HU201800B - Process for increasing the production of t-pa and scu-pa - Google Patents
Process for increasing the production of t-pa and scu-pa Download PDFInfo
- Publication number
- HU201800B HU201800B HU864143A HU414386A HU201800B HU 201800 B HU201800 B HU 201800B HU 864143 A HU864143 A HU 864143A HU 414386 A HU414386 A HU 414386A HU 201800 B HU201800 B HU 201800B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- growth factor
- priority
- culture
- ecgf
- heparin
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
- A61K31/727—Heparin; Heparan
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/948—Microorganisms using viruses or cell lines
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Control Of Eletrric Generators (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás t-PA (szöveti plazminogén aktivátor) és SCU-PA (egyetlen láncú urokináz plazminogén aktivátor normál humán diploid tüdő fibroplaszt sejtek általi termelésének növelésére szérum-mentes tápközegben.
A találmány szerinti eljárást úgy végezzük, hogy a tenyészethez 5 μg/ml - 220 μβ/ηιΐ mennyiségben heparint vagy kis molekulatömegú heparin és 5 μg/ml - 220 μg/ml mennyiségben valamely endotéliális sejtnövesztő faktort adunk.
A plazminogén-aktivátorok (PA) szerint proteázok tripszinszerű fajlagossággal, amelyek átalakítják a plazminogén proenzimet plazmin enzimmé. A plazmin viszont a fibrinolizis elsődleges szere a véráramban, ahol az egy vérrög fibrin-hálózatát lebontja, oldható termékeket képezve. A két ismert elsődleges (primér) humán plazminogén aktivátor a szöveti plazminogén aktivátor (t-PA) és az egyetlen láncú urokináz plazminogén aktivátor (SCUPA), ez utóbbi az urokináz (UK) proenzimje.
A t-PA-t, amely 63-65 K fehérje, számos emlős endotéliális sejt kiválasztja, beleértve az aortás és vénás endotéliális sejteket. A t-PA nagy affinitással bír a fibrinhez. Ebből az okból kifolyólag a t-PA-ról úgy gondoljuk, hogy közvetlenül a vérrög helyén keletkezik és hat. Az SCU-PA-ról amely 55 K egyetlen láncú fehérje, viszont úgy véljük, hogy a vérrög helyére a véráram útján érkezik.
A t-PA és SCU-PA, az UK és a sztreptokináz (SK, egy harmadik plazminogén aktivátor), valamint ezek módosulatai, intenzív tanulmányok tárgyai, hogy meghatározzák megfelelő fiziológiai szerepüket a trombolizisben, angiogenezisben, metasztázisban, gyulladásokban és peteérésben. Az ilyen tanulmányok magukban foglalják ezen anyagok alkalmazásának klinikai taunlmányait trombózis kezelésére. Ezek a vizsgálatok ezenkívül magukban foglalják ezen enzimek nagyobb mennyiségű előállításának eszközeire irányuló kutatásokat normál humán sejtekből, hogy ezeket az enzimeket trombolitikus szerként alkalmazhassuk. Ezen kívül maguknak az enzimeknek ilyen emelt szintű termelése magával vonja a megfelelő hírvivő RNS-ek (mRNS) emelt szintjeit is. Az mRNS-ek megnövekedett szintjének létrejötte viszont rekombináns DNS előállítási módszerekkel növeli az enzimek vagy módosulataik termelését.
A plazminogén aktivátorokra, főleg a t-Pa-ra, UK-ra és SCU-PA-ra vonatkozóan nem régi öszszefoglaló olvasható az alábbi irodalmi helyen: Cedorholm-Williams S.A.: „Molecular Biology of Plasminogen Activators and Recombinant DNA Progress” (A plazminogén aktivátorok molekuláris biológiája, és a rekombináns DNS folyamat); Bio Eassyas, 7,168-713 (1984).
Jelenleg a t-PA fő nem rekombináns) forrásai nagy mennyiségben a Bowes melanóm sejtek. Ezek a rosszindulatú sejtek megfelelő mennyiségű t-PA-t termelnek az enzim tisztításához és jelleiüzéséhez, és monoklonális és poliklonális antitestek előállításához. Ezen kívül ezek megfelelően fajlagos hírvivő RNS-t (mRNS) termelnek, hogy lehetővé váljék a teljes gén-klónozás. A t-PA-nak és hírvivő RNSének forrását azonban keresik normál (azaz nem rosszindulatú) sejtekből. Olyan forrás szükséges, amely nagy mennyiségű t-PA-t termel szérum-mentes tápközegből, ez lehetővé teszi jelentős mennyiségű mRNS izolálását a sejtekből. A szérum jelenléte nagymértékben hat a t-PA termelésre és kinye5 résre a t-PA inhibitor és egy sor, szérumban található fehérje jelenléte miatt.
Nemrégiben számolt be két folyóiratcikk PA termeléséről normál humán sejtekből. ELőször Kadouri A. és Bohak Z. (Production of Plasminogen
Activator inCultures ofNormalFibromasts” (Plazmingén aktivátor előállítása normál fibrolasztok tenyészeteiben) Biotechnology, 35-358 /1983. június/) adnak hfrt plazminogén aktivátor (PA) előállításáról tüdófibroblasztok számos különböző tör15 zséből. Ők a PA előállítását elsősorban az IMR-90 humán diploid fibroblasztból tanulmányozták különböző szérumokkal és poli-D-lizinnel burkolt tenyésztő lemezekkel. Két kísérletről számolnak be, amelyben egyik szérumos tápközeget használnak először, ezután pedig a tépközeget 0,5% laktalbumin-hidrolizátummal kiegészített szárum-mentes tápközegre cserélik ki néhány napos termelésre (lásd a közelményben az 1(B) és 2(B) ábrákat a 356. oldalon). Egy szakaszos és egy folyamatos eljárást is tanulmányoztak, de az ezekben a kísérletekhez alkalmazott tápközeg mibenléte nem volt egyértelműen azonosítható. A szerzők nem ismerik fel, hogy itt két különböző PA-ról van szó, amelyeket a sejtek termelnek.
A másik közleményben (Gerard C. Brouty-Boye és munkatársai: „Biosynthesis of Humán TissueType Plasminogen Activator by Normál Cells (Humán szöveti típusú aktivátor bioszintézise normál sejtek révén), Biotechnology, 1058-1062,1984. De35 cember) a szerzők beszámolnak t-PA előállításáról humán embrió tüdő (HEL) sejtekben szérum-mentes tápközegben. Nyolc különböző induktor alkalmazását tanulmányozták t-PA termelésének stimulálására ezekből a sejtekből. Ezek a lehetséges in40 duktorok a következők voltak: kalcitonin (lazac), kolera toxin, kolhicin, konkavalin A. glicin, glicilglicin, heparin, laktalbumin, nátrium-butirát, atrombin, és ultraibolya fény. Ezek közül a konkavalin A jelentősen (négyszeresére növelte a termelést az induktor nélküli állapothoz viszonyítva. A szerzők azt is megjegyzik, hogy szinergikus hatás a konkavalin A és többi vizsgált vegyület között nem volt érzékelhető.
A jelen találmány heparin és endotéliális sejtnö50 veszthető faktor (ECGF) kombinációjának alkalmazását tartalmazza abból a célból, hogy növelje a normál humán diploid tüdő fibroblaszt sejtek által szérummentes tápközegben termelt t-PA és SCUPA mennyiségét. A EGCF szarvasmarha hipotala55 muszból vagy hipofízisből származó extraktum, amely stimulálja a szarvasmarha és humán vénás és aortás endotéliális sejtek növekedését (lásd Maciag T. és munkatársai: Proceeding of the National Academy of Science, 76,5674-78 (1979); és Olander J.
és munkatársai: In Vitro, 16,209 /1980/). Az ECGF kereskedelmi forgalomban kapható. A heparinról leírták, hogy 90 μg/ml koncentrációban fokozza az ECGF stimulátor hatását humán köldök vénás endotéliális sejtek (HUVE) burjánzására és felnőtt emberi véredényekből származó endotéliális sejtek
-2HU 201800 Β burjánzására. Nincsen arra utalás, hogy ezek a szerek stimulálnak a PA termelést ezekben a sejtekben (lásd Thomton S.C. és munkatársai: Science, 222, 623 /1983/). Ebben a tanulmányban a tápközeg 20 százalék borjúembrió-szérummal van kiegészítve. Maciag T. és munkatársai (Science, 225, 932-5 /1984/) továbbá arról számolnak be, hogy a heparinnak erős kötő aktivitása van ECGF-hez, amely az ECGF heparin-Sepharose kromatográfiás kivonásának alkalmazásában is megmutatkozik. A jelen találmány abban különbözik a fentiektől, hogy az ECGF és a heparin kombinációjáról úgy találtuk, hogyjelentősen növeli a normál humán tüdő fibroblaszt tenyészetek által szérummentes tápközegben termelt t-PA és SCU-PA mennyiségét. Amint alább leírjuk, más endoteüális sejt polipeptid autogéneket is lehet alkalmazni ebben a találmányban endoteliális sejtnövesztő faktorként, így ezután az ECGF kifejezést úgy alkalmazzuk, hogy azokat az endoteliális sejtnövesztő faktorokat ölelje fel, amelyeket szarvasmara hipofízisből vagy hipotalamuszból izolálhatunk. Az „endoteliális sejtnövesztő faktor” kifejezés viszont, amint ezt a továbbiakban alkalmazzuk, a többi endoteliális sjet polipeptid autogéneket foglalja magában.
A jelen találmány eljárást nyújt szöveti plazminogén aktivátor (t-PA) és egyetlen láncú urokináz plazminogén aktivátor (SCU-PA) termelésének növelésére normál humán diploid tüdő fibroblaszt sejttenyészetekben szérummentes tápközegben, az eljárás abból áll, hogy a fenti tenyészethez heparint vagy kis molekulatömegű heparint és endoteliális sejtnövesztő faktort adunk. A standard (nem tisztított), kereskedelmi forgalomban levő ECGF-re számolva az ECGF-et a szérum-mentes tenyésztő tápközeghez 5 μg/ml-220 μg/ml koncentrációban, és a heparint vagy kis molekulatömegű heparint 5 μg/ml - 220 gg/ml koncentrációban adjuk. Az ilyen standard ECGF-re vonatkoztatva a heparin vagy kis molekulatömegű heparin előnyös koncentrációja 25 μg/ml és 150 μg/ml között, és az ECGF előnyös koncentrációja 25 μg/ml és 100 μg/ml között van. A heparin vagy kis molekulatömegű heparin még előnyösebb koncentrációja 30 μg/ml és 100 μg/ml között van, és az ECGF még előnyösebb koncentrációja 25 μg/ml és 60 pg/ml között van. Ezen kívül amikor az ECGF koncentrációja 15 μg/ml alatt van, akkor 30 μg/ml heparin-koncentráció vagy több az előnyös. Hasonlóképpen, amikor az alkalmazott heparin koncentrációja 15 μg/ml alatt van, akkor 25 μg/ml ECGF koncentráció vagy több az előnyös. A heparin (standard molekulatömegű) az előnyös a kis molekulatömegű heparinnal szemben. Bár bármilyen normál humán diploid tüdő fibroblaszt sejtet lehet alkalmazni a t-PA és SCU-PA termelésére a jelen találmány eljárása szerint, az előnyös törzsek a WI-38, MCR5, IMR-90 és IMR-91. A legelőnyösebb a WI-38 tüdő fibroblaszt sejt törzs.
A találmány továbbá eljárást nyújt szöveti plazminogén aktivátor (t-PA) termelésének növelésére normál diploid tüdő fibroblaszt sejttenyészetekben, amely abban áll, hogy a tenyészethez heparint vagy kis molekulatömegű heparint és enditeliális sejtnövesztő faktort adunk. A standard (nem tisztí4 tott), kereskedelmi forgalomban levő ECGF-re számolva az ECGF-et a szérummentes tenyésztő tápkőzeghez 5 μβ/ηιΐ - 220 pg/ml koncentrációban, és a heparint vagy kis molekulatömegú heparint 5 μ(ϊ/πι1 - 220 mcg/ml koncentrációban adjuk. A heparin vagy kis molekulatömegű heparing és az ECGF különböző előnyös koncentrációi a fentebb már leírtakéval azonosak a találmánynak ebben az alkalmazásában is. A heparin az előnyös a találmánynak ebben az alkalmazásában is. Az előnyös és legelőnyösebb tüdő fibroblaszt sejttenyészet törzsek a t-PA előállításához ugyanazok, amelyeket a mind t-PA, mind az SCU-PA előállítását egyaránt célzó fentebb leírt, találmányunk szerinti eljárásnál előnyösnek htunk le.
A találmány továbbá eljárást nyújt egyetlen láncú urokináz plazminogén aktivátor (SCU-PA) termelésének növelésére normál humán diploid tüdő fibroblaszt sejttenyészetekben, amely abban áll, hogy a tenyészethez heparint vagy kis molekulatömegű heparint és endotéliális sejtnövesztő faktort adunk. A standard (nem tiszított), kereskedelmi forgalomban levő ECGF-re számolva az ECGF-et a szérummentes tenyésztő tápközeghez 5 pg/ml 220 μg/ml koncentrációban, és a heparint vagy kis molekulatömegű heparint 5 μg/πll - 220 (xg/ml koncentrációban adjuk. A heparin vagy a kis molekulatömegű heparin és az ECGF különböző előnyös koncentrációi a fentebb már leírtakéval azonosak a találmánynak ebben az alkalmazásában is. A heparing az előnyös a találmánynak ebben az alkalmazásában is. Az előnyös és legelőnyösebb tüdő fibroblaszt sejttenyészet törzsek az SCU-PA előállításához ugyanazok, amelyeket a mind a t-PA, mind az ACU-PA előállítását egyaránt célzó fentebb leírt, találmányunk szerinti eljárásnál előnyösnek írtunk le.
Mind az endotéliális sejtnöveszto faktor (ECGF), mind a heparing kereskedelmi forgalomban kapható. A találmány gyakorlati megvalósításában alkalmazott standard ECGF egyik forrása a Collaborative Research, Inc., Lexington, Massachusets. AZ ő ECGF-jük (amelyet „endotéliális sejtnövesztő kiegészítődnek, vagy „CR-ECGSnek neveznek) szarvasmarha hipotalamuszból készül. A standard ECGF másik forrása a Seragen, Inc., Boston, Massachussets, akik az anyagot szarvasmarha hipofízisből készítik. Az alábbi I-V. Táblázatok a találmány szerinti eljárást t-PA és SCUPA termeléséhez standard ECGF-et alkalmazva mutatják be. A heparin megbízható kereskedelmi forrásaként számos hely szóba jöhet. A „kis molekulatömegű heparin”, ahogy itt használjuk, depolimerizált heparint jelent, amelynek átlagos molekulatömege 15000-nél kevesebb. A jelen találmány gyakorlati kivitelezésében alkalmazott kis molekulatömegű heparint a 4,281,108 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás úja le; ennek átlagos molekulatömege mintegy 5000.
A fentebb leírt endotéliális sejtnövesztő faktoron (ECGF és p-ECGF) kívül, amelyeket szarvasmarha hipotalamuszból és szarvasmarha hipofízisből izoláltak, más endotéliális sejtnövesztő faktorokat is izoláltak és jellemeztek. így létezik az endotéliális sejt polipeptid mitogéneknek egy családja,
-3HU 201800 Β amelyeket endotéliális sejtnövesztő faktoroknak azonosítunk és amelyeket benne foglaltatnak az endotéliális sejtnövesztő faktor fogalmában ahogyan itt alkalmazzuk. így Schreiber Alán B. és munkatársai (The Journal of Cell Biology, 101, 11231626 (1985/) meghatározták, hogy a savas, agy-eredetű fibroblaszt növekedési faktor (savas FGF), és a szarvasmarha szem-eredetű Π. növekedési faktor (EDGF-Π) ebbe az endotéliális sejtnövesztő faktor (ECGF) családba tartozik. Javasolták továbbá, 10 hogy az α-heparing kötő növekedési faktort (aHGF), savas hipotalamusz eredetű növekedési faktort (savas HDGF), és retina eredetű növekedési faktort (RDGF) szintén úgy határozzák meg, hogy ebben az endotéliális sejtnövesztő faktor (ECGF) 15 családba tartozzanak. Mégis a hipotalamusz-eredetű növekedési faktor az igazán használatos ennek a találmánynak a gyakorlati alkalmazásában.
Schreiber és munkatársai (fentebb idézett munka, 1625. oldal) a következő tényezőket írják le, 20 amelyeket alkalmaztak, hogy megállapítsák, melyik endotéliális sejt polipeptid faktor családba: (a) heparin affinitás; (b) kereszt-reaktivitás poliklonális ECGF antiszérumokra és monoklonális ECGF antitestekre; (c) versengés ECGF-fel a nagy affinitású 25 endotéliális sejt eredetű receptorokhoz való kötésért; és (d) hatékony heparin potenciroz. Ezen kívül az ECGF ellen készített antitestek gátolják a savas FGF és EDGF-II mitogén aktivitását, továbbá bizonyítékokat nyújtva a családok rokonságé- 30 hoz. így az ezeket a jellemzőket, főleg az (a), (c) és (d) szerinti jellemzőket mutató endotéliális sejtnövesztő faktorok beletartoznak a jelen találmány gyakorlati megvalósításához megfeleld enditéliális sejtnövesztő faktorok közé. A különböző ismert endotéliális sejtnövesztő faktorok előállítása és tisztítása a szakirodalomban le van írva. így pl. a 5 savas FGF kivonását és tisztítását Thomas K. és munkatársai írják le (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 81,357-361 /1984/).
A VI., VII. és VIII. Táblázatok mutatják be a jelen találmány szerinti t-PA és SCU-PA termelést a tisztított „p-ECGF’ endotéhális sejtnövesztő faktort alkalmazva. A tisztított ECGF szintén beszerezhető a kereskedelemben a Collaborative Research Inc.-től (Lexington, Massachussets). Ezt az anyagot Burgess W. H. és munkatársai eljárása szerint készítik (Journal of Biological Chemistry, 260,11,389-11,392/1985/), és 90%-os vagy nagyobb tisztaságú. Amikor ezt a t-PA és/vagy SCU-PA termelésében alkalmazzuk a jelen találmány szerint, tisztított ECGF-et (p-ECGF) adunk a tenyésztő közeghez 25 nanogramm/ml (ng/ml) vagy nagyobb koncentrációban. A tisztított ECGF előnyös koncentráció tartománya 50 nanogramm/ml és 500 nanogramm/ml között van. A tisztított ECGF különösen előnyös koncentrációja 100 nanogramm/ml és 300 nanogramm/ml között van.
Az alábbi I. Táblázat bemutatja a találmány szerinti heparin + ECGF koncentráció potencirozó hatását a t-PA termelésére humán diploid tüdő fibroblaszt sejtek WI-38 és MRC-5 törzseiből. Ezekben az eljárásokban a hepaint 90 ^g/ml koncentrációban és az ECGF-et 50 ^g/ml koncentrációban alkalmazzuk.
I. Táblázat
Normál humán fibroblaszt által végzett t-PA termelés függősége ECGF és heparin jelenlététől szérummentes tápközegben
| Sejt-típus | Tenyészet száma/tc | Idő (óra) | semmi | RPMI-1640 plusz heparinb ECGF0 t-PAd (ng/üreg) | heparin/ECGF | |
| WI-38 | C8/tc28 | 24 | 0 | 0 | 0,3 | 22,6 |
| 46 | 0 | 0 | 16,5 | 136,5 | ||
| 96 | 0 | 0 | 7,1 | 193,1 | ||
| WI-38 | C9/tc24 | 24 | 0 | 0 | 13,9 | 33,9 |
| 46 | 4,2 | 15,9 | 31,0 | 146,0 | ||
| 96 | 8,8 | 19,7 | 31,0 | 192,2 | ||
| WI-38 | C14/tc25 | 24 | 8,1 | 14,9 | 32,3 | 72,0 |
| 46 | 13,0 | 26,8 | 34,9 | 134,7 | ||
| 96 | 15,5 | 15,2 | 25,9 | 220,6 | ||
| MCR-S | tc25 | 24 | 9,7 | 10,5 | 28,2 | 43,3 |
| 96 | 22,4 | 26,9 | 35,3 | 256,7 |
a) A tenyészet száma különböző időpontokban liofilezett egyedi tenyészetekre vonatkozik.
A te a szövettenyészet átoltásának szintjét jelzi (azaz az a szám, ahányszor a tenyészetet átoltottuk, általában kettőzéssel)
b) A heparint 90 μg/ml koncentrációban alkalmazzuk,
c) Az ECGF-et (endotéliális sejtnövesztő faktor) 50 μg/ml koncentrációban alkalmazzuk.
d) A t-PA-t (szöveti plazminogén aktivátor) ELISA méréssel határozzuk meg, tisztított humán méh t-PA ellen irányuló IgG-t alkalmazva
-4HU 201800 Β
Ezekhez a tanulmányokhoz a tenyészeteket összefolyásig növesztjük 24 üreges szövettenyésztő lemezeken, 10% borjúembrió szérummal és gentamicinnel kiegészített RPMI-1640-et alkalmazva. Az összefolyáskor a szérum-tartalmú tápközeget eltávolítjuk az üregekből és a sejteket kétszer vagy háromszor mossuk foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldattal. RPMI-1640 tápközeget adalékokkal (azaz heparinnal, ECGF-fel, vagy heparin/ECGFfel) vagy adalékanyagok nélkül adunk az üregekhez (1 ml/üreg) és adott időpontokban alikvotokat veszünk ki a vizsgálatokhoz. Négyszeres párhuzamosban készült üregekből az alikvotokat összegyűjtjük és Tween-80-at adunk hozzá 0,01% végső koncentrációban. A mintákat 4 °C hőmérsékleten tároljuk a mérési eljárásig. A t-PA-t standard ELISA vizsgálati készletet alkalmazva mérjük, a készlet az American Diagnostica-tól (Greenwich, Connaecticut) szerezzük be. Az SCU-PA-hoz az ELISA vizs5 gálatot a fentebb leírtak szerint fejlesztjük ki.
Az alábbi HA. és II.B. táblázatokban a t-PA termelését ki nem egészített tápközeggel, egyedül ECGF-fel kiegészített tápközeggel, egyedül heparinnal kiegészített tápközeggel, és EGCF/heparin10 nal kiegészített tápközeggel mérjük - ECGF és heparin változó koncentrációinál. AIIA és ΠΒ táblázatokban bemutatott tanulmányokat azonos módon hajtjuk végre, mint ahogy ezt az I. Táblázattal kapcsolatban leírtuk. WI-38 (TC 25) humán diplo15 id fibroblaszt sejteket alkalmazunk.
IIA TÁBLÁZAT t-PA termelése ECGF-fel, heparinnal, és ECGF/heparinnal különböző koncentrációknál
| Tápközeg | 7 | 16 | 25 | Idő (óra) 30 t-PA (ng/üreg) | 42 | 50 | 62 |
| 1ARPMI | 5 | 9 | 11 | 15 | 19 | 17 | 19 |
| 25 ^g ECGF | 7 | 23 | 29 | 32 | 36 | 32 | 32 |
| 3.10 Kg ECGF | 7 | 36 | 51 | 67 | 77 | 75 | 79 |
| 4.25 Kg ECGF | 10 | 42 | 50 | 73 | 77 | 80 | 78 |
| 5.50 Kg ECGF | 12 | 38 | 58 | 85 | 94 | 92 | 103 |
| 6.100 μ ECGF | 11 | 43 | 64 | 93 | 113 | 115 | 121 |
| 7.200 Kg ECGF | 13 | 54 | 83 | 116 | 145 | 152 | 163 |
| 8.5 Kg ECGF | 13 | 51 | 85 | 140 | 194 | 217 | 243 |
| + 90 KgHepo 9.10 Kg ECGF | 12 | 55 | 86 | 131 | 171 | 184 | 239 |
| + 90 KgHep 10.25 Kg ECGF | 14 | 68 | 195 | 141 | 207 | 222 | 300 |
| + 90 KgHep 1150 Kg ECGF | 12 | 83 | 107 | 150 | 194 | 229 | 307 |
| + 90 KgHep 12.100 Kg ECGF | 15 | 65 | 107 | 148 | 196 | 241 | 350 |
| + 90 KgHep 13.200 Kg ECGF + 90 KgHep | 20 | 76 | 128 | 175 | 258 | 305 | 421 |
IIB TÁBLÁZAT t-PA termelése ECGF-fel, heparinnal, és ECGF/heparinnal különböző koncentrációknál
Idő (órák)
| Tápközeg | 7 | 16 | 25 | 30 t-PA (ng/üreg) | 42 | 50 | 62 |
| 1B.RPMI | 5 | 8 | 7 | 10 | 9 | 15 | 18 |
| 14.5Kg Hep | 5 | 7 | 12 | 12 | 19 | 23 | 28 |
| 15.15 KgHep | 4 | 8 | 7 | 7 | 9 | 20 | 19 |
| 16.30 Kg Hep | 6 | 7 | 11 | 9 | 12 | 14 | 15 |
| 17.90 pg Hep | 6 | 8 | 10 | 10 | 11 | 20 | 20 |
| 18.180 Kg Hep | 7 | 8 | 20 | 14 | 16 | 17 | 28 |
| 19.5 Kg Hep | 8 | 36 | 59 | 90 | 118 | 165 | 231 |
| + 50 Kg ECGF 20.15 pg Hep | 9 | 47 | 86 | 101 | 141 | 174 | 241 |
| + 50 Kg ECGF 21.30 Kg Hep | 8 | 54 | 71 | 84 | 141 | 171 | 241 |
| + 50 pg ECGF 22.90 KgHep + 50 Kg ECGF | 10 | 51 | 98 | 120 | 171 | 203 | 283 |
-5HU 201800 Β
10
IIB TÁBLÁZAT (folyt.) t-PA termelése ECGF-fel, heparinnal, és ECGF/heparinnal különböző koncentrációknál
| Tápközeg | 7 | 16 | Idő (órák) 25 30 42 t-PA (ng/üreg) | 50 | 62 |
| 23.180 jigHep + 50 pg ECGF | 12 | 76 | 95 116 170 | 221 | 312 |
A ΠΙ. Táblázat a Bowes melanóma sejtek által nóma sejtek a tisztított t-PA eredeti forrásai (ezetermelt t-PA és SCU-PA termelését mutatja be két a tanulmányokat hasonló módon hajtjuk végre,
ECGF-fel (50 pg/ml) és heparinnal (90 pg/ml) mint az I. Táblázat szerinti eljárásban), kombinációban, vagy ezek nélkül. A Bowes melaIII. TÁBLÁZAT t-PA és SCU-PA termelése Bowes melanóma sejtekkel ECGF/heparin faktorokkal vagy ezek nélkül
| Tápközeg | 6 | 12 | Idő (óra) 24 48 t-PA (ng/ml) | 72 | 96 |
| faktorok nélkül | 15 | 25 | 65 140 | 215 | 225 |
| + ECGF/Hep | 15 | 40 | 95 160 | 195 | 180 |
| SCU-PA (ng/ml) | |||||
| faktorok nélkül | 0a | 0 | 0 0 | 0 | 0 |
| + ECGF/Hep | 0 | 0 | 0 0 | 0 | 0 |
a) 0 a kimutathatatlanságot jelenti, azaz kisebb értékeket, mint a mérés érzékenysége (mintegy 1 ng)
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a Bowes melanóma sejtek csak t-PA-t termelnek, amelynek szintje lényegében azonos marad ECGF/heparin hozzáadásává! a tenyésztő tápközeghez, vagy anélkül.
Az alábbi IV. Táblázat bemutatja mint t-PA, mind SCU-PA termelését WI-38 sejtekkel ECGFfel és heparinnal kombinációban (50 mcg/ml, illetve 90 mcg/ml), vagy ezek nélkül.
IV. TÁBLÁZAT t-PA és SCU-PA termelése WI-38 sejtekkel ECGF/heparin faktorokkal, vagy ezek nélkül
| Tápközeg | 3 | 4 | Idő (nap | ||
| t-PA (ng/ml) | 5 | 6 | |||
| faktorok nélkül | 45 | 30 | 25 | 30 | |
| + ECGF/Hep | 365 | 510 | 495 | 590 | |
| faktorok nélkül | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| + ECGF/Hep | 240 | 335 | 300 | 320 |
Ezek az eredmények megalapozzák, hogy az ECGF és heparin kombinációjának hozzáadása humán fibroblaszt sejttenyésztő tápközeghez lényegesen növeli mind t-PA, mind SCU-PA termelését.
Az alábbi V: Táblázat a t-PA termelését mutatja be a két faktorral (ECGF és heparin) vagy azok nélkül a tápközeg visszavezetésével, gördülő palackokat alkalmazva. Az alkalmazott szövettenyészet
WI-38/TC27. Az első ciklusban a tenyészetet 10%os szérumos tápközegben növesztjük. Ezt mosással eltávolítjuk és szárummentes tápközeggel (RPMI) helyettesítjük a fenti faktorokkal, vagy azok nélkül (az ECGF koncentráció 50 μg/ml, és a heparin60 koncentráció 90 pg/ml). A bemutatott adatok a szérummentes tápközegben egymást követő ciklusok napja szerint vannak feltüntetve.
-6HU 201800 Β
12
V. TÁBLÁZAT t-Pa termelése faktorokkal (ECGF + heparín) vagy azok nélkül, visszavezetéssel
| t-Pa (ng/ml) | |||
| nap | faktorok faktorokkal nélkül | ||
| í. ciklus | 2 | 15 | 150 |
| 3 | 30 | 140 | |
| 4 | 25 | 130 | |
| 2. ciklus | 2 | 50 | 760 |
| 3 | 100 | 1165 | |
| 4 | 240 | 1136 | |
| 3. ciklus | 2 | 600 | 650 |
| 3 | 560 | 960 | |
| 4 | 500 | 910 | |
| 4. ciklus | 2 | 50 | 260 |
A meghatározáshoz a később leírt ELISA t-PA mérést használjuk.
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az ECGF és heparín kombinációja nagy mértékben növeli a t-PA termelését szérummentes tápközegben, amikor a sejteket visszavezetjük egy hosszabb időtartamú termelési műveletben.
A t-PA termelésének szintjét ECGF/heparinnal stimulált WI-38 tenyészetekben így 2001000ng/106 sejt/nap nagyságrendben határozzuk meg. Azt is megállapítjuk, hogy a fibroblaszt diploid sejteket legalább kétszer, esetleg háromszor vissza lehet vezetni, hogy t-PA-t termeljenek. így, amint ezt a fenti V. Táblázat bemutatja, az olyan tenyészeteket, amelyeket t-PA termeléséhez stimuláltunk, 48 óra múlva visszatápláljuk növesztő tápközeggel (amely 10% boíjúembrió szérumot tartal5 máz), majd ezt követően (öt nap után) újra stimuláljuk szérummentes, ECGF és heparin-tartalmú tápközegben. Az eredmények azt mutatják, hogy a sejtek képesek t-PA termelésére olyan szinten, amely összehasonlítható mértékű vagy nagyobb, mint a primer stimulálás után megfigyelt.
A faktorok maximális koncentrációjánál (ECGF ^g/ml-nél és heparín 90 ^g/ml-nél) hasonló eredményeket kapunk tekintet nélkül arra, vajon a diploid fobroblaszt szövettenyésztő lemezeken te15 nyésztjük (amely 95% levegő és 5% CO2 jelenlétében növekszik), vagy zárt szövettenyésztő üvegedényben tenyésztjük, 25 cm2 -150 cm2 mérettartományban. A találmányt gyakorlatban sikerrel hajtjuk végre 200-as szinten (teljes nedves sejt-tö20 meg mintegy 8 g 150 cm-es üvegedényben a rekombináns munkákhoz szükséges hírvivő RNS termelésének folyamán.
Az alábbi VI., VII., és VIII. Táblázatokban a t-PA, SCU-PA, illetve t-PA termelését mutatjuk be, heparint és tisztított ECGF-et alkalmazva különböző tisztított ECGF koncentrációknál. WI-38 fibroblaszt sejteket és szérummentes tápközeget alkalmazunk ezekben a kísérletekben. Mindhárom kísérletben a heparín, ahol alkalmazzuk, 90 ^g/ml koncentrációban van. Ezekben a táblázatokban a standard ECGF-et „ECGF’-nek jelöljük, míg a tisztított ECGF-et „p-ECGF’-nek jelöljük.
VI. TÁBLÁZAT t-PA termelése standard ECGF-fel és tisztított ECGF-fel különböző koncentrációknál
| Tápközeg | 8 | 24 | Idő (óra) t-PA (ng/üreg) | 48 | 72 |
| 1. RPMI egyedül | - | — | 10 | - | |
| 2.50 p^/ml ECGF | 19 | 70 | 85 | 56 | |
| 3.90 μg/ml hep. | 15 | 8 | 21 | 12 | |
| 4.50 μg/ml ECGF | 20 | 71 | 218 | 320 | |
| + 90 μg/ml hep. | |||||
| 5.50 μg/ml p-ECGF | - | 8 | 14 | - | |
| 6.50 ng/ml p-ECGF | - | 17 | 59 | 46 | |
| + 90 gg/ml hep. | |||||
| 7.100 ng=ml p-ECGF | - | 19 | 63 | - | |
| 8.100 ng/ml p-ECGF | 2,8 | 37 | 99 | 200 | |
| + 90 pg/ml hep. | |||||
| 9.200 ng/ml p-ECGF | 2,4 | 28 | 28 | - | |
| 10.200 ng/ml p-ECGF | - | 65 | 188 | 437 |
+ 90 μg/ml hep.
VII. TÁBLÁZAT
SCU-PA termelése standard ECGF-fel és tisztított ECGF-fel különböző koncentrációknál
| Tápközeg | 8 | Idő (óra) | 72 | |
| 24 SCU-PA (ng/üreg) | 48 | |||
| 1. RPMI egyedül | 32 | 22 | 47 | 134 |
| 2.50 μg/ml ECGF | 160 | 281 | 186 | 289 |
| 3.90 μg/ml hep. | 121 | 101 | 103 | 130 |
-7HU 201800 Β
VII. TÁBLÁZAT (folyt.)
SCU-PA termelése standard ECGF-fel és tisztított ECGF-fel különböző koncentrációknál
| Idő (óra) | ||||
| 8 | 24 | 48 | 72 | |
| Tápközeg | SCU-PA (ng/üreg) | |||
| 4.50 μg/ml ECGF | m | 279 | 256 | 575 |
| + 90 μg/ml hep. 5.50 ng/ml p-ECGF | 5,6 | 80 | 90 | 105 |
| 6.50 ng/ml p-ECGF | 5,1 | 305 | 229 | 323 |
| + 90 μg/ml hep. 7.100 ng/ml p-ECGF | 212 | 244 | 194 | |
| 8.100 ng/ml p-ECGF | 36 | 258 | 249 | 541 |
| + 90 μg/nll hep. 9.200 μg/ml p-ECGF | 11 | 258 | 216 | 238 |
| 10.200 μg/ml p-ECGF + 90 μ^/ηιΐ hep. | 289 | 308 | 730 |
VIII. TÁBLÁZAT t-PA termelése standard ECGF-fel és tisztított ECGF-fel különböző koncentrációknál
| Tápközeg | 8 | 12 | Idő (óra) 24 t-PA (ng/üreg) | 48 | 72 |
| 1. RPMI egyedül | 4,1 | 3,4 | 4,7 | 5,0 | 9,5 |
| 2. Hep.* | 5,4 | 6,6 | 9,4 | 14,3 | 14,6 |
| 3.50 μg/ml ECGF | 4,9 | 7,3 | 27,7 | 27,4 | 27,2 |
| 4.50 μg/ml ECGF + hep. | 8,3 | 15,8 | 51,1 | 102,0 | 149,4 |
| 5.200 ng/ml p-ECGF | 5,1 | 8,1 | 26,7 | 17,3 | 13,7 |
| 6.200 ng/ml p-ECGF + hep. | 6,6 | 11,4 | 37,1 | 76,4 | 79,6 |
| 7.100 ng/ml p-ECGF | 5,4 | 6,5 | 14,3 | 12,0 | 11 |
| 8.100 ng/ml p-ECGF + hep. | 5,7 | 9,1 | 32,6 | 54 | 41,2 |
| 9.50 ng/ml p-ECGF | 4,6 | 5,6 | 8,9 | 7 | 10 |
| 10.50 ng/ml p-ECGF + hep. | 5,5 | 5,9 | 20,4 | 25,6 | 22,6 |
| 11.25 ng/ml p-ECGF + hep. | 5,4 | 6,1 | 13,8 | 17,7 | 16,4 |
| 13.12,5 ng/ml p-ECGF | 3,4 | 5,1 | 4,4 | 5,4 | 7,7 |
| 14.12,5 ng/ml p-ECGF + hep. | 4,9 | 3,3 | 9,2 | 14,1 | 12 |
* a heparin-koncentráció minden esetben 90 μξ/πύ
Fibrin autofrágiát, I-fibrinolizist, immunprecipitálást és vizsgálatot fejlesztünk ki és alkalmazunk a t-PA és SCU-PA termelés mérésére mind kvalitativen, mind kvantitativen. Anti-UK IgG-t tisztítunk ammónium-szulfátos kicsapással és DEAE kromatográfiával humán urokináz (Abbokina- 50 se, Abbot Laboratories, Chicago, Illinois) ellen irányuló kecske antiszérumból. Az így készített antiUK IgG-ről úgy találjuk, hogy kiváló reagens SCUPA immun kicsapásához különböző humán tüdő fibroblaszt tenyészetek felülúszóiból. Ugyanezt az 55 antitestet és egy hasonlóképpen készített nyúl antiUK IgG-t alkalmazunk SCU-PA méréséhez kettős rétegű (szendvics) ELISA mérésben. Az I-VIH. Táblázatokban fentebb bemutatott adatokat a megfelelő ELISA vizsgálattal határozzuk meg. 60
Ezen kívül a plazminogén aktivátorokhoz (t-PA és SCU-PA) egy kromogénes mérési módszert alkalmazunk mikrotitráló lemezeken való használatra. Ebben a közvetett mérésben plazminogént alakítunk át plazmlnná t-PA vagy SCU-PA révén. A 65 plazmin viszont elhasítja a szubsztrátumot, a D-valil-L-leucil-L-lizin-p-nitroanilidet, felszabadítva a p-nitroanilin kromofórt, amelyet fotometriásan mérünk 405 nm-nél. Ez a vizsgálati módszer lineáris a 0,125-5,0 nemzetközi egység (IU) tartományban SCU-PA-ra és 0,5-5 ng/ml tartományban t-PA-ra. A t-PA elleni fajlagos semlegesítő antitest hozzáférhetőségével ezt a módszert lehet alkalmazni az egyes enzimek relatív mennyiségének becslésére komplex keverékekben.
További bizonyítékokat kapunk, amelyek normál humán diploid tüdő fibroblasztok által végzett SCU-PA és t-PA termelést igazolják, két technika segítségével: fibrin autográfiával és immunredpitációval. Mindkét technika enzimek szétválasztásán alapul SDS-akrilamid gélelektroforézissel. Fibrin autográfia esetében az elektroforézissel elkülönítjük PA-k kimutatását úgy érjük el, hogy az akrilamid gélt felülrétegezzük fibrinagarral. Plazminogén jelenlétében plazminnal előidézett fibrinelbomlás következtében létrejött feltisztulások jelen-8HU 201800 Β nek meg azoknál a helyeknél, amelyeket PA aktivitással bíró molekulák foglalnak el.
Immunpredpitádó esetében a metabolikusanin situ ö-metioninnal jelzett fehérjéket először fajlagos antitestekkel reagáltatjuk. Az immunkomplexeket, amelyek így kifejlődnek, ezután szelektíven eltávolítjuk a tenyészfolyadékból A-fehéije-Sepharose gyöngyökön (Protein A-Sepharose, Pharmacia) végzett abszorpcióval, és ezt követő eluálással.
Az ilyen módon izolált, metioninnal jelzett fehérjéket SDS-akrilamid gélen szétválasztjuk, és helyzetüket lokalizáljuk; az akrilamid gélt röntgenfilmre kitéve.
A fibrin autográfiánál két elkülönült elektroforetikus csíkot mutatunk ki (amelyek mindegyike fibrinolitikus aktivitást mutat) a diploid fibroblasztok (WI-38) egybefüggő tenyészeteiből kinyert, (szérum-mentes) használt tápközegben. Az elektroforetikus csíkok egyike az egyetlen láncú urokinázzal (SCU-PA) vándorol együtt (55000 Mr), és a másik csík a tisztított t-PA-van vándorol együtt (63000-65000 Mr), ugyanakkor csak egyetlen fibrinolitikus enzimet találunk a Bowes melanóma tenyészetekből nyert használt tápközegben (szintén 63000-65000 Mr). Amikor az akrilamid géleket felülrétegezzük anti-urokináz IgG-t (150 μg/ml tartalmazó fibrin agarral, a diploid tenyészetből származó az a fibrinolitikus enzim, amely az egyedi láncú urokinázzal együtt vándorol, és maga az egyedi láncú urokináz enzim egyaránt semlegesítődik (azaz az SCU-PA-nak tulajdonítható antitest nélkül megjelenő felsztitulás zónái anti-urokináz IgG jelenlétében eltűnnek). Hasonlóképpen, amikor az akrilamod géleket anti-t-PA IgG-t (50 μg/ml) tartalmazó fibrin agarral rétegezzük felül, a diploid tenyészetekből származó annak a fibrinolitikus enzimnek tulajdonítható feltisztulás zónája, amely enzim együtt vándorol a tisztított t-PA-val, valamint a tisztított t-PA zónája, és a Bowes-féle használt tápközegből származó fibrinolitikus enzim zónája mind eltűnnek.
Az immunredpitádós tanulámyokból származó adatok megerősítik és kiterjesztik a korábbi vizsgálati mérések eredményeit. Ezzel a technikával lehetségessé válik a fajlagos antitesttel kicsapott enzimek molekulatömegének meghatározása összehasonlítva ezek relatív mozgékonyságát ismert molekulatömegű 14C-jelzett fehérjék mozgékonyságával, A Bowes melanóma t-PA ellen készített fajlagos anti-t-PA IgG-t és fajlagos anti-UK IgG-t (az Abbokinase elleni szérumból tisztítva) alkalmazva megállapítjuk, hogy a WI-38 diploid fibroblaszt tenyészetben talált két fibrinolitikus enzim megfelel a 63-65000 Mr molekulatömegű, illetve 55000 Mr molekulatömegű fehérjéknek, ezek a molekulatömegek Bowes melanóma t-PA-nak, illetve a humán egyetlen láncú urokináznak (SCU-PA) felelnek meg. Ezt az azonosítást nem lehetne elvégezni fib rin autográfiával, mivel az enzimek kezelése redukálószerrel, amely kötelező lépés a molekulatömeg meghatározásában, elroncsolja a fibrinolitikus aktivitást. Az immunpredpitációs adatok azt igazolják, hogy a Bowes melanóma sejtek csak t-PA-t termelnek, mivel SCU-PA-t nem lehet kicsapni an16 ti-UK IgG-vel olyan körülmények között, amelynél az SCU-PA-t diploid tenyészfolyadékból kicsapjuk. Az adatok azt is mutatják, hogy az ECGF és a heparin emeli mind a t-PA, mind az SCU-PA szintjét, mivel az immmunredpitálható t-PA és SCUPA mennyisége növekszik, amikor a sejteket ezeknek az adalékoknak a jelenlétében tenyésztjük.
Ezek az adatok az I-VIII. Táblázatokban bemutatott ELISA eredményekkel együtt azt mutatják, hogy az embrió tüdőszövetből származó humán diploid tüdő fibroblasztok két fibrinolitikus enzimeket termelnek, egy urokináz típusú és egy szöveti típusú plazminogén aktivátort. Mindkét enzim termelésének szintje jelentésen megnövekszik ECGF és heparin kombinációjának hozzáadására a tápközeghez. A t-PA és SCU-PA így kapott megnővekedett termelése elegendő arra, hogy lehetővé tegye fajlagos t-PA és SCU-PA mRNS izolálását normál humán diploid tüdő fibroblaszt sejtekből.
Ez a találmány továbbá eljárást nyújt t-PA és SCU-PA termelésének stimulálására emlősökben, valamint eljárást gyógyászati kompozídók előállítására.
Nem régi bizonyítékok jelzik, hogy az endotéliális sejt polipeptid növekedési faktorok vagy mitogének családjának tagjai fontos szerepet játszanak a véredény homeosztázisban (Macig T.: Progress in thrombosis and Hemostasis 7,167 /1984/). Ezekről a faktorokról úgy véljük, hogy az endotéliális sejt vándorlás és burjánzás fajlagos és hatékony szabályozóiként működnek az új véredények képzésének (neovaszkularizáció) folyamatában, amely révén új véredények képződnek (azaz angiogenezis). Ezeknek a faktoroknak biológiai aktivitásáról úgy hiszik, hogy az endotéliális sejtfelületen jelen levő nagy afifinitású polipeptid receptor által közvetített, és a heparin glikozaminglikánnal való szerkezeti kölcsönhatás révén van potencirozva (Schreiber A.B. és munkatársai; Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 82 (6), 138 /1985/; Friesel R. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 26(7), 581 /1986/). Az enditéliális sejtnövesztő faktorok kölcsönhatását endotéliális sejtektől eltérő sejteken levő receptorokkal is közlik ezek a szerzők, ilyenek pl. a humán fityma fibroblasztok, rágcsáló BALB/c3T3 fibroblasztok, humán epidermoid karcinóma (A-431) és humán állkapocs karcinóma (A-549).
A jelen találmány in vitro szempontjai szerint, amelyeket fentebb leírtunk valamely endotéliális sejtnövesztő faktor és heparin stimulálják a humán diploid tüdő fibroblaszt sejteket, hogy több t-PA-t és SCU-PA-t termeljenek. A jelen találmány másrészről eljárást nyújt szöveti plazminogén aktivátor (t-PA) és egyetlen láncú plazminogén aktivátor (SCU-PA) termelésének in vivő stimulálására, beleértve az embert is, ha erre szükség van; az eljárás abból áll, hogy az adott emlősnek hatásos mennyiségű heparint vagy kis molekulatömegű heparint és endotéliális sejtnövesztő faktort adunk. A fentebb leírt endotéliális polipeptid mitrogének, nevezetesen az ECGF, savas FGF és EDGF-Π az előnyösek a találmány ehhez a szempontjához, és az ACGF a legelőnyösebb. A beadásnak az a módja előnyös, amelyben a heparin vagy kis molekulatömegű heparin és az endotéliális sejtnövesztő faktor kombi9
-9HU 201800 Β nációját közvetlenül a vérrög vagy a lehetséges vérrög helyén szolgáltatjuk. így a beadás intravénás, koszorúéren belüli vagy hasonló útja (pl. injekcióval vagy infúzióval) az előnyös.
Amint a jelen találmány hátterét vizsgálva megemlítettük, a t-PA és az SCU-PA endogén trobolitikus szerek, amelyek a véredényekben úgy működnek, hogy a plazminogént átalakítják plazminná. Magát a heparint alkalmazzák a kezelésben, gyakran a sebészi beavatkozás különböző típusaival együtt, beleértve a koszorúérsebészetet, trombózisellenes szerként. A jelen találmánynak ezen szempontja szerint heparint vagy kis molekulatömegű heparint és egy endotéliális sejtnövesztő faktort alkalmazunk a t-PA és/vagy SCU-PA endogén (in vivő) termelésének stimulálására. így a jelen találmány szerint heparin vagy kis molekulatómegú heparin és egy endotéliális sejtnövesztő faktor beadása hasznos a trombózis kezelésére. Ezen kívül a heparin és egy endotéliális sejtnövesztő faktor közti potencirozó hatás t-PA és/vagy SCU-PA termelésében lehetővé teszi a heparin (vagy kis molekulatömegű heparin) alacsonyabb szintű beadását trombózis elleni szerként, mint ez jelenleg szükséges. A heparin terápia fő mellékhatása a vérzés. Ezen kívül Spann J.F. és munkatársai (Drugs, 28, 465-483 és 478 /1984/) beszámolnak arról, hogy egy koszorúér vérrög eloszlatása után (sztreptokináz koszorúéren belüli beadásával) újra elzáródás ment végbe egy 159 betegből álló tanulmányozott csoport átlag (17%-ában a korai intravénás heparin kezelés ellenére. A heparin vagy kis molekulatömegű heparin és egy endotéliális sejtnövesztő faktor beadása jelen találmány szerint hasznos lehet az ilyen újra elzáródás megelőzésére a t-PA vagy SCU-PA endogén szintjének stimulálásával. Hogy megkíséreljék az ilyen újra elzáródás megelőzését, Spann és munkatársai (lásd fentebb idézett munka) beszámoltak 30000 egység/naptól felfelé terjedő heparin-dózis alkalmazásáról egészen addig az adagig, hogy elérjék: a részleges tromboplasztin idő a normálisnak 2-3-szorosa legyen. A heparinnak vagy kis molekulatömegű heparinnal és egy endotéliális sejtnövesztő faktornak azon képessége következtében, amikor a jelen találmány szerint beadjuk, hogy stimulálja a t-PA és SCU-PA endogén termelését, magának a heparinnak az adagját az ilyen újra elzáródás megelőzésében a jelen találmány szerint nagy mértékben lehet csökkenteni. A jelen találmány előnye abban a képességben van, hogy stimulálja az endogén t-PA és SCU-PA termelését olyan körülmények között, amelyben a nagy heparin-adagnak tulajdonítható vérzés szisztematikus fenyegetése csökken (lásd Bergmann
S.R. és munkatársai: Science, 220 1181-1183 /1983/).
A t-PA és/vagy SCU-PA in vitro termelésének stimulálásában való felhasználásnál emlősökben, beleértve az embert is, ha erre szükség van, a heparin vagy kis molekulatömegű heparin előnyös adagja 0,1-5,0 mg/kg/nap (mintegy 1100-50000 egység/nap), és az endotéliális sejtnövesztő faktor előnyös adagja 0,1-5,0 mg/kg/nap. A heparin előnyösebb adagja 0,1-2,0 mg/kg/nap. Az ilyen adagok változhatnak a szóbanforgó betegtől és az állapot súlyosságától függően. Trombózis kezeléséhez nagyobb adagok lehetnek szükségesek, hogy elvégezzék a teljes trombolizist (a rög feloldását). Az előnyös emlős a beadáshoz az ember. A heparin vagy kis molekulatömegű heparin és egy endotéliális sejtnövesztő faktor hatásos adagjának meghatározása egy adott terápiához a gyógyszerészeti és orvosi szakterületen belüli jártasság keretén belül van. Az ilyen meghatározások a t-PA, SCU-PA, fibrinolizis, és más vér- és keringési faktorok szintjeinek megfigyelésén alapulnak. Az adott trombózisok, amelyeket a jelen találmány szerint kezelni lehet, magukban foglalják a tüdő-, koszorúér-, mélyvénás-, és agyi trombózisokat. Ezek közül a tüdő- és koszorúér trombózisok kezelése előnyös, és a tüdő-trombózis kezelése a legelőnyösebb.
Egy még további szempont szerint a jelen találmány gyógyászati kompozíciót nyújt, amely egy endotéliális sejtnövesztő faktort, heparint vagy kis molekulasúlyú heparint, t-PA-t és SCU-PA-t tartalmazó sejtmentes tenyészfolyadékot tartalmaz, ahol az említett tenyészfolyadék normál humán diploid tüdő fibroblaszt tenyészetből származik, amelyhez heparint vagy kis molekulatömegű heparint és endotéliális sejtnövesztő faktort adtak. A t-PA és SCU-PA az említett tenyészet általi termelődése következtében van jelen a tenyészfolyadékban. Ennek a gyógyászati kompozíciónak egy finomított formája, amelyből a 75000 feletti és 50000 alatti molekulatömegek el vannak távolítva, és ezáltal lényegében az említett tenyészet által termelt t-PA és SCU-PA-t tartalmazza, előnyös. Az ilyen finomítás eltávolíthatja a heparin vagy kis molekulatömegű heparin és az endotéliális sejtnővesztő faktor és proteáz-inhibitorok, mint pl. proteáz-nexin vagy plazminogén aktivátor inhibitorok jó részét. Az ilyen gyógyászati kompozíciók közül azok, amelyben az említett tenyészet által termelt t-PA és SCU-PA koncentrációja legalább 1000 ng/ml, az előnyösek.
Az ECGF, p-ECGF és heparin vagy kis molekulatömegű heparin koncentrációi és előnyös koncentrációi, amelyeket a találmány in vitro szempontjainál fentebb leírtunk a t-PA és SCU-PA termelésének módszerére tekintettel, alkalmazhatók a jelen találmány gyógyszerészeti kompozíciókat illető szempontjaihoz is. Hasonlóképpen az ECGF, savas FGF, EDGF-II, α-HGF, savas HDGF és RDGF endotéliális sejtnövesztő faktorok előnyösek a jelen találmány ideillő szempontjához is. Az EDGF, savas FGF és EDGF-II a legelőnyösebbek, és az ECGF különösen rendkívül előnyös. Előnyösek továbbá a WI-38, MRC-5, IMR-90 és IMR-91 normál humán diploid tüdősejtek, amelyek közül a WI-38 a legelőnyösebb.
A találmány szerinti finomítatlan és finomított gyógyászati kompozíciók főleg trombolitikus terápiában (eloszlatni vagy feloldani a vérrögöket), vagy a trombózis-ellenes terápiában (megelőzni, hogy vérrögök képződjenek vagy újra képződjenek) lehet alkalmazni. Amikor ilyan terápiában alkalmazzuk, a finomított kompozíció előnyös adagja 1-20 -1-20 mg t-PA-t és SCU-PA-t tartalmazzon. Kisebb mennyiségű t-PA és SCU-PA lehet szükséges a finomítatlan kompozícióban a heparinnak
-10HU 201800 Β vagy kis molekulatömegű heparinnak és az endotéliális sejtnövesztő faktornak azon képessége következtében, hogy ott stimulálják a t-PA és az SCU-PA in vivő termelését.
Claims (10)
1. Eljárás szöveti plazminogén aktivátor (t-PA) és egyetlen láncú urokináz plazminogén aktivátor (SCU-PA) termelésének növelésére normál humán diploid tüdő fibroblaszt sejttenyészetekben, szérummentes tápközegben, azzal jellemezve, hogy a tenyészethez 5 μ^ιηΐ - 220 μg/ml mennyiségben heparint vagy kis molekulatömegű heparint és 5 μg/ml - 220 μg/ml mennyiségben valamely endotéliális sejtnövesztő faktort adunk. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyészethez heparint adunk. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a heparint vagy kis molekulatömegű heparint 30 μg/ml és 100 μg/ml közti mennyiségben adjuk a tenyészethez. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy endotéliális sejtnövesztő faktorként standard endotéliális sejtnövesztő faktort (ECGF) adunk a tenyészethez. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a standard ECGF-et 25 μg/ml és 60 μg/ml közti mennyiségben adjuk a tenyészethez. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy endotéliális sejtnövesztő faktorként tisztított endotéliális sejtnövesztő faktort (p-ECGF) adunk a tenyészethez. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a p-ECGF-et 50 ng/ml és 500 ng/ml közti mennyiségben adjuk a tenyészethez. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a p-ECGF-et 100 ng/ml és 500 ng/ml közti mennyiségben adjuk a tenyészethez. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy endotéliális sejtnövesztő faktorként endotéliális sejtnövesztő faktort (ECGF), savas agyi eredetű fibroblaszt növesztő faktort (savas FGF), szarvasmarha-szem eredetű II. növekedési faktort (EDGF-II), α-heparin-kötő növekedési faktort (aHGF), savas hipotalamusz eredetű növekedési faktort (savas HDGF), vagy retina eredetű növekedési faktort (RDGF) adunk a tenyészethez. (Elsőbbsége: 1985.10.01.) i7zerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy normál humán diploid tüdő fibroblaszt sejttenyészetként WI-38, MRC-5, IMR 90 vagy IMR-91 tenyészetét alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
11. Az 1. vagy 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy normál humán diploid tüdő fibroblaszt sejttenyészetként WI-38 tenyészetét alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
12. Eljárás szöveti plazminogén aktivátor (t-PA) termelésének növelésére normál humán diploid tü20 dő fibroblaszt sejttenyészetben, szérummentes tápközegben, azzal jellemezve, hogy a tenyészethez 5 μg/ml - 220 μ^/πύ mennyiségben heparint vagy kis molekulatömegű heparint és 5 gg/ml 220 yg/ml mennyiségben valamely endotéliális sejtnövesztő faktort adunk. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy heparint adunk a tenyészetjhez. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
14. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a heparint vagy kis molekulatömegű heparint 30 μg/ml és 100 pg/ml közi mennyiségben adjuk a tenyészethez. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
15. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy endotéliális sejtnövesztő faktorként standard endotéliális sejtnövesztő faktort (ECGF) adunk a tenyészethez. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
16. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a standard ECGF-et 25 pg/ml és 60 μg/ml közti mennyiségben adjuk a tenyészethez. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
17. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy endotéliális sejtnövesztő faktorként tisztított endotéliális sejtnövesztő faktort (pECGF) adunk a tenyészethez. (Elsőbbsége: 1985. 10.01.)
18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a p-ECGF-et 50 ng/ml és 500 ng/ml közti mennyiségben adjuk a tenyészethez. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a p-ECGF-et 100 ng/ml és 300 ng/ml közti mennyiségben adjuk a tenyészethez. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
20. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy endotéliális sejtnövesztő faktorként endotéliális sejtnövesztő faktort (ECGF), savas agyi eredetű fibroblaszt növesztő faktort (savas FGF), szarvasmarha szem eredetű H. növekedési faktort (EDGF-II), α-heparin-kötő növekedési faktort (α-HGF), savas hipotalamusz eredetű növekedési faktort (RDGF) adunk a tenyészethez. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
21. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy normál humán diploid tüdő fibroblaszt settenyészetként WI-38, MRC-5, IMR-90 vagy IMR-91 tenyészetet alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
22. A 12. vagy 21. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy normál humán diploid tüdő fibroblaszt sejttenyészetként WI-38 tenyészetet alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
23. Eljárás egyetlen láncú urokináz plazminogén aktivátor (SCU-PA) termelésének növelésére normál humán diploid tüdő fibroblaszt sejttenyészetekben, szérummentes tápközegben, azzal jellemezve, hogy a tenyészethez 5 μg/ml - 220 gg/ml mennyiségben heparint vagy kis molekulatömegű heparint és 5 pg/ml - 220 μ£/πι1 mennyiségben valamely endotéliális sejtnövesztő faktort adunk. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
24. A 23. igénypont szerint eljárás, azzal jellemezve, hogy heparint adunk a tenyészethez. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
25. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jelle11
-11HU 201800 Β mezve, hogy a heparint vagy kis molekulatőmegű heparint 30 pg/ml és 100 pg/ml közti mennyiségben adjuk a tenyészethez. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
26. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy endotéliális sejtnövesztő faktorként 5 standard endotéliális sejtnövesztő faktort (ECGF) adunk a tenyészethez. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a standard ECGF-et 5 pg/ml és
220 μg/ml közti mennyiségben adjuk a tenyészet- 10 hez. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
28. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a standard ECGF-et 25 μg/ml és 60 μg/ml közti mennyiségben adjuk a tenyészethez. (Elsőbbsége: 1985.10.01.) 15
29. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy endotéliális sejtnövesztő faktorként tisztított endotéliális sejtnövesztő faktort (pECGF) adunk a tenyészethez. (Elsőbbsége: 1985.
10.01.) 20
30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a p-ECGF-et 50 ng/ml és 500 ng/ml közti mennyiségben adjuk a tenyészethez. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
31. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jelle- 25 mezve, hogy a p-ECGF-et 100 ng/ml és 300 ng/ml mennyiségben adjuk a tenyészethez. (Elsőbbsége:
1985.10.01.)
32. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy endotéliális sejtnövesztő faktorként 30 endotéliális sejtnövesztő faktort (ECGF), savas agyi eredetű fibroblaszt növesztő faktort (savas FGF), szarvasmarha szem eredetű II. növekedési faktort (EDGF-II), α-heparin - kötő növekdési faktort (α-HGF), savas hipotalamusz-eredetű nö- 35 vekedési faktort (savas HDGF), vagy retina-eredetű növekedési faktort (RDGF) adunk a tenyészethez. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
33. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy normál humán diploid tüdő fibroblaszt 40 sejttenyészetként WI-38, MRC-5, IMR-90 vagy IMR-91 tenyészetét alkalmazzuk. (Elsőbbsége:
1985.10.01.)
34. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy normál humán diploid tüdő fibroblaszt 45 sejttenyészetként WI-38 tenyészetét alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1985.10.01.)
35. Eljárás trombózis kezelésére alkalmas gyó22 gyászati kompozíció előállítására, azzal jellemezve, hogy egy endotéliális sejtnövesztő faktort heparint vagy kis molekulatömegű heparint, t-PA-t és ScuPA-t tartalmazó, adott esetben finomított, sejtmentes tenyészfoiyadékot, ahol az említett tenyészfolyadék normál humán diploid tüdő fibroblaszt szérum-mentes tápközegben nőtt olyan tenyészetéből származik, amelyhez heparint vagy kis molekulatömegű heparint és az említett endotéliális sejtnövesztő faktort adunk, gyógyászatilag elfogadható segédanyagokkal összekeverünk. (Elsőbbsége: 1986.09.17.)
36. A 35. igénypont szerinti eljárás finomított gyógyászati kompozíció előállítására, azzal jellemezve, hogy olyan finomított tenyészfoiyadékot keverünk, ahol a 75000 feletti és 50000 alatti molekulatömegű anyagok el vannak távolítva és így az említett tenyészet által termelt t-PA-t és/vagy SCUPA-t tartalmazza. (Elsőbbsége: 1986.09.17.)
37. A 35. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább 100-100 ng/ml t-PA-t és SCUPA-t egymástól függetlenül tartalmazó finomított tenyészfoiyadékot keverünk. (Elsőbbsége: 1986. 09.17.)
38. A 35. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy endotéliális sejtnövesztő faktorként endotéliális sejtnövesztő faktort (ECGF), savas agyi eredetű fibroblaszt növesztő faktort (savas FGF), szarvasmarha szem-eredetű II. növekedési faktort (EDGF-II), α-heparin-kötó növekedési faktort (α-HGF), savas hipotalamusz-eredetű növekedési faktort (savas HDGF), vagy retina-eredetű növekedési faktort (RDGF) tartalmazó tenyészetet keverünk. (Elsőbbsége: 1986.09.17.)
39. A 35. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy endotéliális sejtnövesztő faktorként standard endotéliális sejtnövesztő faktort (ECGF) tartalmazó tenyészetet keverünk. (Elsőbbsége: 1986.09.17.)
40. A 35. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy normál humán diploid tüdő fibroblaszt sejtként WI-38, MRC-5, IMR-90, vagy IMR-91 tenyészetét keverjük. (Elsőbbsége: 1986.09.17.)
41. A 35. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy WI-38 humán diploid tüdő fibroblaszt sejt-tenyészetét keverjük. (Elsőbbsége: 1986. 09.17.)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US78265885A | 1985-10-01 | 1985-10-01 | |
| US07/907,004 US4889808A (en) | 1985-10-01 | 1986-09-17 | Method of enchancing t-PA and SCU-PA production |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT42524A HUT42524A (en) | 1987-07-28 |
| HU201800B true HU201800B (en) | 1990-12-28 |
Family
ID=27120027
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU864143A HU201800B (en) | 1985-10-01 | 1986-09-30 | Process for increasing the production of t-pa and scu-pa |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4889808A (hu) |
| EP (1) | EP0219270B1 (hu) |
| KR (1) | KR870004133A (hu) |
| AT (1) | ATE73844T1 (hu) |
| AU (1) | AU603552B2 (hu) |
| DE (1) | DE3684403D1 (hu) |
| DK (1) | DK465986A (hu) |
| ES (1) | ES2046170T3 (hu) |
| GB (1) | GB2181741B (hu) |
| GR (1) | GR3004775T3 (hu) |
| HU (1) | HU201800B (hu) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61221128A (ja) * | 1985-03-26 | 1986-10-01 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | プラスミノ−ゲン活性化因子に対するモノクロ−ナル抗体とその調製方法及び該モノクロ−ナル抗体の使用方法 |
| US5206223A (en) * | 1986-06-26 | 1993-04-27 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Method for inhibiting heparanase activity |
| CA1322163C (en) * | 1986-07-03 | 1993-09-14 | Kenneth A. Thomas, Jr. | Plasminogen activator production |
| GB8723082D0 (en) * | 1987-10-01 | 1987-11-04 | Porton Prod Ltd | Enzyme production |
| US4957863A (en) * | 1988-01-26 | 1990-09-18 | Monsanto Company | Method of increasing yield of t-PA in cell culture |
| WO1989009257A1 (en) * | 1988-03-22 | 1989-10-05 | Invitron Corporation | METHOD TO ENHANCE tPA PRODUCTION |
| US5210037A (en) * | 1988-03-22 | 1993-05-11 | Centocor Incorporated | Method to enhance TPA production |
| US5830685A (en) * | 1990-02-09 | 1998-11-03 | Genentech, Inc. | Method of producing proteins using mammalian lung cell lines |
| US5500409A (en) * | 1990-10-01 | 1996-03-19 | Thomas Jefferson University | Method for inhibiting collagen synthesis by keloid fibroblasts |
| SK120193A3 (en) * | 1991-05-02 | 1994-07-06 | Yeda Res & Dev | Pharmaceutical composition for the prevention and/or treatment of pathological processes |
| US5861382A (en) * | 1992-05-01 | 1999-01-19 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Methods for regulation of active TNF-α |
| US6750207B1 (en) | 1992-05-01 | 2004-06-15 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Compositions for the regulation of cytokine activity |
| US5464815A (en) * | 1993-09-08 | 1995-11-07 | Genentech, Inc. | Inhibition of heparin-binding |
| US7037332B2 (en) * | 2000-03-15 | 2006-05-02 | Orbus Medical Technologies, Inc. | Medical device with coating that promotes endothelial cell adherence |
| US7285536B2 (en) * | 2001-12-05 | 2007-10-23 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | Anti-cancer therapeutic compounds |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL8003402A (nl) * | 1980-06-11 | 1982-01-04 | Leuven Res & Dev Vzw | Nieuwe plasminogeen-activator en farmaceutisch preparaat met trombolytische werking. |
| JPS5951220A (ja) * | 1982-08-02 | 1984-03-24 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 新規なプラスミノ−ゲン・アクチベ−タ−およびその製法ならびにこれを含有する薬剤 |
| US4520107A (en) * | 1982-09-28 | 1985-05-28 | Polydex Chemicals Ltd. | Tissue culture and cell growth-promoting material and its method of manufacture |
| NZ206699A (en) * | 1982-12-30 | 1989-08-29 | Bio Response Inc | Process for the production of serum independent cell lines |
| US4757005A (en) * | 1984-04-19 | 1988-07-12 | Miles Inc. | Method and cell line for obtaining plasminogen activators |
| US4661453A (en) * | 1984-06-19 | 1987-04-28 | American Biogenetic Sciences, Inc. | Production of tissue plasminogen activator factor |
| EP0186084B1 (en) * | 1984-12-24 | 1991-09-04 | Merck & Co. Inc. | Brain-derived growth factor |
| CA1322163C (en) * | 1986-07-03 | 1993-09-14 | Kenneth A. Thomas, Jr. | Plasminogen activator production |
| JP2666348B2 (ja) * | 1988-04-21 | 1997-10-22 | ソニー株式会社 | 再生装置 |
-
1986
- 1986-09-17 US US07/907,004 patent/US4889808A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-09-30 KR KR1019860008204A patent/KR870004133A/ko not_active Application Discontinuation
- 1986-09-30 DK DK465986A patent/DK465986A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-09-30 HU HU864143A patent/HU201800B/hu not_active IP Right Cessation
- 1986-10-01 AU AU63413/86A patent/AU603552B2/en not_active Ceased
- 1986-10-01 ES ES198686307553T patent/ES2046170T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-01 DE DE8686307553T patent/DE3684403D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-10-01 EP EP86307553A patent/EP0219270B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-01 AT AT86307553T patent/ATE73844T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-10-01 GB GB8623615A patent/GB2181741B/en not_active Expired
-
1992
- 1992-06-02 GR GR920401125T patent/GR3004775T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE73844T1 (de) | 1992-04-15 |
| DE3684403D1 (de) | 1992-04-23 |
| DK465986A (da) | 1987-04-02 |
| KR870004133A (ko) | 1987-05-07 |
| ES2046170T3 (es) | 1994-02-01 |
| GB8623615D0 (en) | 1986-11-05 |
| EP0219270A2 (en) | 1987-04-22 |
| AU6341386A (en) | 1987-04-02 |
| US4889808A (en) | 1989-12-26 |
| GB2181741A (en) | 1987-04-29 |
| EP0219270B1 (en) | 1992-03-18 |
| HUT42524A (en) | 1987-07-28 |
| DK465986D0 (da) | 1986-09-30 |
| GB2181741B (en) | 1989-10-18 |
| GR3004775T3 (hu) | 1993-04-28 |
| EP0219270A3 (en) | 1989-04-05 |
| AU603552B2 (en) | 1990-11-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Saksela et al. | The opposing effects of basic fibroblast growth factor and transforming growth factor beta on the regulation of plasminogen activator activity in capillary endothelial cells. | |
| HU201800B (en) | Process for increasing the production of t-pa and scu-pa | |
| Bunning et al. | Interleukin 1 preferentially stimulates the production of tissue-type plasminogen activator by human articular chondrocytes | |
| JPH0378375B2 (hu) | ||
| Stalder et al. | Release of vascular plasminogen activator (v‐PA) after venous stasis: electrophoretic—zymographic analysis of free and complexed v‐PA | |
| Baker et al. | Protease nexins and cellular regulation | |
| Wang et al. | Latent and active plasminogen activator in corneal ulceration. | |
| US4996050A (en) | Fibrinolytic activity enhancer | |
| Saksela et al. | Plasminogen activators, activation inhibitors and alpha2‐macroglobulin produced by cultured normal and malignant human cells | |
| Zacharski et al. | Thrombin‐specific sites of fibrinogen in small cell carcinoma of the lung | |
| Iwamoto et al. | Secretion of plasminogen activator and its inhibitor by glomerular epithelial cells | |
| US4780412A (en) | Fibrinolytic enzymes produced from established non-cancerous cell lines | |
| KR100442758B1 (ko) | 조직인자응고계억제제함유혈관신생저해제 | |
| US5977056A (en) | Treatment of thrombotic events | |
| Sirén et al. | Retinal pigment epithelial cells secrete urokinase-type plasminogen activator and its inhibitor PAI-1 | |
| US20060069035A1 (en) | Peptide for regulation of urokinase plasminogen activator and method of optimizing therapeutic efficacy | |
| JPS63119675A (ja) | 変形組織プラスミン活性化剤 | |
| EP0251806B1 (en) | Plasminogen activator production | |
| AU2003213856B2 (en) | Peptides for regulation of urokinase (uPA) and tissue type (tPA) plasminogen activator and method of optimizing therapeutic efficacy | |
| EP0487660B1 (en) | Treatment of thrombotic events | |
| Rappaport et al. | Heparin Potentiates Endothelial Gell Growth Factor Stimulation of Plasminogen Activator Synthesis by Diploid Human Lung Fibroblasts | |
| JPS62115282A (ja) | 組織プラスミノ−ゲン活性化因子および単鎖ウロキナ−ゼプラスミノ−ゲン活性化因子の増強方法 | |
| Aronson et al. | Human prothrombin fragments FI (αβ) and F2: Preparation and characterization of structural and biological properties | |
| US7271143B1 (en) | Peptides for regulation of urokinase (uPA) and tissue type (tPA) plasminogen activator and method of optimizing therapeutic efficacy | |
| De Petro et al. | Characterisation of fibronectin fragments and plasminogen activators released by RSV-transformed cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |