HU201349B

HU201349B - Process for producing d-amino acid oxidase

Info

Publication number: HU201349B
Application number: HU86789A
Authority: HU
Inventors: Estera Szwajcer; Klaus Mosbach
Original assignee: Klaus Mosbach
Priority date: 1985-01-11
Filing date: 1986-01-10
Publication date: 1990-10-28
Also published as: BG47043A3; EP0211033A1; SE8500157D0; EP0211033B1; CA1283614C; HUT43105A; DK434186A; AU5313886A; JPS62501677A; DK434186D0; FI863673A0; SU1604163A3; DE3680255D1; KR870700092A; FI863673A; KR950000885B1; ATE65260T1; AU599582B2; WO1986004087A1

Description

A találmány tárgya eljárás cefalosporin C-vel szemben hatásos tiszta D-aminosav-oxidáz előállítására.

Az aminosav-oxidáz alkalmazására tartós igény áll fenn oC-ketosavaknak a megfelelő 5 aminosavakböl való előállításához, ugyanis az oC-ketosavak a veseelégtelenségben szenvedő betegek táplálék-kiegészítésére fontosak. Mind a Trigonopsis variábilis élesztőben talált D-aminosav-oxidáz aktivitást [Brodelius, 10 P., Nilsson, K. és Mosbach, K; Appl. Biochem, Biotechnoi. 6, 293-308, (1981)], mind a Providencia baktériumban talált L-aminosav-oxidáz aktivitást [Szwajcer, E., Brodelius, P. és Mosbach, K., Enzyme Microb. Technoi. 4, 409- 15 -413 (1982)] felhasználták. A D-aminosav-oxidáz a cefalosporin C-re is hat, azt oxidatív dezaminálással keto-adipil-7-amino-cefalosporánsavvá alakítja. Hasonló aktivitást Írtak le a 3 658 649 számú amerikai egyesült államok- 20 beli szabadalmi leírásban. Az alkalmazott extraktum azonban csak ammónium-szulfátos lecsapással nyert nyerstermék volt, amely többféle aminosav-oxidázt tartalmazott.

Aminosav-oxidáz aktivitásuk szempontjá- 25 ból számos különféle mikroorganizmust vizsgáltak meg. Ezek közé tartoznak az E. coli, Pseudomonas species, Aerobacter species, Candida tropicalis, Penicillium rocforti, Aspergillus flavus és A. niger, Neurospora 30 crassa, Nocardia, Citrobacter és a Trigonopsis variábilis. Közülük csak a Trigonopsis variábilist és a Citrobactert találták képesnek cefalosporin C keto-adipil-7-amino-cefalosporánsavvá való dezaminálására. A Citro- 35 bacterben az aktivitást igen gyengének találták, úgy vélik, hogy ez az aktivitás membránhoz kötött, mig a Trigonopsis enzimaktivitása jóval nagyobb és a citoplazmában található. 40

Megemlítjük még, hogy cefalosporin C-re ható enzimet sertés veséből is kinyertek [Mazzeo, P. és Romeo, A.; J.C.S.Perkin I(P3),

2532 (1972)].

A 7-amino-cefalosporánsav ipari szem- 45 pontból igen fontos, mivel a szemiszintetikus cefalosporinok előállításának alapjául szolgál hasonlóképpen ahhoz, amint a 6-amino-penicillinsav a szemiszintetikus penicillinekéhez.

A szakirodalomból ismert egy olyan aci- 60 láz, amely a glutaril-7-amino-cefalosporánsav oldalláncát hidrolizálja [Shibyva, Y., Matsumoto, K. és Fuji, T,; Agr. Bioi. Chem. 45, 1561-1567, (1981)]. A glutaril-7-amino-cefalosporánsav a keto-adipil-7-amino-cefalospo- 55 ránsavból egyidejű hidrogén-peroxid képződés mellett spontán jön létre. A 1. reakcióvázlatban bemutatjuk a 7-amino-cefalosporánsav keletkezését Cefalosporin C-ből D-aminosav-oxidáz és aciláz enzimek hatására, θθ

A találmány tárgya eljárás cefalosporin C-re ható Trigonopsis variábilis D-aminosav-oxidáznak lényegében tiszta formában való előállítására. A Trigonopsis variábilis élesztő különféle törzsei számos törzsgyűjteményben 65 hozzáférhetőek, például az NRRL Y-1579, az ATCC 10679, illetve CBS 4095 számon szerepelnek a megfelelő törzskatalógusokban; vizsgálatainkat Trigonopsis variábilis CBS 4095 törzzsel (Central Bureau voor Schimmelculture Baarn, Hollandia) végeztük.

A találmány tárgya még egy a D-aminosav-oxidáznak Trigonopsis variábilisból való izolálására szolgáló eljárás is.

A D-aminosav-oxidáznak homogenitásig való tisztítására alkalmas találmány szerinti egyszerű eljárás három lépésből áll. Ezek a következők:

i) a Trigonopsis variábilis nyers sejtextraktuumát megsavanyitva és melegítve csapadék és felülúszó frakciókra bontjuk, kívánt esetben az extraktumhoz melegítés előtt enzimvédő anyagot adunk, ii, az i) lépésben kapott felülúszó frakciót - kívánt esetben dialízis és bepárlás után - megfelelő mennyiségű ammónium-szulfáttal kezelve második csapadékfrakciót nyerünk, amely csapadék a cefalosporin C-re ható D-aminosav-oxidázt tartalmaz, majd iii) a ii) lépésben kapott csapadékot újra szuszpendáljuk, és a szuszpenzióból a D-aminosav-oxidázt kívánt esetben dialízist követően izoelektromos lecsapással kinyerjük, és kívánt esetben tovább tisztítjuk.

A fenti i) lépés szerinti savanyítást elvégezhetjük ecetsavnak a nyers sejtextraktumhoz való adagolásával. A sejtextraktumot pH 4 és 6 közé, előnyösen pH 5,1 és 5,3 közé, még előnyösebben pH 5,3-ra savanyítjuk.

A találmány egy másik megvalósítási módjánál a savanyítás után, a melegítést megelőzően minden képződött csapadékot eltávolítunk. Továbbá a melegítést megelőzően adagolhatunk a meg savanyított sejtextraktumhoz D,L-metionint is, előnyösen olyan mennyiségben, hogy végkoncentrációja 25 mmól/1 körüli legyen.

A nyers extraktumot az i) lépés szerinti kezelés során 40-60 °C-ra előnyösen 40-50 °C-ra, még előnyösebben 50 °C-ra melegítjük.

A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint az i) lépésben kapott felülúszót az ammónium-szulfáttal való kezelést megelőzően dializáljuk, előnyösen pH 8,3-as, 20 mmól/l-es nátrium-pirofoszfáttal szemben dializáljuk.

Egy további előnyős megvalósítási mód szerint az i) lépésben kapott felülúszót az ammónium-szulfáttal való kezelést megelőzően dializáljuk és bekoncentráljuk. A bekoncentrálást előnyösen bepárlással végezzük.

Az ammónium-szulfátos kezelést egy előnyös megvalósítási forma szerint a következő módon végezzük:

i) a felülúszó frakcióhoz körülbelül 30 tömegX koncentráció eléréséig ammónium-szulfátot adunk, majd a kapott csapadékot eltávolítjuk és

HU 201349 Β ii) a felülúszohoz az 55 tömeg% körüli koncentráció eléréséig további ammónium-szulfátot adagolunk, majd a kapott csapadékot összegyűjtjük.

A D-aminosav-oxidázt tartalmazó második csapadékot a iii) lépésben az izoelektromos lecsapással való elkülönítést megelőzően dializálhatjuk, a dialízist előnyösen pH 8,3-as, 20 mmól/l-es nátrium-pirofoszfáttal szemben végezzük.

Az izoelektromos kicsapás során

i) az előzőekben említett második csapadékot pH 5,1-es 25 mmól/l-es nátrium-acetáttal szemben dializáljuk, majd a dializálás után visszamaradó minden csapadékot eltávolítunk, és ii) az i) lépésben kapott oldatot pH 4,6-os, 100 mmól/l-es nátrium-acetáttal szemben dializáljuk és a kapott tisztított D-aminosav-oxidáz csapadékot összegyűjtjük.

Az izoelektromos lecsapással kapott D-aminosav-oxidázt gélelektroforézissel tovább tisztíthatjuk.,

A találmány szerint a D-aminosav-oxidázt immobilizált formában, előnyösen cianogén-bromiddal aktivált Sepharose-hoz kötve is előállíthatjuk.

A találmány egy további megvalósítási módja a következő:

i) a Trigonopsis variábilis sejteket elroncsolva nyers extraktumot készítünk, majd ezt megsavanyitjuk;

ii) a megsavanyitott nyers extraktumot 50 °C hőmérsékletre melegítjük, a képződött csapadékot eltávolítjuk és a felülúszót dializáljuk;

iii) a ii) lépésben kapott felülúszót ammónium-szulfáttal kezeljük és a kapott csapadékot dializáljuk, majd iv) a D-aminosav-oxidázt izoelektromos kicsapással elkülönítjük.

A találmány egy további megvalósítási módja szerint a következő módon járunk el:

i) a Trigonopsis variábilis nyers sejtextraktumot ecetsavval pH = 5,3-ra savanyítjuk, miközben az extraktum csapadékra és felülúszóra válik el;

ii) a felülúszohoz 25 mmól/1 végkoncentrációig D,L-metionint adunk;

iii) a felülúszót 50 °C-ra melegítjük és tiz percig ezen a hőmérsékleten tartjuk, miközben egy második csapadék és felülúszó képződik;

iv) a iii) lépésben kapott felülúszót pH = 8,3-as, 20 mmól/l-es nátrium-pirofoszfát pufferrel szemben dializáljuk;

v) a iv) lépésben kapott oldathoz 30% vógkoncentrációig nátrium-ammónium-szulfátot adunk, majd a kapott csapadékot eltávolítjuk;

vi) a v) lépésben kapott oldathoz 55% vógkoncentrációig szilárd ammónium-szulfátot adunk, és a képződő csapadekot összegyűjtjük;

vii) a vi) lépésben kapott csapadékot először pH = 8,3-as, 20 mmól/l-es nátrium-pirofoszfát pufferrel, majd pH = 5,1-es, 25 mmól/l-es nátrium-acetát pufferrel szemben dializáljuk, és a dializálás után visszamaradó csapadékot eltávolítjuk, majd viii) a vii) lépésben kapott oldatot pH = 4,6-os, 100 mmól/l-es acetátpufferrel szemben dializáljuk, majd összegyűjtjük a kapott, D-aminosav-oxidázt tartalmazó csapadékot.

A találmányt a későbbiekben ismertetésre kerülő példák és az ábrák segítségével részletesebben is bemutatjuk.

Az 1. ábrán a tisztított D-aminosav-oxidáz poliakrilamidgél elektroferogramja látható. 25 ug tiszta fehérje nátrium-dodecil-szulfátos (SDS, rendszerben való gélelektroforézisével egy frakciót kapunk. (A gél bal oldalán látható kisebb sötét sáv a két különböző gél érintkezésének határvonala.) A gélhez adott jelzőfestéket a fehérje festése előtt eltávolítottuk a gélről.

A 2. ábrán a Trigonopsis variábilis D-aminosav-oxidáz molekulatömeg meghatározásának eredményét mutatjuk be. Az SDS gélelektroforézist 12%-os pöliakrilamidgélen végeztük Laemmli eljárása szerint [Laemli, U.K., Natúré 227, 680-685 (1970)]. A következő standard fehérjéket használtuk: albumin (A; M = 66 000), Ovalbumin (Ον; M =45 000), tripszinogén (Tr; M = 24 000) és lizozim (L; M = 14 500).

A 3. ábrán a gélek D-aminosav-oxidáz aktivitásán alapuló festését mutatjuk be. A bemutatott frakció a találmány szerinti eljárás iii) lépéséből származik. A gélek inkubálása a: cefalosporin C-vel, b: D-leucinnal történt. A vizsgálati módot a kővetkezőkben ismertetjük.

Az alkalmazott anyagok és módszerek a következők:

Anyagok:

A peroxidáz (II típusú, tormából származó), valamennyi aminosav, a cefalosporin C, a dinitro-fenil-hidrazin és az o-dianizidin a Sigma cég (St.Louis, Mo, USA) terméke. Az akrilamid és az N,N’-metilén-biszakrilamid Merck-Schuchardt (München, NSZK) termékek. Az Ν,Ν,Ν’,Ν’-tetrametíl-etilén-díamin, az ammónium-perszulfát és a 0,25 mm szilikagél F254-gyel bevont lemezek a Merck cég (Darmstadt, NSZK) termékei. A növesztő tápközegek a Difco cég (Detroit, USA) termékei. Az oxigénelektródot a Ránk Brothers Bottisham cégtől (Cambridge, Nagy-Britannia) szereztük be.

Módszerek:

Az analitikai izoelektromos fókuszálást pöliakrilamidgélen, LKB 1801-101 rendszerben végeztük. A hordozó amfolitok pH tartománya

3,5-9,5. Az izoelektromos fókuszálást az LKB-nek a pöliakrilamidgélen végzett analitikai elektrofókuszáláshoz való amfolin poliakril-35

HU 201349 Β aniidgél lemezekhez mellékelt útmutatója szerint végeztük (LKB-Produkter AB, Bromma, Sweden, 1979).

A vastartalmat a lundi egyetem analitikai kémiai tanszékén határozták meg atomabszorpciós spektrofotometriás eljárással.

Tenyésztési körülmények:

A vizsgálatokhoz alkalmazott mikroorganizmus, a Trigonopsis variábilis élesztő azonos a Brodelius és munkatársai által alkalmazott mikroorganizmussal (Brodelius, P., Nil— són, K. és Mosbach, K.; Appl. Biochem. Biotechnol. 6, 293-308 (1981). Nagyobb sejttömeget fermentorban, 8 literes tenyészetben nyerünk. Az alkalmazott tápközeg 1% élesztőkivonatot, 1,5% malátakivonatot, valamint 0,2% DL-metionint tartalmaz, pH-ja 6,0. A tenyésztést 44 órán át 28 °C hőmérsékleten végezzük. A törzstenyészetet a fentivel azonos összetételű, de 2% agart is tartalmazó ferde agaron tartjuk fenn. A sejteket a tápközegböl 4000 g értéken 30 percen át folytatott centrifugálással gyűjtjük össze, majd az öszszegyűjtött sejteket mossuk és felhasználásig fagyasztva tároljuk. Több fermentáció átlagos sejthozama a 45-50 g sejtmassza tartományba esik.

Elektroforézis:

Analitikai célra diszk poliakrilamidgél elektroforézist végzünk Hedrick, J.L. és Smith, A.J. [Arc. Biochem. Biophys. 126 155-164 (1968)] módszere szerint, valamint Laemmli, U.K. [Natúré 227 680-685 (1970)] SDS-tartalmú gélekre alkalmazott módszere szerint. Az elektroforézist 8-10 °C hőmérsékleten végezzük. Kezdetben, a jelzófestéknek a szeparálógélbe való vándorlásáig alacsony, csövenként 2 mA áramerősséget alkalmazunk, ezt követően az áramerősséget állandó, 4 mA/csö értékre növeljük. A csövek átmérője 0,8 cm, hossza 9,5 cm. A fehérje helyzetének megállapítására a géleket az elektroforézis után Coomassie Brilliant Blue R színezékekkel festjük.

Az enzimaktivitásnak a gélen való helyzetét Hedrick és Smith előzőekben hivatkozott munkájában leírt módszerével vizsgáljuk, a géleket a képződött hidrogén-peroxid kimutatásával - például o-dianizidin alkalmazásával - festjük. A géleket 5 mmól/1 cefalosporin C-t (vagy más aminosavat), 0,025% peroxidázt és 0,025% o-dianizidint tartalmazó pH 7,2-es 0,1 mól/l-es nátrium-foszfát-pufferben inkubáljuk 30-60 percig, mialatt a vörösesbarna színezék kialakul.

Az enzim preparatív izolálására speciális berendezést dolgoztunk ki. Az üvegcső átmérője 2 cm, hossza 14 cm. 8%-os poliakrilamidgélt készítünk Hedrich és Smith szerint (lásd az előzőekben) pH 8,3-as, 0,19 mól/l-es trisz-glicin-puffer alkalmazásával. A felső gélt riboflavin helyett ammónium-perszulfát és TEMED jelenlétében polimerizáljuk, a katalizátorokat Laemnili eljárásában (lásd az előzőekben) megadott mennyiségben alkalmazzuk. Az elektroforézist 3-4 órán át 10 °C hőmérsékleten folytatjuk, az első 30 percben 20 mA, a továbbiakban 40 mA áramerősség alkalmazásával.

A molekulatömeg meghatározása

A molekulatömeget Hedrick és Sniith eljárásával (lásd az előzőekben) határozzuk meg, az SDS gélelektroforézist Laemmli eljárása szerint (lásd az előzőekben) hajtjuk végre. Az első eljárásnál SIGMA gyártmányú, nem-denaturált poliakriiamidgél elektroforézis molekulatömeg markereket (standardokat), a másikhoz SDS molekulatömeg markereket használunk. A fehérjeineghatározást Lowry, O.H., Rosebrough, N.J; Ferr, A.L. és Randall, R.J. [Bioi. Chem. 193 265-275 (1951)] módszerével végezzük.

D-aminosav-aktivitás vizsgálata

A D-aminosav-oxidázt 50 °C-on 5-10 percig vizsgáljuk az oxigénfogyasztás sebességének Ránk oxigénelektróddal való meghatározásával. Ez idő alatt nem következik be enzimdenaturálódás. A vizsgálati elegy 2 ml végtérfogatban 1,8 ml pH 8,0-as 20 mmól/l-es nátrium-pirofoszfatot, 0,1 ml 100 mmól/l-es cefalosporin C-t és annyi enzimet tartalmaz, amennyi a helyes kezdeti oxigénfogyasztási sebességet biztosítja. 1 egység (E) az alkalmazott körülmények között 1 mmól oxigén/perc oxigénfelvételnek felel meg. Időről időre az aktivitást a képződött ketosav mennyiségének kolorimctriás módszerrel való mérésével is ellenőrizzük. A kolorimetriás vizsgálatot 30 °C-on 2,4-dinitro-fenil-hidrazln, valamint o-dianizidin-peroxidáz alkalmazásával végezzük (lásd az előzőekben).

Példa

Trigonopsis variábilis D-aminosav-oxidáz tisztítása:

Minden műveletet 5 °C hőmérsékleten végzünk.

1. lépés

Nyers extraktum készítése g -20 °C hőmérsékleten fagyasztott sejtpépet felolvasztunk, majd 1,5 térfogat pH

8,3-as, 20 mmól/l-es nátrium-pirofoszfát-pufferben szuszpendáljuk. A sejtszuszpenziót azonos térfogatú porított szárazjéggel keverjük, majd mixerben roncsoljuk. A D-aminosav-oxidáz néhány más oldható fehérjével együtt szabaddá válik. A szétroncsolt sejteket 30 percig 12 000 g-n centrifugáljuk. A szétroncsolt sejteket néhányszor új pufferrel mossuk és centrifugáljuk. Az összegyűjtött felülúszókat 2 mól/l-es ecetsavval pH 5,3-ra savanyítjuk, majd a kapott csapadékot

HU 201349 Β

000 g-n 30 percig végzett centrifugálással eltávolítjuk.

2. lépés

Hőkicsapás

730 ml az 1. lépésből származó savas felülúszóhoz az enzim védelmére 25 mmól/1 DL-metionint adunk. A felülúszót 50 °C hőmérsékletre melegítjük, és 10 percig vízfürdőben ezen a hőmérsékleten tartjuk. A kapott csapadékot 12 000 g-n 30 perc alatt lecentrifugáljuk és a csapadékot eldobjuk. A felülúszót pH 8,3-as, 20 mmól/l-es nátrium-pirofoszfát-pufferrel szemben éjszakán át dializáljuk.

3. lépés

Ammónium-szulfátos kicsapás

A dialízishüvelyben lévő, a 2. lépésből származó mintát a fehérjetartalom növelésére (1%) meleg levegő átfúvásával besűrítjük. A minta pH-ját 2 mól/l-es ecetsavval pH 6,3-ra állítjuk be, majd a mintát 1-2 órán át szilárd ammónium-szulfáttal keverjük. A 30% ammónium-szulfáttal kisózott frakciót állni hagyjuk, hogy csapadék képződjön, majd 12 000 g-n 30 percig centrifugáljuk. A képződött csapadékot eldobjuk, a felülúszót a pH 6,0-ra való beállítása után szilárd ammónium-szulfáttal (55%) keverjük. A képződött csapadékot 30 percig 12 OOOg-n centrifugáljuk, majd pH

8,3-as, 20 mmól/l-es nátrium-pirofoszfáttal szemben dializáljuk.

4. lépés

Izoelektromos kicsapás

10,3 ml, a 3. lépésből származó mintát 12 órán át pH 5,1-ee, 25 mmól/l-es nátrium-acetát-pufferrel szemben dializálunk. A kapott csapadékot 12 000 g-n 30 percig végzett centrifugálással eltávolítjuk. A csapadék nyomokban tartalmaz enzimaktivitást. A felül5 úszót pH 4,6-os, 0,1 mól/l-es nátrium-acetát-pufferrel szemben 12 órán át dializálva ismét kicsapjuk. A képződött csapadék tartalmazza a D-aminosav-oxidáz-aktivitás nagy részét. A csapadékot pH 8,3-as, 20 mmól/l-es pirofoszfátpufferben oldjuk és azonos pufferrel szemben egy éjszakán át dializáljuk. Preparatív diszk-gélelektroforézis

A 4. lépésből származó mintát preparatív gélelektroforézishez használjuk fel. Az elektroforézishez 5 mg a 4. lépésben kapott fehérjét alkalmazunk. A cefalosporin C-vel szemben aminosav-oxidáz-aktivitást mutató sávot kivágjuk és Potter homogenizátorban, 1000 fordulat/perc mellett, pH 8,3-as, 20 mmól/l-es pirofoszfátpufferben 5 percig homogenizáljuk. A kapott szuszpenziót 1000 g-n 20 percig centrifugáljuk. A gélt azonos térfogatú pufferrel háromszor mossuk, és az összegyűjtött felülúszókat meleg levegővel - az előzőekben ismertetettek szerint - 3 ml végtérfogatra sűrítjük, majd a további vizsgálatokhoz felhasználjuk.

³⁰

Eredmények és értékelésük

A találmány szerinti eljárás egyszerű módszert biztosít D-aminosav-oxidáz homoge35 nitásig való tisztítására. Az izoelektromos kicsapást követő preparatív gélelektroforézissel eltávolítjuk a gélelektroforézisnél megfigyelt két további gyenge sávot. A fajlagos aktivitás 5,8 E/mg értékről 3,8 E/mg értékre csökken. (Lásd az 1. táblázatban.) Ez feltehetően az extrahálás alatt bekövetkező részleges denaturálódás vagy még nem azonosított kofaktorok elvesztésének a következménye.

1. Táblázat

Trigonopsis variábilis D-aminosav-oxidáz tisztítása. Az aktivitást cefalosporin C-vel szemben mérjük. A fehérjetartalmat Lowry és mts-i módszerével (lásd az előzőekben) határozzuk meg

Kezelési lépések	(Össz- -aktivitás (Egység)	Fehérje (mg/ml)	Fajlagos aktivitás (Egység/mg)	Tisztítás (Hányszoros)	Hozam (%)
1. Nyers extraktum	384	3,5	0,15	1	100
2. Hőkicsapás	308	5,6	1,0	6,5	80
3. Ammónium-szulfátos
(30-55%) kicsapás	300	6,0	4,9	33,0	78
4. Izoelektromos
kicsapás	154	2,8	5,8	39	40

(pH 4,6)

HU 201349 Β

Nátrium-dodecil-szulfátos poliakrilamid-gél-elektroforézissel egy sávot kapunk (lásd az 1. ábrán), amelynek molekulatömege 43 000 körüli (lásd a 2. ábrán). A natív fehérje molekulatömegét Hedrick és Smith módszerével 5 [Hedrick, J.L. és Smith, A. J.; Arch.Biochem. Biophys. 126, 155-164 (1968))) 86 000 körülinek találtuk.

A D-aminosav-oxidáz ennek megfelelően aktiv formájában 86 000 körüli molekulatöme- 10 gű, két alegységgel bíró dimerként létezik.

A gélek D-leucinnal illetve cefalosporin C-vel való inkubálást kővető festésekor a preparativ gélelektroforézissel nyert mintán csak egy sáv látható, mig a kevésbé tiszti- 15 tott, a 3. lépésből származó készítmény D-leucinnal való inkubálást követően 3, míg cefalosporin C-vel való inkubálást kővetően csak egy sávot ad. (Lásd a 3. ábrán.) Ez azt jelzi, hogy a Trigonopsisban néhány D-ami- 20 nosav-oxidáz vagy izoenzim van jelen, de ezek közül csak egy fejt ki aktivitást cefalosporin C-vel szemben. Trigonopsis variábilis D-aminosav-oxidáz tisztítására ismeretes egy eljárás, amelyet a Berg, C.P. és Rodden, F.A.; 25

Anal. Biochem. 71, 214-222 (1976) szakirodalmi helyen ismertetnek. A szerzők azonban a fehérjének csak a D-leucinnal szembeni aktivitását vizsgálták. Nem ellenőrizték az enzimkészítmény homogenitását. Az eljárás egy 30 szennyezett elegyet eredményez, amely elegy fehérjéi közül némelyek feltehetően aminosav-oxidázok.

Az izolált, cefalosporin C-vel szemben aktív lényegében tiszta D-aminosav-oxidáz tulajdonságai a következők:

Az enzim izoelektromos pontja 4,6 körüli. Az atomabszorpciós elemzések erősen valószínűsítik, hogy az enzim két molekula vasat tartalmaz, ami alegységenként egy molekulának 40 felel meg. 10 mmól/l-es EDTA-val, illetve 1 mmól/l-es o-fenantrolinnal szemben végzett dialízis során az aktivitás változatlan marad.

0,5 mmól/l-es koncentrációnál az arzenites kezelés 46%-ra, a cianidos kezelés 34%-ra csökkenti az aktivitást. Cefalosporin C-re, fenil-alaninra, alaninra, metionra, illetve leucinra a Km értékek 13, 10, 76, 0,76, illetve 0,12. A preparativ gélelektroforézissel kapott minta 5 mg/ml koncentrációnál nem bir a flavin-dependens enzimekéhez hasonló spektrummal, amint az várható volt, mivel a cefalosporin C-vel szemben aktiv, sertésvese eredetű aminosav-oxidáz FAD-dependens [Mazzeo, P. és Romeo, A.; J.C.S. Perkin I(P3) 55

2532 (1972)]. Különböző flavin-kofaktorok, így FMN vagy FAD adagolása nem növeli a lecsökkent fajlagos aktivitást. Sikertelenek voltak a flavinok enzimből való kinyerésére irányuló kísérleteink, igy kálium-bromiddal szemben való extenziv dialízis mind savas közegben [Mayhew, S.G.; Biochim. Biophys.

Acta 235, 289-302 (1971)], mind lúgos pH-n iMassey, V. és Curti, B.; J: Bioi. Chem. 241, 3417-3429 (1966)} sikertelennek bizonyult.

Nem sikerült flavint nyerni tripszinezéssel, forralással vagy 85%-os fenololdattal való extrahálással sem. Ez az eredmény hasonló ahhoz, amelyet Aspergillus nigerböl származó D-aminosav-oxidázzal kapcsolatosan ismertettek, ahol a szerzők nem voltak képesek flavin kimutatására [Kishore, G. és Vaidyanathan, C.S.; Indián J. Biochem. Biophys. 13, 216-222 (1976)].

A tiszta enzim pH 8,3-as, 20 mmól/l-es pirofoszfátpufferben fagyasztott állapotban stabil, A felolvasztás és a fagyasztás nem csökkentik az aktivitást. 8 °C hőmérsékleten az aktivitás igen lassan csökken, szobahőmérsékleten viszonylag alacsony a stabilitás. A hőstabilitás javítására az enzim különféle módszerekkel immobillá tehető. Például a 3. lépésben nyert 17,5 E/ml aktivitású enzimet 1 ml cianogén-bromiddal aktivált Sepharose 4B-vel pH 8,3-as, 0,1 mól/l-es borátpufferben 30 percig 30 °C hőmérsékleten reagáltatva tartós aktivitású 7 E/ml-es Sepharoset nyerünk.

Berg és Rodden tápközegét helyettesítve [Berg, C.P. és Rodden, F.A.; Anal. Biochem. 71, 214-222 (1976)] a tenyésztési időt körülbelül ötödére csökkentettük. 0,2% DL-metionint adva a tápközeghez az enzimhozamot ötszörösére növeltük.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás cefalosporin C-vel szemben 35 aktiv Trigonopsis variábilis D-aminosav-oxidáz lényegében tiszta formában való előállítására, azzal jellemezve, hogy

i) a Trigonopsis variábilis nyers sejtextraktumot megsavanyítjuk és melegítjük, kívánt esetben a melegítés előtt enzimvédő anyagot adunk a sejtextraktumba, ii) a kapott csapadékot tartalmazó oldat felülúszóját, kívánt esetben dialízis és besűrítés után, annyi ammónium-szulfáttal kezel45 jük, hogy második, a D-aminosav-oxidázt tartalmazó csapadékot kapunk, iii) a ii) lépésben kapott csapadékot újra felszuszpendáljuk és a D-aminosav-oxidázt kívánt esetben dialízist követően izoelektro50 mos kicsapással kinyerjük, és kívánt esetben tovább tisztítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nyers sejtextraktumot ecetsavval savanyítjuk meg.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nyers sejtextraktumot 4 és 6 közötti pH-ra savanyítjuk.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nyers sejtextraktuni pH60 -ját 5,1-5,3-ra állítjuk be.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nyers sejtextraktuni pH-ját 5,3-ra állítjuk.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal 65 jellemezve, hogy a megsavanyított nyers

-611 sejtextraktumból melegítés előtt eltávolítjuk a jelenlévő csapadékot.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nyers sejtextraktumhoz melegítés előtt enzimvédö anyagként D,L-me- 5 tionint adunk.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a D,L-metionint 25 mmól/1 végkoncentráció eléréséhez szükséges menynyiségben adagoljuk. 10
9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nyers sejtextraktumot 40-60 °C-ra melegítjük.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nyers sejtextraktumot 40- 15 -50 °C-ra melegítjük.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nyers sejtextraktumot 50 °C-ra melegítjük.
12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, az- 20 zal jellemezve, hogy az i) lépésből származó felülúszöt az ammónium-szulfátos kezelést megelőzően dializáljuk.
13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a dialízist pH 8,3-as, 25 20 mmól/l-es nátrium-pirofoszfát oldattal szemben végezzük.
14. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a felülúszöt a dialízist követően, az ammónium-szulfáttal való keze- 30 lést megelőzően besűrítjük.
15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a besűrítést bepárlással végezzük.
16. Az 1. igénypont szerinti eljárás, az- 35 zal jellemezve, hogy az ammónium-szulfátos kezelés során:

i) a felülúszóhoz 30 tomeg% koncentráció eléréséig ammónium-szulfátot adagolunk, majd a kapott csapadékot eltávolítjuk; és 40 ii) az i) lépésben kapott felülúszóhoz az 55 tömeg% koncentráció eléréséig ammónium-szulfátot adunk, majd a kapott csapadékot összegyűjtjük.
17. Az 1. igénypont szerinti eljárás, az- 45 zal jellemezve, hogy a D-aminosav-oxidázt tartalmazó második csapadékot az izoelektromos kicsapással való elkülönítést megelőzően dializáljuk.
18. A 17. igénypont szerinti eljárás, az- 50 zal jellemezve, hogy a dialízist pH 8,3-as,

20 raraól/l-es nátrium-pirofoszfáttal szemben végezzük.
19. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az izoelektromos kicsa- 55 pást úgy végezzük, hogy

i) a második csapadékot pH 5,1-es,

25 mmól/l-es nátrium-acetát pufferrel szemben dializáljuk, a dializálás után minden visszamaradó csapadékot eltávolítunk és 60

HU 201349 Β ii, a kapott oldatot pH 4,6-os, 100 mmól/l-es acetátpufferrel szemben dializáljuk, majd a kicsapódott tisztított D-aminosav-oxidázt összegyűjtjük.
20 Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az izoelektromos kicsapással kapott D-aminosav-oxidázt gélelektroforézissel tovább tisztítjuk.
21. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy

i) a Trigonopsis variábilis sejteket szétroncsoljuk, és a kapott nyers extraktumot megsavanyítjuk;

ii) a megsavanyított nyers extraktumot 50 °C-ra melegítjük, a képződött csapadékot eltávolítjuk és a felülúszöt dializáljuk, majd iii) a ii) lépésben kapott oldatból a terméket ammónium-szulfáttal kicsapjuk és dializáljuk és iv) a D-aminosav-oxidázt izoelektromos kicsapással elkülönítjük.
22. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy

i) Trigonopsis variábilis nyers sejtextraktumot ecetsav adagolásával pH 5,3-ra savanyítunk, a képződött csapadékot eltávolítjuk, majd ii) a felülúszóhoz 25 mmól/1 végtérfogat koncentráció eléréséig D,L-metionint adunk, iii, a felülúszöt 50 °C hőmérsékletre melegítjük és azt 10 percig 50 °C-on tartva a képződő második csapadékot elkülönítjük a felúlúszótól, iv) a iii)) lépésben kapott felülúszöt pH

8,3-as 20 mmól/l-es nátrium-pirofoszfáttal szemben dializáljuk,

v) a iv) lépésben kapott oldathoz 30 tömeg% koncentrációig nátrium-ammónium-szulfátot adunk és a kapott csapadékot eltávolítjuk, vi) az v, lépésben kapott oldathoz 55% végkoncentrációig szilárd ammónium-szulfátot adunk, és a képződött csapadékot összegyűjtjük, vii) a vi) lépésben kapott csapadékot először pH 8,3-as, 20 mmól/l-es nátrium-pirofoszfát-pufferrel szemben, majd pH 5,1-es, 25 mmól/l-es nátrium-acetát-pufferrel szemben dializáljuk, és a dialízis után visszamaradó minden szilárd anyagot eltávolítunk, majd viii) a vii) lépésben kapott oldatot pH

4,6-os, 100 mmól/l-es acetátpufferrel szemben dializáljuk, és a képződő, D-aminosav-oxidáz-tartalmú csapadékot összegyűjtjük.
23. Eljárás D-aminosav-oxidázt tartalmazó immobilizált készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-23. igénypontok bármelyike szerint előállított D-aminosav-oxidázt ciariogén-bromiddal aktivált Sepharose-val kapcsoljuk össze.

Kiadja az Országos Találmányi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: dr. Szvoboda Gabriella osztályvezető