CN1036387A - 制备uk-61,689的微生物学方法及所用的微生物 - Google Patents

制备uk-61,689的微生物学方法及所用的微生物 Download PDF

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Abstract

公开了几个玫瑰红黄马杜拉放线菌突变株，其特 征在于、它们能通过发酵而产生UK—61,689，UK -61,689是一种以前只靠UK—58,852的选择性酸 水解才能得到的酸性多环醚类抗球虫抗生素；还公开 了具有ATCC53,666、ATCC53,665、ATCC53,664 和ATCC53,674的鉴定特征的玫瑰红黄马杜拉放线 菌。

Description

本发明涉及生产抗生素UK-61,689的微生物学方法，抗生素UK-61,689是一种以前只是靠化学方法才能得到的酸性多环醚抗球虫抗生素。更具体地说，本发明涉及通过培养具有ATCC53,666的鉴定特征的玫瑰红黄马杜拉放线菌( Actinomadura roseorufa)来发酵生产UK-61,689的方法，涉及具有ATCC53,665、ATCC53,664和ATCC53,674鉴定特征的玫瑰红黄马杜拉放线菌突变株。
1986年1月22日公布的EP-0169011描述了生产多环醚抗生素UK-58,852的方法，该抗生素是通过在深层通气条件下用液位营养培养基培养玫瑰红黄马杜拉放线菌新亚种( Actinomadura roseorufa Huang sp.nov.)ATCC39,697而产生的。
UK-61,689是一种单配糖基酸性多环醚，其结构如式(I)所示，
Figure 8810734500041
1986年8月1日提交的英国专利申请第8618844号描述了其制备方法，即对式(II)所示的二配糖基多环醚UK-58,852进行选择性酸水解。其中所描述的方法包括UK-58,852的酸水解，水解最好在室温下以乙腈/水作溶剂用1∶1当量的对甲苯磺酸和UK-58,852钠盐进行。
1986年1月22日公布的欧洲申请169011描述了UK-58,852的制备方法。UK-58,852本身就是一种有效的抗生素，更是有效的抗球虫剂。它是由玫瑰红黄马杜拉放线菌新亚种ATCC39,697在液体营养培养基中深层通气发酵所产生。在发酵生产UK-58,852的同时还产生两个相关的微量组份，每个组份在控制球虫病方面均是有效的抗生素。这二个微量组份分别定名为CP-70,228和CP-70,828，它们具有上述式(II)所示的结构，前者R是H，R1是CH3；后者R和R1均为甲基。
本发明涉及制备UK-61,689的微生物学方法，它包括在液体营养培养基中，最好在深层通气条件下培养玫瑰红黄马杜拉放线菌ATCC53,666的突变株。UK-61,689是一种有价值的酸性多环醚抗生素和强抗球虫剂。本发明特别涉及得自玫瑰红黄马杜拉放线菌ATCC53,666的突变株ATCC53,674和53,665，其特征在于它们能在产生UK-61,689的同时产生UK-58,852；涉及ATCC53,665的一个突变株，其特征在于它能在产生UK-61,689时基本上不产生UK-58,852，所述突变株具有玫瑰红黄马杜拉放线菌ATCC53,664的鉴定特征。
产生UK-61,689和UK-58,852的微生物是从玫瑰红黄马杜拉放线菌的一个称为FD-27684(ATCC53,666)的新菌株突变而得到的，该新菌株是从采自日本镰本山江村(YamaeVillage，Kamamoto，Japan)的土壤样品中分离的。
用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)作为诱变剂，然后考察经处理微生物的单菌落的UK-61,689的产生。一般的步骤包括在28℃下，在深层好气条件下在液体营养培养基中振荡培养ATCC53,666。生长阶段培养基的选择并不重要。培养基中含有西瑞糖(10.0克)、玉米淀粉(5.0克)、玉米浆(5.0克)NZ Amine YTT(5.0克)(酪蛋白酶解物的注册商标，Humko Sheffield化学公司)、氯化钴(0.002克)，将该培养基悬浮在1升水中，用氢氧化钠调pH至7.0，分装(800毫升)到一个费氏烧瓶中。高压灭菌后，用斜面生长悬浮液或冻干的营养菌丝体接入瓶中，而后在约200转/分的摇床上28℃下振荡培养8天。然后取出50毫升样品，菌丝体用特氟隆杵组织研磨器匀浆，随后再进行超声波断裂。离心断裂的菌丝体，洗去培养液，再悬浮在装有50毫升新鲜培养液的300毫升三角瓶中，在32℃下摇瓶培养2小时，然后再离心细胞，用无菌水洗去培养液，再悬浮于50毫升pH9.0的三(羟甲基)氨基甲烷-苹果酸缓冲液中。各份悬浮液再在34℃下，在250-300转/分的旋转水浴摇床上，用浓度为每毫升750-1500微克的诱变剂NTG处理1小时。离心处理后的细胞，用无菌水洗去诱变剂，并悬浮于装有新鲜生长培养基的三角瓶中，32℃下在200转/分的柜式摇床上振荡培养。3天后，对生长良好的菌丝体作匀浆和超声处理。对每份超声过的菌悬液进行逐级稀释并涂在固体营养培养基上，平皿在28℃下进行培养，直到菌落形成单位的大小足以转接到斜面上为止。一种适合于平皿和斜面的培养基是N-Z Amine Type A(Humko Sheffield化学公司)减至1.0克/升的172号ATCC培养基。使接种后的斜面在28℃生长10-14天，而后就可以用作试验了。该试验是接种300毫升三角瓶中装有的25毫升合适培养基(这样一种培养基含有西端糖，45.0克；黄豆粉，10.0克；玉米浆，15.0克；MnSO4·H2O，0.1克；MgSO4·7H2O，0.1克；氯化钴，0.002克；碳酸钙，3.0克；水1升，调培养基的pH至7.0)。121℃高压灭菌30分钟后，用斜面生长悬浮液分别接入三角瓶中，在New Brunswick摇床上，28℃振荡培养7天。为检测突变株培养物FD-28454(ATCC53,674)，使用所收集的全培养液经甲基异丁酮抽提，薄层层析(硅胶)展层后用香草醛试剂喷层析板，在100℃下加热5分钟后进行考察。展层系统为9份氯仿与1份甲醇，在该系统中，UK-61,689的Rf值约为0.3，UK-58,852的Rf值约为0.65。这样获得的突变株培养物产生UK-61,689和UK-58,852的混合物。UK61,689与UK58,852的比例变化在某种程度上似乎取决于发酵条件。所得突变株的形态和培养特征基本如本文所述的玫瑰红黄马杜拉放线菌ATCC53,666。该突变株的不同特征在于它能产生UK-61,689和UK-58,852的混合物，其中UK-61,689是主要产物。突变株的培养和UK-61,689抗生素的分离可在与以前发酵生产聚醚类抗生素所用的相似条件下进行。参见例如美国专利4,361,649。最好采取在24-36℃温度下，用液体营养培养基在深层搅拌通气条件下进行培养。培养用营养培养基包括可同化的碳源，如糖、淀粉和甘油；有机氮源，如酪蛋白、酶解酪蛋白、黄豆饼、棉籽饼、花生饼、麸皮、豆粉、肉粉、鱼粉。生长物质的原料如可溶性谷物、鱼粉、棉籽粉、酵母浸汁，还有无机盐，如氯化钠、碳酸钙，以及微量元素如铁、镁、铜、锌、钴和锰也可以加以利用而产生有益的结果。发酵中如果泡沫过多，可向发酵培养基中加入诸如植物油或硅酮等消沫剂。容器中培养基的通气对深层培养
较合适的速度是每体积的发酵液每种通过喷嘴送入培养基的无菌空气保持在0.5-2个体积。可用发酵领域技术人员一般熟知的搅拌装置来维持搅拌。搅拌的速度根据所用搅拌器的类型而定。摇瓶的转速通常是每分钟150-300转，而发酵罐则通常为每分钟300-1700转。当然必须在接种和整个生长过程中保持无菌条件。
制备本发明抗生素所用的接种物可以使用培养物的斜面生长物或用该培养物或该培养物的冻融的菌丝体悬浮液接种的Roux瓶。一种适于菌株最初在斜面和Roux瓶上生长的固体培养基是ATCC172号培养基。前面提到的突变研究用的液体培养基也适于在冻干前制备营养菌丝体。生长物既可用来接种摇瓶，也可用来接种种子罐，也可用摇瓶作为种子罐的种子。摇瓶中达到最大生长通常需4-8天，而深层接种罐中的接种物通常在最适合的时间4-5天内达到最大生长。
发酵期间抗生素产物的积累可以用薄层色谱法在如前述用香草醛试剂喷雾显迹后进行定性检测。也可以将展层后的薄层板铺以接种枯草杆菌( Bacillus  subtilis)的脑心浸汁琼脂，在37℃下培养16小时后观察抗生素。薄层色谱也是发酵液中抽提的粗制品和纯制品组成分析的有用工具。一种应用10厘米×4.6毫米C-18微孔柱，流动相是0.01M碳酸铵/乙腈/甲醇(40/200/760)的高压液相色谱法，用折光率检测器可以定量测出发酵液中UK-61,689和一同产生的UK-58,852的量。
由本文所述的突变株发酵产生的抗生素UK-61,689，在菌丝体和发酵液中积累，并可通过抽提所收集的全部未经过滤的发酵液来分离和回收，即用有机溶剂如氯仿、乙酸乙酯、甲基异丁酮或丁醇在自然pH下抽提全发酵液。为了避免严重的乳化问题，也可分离出菌丝体，将菌丝体和澄清的发酵液分别用有机溶剂抽提。然后有机溶剂抽提液浓缩至稀浆状，用色谱法得到纯的UK-61,689。
一种典型的分离和回收抗生素的方法如下：用甲基异丁酮抽提突变株发酵得到的全发酵液。真空蒸发抽提液，得到浅红色油状物，把它溶于乙酸乙酯中，而后倒在硅胶柱上，用乙酸乙酯洗脱硅胶柱，洗脱物用薄层色谱法进行检测。合并含有UK-61,689的组分并蒸发至干。由此得到的UK-61,689可以用异丙醚结晶而进一步纯化。
UK-61,689可以用已知方法把菌丝体发酵所得的全发酵液蒸发而回收，这些方法包括喷雾干燥或过滤或离心而从发酵液中分离菌丝体。这样得到的菌丝体产物在菌丝体表面和菌丝体间含有UK-61,689，使得菌丝体成为UK-61,689的良好载体。
按上述制备FD-28454(ATCC53,674)的方法，取上述突变株FD-28454的单菌落分离株(称为FD-28474)本身进行NTG诱变处理。用这一方法得到另一个突变株(FD-28499)，该菌株具有玫瑰红黄马杜拉放线菌ATCC53,666的形态和培养特征，当然，也具有第一个产生的突变株的形态和培养特征。然而这个突变株(FD-28499)不同于突变株FD-28454和FD-28474，即它只产生UK-61,689而基本上不产生(即＜1％)UK-58,852。用与培养首先描述的突变株(FD-28454)相同的方法培养突变株FD-28499，用上述方法从发酵液中回收UK-61,689。
最后一个突变株(由Pfizer公司培养物收集处鉴定为FD-28499)、突变株FD-28454和FD-28474及起始微生物FD-27684，均已按布达佩斯条约的有关条款保藏在美国典型培养物保藏中心(Rockville，Maryland)，该中心是公认的提供永久保藏的保藏机构，一旦本申请被授予专利，公众就可以索取。这几个菌株分别定名为玫瑰红黄马杜拉放线菌ATCC53,664、ATCC53,674、ATCC53,665和ATCC53,666。在本申请未决期间，由美国专利和商标局局长按37 CFR 1.14和35 USC 122的授权并根据提交了该申请的对应申请或后续申请的国家的专利法确定谁可以索取保藏物。对公众索取保藏微生物的所有限制，都将在对该微生物授予专利后不可改变地取消。
L.H.Huang进行了FD-27684、FD-28474及FD-28499的分类学研究，他提供了下列描述。
将每一种斜面培养物接种到ATCC172号培养液中，在28℃下摇床培养4天。然后离心20分钟，用无菌蒸馏水洗三次，再接种到鉴定放线菌常用的培养基上。
在28℃下培养这些培养物，在不同时间记录结果，但最经常的是在第14天记录。使用常用术语描述颜色，但确切的颜色用ColorHarmony Manual(第4版)的踅斜冉侠慈范āＨ赴?基酚分析方法为Becker等人所述的方法(Appl.Microbiol.，12：421-423，1964)。全细胞糖分析利用Lechevalier(J.Lab.Clin.Med.71：934-944，1968)及Staneck和Roberts(Appl.Microbiol.，28：226-231，1974)的方法。用玫瑰红黄马杜拉放线菌ATCC39,697的典型培养物作对照。
用于培养物特性鉴定的鉴定培养基及描述其组成的参考文献如下：
1.胰蛋白胨酵母浸汁液体培养基-(ISP1号培养基，Difco公司)。
2.酵母浸汁-麦芽汁琼脂-(ISP2号培养基，Difco公司)。
3.燕麦粉琼脂-(ISP3号培养基，Difco公司)。
4.无机盐-淀粉琼脂-(ISP4号培养基，Difco公司)。
5.甘油-天冬酰胺琼脂-(ISP5号培养基，Difco公司)。
6.蛋白胨-酵母浸汁铁琼脂-(ISP6号培养基，Difco公司)。
7.蔗糖察氏琼脂-S.A.Waksman，The ActinomycetesVol.2，1号培养基，P.328，1961。
8.葡萄糖-天冬酰胺琼脂-同上，2号培养基，P.328。
9.本奈特氏琼脂-同上，30号培养基，P.331。
10.伊姆松氏琼脂-同上，28号培养基，P.331。
11.营养琼脂-同上，14号培养基，P.330。
12.高尔登和史密斯氏酪氨酸琼脂-R.E.Gordon and M.M.Smith，J.Bacteriol.69：147-150，1955。
13.酪蛋白琼脂-同上。
14.苹果酸钙琼脂-S.A.Waksman，Bacteriol.Rev.21：1-29，1957。
15.明胶-R.E.Gordon and J.M.Mihm，J.Bacterol.73：15-27，1957。
16.淀粉-同上。
17.有机硝酸盐液体培养基-同上。
18.葡萄糖硝酸盐液体培养基-S.A.Waksman，TheActinomycetes，Vol.2，1号培养基，P.328，1961。用3克葡萄糖代替30克蔗糖，不加琼脂。
19.马铃薯胡萝卜琼脂-M.P.Lechevalier，J.Lab.and Clinical Med.，71：934-944，1968，但只用30克马铃薯，2.5克胡萝卜和20克琼脂。
20.自来水2％琼脂。
21.高氏1号无机盐琼脂-G.F.Gauze et al.，Problemsin the Classification of AntagtonisticActinomycetes，Eng.Ed.，P.13，1957。
22.高氏2号有机琼脂-同上。
23.脱脂牛奶-Difco公司。
24.纤维素利用-
(a)H.L.Jensen，Proc.Linn.Soc.N.S.W.
55：231-248，1930.
(b)M.Levine and H.W.Schoenlein，ACompilation of Culture Media，2511号培养基，1930。
25.有机酸利用-R.E.Gordon et al.，Int.J.Syst.Bacteriol.24：54-63，1974。
26.利用碳水化合物产酸-同上。
27.水解马尿酸和七叶苷-同上。
28.分解腺嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤和尿素-同上。
29.溶菌酶抗性-同上。
30.碳水化合物利用-C-2培养基，H.Nonomura and Y.Ohara，J.Ferment.Technol.49：887-894，1971。
31.温度范围-ATCC172号培养基，ATCC CultureCollection Catalogue，15th ed.，P.608，1982。FD-27684培养物的描述
酵母浸汁-麦芽汁琼脂：生长良好，粉红至红色(61/2ia，7ia，6ia)，隆起，皱折，长有白色气丝；反面红色(7ia)；无可溶性色素。
燕麦粉琼脂：生长中度，奶油色(2ca)，略隆起，光滑或出现单菌落；无气丝或气丝稀少，白色；反面奶油色(2ca)；无可溶性色素。
无机盐-淀粉琼脂：生长弱至中度，无色至奶油色(2ca)，稀薄，光滑；无气丝或气丝稀少，白色；反面颜色同表面；无可溶性色素。
甘油-天冬酰胺琼脂：生长弱至中度，奶油色(2ca)，带粉色至红色斑点(6ea，61/2ga)；无气丝或气丝稀少，白色；反面无色至奶油色(2ca)，带红色斑点；无可溶性色素。
蔗糖察氏琼脂：生长弱至中度，奶油色(2ca)，带粉色至红色斑点(5ea， )；无气丝或气丝稀少，白色；反面无色至奶油色(2ca)；无可溶性色素。
葡萄糖一天冬酰胺琼脂：生长中度至良好，粉色至红色(
Figure 8810734500142
Figure 8810734500143
)，隆起；光滑，颗粒至皱折；气丝白色至浅粉色(6ea)；反面红色( )；浅淡黄色(3ca)可溶性色素。
高尔登—史密斯氏酪氨酸琼脂：生长中度至良好，粉—橙色(5ea)，中度隆起，皱折；无气丝或气丝稀少，白色；反面颜色同正面；浅黄色(2lc)可溶性色素。
苹果酸钙琼脂：生长贫乏，无色，稀薄，光滑，无气丝；反面无色；无可溶性色素。
酪蛋白琼脂：生长中度至良好，粉一橙色至橙色(4ia，5ia)，中度隆起，皱折，无气丝；反面浅黄至淡粉色(3ga，8ea)；有褐色(3lc)可溶性色素。
本奈特氏琼脂：生长良好，红色至深红色
Figure 8810734500145
隆起，皱折；气丝白色至粉色(6ea)；反面红色
Figure 8810734500146
有褐色(3ne)可溶性色素。
伊姆松氏琼脂：生长良好至很好，橙色(5la，5na)，隆起，皱折，有白色气丝；反面橙色(5ic)；无可溶性色素。
营养琼脂：生长中度，淡橙色(5ea，5ga)，略隆起，光滑或出现单个菌落，无气丝；反面淡橙色(5ga)；无可溶性色素。
明胶琼脂：生长中度至良好，浅橙色(4ga)，中度隆起，光滑至皱折；气丝稀少，白色；反面浅橙色(4ga)；无可溶性色素。
淀粉琼脂：生长中度至良好，浅橙色(5ga)，中度隆起，光滑至皱折；气丝稀少，白色；反面同正面；无可溶性色素。
马铃薯胡萝卜琼脂：生长弱至中度，奶油色至浅粉色(2ea，4ca)，稀薄至略隆起；气丝稀少，白色；反面奶油色至浅粉色(4ca)；无可溶性色素。
自来水琼脂：生长弱，无色至奶油色 ，稀薄，光滑；气丝稀少，白色；反面同正面；无可溶性色素。
高氏无机盐培养基1：生长中度，粉色至红色(5ca，6la)，带有红色斑点(6lc)，略隆起，光滑；无气丝或气丝稀少，白色；反面同正面；无可溶性色素。
高氏有机培养基2：生长中度至良好，粉—橙色(5ga)，中度隆起，略皱折；气丝稀少，白色；反面同正面；无可溶性色素。
形态学特性：培养7周后，在所用的任何培养基上都没有发现孢子。然而在马铃薯胡萝卜琼脂上，菌丝末端、侧枝或中间产生膨大，这些膨大体是单个的，且光滑。它们呈球形，卵圆至椭圆形，其直径为1.2-2.5m或大小为1.2-2.2×0.9-1.8m。类似的结构也在酵母浸汁—麦芽汁琼脂、燕麦粉琼脂、自来水琼脂、明胶琼脂、蔗糖察氏琼脂及高氏无机盐1号培养基上发现。
生化特性：不产生黑色素；不产生硫化氢；液化明胶：不水解淀粉；硝酸盐还原至亚硝酸盐；在Jensen氏纤维素培养基上稍有生长，而在Levine和Schoenlein氏纤维素培养基上不生长；在二种纤维素培养基上均不被分解；在牛奶上凝固并胨化；苹果酸钙分解阴性；酪氨酸分解阳性；酪蛋白分解阳性。
碳永化合物利用：利用葡萄糖，鼠李糖和蔗糖；不利用阿拉伯糖、果糖、肌醇，甘露醇，棉籽糖和木糖。
阳性试验有：醋酸盐、丙酸盐和丙酮酸盐的利用；利用葡萄糖、鼠李糖、麦芽糖和海藻糖产酸。
以下试验为阴性：分解腺嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤和尿素；七叶苷、马尿酸盐水解；溶菌酶抗性；利用苯甲酸盐、柠檬酸盐、糊精、乳酸盐、苹果酸盐、粘酸盐、草酸盐、酚和琥珀酸盐；利用下列物质产酸：阿拉伯糖、果糖、肌醇、甘露醇、棉籽糖、蔗糖、木糖、核糖醇、纤维二糖、卫茅醇、赤藓糖醇、半乳糖、甘油、乳糖、甘露糖、松三糖、蜜二糖、α-甲基-D-葡萄糖苷、核糖、水杨苷、山梨醇、山梨糖和淀粉。
全细胞分析：全细胞水解液含内消旋二氨基庚二酸、半乳糖、葡萄糖、马杜拉糖、核糖和鼠李糖。
温度关系
21℃         28℃         37℃       45℃
中度生长    生长良好    中度生长    不生长
培养物FD-27684的特征是：不产生黑色素；基丝粉红色、粉-橙色、橙色至红色；全细胞组分含内消旋二氨基庚二酸和马杜拉糖。尽管培养时间长达7周，培养物仍不产生孢子，但在一些培养基上产生菌体膨大现象。它可归于马杜拉放线菌属。
培养物FD-27684在大多数培养特征和几乎所有生化特性上与玫瑰红黄马杜拉放线菌Huang ATCC39,697(见欧洲专利申请169001)相似。在明胶琼脂和淀粉琼脂上，FD-27684的菌落是浅橙而不是淡奶油色。在酪氨酸琼脂和伊姆松氏琼脂上，它们呈淡橙色而不是褐色。培养物FD-27684不同于玫瑰红黄马杜拉放线菌，它使牛奶凝固。这些区别甚小，因而认为培养物FD-27684为玫瑰红黄马杜拉放线菌的新菌株。
同亲代培养物FD-27684相比较，突变株FD-28474在酵母浸汁-麦芽汁琼脂、本奈特氏琼脂、高氏有机2号培养基、明胶琼脂和淀粉琼脂上产生的气丝较少，在伊姆松氏琼脂上该突变株的菌落是奶油色而不是橙色；在马铃薯胡萝卜琼脂上是浅粉色而不是奶油色至浅粉色。该突变株与其亲代不同而产生硫化氢。其余所有培养特征和生化特性都相同。因此认为突变株FD-28474为玫瑰红黄马杜拉放线菌的一个新菌株。
来自培养物FD-28474的突变株FD-28499与亲代比较，它几乎具有FD-28474的所有培养特征和所有的生化特性。该突变株不同于培养物FD-28474的只是在酵母汁-麦芽汁琼脂上为深褐色而不是深红色菌落，在高氏有机2号培养基上出现一些粉色斑点。因此，认为突变株FD-28499是玫瑰红黄马杜拉放线菌的新菌株。
FD-28454未进行分类学研究。然而由于它来自玫瑰红黄马杜拉放线菌的一个菌株，并且经突变后产生玫瑰红黄马杜拉放线菌的一个菌株，因此认为它是玫瑰红黄马杜拉放线菌的一个菌株。
抗生素UK-61,689对多种革兰氏阳性微生物的生长具有抑制作用。下面表1总结了体外试验的结果。在这一试验中将每一种微生物接种在含有营养培养基和不同浓度的UK-61,689抗生素的一组试管中，测定该化合物在24小时内抑制微生物生长的最低浓度(MIC)，以微克/毫升表示。
                          表I
                        抗菌活性
   微生物                                 菌株号   MIC(微克/毫升)
  产气英膜梭菌( C1ostridium  perfringens)                 10A006    50
                                          10A009    12.5
  化脓放线菌( Actinomyces  pyogenes)                    14D002    50
                                          14D008    50
                                          14D011    50
  豖痢疾密螺旋体( Treponema  hyodysenteriae)                94A001    3.12
                                          94A002    3.12
                                          94A007    1.56
                                          94A008    1.56
用下列方法得到UK-61,689及其盐抑制鸡球虫感染效力的数据。每组3-5只10日龄的无病白色来航公雏鸡，喂以含有UK-61,689或其钠盐和/或钾盐均匀分散于其中的糊状饲料。喂养24小时后，每只鸡口服接种艾美球虫( Eimeria)特定种的虫囊进行试验。另一群10日龄雏鸡，以3-5只为一组，喂以不含UK-61,689抗生素或其盐的相同糊状饲料。24小时后也用球虫感染作为感染的对照。另外一组3-5只10日龄雏鸡喂以不含UK-61,689抗生素的同样饲料，但不用球虫感染，作为正常对照。5天后评价小肠艾美球虫( E. acervulina)的处理结果，六天后评价所有其余的处理结果。
用于衡量抗球虫活性的准则为：柔嫩艾美球虫( E. tenella)病变以0-4评分(J.E.Lynch，“A New Method for thePrimary Evaluation of Anticoccidial Activity”，Am.J.Vet.Res.，22，324-326，1961)；其它球虫根据J.Johnson和W.H.Reid所设计的评分系统进行改进而以0-3评分(“Anticoccidial Drugs.Lesion ScoringTechniques in Battery and Floor Pen Experimentsin Chicks，”Exp.Parasit.，28，30-36，1970)。由每个处理组的病变评分除以感染对照的病变评分来确定常数比率。
UK-61,689及其阳离子盐表现出极好的抗家禽球虫感染的活性。当以15-120ppm量掺入鸡饲料时，这些化合物可有效地控制由柔嫩艾美球虫、小肠艾美球虫、巨型艾美球虫( E. maxima)、布氏艾美球虫( E. brunetti)和盲肠艾美球虫( E. necatrix)引起的感染。
本发明化合物用来防治家禽球虫病时，以合适的载体口服给药。较为方便的是将药物简单地分散在饮用水或家禽饲料中，使药物的治疗剂量随每天饮水或家禽喂饲时摄入。药物可直接计量混和在饮水中，最好以液体剂型、水溶性浓缩剂型(如水溶性盐的水溶液)混合，或者直接以上述形式加入饲料中，或以预混物或浓缩液形式加入饲料中。常用治疗剂在载体中的预混物或浓缩液将药物掺入饲料。适合的载体按要求可为液体或固体，如常用于家禽饲料的水；各种饼料如豆饼粉、亚麻油饼粉、玉米蕊粉；以及无机盐混合物。一种十分有效的载体是家禽饲料本身，即家禽饲料的一小部分。此外，菌丝体可以作为载体。载体使活性物质均匀分布在与预混物混和的成品饲料中。这一点很重要，因为要求这銮啃б┘劣泻苄〉谋壤Ｖ匾氖歉没衔镆浞?混和到预混物中，随后混和到饲料中。为此，药剂可分散或溶解到合适的油性载体中，诸如豆油、玉米油、棉籽油等，或者溶解在一种挥发性有机溶剂中，然后再与载体混和。应该认识到，浓缩物中活性物质的比例可有广泛的变化，因为成品饲料中药剂的量可以靠适当比例的预混物与饲料混合加以调节来达到所要求的治疗剂量。
高效浓缩剂可以由饲料加工厂用蛋白质载体如豆饼粉和其他上述饼粉进行混和，产生浓缩的辅料，它适于直接饲喂家禽。在这些情况下，允许家禽消耗普通的饲料。此外，这些浓缩辅料可直接加到家禽饲料中产生一种营养上平衡的，含有有效治疗量的本发明化合物的成品饲料。混合物可以采用标准的方法充分混和，如用一台双壳混合机来达到均匀。
当然，对本领域技术人员显而易见的是，这里所述的化合物的用量在不同情况下会有不同。在生长期间，即在雏鸡的头6-12周期间连续低剂量投药，是一种有效的预防措施。在治疗已发生的感染时，可能需要用较高剂量来消除感染。饲料中的用量一般在15-120ppm范围内。在饮用水中给药时，其剂量应提供同样的药物日剂量，即15-120ppm，这要用饲料的平均日耗量和水的平均日耗量的重量比来换算。
用以下实施例说明本发明。然而要理解的是本发明不限于这些实施例的具体描述。
                  实例1
A.接种物的制备
制备具有下列组成的无菌液体培养基。
成分                          克/升
西瑞糖                        10.0
玉米淀粉                      5.0
玉米浆                        5.0
NZ Amine YTT★                              5.0
氯化钴                        0.002
★(为酶解酪蛋白的注册商标，Humko Sheffield化学公司)调pH至7.0后，培养基分装(800毫升)到2800毫升的费氏烧瓶中，塞上棉塞并包上纸，121℃下(15磅/英寸2)高压灭菌60分钟。冷却后，用FD-28454(ATCC53,674)斜面的营养细胞悬浮液接种培养基。将烧瓶放在振幅1.5-2.5英寸，每分钟150-200转的旋转摇床上，28℃振荡培养6天。
B.UK-61,689的发酵和分离
用装有800毫升培养后的培养物的费氏烧瓶接种14升发酵罐，发酵罐内装有8升加有4毫升硅酮消泡剂的无菌培养基，其组成如下：
成分                             克/升
西瑞糖                           45.0
豆粉                             10.0
玉米浆                           15.0
血粉                             5.0
玉米粉                           5.0
MnSO4·H2O                     0.1
MgSO4·7H2O                    0.1
CoCl2·6H2O                    0.002
CaCO3                           3.0
调pH至6.9-7.0发酵在30℃下进行至产生大量活性，搅拌转速为每分钟500转，通气量每分钟每体积培养基0.75体积空气。发酵液及回收液中的UK-61,689/UK-58,852可以用硅胶薄层色谱板观察，展层系统为氯仿∶甲醇(9∶1)。展层后的层析板喷以香草醛试剂(6克香草醛在100毫升乙醇和3％浓硫酸中的溶液)，100℃加热5分钟。UK-61,689显示淡红-蓝色斑点。也可以将层析板铺以接有枯草杆菌的琼脂，琼脂中先加入0.4毫升5％2，3，5，-三苯基-2H-四唑氯化物溶液。37℃培养16小时后观察在红色背景上的无色抗生素区。
全发酵液用甲基异丁酮进行抽提，浓缩溶剂得到14.4克残留物。残留物在用含乙酸乙酯的柱用硅胶G(70-230目，Woelm)装填的6×100厘米柱上进行层析，用乙酸乙酯洗脱，流速约每分钟20毫升。每10毫升收集一份。
用Analtech硅胶GF板进行薄层层析，用氯仿∶甲醇(9∶1)展层，喷以香草醛试剂显示，加热后检查各组分。
合并含有UK-61,689抗生素的部分(总体积大约200毫升)，加约2克Darco G60搅拌15分钟。过滤除去碳后，滤液(乙酸乙酯)用5％经1N氢氧化钠调pH至10.0的磷酸氢二钠缓冲液洗。分离后，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，然后真空蒸发。蒸发后剩下的粘性油再用少量庚烷溶解而出现结晶。过滤收集结晶，真空干燥后得到1.4克抗生素UK-61,689钠盐；熔点167℃；C13核磁共振(CDCl3)(ppm)：179.16，107.54，103.21，97.80，97.01，87.02，84.65，84.28，82.39，82.10，80.92，80.28，79.96，77.62，77.11，76.60，74.91，74.65，73.15，70.19，67.74，66.94，59.07，56.84，45.49，39.92，39.00，36.55，33.88，33.79，33.63，33.51，33.21，32.51，32.33，30.63，27.64，26.98，26.91，26.16，23.25，18.43，17.53，17.00，12.13，11.05，10.47.
合并含有UK-58,852的部分，如上述用约2克Darco G60处理，然后浓缩。将残留物悬浮于已烷中，用硅胶在过滤漏斗上分批处理。用己烷洗吸附剂，然后用氯仿和乙酸乙酯洗脱。浓缩乙酸乙酯部分，残留物在硅胶上再层析，产物用庚烷结晶得到白色固体的UK-58,852抗生素。
                     实例2
按照实例1的方法进行，但用FD-28499(ATCC53,664)代替FD-28454(ATCC53,674)。全发酵液的甲基异丁酮抽提物经高压液相色谱得到的UK-61,689基本上不含UK-58,852(＜1％)。它的薄层层析行为与实例1报告的UK-61,689相同。
酸型UK-61,689的制备是用钠盐的氯仿溶液与等体积的水搅拌，并用磷酸将pH降至3.0。然后分离各相，真空下蒸发氯仿，得到抗生素UK-61,689的游离酸。
                     实例3
按照实例1的方法发酵FD-28474(ATCC53,665)，不同的是发酵培养基不含玉米浆或血粉。合并4份发酵全液进行过滤。滤液和菌丝体分别用甲基异丁酮(3×200毫升)抽提。合并抽提液后减压浓缩至油状(18.5克)。将油状物溶于丙酮(200毫升)，然后将该溶液分为二等份(I和II)。
I份加氢氧化钠溶液(20％)调pH至12。将此碱性溶液过滤并减压浓缩成油状。向该油状物中加入丙酮(10毫升)、庚烷(79毫升)和水(39毫升)，产生深褐色结晶。将结晶再溶解在庚烷中，得到2克浅褐色结晶，用高压液相色谱分析含有75％UK-61,689和5％UK-58,852。
将II份减压浓缩至油状，将油状物溶于100毫升乙酸乙酯中。然后上硅胶(500克)柱进行层析，用乙酸乙酯作洗脱剂。合并富含UK-61,689的部分并浓缩至油状。把油状物溶于丙酮(10毫升)-庚烷(110毫升)中，所得UK-61,689结晶进行过滤和干燥(1.2克)。UK-58,852未回收。

Claims (8)

1.一种制备具有式(I)的化合物UK-61,689的方法，其特征在于，该方法包括，在深层通气发酵条件下，在含有可同化的碳源、氮源和无机盐的液体营养培养基中，发酵具有ATCC53,665、ATCC53,674或ATCC53,664的鉴定特征的玫瑰红黄马杜拉放线菌，直至在全发酵液中积累大量所述化合物。
2.一种根据权利要求1的方法，其特征在于，回收所述化合物。
3.一种根据权利要求2的方法，其特征在于，从菌丝体所带的发酵液中回收式(I)化合物。
4.一种根据权利要求2的方法，其特征在于，该方法包括培养玫瑰红黄马杜拉放线菌ATCC53,665或ATCC53,674。
5.一种根据权利要求2的方法，其特征在于，该方法包括培养玫瑰红黄马杜拉放线菌ATCC53,664。
6.一种制备抗球虫剂组合物的方法，其特征在于，该方法包括回收权利要求1的方法所产生的菌丝体所带的UK-61,689。
7.一种制备马杜拉放线菌属新菌株的方法，其特征在于，所述菌株是通过使玫瑰红黄马杜拉放线菌ATCC53,666突变而得到的，该菌株如果在通气条件下在含有可利用的碳源、氮源和无机盐的液体营养培养基中发酵，则产生UK-61,689。
8.一种制备马杜拉放线菌属新菌株的方法，其特征在于，所述菌株是通过使玫瑰红黄马杜拉放线菌ATCC53,665突变而得到的，该菌株如果在通气条件下在含有可利用的碳源、氮源和无机盐的液体培养基中发酵，则产生UK-61,689而基本上不产生UK-58,852。
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