só/keményítős agar - a növekedés gyenge vagy mérsékelt, színtelentől krémszínűig (2ca), vékony, sima telep; légmicélium nincs vagy csak elszórtan, fehér; fonák oldal olyan, mint a felszíni; oldható színanyag nincs.

Glicerin/aszparaginos agaron - a növekedés gyenge vagy mérsékelt, krémszínű (2ca) telep rózsaszínű-vörös pontokkal (6ea, 6 l/2gal); légmicéllium nincs vagy csak elszórtan, fehér; fonál oldal színtelentől krémszínűig (2ca), vörös pontokkal; oldható festékanyag nincs.

Szacharózos Czapek-féle táptalajon - a növekedés gyenge vagy mérsékelt, krémszínű rózsaszín vörös pontokkal (5ea, 6 l/2ia); légmicélium nincs vagy csak elszórtan, fehér; fonák oldal színtelen vagy krémszínű (2ca); oldható anyag nincs.

-4HU 201805 Β

Glükóz/aszparaginos agaron - a növekedés mérsékelt vagy jó; a telepek színe rózsaszíntől vörösig (6 1/2 ga, 6 l/2na), kiemelkedők, sima, szemcsés vagy ráncos felszínű; a légmicéliumok fehértől fakó rózsaszínig (6ea); a fonák oldal vörös (6 l/2ga, 6 l/2ia); halvány sárga (3ca) oldható festékanyag.

Gordon és Smith-féle tirozinos agaron - jó vagy mérsékelt növekedés, a telepek színe rózsaszínes narancs (5ea), mérsékelten kiemelkedők, ráncosak; légmicélium nincs vagy csak elszórtan, fehér; a fonák oldal olyan, mint a felszíni; sárga (21c) színű oldható színanyag.

Kalcium-malátos agaron - nagyon gyenge növekedés, színtelen, vékony, sima telepek; légmicélium nincs; fonák oldal színtelen; oldható színanyag nincs.

Kazeines agaron - jó vagy mérsékelt növekedés; telepek színe rózsaszínes narancstól narancs színűig (4ia, 5ia), mérsékelten kiemelkedők, ráncosak; lágmicélium nincs; fonák oldal színe sárgástól halvány rózsaszínűig (3ga, 5ea); barna (31c) oldható színanyag.

Bennett-féle agaron - jó növekedés; a telepek vöröstől sötét vörös színűek (6 l/2ne, 6 l/2ng), kiemelkedőek, ráncosak; légmicéliumok színe fehértől rózsaszínűig (óea); fonák oldal vörös (61/2 le); barna (3ne) oldható színanyag.

Emerson-féle agaron-jó vagy kiváló növekedés; a telepek narancsszínűek (51a, 5na), kiemelkedők, ráncosak; fehér légmicéliumok; fonák oldal naracsszínű (5ic); oldható színanyag nincs.

Tápagaron (Nitrient agar) - mérsékelt növekedés; a telepek halvány narancsszínűek (5ea, 5ga), gyengén kiemelkedők, simák vagy különálló telepeknek látszanak; légmicélium nincs; fonák oldal halvány rózsaszínű (5ga); oldható színanyag nincs.

Zselatinos agaron - jó vagy mérsékelt növekedés; a telepek halvány narancsszínűek (4ga), mérsékelten kiemelkedők, simák vagy ráncosak; elszórtan fehér légmicélium; fonák oldal halvány narancsszínű (4ga); oldható színanyag nincs.

Keményítős agaron - jó vagy mérsékelt növekedés, a telepek halvány narancsszínűek (5ga), mérsékelten kiemelkedők, simák vagy ráncosak; elszórtan fehér légmicélium; fonák oldal olyan, mint a felszíni; oldható színanyag nincs.

Burgonyás/sárgarépás agaron - gyenge vagy mérsékelt növekedés; a telepek színe krémszíntől halvány rószaszíhig (2ca, 4ca), vékonyak vagy gyengén kiemelkedők; elszórtan fehér légmicélium; a fonák oldal színe krémszínűtől halvány rózsaszínig (4ca); oldható pigment nincs.

Csapvizes agaron-gyenge növekedés; színtelen vagy krémszínű (1 l/2ca), vékony, sima telepek; elszórtan fehér légmicéliumok; fonák oldal olyan, mint a felszíni; oldható színanyag nincs.

Gauze-féle 1. számú ásványi táptalajon - mérsékelt növekedés, a telepek színe rózsaszíntől vörösig (5ca, 61a) vörös pontokkal (61c), gyengén kiemelkedők, simák; légmicélium nincs vagy elszórtan fehér; fonák oldal olyan, mint a felszíni; oldható színanyag nincs.

Alaktani tulajdonságok: Héthetes növesztés után sem figyelhetünk meg spóraképzést egyik alkalmazott táptalajon sem. Burgonyás/sárgarépás agaron viszont laterális, terminális vagy interkaláris hifakiemelkedések figyelhetők meg, melyek egyedülállók és simák; gömbölydedek, oválisak vagy eliptikusak, 1,2-2,5 mm átmérőjúek vagy 1,22,2x0,9—1,8 mm méretűek. Hasonló struktúrákat figyelhetünk meg az élesztőkivonat/malátakivonatos agaron, zabliszten agaron, csapvizes agaron, zselatinos agaron, szacharózos Czapek-féle agaron és a Gauze-féle 1-es ásványisós táptalajon.

Biokémiai tulajdonságok: Melamint nem képez; hidrogén-szulfid nem keletkezik; a zselatint elfolyósítja; a keményítőt nem hidrolizálja el; nitrátot nem redukál nitritté; gyenge növekedés a Jensenféle cellulózos táptalajon és nincs növekedés a Levin és Schoenlein-féle cellulózos táptalajon; egyik cellulózos táptalajon sincs szétesés; koaguláció és peptonizáció tejen; kalcium-malát emésztése negatív; tirozinemésztés pozitív; kazeinbontás pozitív.

Szénhidráthasznosítás: a glükózt, ramnózt és szacharózt felhasználja, az arabinózt, fruktózt, inozitot, mannitot, rafinózt és xilózt nem.

Pozitív eredményt ad: az acetát, propionát és piruvát hasznosítási teszt; sav termelődik a glükózból, ramnózból, maltózból és trehalózból.

Negatív eredményt ad: az adenin, xantin, hipoxantin és karbamid lebontási vizsgálat; az eszkulin és hippurát hidrolízis; a lizozimmal szemben rezisztancia; a benzoát, citrát, dextrin, laktát, malát, mukát, oxalát, fenol és szukcinát hasznosítás; a savtermelés arabinózból, fruktózból, adonitbóí, celiobiózból, dulcitból, eritritből, galaktózból, glicerinből, laktózból, mannózból, melezitózból, malibiózból, α-metil-D-glükozidbóí, ribózból, szalicinből, szorbitból, szorbózból és keményítőből.

Teljes-sejt analízis: a teljes sejt hidrolizátuma mezo-diamino-pimelinsavat, galaktózt, glükózt, madurozt, ribőzt és ramnózt tartalmaz.

Hőmérsékelti viszonyok hatása a növekedésre:

21°C 28’C 37’C 45’C mérsékelt jó mérsékelt nincs növekedés

Az FD-27684 törzset jellemzi, hogy nem képez melamint; a szubsztrát-micélium rózsaszín, rózsaszín-narancsos, narancsszínű vagy vörös; a teljessejt hidrolizátumban mezo-diamino-pimelinsav és maduróz van. Hosszú, akár hét hetes inkubációs idő alatt sem termel a tenyészet spórákat, bár bizonyos táptalajokon hifakiemelkedések megfigyelhetők. Actinomadura nemzetségként határozható meg.

Az FD-27684 törzs a tenyészet sajátosságai és csaknem valamennyi biokémiai tulajdonság szempontjából hasonló az Actinomadura roseorufa Huang ATCC 39 697 törzshöz (lásd 169 001 számú európai szabadalmi bejelentés). Zselatinos agaron és keményítős agaron az FD-27284 törzs telepei inkább halvány narancs színűek, mint halvány krémszínűek; tirozinos agaron és Emerson-féle agaron inkább narancsszínűek, mint barnák. Ellentétben az A.roseorufa vagy ATCC 39697-el az FD27684 törzs nem koagulálja a tejet. Ezek a különbségek kicsik, és ezért az FD-27684 törzset az A.roseorufa egy új törzsének tekintjük.

Az FD-27684 szülőtörzshöz képest az FD-28474

-5HU 201805 Β mutáns kevesebb légmicéliumot fejleszt élesztőkivonat/malátakivonatos agaron, Bennett-féle agáron, Gauze-féle 2-es számú szerves táptalajon, zselatinos agaron és keményítős agaron. A mutáns telepei inkább krémszínnek, mint narancsszínűek az Emerson-féle agaron, és inkább halvány rózsaszínűek, mint krémszínűek a burgonyás/sárgarépás agaron. Ellentétben a szűlőtörzzsel, a mután hidrogén-szulfidot termel. Az összes többi tenyészeti sajátosságuk és biokémiai tulajdonságuk azonos.

Ezek alapján az FD-28474 törzset az Actinomadura roseorufa új törzsének tekintjük.

Összehasonlítva az FD-28474 törzzsel, melyből származik, az FD-28499 törzs csaknem valamennyi tenyészeti sajátosságában és valamennyi biokémiai tulajdonságában megegyezik vele. A mutáns csak annyiban különbözik, hogy az élesztőkivonat/malátakivonatos agaron inkább sötétbarnák a telepek, mint sötésvörösek és a Gauze-féle szerves táptalajon (2-es táptalaj) néhány rózsaszín pont figyelhető meg a telepeken. Ezek szerint az FD-28499 törzset az Actinomadura roseorufa egy új törzsének tekintjük.

Az FD-28454 törzset rendszertani vizsgálatoknak nem vetettük alá. Minthogy azonban egy Actinomadura roseorufa törzsből származott, és mutációval egy Actinomadura roseorufa törzset hozott létre, az Actinomadura roseorufa egyik törzsének tekintjük.

Az UK-61689 antibiotikum gátolja számos Grapozitív mikroorganizmus növekedését. Az I. táblázatban az in vitro eredményeket foglaljuk össze. Ezekhez a vizsgálatokhoz a tápközeget és az UK61689 antibiotikumot különböző koncentrációban tartalmazó kémcsöveket az egyes mikroorganizmusokkal oltjuk be, hogy meghatározzuk a vegyületeknek pg/ml értékben kifejezett minimális koncentrációját, mely már meggátolja, hogy az illető mikroorganizmus 24 óra alatt kinőjön (MIC).

I. TÁBLÁZAT Antibakteriális aktivitás

mikroorganizmus	törzs száma	MIC, μ^ωΐ
Clostridium perfringnes	10A006 10A009	50 12,5
Actinomyces
pyogenes	14D002	50
	14D008	50
	14D011	50
Treponema hyodysenteriae	94A001	3,12
	94A002	3,12
	94A007	1,56
	94A008	1,56

Az UK-61689 antibiotikum és sóinak kokcidiumos fertőzéssel szembeni hatását csirkéken az alábbi módon határozzuk meg. 3-5 napos, kórokozóktól mentes fehér leghorn kakasokat olyan takar6 mánnyal etetünk, melyben UK61689 antibiotikumot vagy nátrium és/vagy káliumsóját kevertük egyenletesen el. Miután 24 órán keresztül ezzel etettük őket, mindegyik állatot szájon keresztül a vizsgálandó Eimeria faj oocisztával oltjuk be. A másik csoport állatait ugyanezzel a táppal etetjük, mely nem tartalmaz UK-61689 antibiotikumot vagy sóját. 24 órás etetés elteltével ezeket az állatokat is megfertőzzük, ezek szolgálnak a fertőzött kontrollokként. Egy harmadik csoport 3-5 napos kakasait ugyanezzel a takarmánnyal etetjük antibiotikum nélkül és nem fertőzzük őket. Ezek lesznek a normál kontroll állatok. A kezelés eredményét E.acervilina esetében öt, a többi esetben hat nap elmúltával értékeljük ki. Az E-tenella-val szemben mért kokcidium-ellenes hatást O-tól 4-ig pontozzuk J.E.Lynch éljárását követve [”A new method fór the primary evaluation of anticoccidial activity”, Am.J.Vet.Res., 22:324-326]. A többi fajjal módosított pontozási rendszerével 0-3 ponttal jellemezzük [Anticoccidial drugs.Lesion scoring techniques in battery and floor pen experiments in chicks”, Exp. Parasit., 28:30-36 (1970)]. A kezelt csoportnál mért pontszámot osztva a fertőzött kontrolloknál megállapított pontszámmal, konstans hányadost állapíthatunk meg.

Baromfi fertőzéssel az UK-61689 antibiotikum és kationokkal képzett sói kitűnő kokcidium ellenes hatást mutatnak. 15-120 ppm-et tartalmazó csirkeeleségnél hatékonyak a vegyületek Eimeria tenellaval, E-acervulina-val, E.maxima-val, E.brunetti-vel és E.necatrix-szal szemben.

Szárnyasok kokcidózisának kezelésére a találmány szerinti vegyületet alkalmas vivőanyagban az állatoknak szájon kei észtül adjuk be. Előnyös módon a hatóanyag kívánt adagját hozzákeverjük a baromfiak ivóvízéhez vagy eleségéhez. A hatóanyagot követlenül kimérhetjük az ivóvízbe, előnyösen folyadék, vizes koncentrátum (vízoldékony sójának oldata) formájában, vagy közvetlenül az eleségbe például preroix vagy koncentrátum alakjában. Premixként vagy koncentrátumként a hatóanyag valamelyik általánosan használt vivőanyagban van. A célnak megfelelően a vivőanyag lehet folyékony vagy szilárd, péládul víz, különféle lisztek - szójaliszt, lenmagliszt, kukoricatorza-liszt; vagy ásványi keverék, melyet általánosan használnak a baromfiak eleségében. Különösen alkalmas vivőanyag maga az eleség; azaz az eleség egy kis része. A micélium is szolgálhat vivóanyagként. A vivőanyag elősegíti a hatóanyag egyenletes eloszlását az állatok táplálékában. Ez fontos, mert a hatásos szerből csak kis mennyiség bejutására van szükség. Fontos, hogy a hatóanyag alaposan el legyen keverve a premixban, illetve végül a táplálékban. A hatónyagot e célból olajos közegben - például szójaolajban, kukoricaolajban, gyapotmagolajban stb. - vagy illékony szerves oldószerben oszlatjuk el vagy oldjuk, majd a vivőanyaggal összeőröljük. Nyilvánvaló, hogy a koncentrátumban a hatóanyag széles koncentrációtartományban szerepelhet, minthogy a megfelelő arány beállításával az eleségben a kívánt hatóanyagszint elérhető.

Nagyhatékonyságú koncentrátumot készíthetünk fehérjedús hordozóanyagokban, például szó-6HU 201805 Β jalisztben és más lisztekben, amint fentebb említettük. A tömény hatóanyagkeveréket közvetlenül megetethetjük a baromfiakkal, és emellett lehetővé válik, hogy az állatok a szokásos étrendjüket fogyasszák. Eljárhatunk úgy is, hogy a tömény hatóanyagkeveréket az eleséghez keverjük hozzá a kívánt mennyiségben. A keverékeket alaposan öszszekeveijük a szokásos eljárásokkal, például ikertárcsás keverővei, hogy ezzel biztosítsuk a homogenitást.

Szakemberek előtt nyilvánvaló, hogy az itt leírt vegyületek koncentrációja a körülményeknek megfelelően változhat. Előnyös megelőző eljárás például, ha az állatokat a növekedési periódusban, azaz a csirkék 6-12 hetes koráig folyamatosan alacsony gyógyszerezettségen tartjuk. Fertőzöttség esetén magasabb dózis szükséges, hogy a fertőzést legyőzzük. Az eleségben a szokásos hatóanyagszint általában 15-120 ppm. Ha ivóvízben akaijuk ezt a mennyiséget beadni, figyelembe vesszük, hogy mennyi az állatok napi ivóvíz igénye és eszerint állapítjuk meg a koncentrációt.

Az elmondottakat az alábbiakban példákkal szemléltetjük. A példák a találmány oltalmi körét nem korlátozzák.

1. példa

a) Az oltóanyag elkészítéséhez az alábbi összetételű táptalajt állítjuk össze:

g/1 celeróz 10,0 kukoricakeményítő 5,0 kukoricalekvár 5,0

NZAmineYT* 5,0 kobalt-klorid 0,002 ^xenzimmel emésztett kazein, Humko Sheffield Chemical Co. Inc.

Miután a táptalaj kémhatását beállítottuk pH=7,0 értékre, 800 ml-t öntünk egy 2800 milliliteres Fernbach edénybe, vattadugóval és papírral lezárjuk és 60 percen át 121 ’C hőmérsékleten sterilezzük 1,05 bar nyomáson. Lehűlés után a táptalajt beoltjuk az FD28454 (ATCC 53 674) törzs ferdeagar tenyészetéről készült vegetatív sejtszuszpenziójával. Az edényeket 6 napon át 28 ’C hőmérsékleten rázatjuk körkörös zárógépen, melynek kitérése 3,5-7,5 cm és fordulatszáma percenként 150-200.

b)800 ml tenyészettel oltjuk be a 14 literes fermentorben levő 8 liter táptalajt, mely az alábbi összetételű:

cerelóz	45,0
szójaliszt	10,0
keményítőlekvár	15,0
vérliszt	5,0
kukoricaliszt	5,0
mangán-szulfát-víz	0,1
magnézium-szulfát-víz	0,1
kobalt-klorid-6 víz.	0,002
kálcium-karbonát	3,0

A kémhatást 6,9-7,0 értékre állítjuk be.

A 8 liter táptalajhoz hozzáadunk 4 ml szilikonos habzásgátlót.

A fermentációt 30 ’C hőmérsékleten végezzük, a kevertetés fordulatszáma percenként 500, a levegőztetéshez percenként a tenyészet térfogatának 0,75-ad részét kitevő levegőt használunk. Az UK61689 és UK-58852 antibiotikumok termelődését vékonyrétegkromatográfiával követjük nyomon. A szilikagél rétegen a kromatogram kifejlesztéséhez kloroform/metanol 9:1 arányú elegyét használjuk. A lemezeket vaniilmes reagenssel permetezzük le (vanillines reagens: 6 g vanillin 100 ml 3% koncentrált kénsavat tartalmazó etil-alkoholban), és 5 percen keresztül 100 ’C hőmérsékleten melegítjük. Az UK-161689 antibiotikum vöröses kék földként jelenik meg. Eljárhatunk úgy is, hogy kifejlesztett kromatogramra B.subtilis-szel beoltott agart rétegzünk, melyhez 0,4 ml 5%-os 2,3,5-trifenil-2H-tetrazónium-klorid oldatoto adtunk, és 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk 16 órán át. Az antibiotikumot tartalmazó hely színtelen foltként jelenik meg a vörös háttérben.

A teljes fermentlevet extraháljuk metil-izobutilketonnal, majd az extraktumot bepárolva 14,4 g bepárlási maradékot kapunk. Ezt az anyagot 6x100 cm-es szilikagél G 0,07-0,2 mm szemcseméret, Woelm) oszlopon kromatografáljuk etil-acetáttal eluálva. Átfolyási sebesség ~ 20 ml percenként. 10 milliliteres frakciókat gyűjtünk.

A frakciókat vékonyrétegkromatográfiával vizsgáljuk Analtech szilikagél GF rétegen, a kifejlesztéshez kloroform/metanol 9:1 elegyet használva. Az előhívás vanillinreagens bepermetezéssel és melegítéssel történik.

Az UK-61689 antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük (össztérfogat kb. 200 ml) és 2 g Darco G60-nal kevertetjük 15 percen keresztül. A szenet szűréssel eltávolítjuk, az etil-acetátos szűrletet 5%-os nátrium-dihidrogén-foszfátos oldattal mossuk, melynek kémhatását In nátrium-hidroxiddal pH=10,0 értékre állítottuk be. Az etil-acetátos frakciót elválasztva vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, és csökkentett nyomáson bepároljuk. A viszkózus olajként nyert bepárlási maradékot kis térfogatnyi heptánban oldjuk, melyben megindul a kristályosodás. A kristályos anyagot szűréssel elválasztjuk, csökkentett nyomáson szárítjuk, 1,4 g UK61689 antibiotikumot nyerve nátriumsó alakjában.

Op.:167’C.

C¹³NMR (CDCb): 179,16,107,54,103,21,97,80, 97,01,87,02,84,65,84,28,8239,82,10,80,92,80,28, 79,96,77,62,77,11,76,60,74,91,7{l,65,73,15,70,19, 67,74,66,94,59,07,56,84,45,49,39,92,39,00,36,55, 33,88,33,79,33,63,33,51,33,21,32^1,3233,30,63, 27,64,26,98,26,91,26,16,23,25,18,43,17,53,17,00, 12,13,11,05,10,47.

Az UK-58852 antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, ~2 g Darco G60-nal kevertetjük, és betöményítjük. A bepárlási maradékot hexánban szuszpendáljuk és szűrős tölcséren szilikagéllel keverjük össze. Az adszorbenst hexánnal mossuk és kloroformmal, majd etil-acetáttal eluáljuk. Az etilacetátos frakciót betöményítjük, a maradékot újra kromatografáljuk szilikagélen, és a terméket hep7

-7HU 201805 Β tánban kristályosítjuk fehár szilárd anyagként kinyerve az UK-58852 antibiotikumot.

2. példa

Az 1. példában leírtak szerint járunk el, de az FD-28454 (ATCC 53 674) törzs helyett FD-28499 (ATCC 53 664) törzset használunk. A HPLC vizsgálatok tanúsága szerint a teljes fermentlé metilizobutil-ketonos extraktuma UK61689 antibiotikumot tartalmaz, és lényegében nem tartalmaz UK58852 antibiotikumot (1% alatt). A vékonyrétegkromatográfiás viselkedése azonos az 1. példában leírtakkal.

Az UK-61689-et úgy hozzuk savformába, hogy a nátriumsójának kloroformos oldatát azonos térfogatú foszforsavas vízzel kevertetjük, melynek kémhatása pH=3,0. A fázisokat elválasztjuk, és a kloroformos fázist csökkentett nyomáson bepároljuk UK-61689 antibiotikumot nyerve szabad sav formájában. A érmék spektrum adatai megegyeznek az 1. példában megadottakkal.

3. példa

Az ΈΌ-2&4Π4 (ATCC 53 665) törzzsel végzett fermentációt az 1. példában leírtak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a táptalaj nem tartalmaz kukoricalekvárt és vérlisztet. Négy fermentáció teljes fermentlevét egyesítjük és szűrjük. A szűrletet és a kiszűrt micéliumot külön-külön extraháljuk metil-izobutil-ketonnal (3x200 ml). Az extraktumokat egyesítjük és csökkentett nyomáson bepároljuk. 18,5 g olajos maradékot kapunk. A maradékot 200 ml acetonban felvesszük, az oldatot két egyenlő részre osztjuk (I és Π oldat).

Az I oldat kémhatását 20%-os nátrium-hidroxid oldattal pH=12 értékre állítjuk be. A lúgos oldatot szűrjük és olajos maradékig pároljuk csökkentett nyomáson. Az olajhoz 10 ml acetont, 79 ml heptánt és 39 ml vizet adunk, sötétbarna kristályok válnak ki. A kristályokat heptánban eldörzsövel 2 g halványbarna kristályos anyaghoz jutunk, mely a

HPLC vizsgálat szerint 75% UK-61689 és 5% UK58852 antibiotikumot tartalmaz.

AII oldatot csökkentett nyomáson bepároljuk, az olajos maradékot 100 ml etil-acetátban oldjuk. Az oldatot 500 g szilikagélből készült oszlopon kromatografáljuk eluensként etil-acetátot alkalmazva.

Az UK-61689 antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük és olajos maradékig bepároljuk. A maradékot 10 ml acetonból és 110 ml heptánból álló elegyben vesszük fel, a nyert UK-61689 kristályokat szűréssel összegyűjtjük és szárítjuk. 1,2 g antibiotikumhoz jutunk. Az UK-58582 antibiotikumot nem nyertük ki.

A termék fizikai állandói megegyeznek az 1. példában megadottakkal.

Claims (5)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás az (I) képletű UK-61689jelű vegyület előállítására, ózza/ jellemezve, hogy asszimilálható szénforrást, nitrogénforrást és ásványi sókat tartalmazó táptalajban, süllyesztett aerob körülmények között Actinomadura roseorufa ATCC 53 665, ATCc 53 674, ATCC 53666 vagy ATCC 53 664 törzset tenyésztünk, majd kívánt esetben az (I) képletű vegyületet a fermentléből kinyerjük.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az UK-61689 jelű vegyületet kinyerjük a fermentléből.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Actinomadura roseorufa ATCC 53 665 vagy ATCC 53 674 törzseket tenyésztünk.
4. 4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Actinomadura roseorufa ATCC 53 664 törzset tenyésztünk.
5. 5. Eljárás antikokcidiális készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított (I) képletű UK-61689 vegyületet - kívánt esetben szokásos segédanyagokkal összekeverve antikokcidiális készítménnyé alakítjuk.