KR950000885B1 - D-아미노산 옥시다아제와 그의 단리방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

D-아미노산 옥시다아제와 그의 단리방법
제 1 도는 본 발명에 따른 정제된 D-아미노산 옥시다아제의 폴리아크릴겔 전기영동을 나타낸 도면.
제 2 도는 트리고놉시스 버리어빌리스에서 추출된 D-아미노산 옥시다아제의 분자량의 분포를 나타낸 그래프.
제 3 도는 D-아미노산 옥시다아제에 대한 염색활성도를 나타낸 도면.
본 발명은 세팔로스포린 C에 대하여 활성인 D-아미노산 옥시다아제와 효모인 트리고놉시스 버리어빌리스(Trigonopsis Variabilis)로부터 D-아미노산 옥시다아제를 단리시키는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 아미노산류로부터 α-케톤산을 형성하는데 이미 오랫동안 아미노산 옥시다아제 활성을 사용하였으며, 더욱이 신장병환자에 영양보조물로써 아주 효과적이라고 하는데 큰 관심이 집중되어 왔다.
여기서, 아미노산 옥시다아제라고 하는 것은 효모인 트리고놉시스 버리어빌리스내에서 추출된 D-아미노산 옥시다아제 활성(Brodelius, P., Nilsson, K. 와 Mosbach, K., 1981 Appl Biochem, Biotechnol. 6, 293-308)과 세균인 프로비덴시아(Providencia)에서 추출된 D-아미노산 옥시다아제활성(Szwajcer, E., Brodelius, P., 와 Mosbach, K., (1982). Enzyme Microb. Technol. 4, 409-413) 등을 말하는 것이다.
상기의 D-아미노산 옥시다아제는 케토아디프 7-아미노 세팔로스포린산의 말단기에서 산화성 아미노기가 이탈되므로써 세팔로스포린 C에 대하여 활성을 나타내는 것으로써 이러한 활성에 대한 기술이 US-3, 658, 649에 소개되어 있다.
따라서, 이러한 추출물은 황산암모늄에 의한 침전으로 인하여 얻어지며, 아미노산 옥시다아제를 여러개 함유하고 있는 조(粗) 생성물로 나타나게 된다.
한편, E. cole, Pseudomonas species, Aerobacter species, Candida tropicalis, Penicillium rocforti, Aspergillus flavus and A. niger, Neurospora creassa, Nocardia, Citrobacter and Trigonopsis variabilis. 등을 함유하고 있는 서로 상이한 다수의 유기체들의 후미활성도를 시험한 결과 트리고놉시스 버리어빌리스와 시트로벡터만이 케토아디프 7-아미노 세팔로스포린산에서 세팔로스포린 C를 탈아미노 시킴을 알 수 있었다.
여기서 스트로벡터에 의한 활성은 매우 낮으면서, 막 결합으로 나타나게 되고, 이때 트리고놉시스로 된 효소는 세포 질속에 존재하면서, 그 활성도는 매우 높은 수준을 나타남을 알았다.
또한, 세팔로스포린 C에 대한 활성은 돼지신장에서 얻어진 효소에서 찾을 수 있다는 것도 여기서 언급하여 두기로 한다.(Mazzeo, P., Romeo, A. (1982). J. C. S. PerKim I(p3) 2532)
한편, 상기의 7-아미노 세팔로스포린산은 반합성의 페니실린을 제조하는데 6-아미노 페니실린산이 필요하듯이 반합성의 세팔로스포린을 제조하는데 필요한 기본부재로써 산업적으로 크게 각광을 받고 있다.
그리고, 아실라아제는 글루타릴-7-아미노 세팔로스포린산의 측쇄를 가수분해시킨다고 하는 것은 이미 연구되어 왔으며, (Shibyva, y., Matsumoto, k., Fuji, T. (1981). Agr. Biol. Chem. 45. 1561-1567), 여기서 글루타릴-7-아미노 세팔로스포린산은 동시적으로 형성되어진 하이드로겐 페록사이드에 의하여 역시 순간적으로 케토아디프-7-아미노 세팔로스포린산으로부터 형성되게 된다.
다음에 나타낸 다이아그램은 상기 2가지 효소의 영향하에서 7-아미노 세팔로스포린산의 형성을 일예로 나타낸 것이다.
Figure kpo00001
글루타릴-7-아미노세팔로스포린산 7-아미노세팔로스포린산
본 발명은 세팔로스포린 C에 대하여 활성이고 순수한 형태를 나타내는 트리고놉시스 버리어빌리스 D-아미노산 옥시다아제를 제조하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 트리고놉시스 버리어빌리스로부터 D-아미노산시다아제를 단리시키는 방법을 제공하는데 그 목적이 있는 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 따라 균질하게 D-아미노산 옥시다아제를 정제하는 방법은 다음과 같이 3가지 단계로 간단하게 나타낼 수 있는 바, 즉, (a) 트리고놉시스 버리어빌리스의 조세포 추출물을 산성화하고 가열시켜서 침전물과 상청액(上淸液)분획물로 얻는 단계와 (b) 상기 (a) 단계에서 얻어진 상척액 분획물을 황산암모늄으로 충분하게 처리하여 D-아미모산 옥시다아제가 함유된 제 2 침전물을 얻는 단계와, (c) 상기 (b) 단계에서 얻어진 침전물을 재현탁시키고, 등전침전(等電沈殿)으로 D-아미노산 옥시다아제를 분취하는 단계로 이루어진다.
여기서 상기 (a) 단계에서의 산성과정은 조세포 추출물에 아세트산을 첨가하므로써 실시되어지며, 이때 조세포 추출물은 pH가 약 4 내지 6정도로 산성화되는데, 바람직하게는 pH가 5.1 내지 5.3 정도로 하는 것이 좋으나 더욱 바람직하기로는 pH가 5.3이 되도록 하는 것이 좋다.
한편, 본 발명에 따른 다른 구현예로써 상기와 같이 산성화 과정을 실시한 후에 형성된 침전물은 가열하기 전에 제거시켜야 하는데 D, L-메티오닌을 최종농도가 약 25mM 정도로 될 수 있을 만큼 양을 가열하기전에 첨가하면 된다.
그리고, 상기 (a) 단계에서의 가열과정은 약 40°내지 60℃의 온도에서 가열시키되 바람직하기로는 40 내지 50℃의 온도로 가열하는 것이 좋으며, 더욱 바람직하기로는 50℃의 온도에서 실시하는 것이 가장 좋다.
또 다른 구현예로써, 상기 (a) 단계에서 추출물로부터 얻어진 상청액을 황산암모늄으로 처리하기 전에 투석(透析)시키되 pH가 8.3인 20mM의 피로인산나트륨을 함유하고 있는 버퍼(buffer)에서 실시하는 것이 바람직하다.
더욱 바람직스러운 구현예로는, 상기 (a) 단계의 상청액 분획물을 먼저 투석시킨 다음 증발시켜서 농축시킨 것을 황산암모늄으로 처리하는 것이 좋다.
여기서, 황산암모늄에 의한 처리과정을 다음과 같이하면 더욱 바람직스럽게 된다.
즉, (i) 상기 상청액 분획물에 황산암모늄을 첨가하여 약 30중량%의 황산암모늄 농축액으로 만들고, 이때 생성된 침전물은 제거시키는 단계와, (ⅱ) 상기 (ⅰ) 단계의 상청액에 황산암모늄을 다시 첨가하여 약 55중량%의 황산암모늄 농축액으로 만들고, 침전물을 분취하는 단계로 이루어진 것이다.
한편, 상기 (C) 단계에서 제 2D-아미노산 옥시다아제가 함유되어 있는 침전물을 등전침전으로 분취하기전에 먼저 투석시키되, pH가 8.3인 20mM의 피로인산나트륨이 함유되어 있는 버퍼에서 실시하는 것이 좋다.
이때, 상기의 등전침전 과정은, 즉 (a) 상기 제 2 침전물을 pH가 5.1인 25mM의 아세트산 나트륨이 함유되어 있는 버퍼에서 투석시킨 다음 잔존하는 침전물은 제거시키는 단계와, (b) 상기단계에서 얻어진 용액을 pH가 4.6인 100mM의 아세트산나트륨이 함유되어 있는 버퍼에서 다시 투석시킨 다음 정제된 D-아미노산 옥시다아제 침전물을 회수하는 단계로 이루어진 것이다.
상기 등전침전에 의하여 얻어진 D-아미노산 옥시다아제를 겔(gel) 전기영동으로 정제시킨다.
이와같은 본 발명에 따른 D-아미노산 옥시다아제의 형태는 부동화 형태인데 바람직하기로는 시아노겐-브로마이드-활성 세파로오스와 접합시켜두는 것이 좋다.
본 발명의 또 다른 구현예로써 D-아미노산 옥시다아제를 분리해내는 방법으로는 즉, (a) 트리고놉시스 베리어빌리스의 세포를 산성화된 조추출물로 형성시키기 위하여 붕해시키는 단계와, (b) 산성화된 조추출물을 50℃의 온도로 가열시킨 다음 여기서 생성되는 침전물을 제거시키고, 상청액을 투석시키는 단계와, (c) 상기 (b) 단계의 생성물을 황산나트륨으로 침전시키고, 투석시키는 단계와, (d) 등전침전으로 D-아미노산 옥시다아제를 단리시키는 단계로 이루어진 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예로는 (a) 추출물이 침전물과 상청액분획물로 분리되고 pH가 약 5.3정도가 될 때까지 아세트산을 첨가하여 트리고놉시스 버리어빌리스의 조세포 추출물을 산성화시키는 단계와, (b) 상기의 상청액의 최종농도가 25mM로 되도록 D. L-메티오닌을 첨가하는 단계와, (c) 상기의 상청액을 50℃의 온도로 가열한 다음 가열된 상청액을 제 2 침전물과 제 2 상청액 분획물 형태로 50℃의 온도에서 10분 동안 그대로 방치시키는 단계와, (d) 상기 (c) 단계에서 얻어진 상청액을 pH가 8.3인 20mM 피로인산나트륨 버퍼에서 투석시키는 단계와, (e) 상기 (d) 단계에서 제조된 용액의 최종농도가 30%가 되도록 황산암모늄나트륨을 첨가하고 여기서 생성된 침전물을 제거하는 단계와, (f) 상기 (e) 단계에서 제조된 용액을 최종농도가 55%가 되도록 황산암모늄나트륨을 다시 첨가하고 여기서 생성된 침전물을 분취하는 단계와, (g) 상기 (f) 단계에서 제조된 침전물을 먼저 pH가 8.3인 20mM 피로인산나트륨버퍼에서 투석시키고, 다음에 pH가 5.1인 25mM 아세트산나트륨버퍼에서 투석시킨 다음게 잔존하는 불용성 침전물을 제거시키는 단계와, (h) 상기 (g) 단계에서 얻어진 용액을 pH가 4.6인 100mM 아세트산 나트륨버퍼에서 투석시키고 D-아미노산 옥시다아제가 함유된 침전물을 분취하는 단계로 이루어져 있다.
이하 본 발명을 첨부된 도면에 의거 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
첨부도면 제 1 도는 정제된 D-아미노산 옥시다아제의 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동을 나타낸 도면으로써, 황산도데실나트륨내에서 25g의 순 단백질에 대한 겔 전기영동은 단지 단백질 밴드 하나로 나타나게 되며(도면 왼쪽의 검고 작은 밴드모양은 두 개의 "용융" 겔의 경계선을 가르킨다). 겔에 첨가된 표지물은 단백질이 염색되기 전에 미리 잘려지게 된다.
한편, 첨부도면 제 2 도는 트리고놉시스 버리어빌리스로부터 제조된 D-아미노산 옥시다아제의 분자량을 측정하여 나타낸 그래프로써, SDS겔 전기영동은 라에밀리(Laemmli) 방식에 의거하여 12%의 폴리아크릴 아미드내에서 이루어지게 된(Laemmli, U. K. (1970). Nature 227, 680-685).
이어서 단백질 표지물들이 사용되어지는데, A=알루미늄(66,000), O=오브알부민(45,000), Tr=트립시노겐(24,000)과 L=리소자임(14,000)을 나타낸다.
첨부도면 제 3 도는 D-아미노산 옥시다아제에 대한 염색활성을 나타낸 도면으로써, 예시된 부분은 본 발명에 따라 3단계로 나타낸 것이며, 여기서 겔은 배양되어진 것이고 a=세팔로스포린 C에 배양한 것, b=D-류우신에 배양한 것이다.
이에 대한 분석은 다음에서 설명하기로 한다.
원료와 방법
원료
과산화효소(Type Ⅱ, 고추냉이로부터 얻어짐), 각종 아미노산, 세팔로스포린 C, 디니트로페닐하이드라진 및 O-디아니시딘으로는 시그마(Sigma : st. Louis, Mo. 미국)을 사용하고, 아크릴아미드, N, N′-메틸렌-비스-아크릴아미드로는 머어크-스크차아드트(Merck=Schuchardt : Munich, 독일)를 사용하며, N, N, N′, N′-테트라메틸에틸렌디아민, 암모늄 퍼설페이트와 실리카겔 F254가 0.25㎜ 두께로 코팅된 시이트로는 머어크(Merck : Darmstadt, 독일)를 사용한데, 한편 생장기(基)로는 디프코(Difco : etroit, 미국)를 사용하고, 산소전극은 랜크 브라더스 보티샴 (Rank Brothers Dottisham : Cambridge, 영국)을 사용한다.
방법
폴리아크릴아미드 겔 내에서 분석 등전집속은 LKB 1804-101 시스템을 사용하여 실시하며 적용되어지는 양쪽성 전해질의 pH는 3.5-9.3 정도로 한다.
그리고, 등전집속은, 폴리아크릴아미드 겔에 분석전기집속을 위한 엠포린(ampholine) PAG판으로써 LKB로 된 엽편에 따라 실시되어지게 된다. (1KB-Produkter AB, Bromma, Sweden 1979)
여기서 철은 런드(Lund) 대학의 해석화학팀에서 원자흡수 분광광도 측정법에 의하여 결정되어진 것을 사용한다.
[배양조건]
본원에서 사용된 미생물은 브로델리어스(Brodelius, P., Nilsson, K., 와 Mosbach, K. (1981). Appl. Biochem, Biotechnol. 6. 293-308)와 상등한 효모인 트리고놉시스 버리어빌리스이며, 발효기에서 8ι정도로 배양된 보다 큰 한묶음의 세포를 얻는다.
한편, 생장기(基)는 효모추출물(1%)과 맥아추출물(1.5%)로 이루어져 있으며, 보조제로써 pH가 6.0인 0.2%의 DL-메티오닐이 첨가되어지고 28℃의 온도에서 44시간 동안 배양시킨다.
그리고 2%의 한천이 포함되어 있는 동일한 기로 사면배양되어진 다음, 30분 동안 이 세포를 원심분리시켜서 4000g의 양으로 모아서 세척한 후 사용되기 전까지 냉동상태로 보관한다.
이때 서로 다른 형태로 발효시켜서 얻어진 세포의 평균량은 약 45 내지 50g 정도의 세포 페이스트이었다.
한편, 스트레토미즈(Streptomyces)와 노카디아(Nocardia) 균주는 Department of Microbiology, Institute of Immunology, Wroclow, Poland의 것을 통용하였고, 박테리아와 균류는 ATCC의 것을 통용하였다.
[전기영동]
분석목적으로 디스크 폴리아크릴아미드 겔 전기영동은 겔을 포함하는 SDS 대하여 해드릭과 스미스(Hedrick, J. L. Smith, A. J. (1968 Arch. Biochem. Biophys. 126, 155-164)의 방식과 라에밀리(Laemmli, U.K(1970). Nature 227, 680-685)의 방식으로 실시하되 약 8℃ 내지 10℃의 온도하에서 실시한다.
처음에 투브당 2ma의 낮은 전류를 염료가 분리겔로 이동되어질 때까지 공급한 후 전류를 튜브당 4㎃의 일정한 값으로 증가시킨다.
여기서 튜브의 직경과 길이는 각각 0.8㎝와 9.5㎝이며, 단백질을 주재시키기 위하여 Coamassie Brilliant Blue R로 겔을 염색시킨 다음, 하이드로겐 페록사이드의 검출에 의하여 염색되어진 겔 상에 O-디아니시딘(O-dianlsidine)을 사용하여 효소활성을 헤드릭과 스미스(상술한바와 같음)의 방식으로 주재시킨다.
그리고, 이 겔을 5mM 세팔로스포린 C(또는 다른 아미노산류)과 페록사이다아제(0.05%) 및 O-디아니시딘(0.025%)가 함유되고, pH가 7.2인 0.1M의 인산나트륨 버퍼에서 배양시키되 적갈색으로 염색될 때까지 30 내지 60분동안 실시한다.
여기서 예비적인 효소단리를 실시하기 위하여 본 발명자에 의하여 제작된 특수한 장치를 설치한다. 이 장치의 유리관의 직경은 2㎝이고, 그 관의 길이는 14㎝이다.
이때, pH가 8.3인 0.19M의 트리스-글리신버퍼를 사용하여 헤드릭 및 스미스(상술한바와 같음)의 방식으로 겔(8%의 폴리아크릴아미드)를 준비한다.
상기의 겔을 리보플라빈(riboflavin : 촉매의 양은 라에밀리(상술한 바와 같음)에 따라 주어짐) 대신에 과황산염암모늄과 TEMED의 존재하에서 중합시킨 다음 10℃의 온도하에서 3 내지 4시간 동안 전기 영동을 실시하되 처음 30분동안은 20㎃로 하고 그 다음에는 40㎃로 실시한다.
[분자량측정]
분자량측정도 상술한바와 같이 헤드릭 및 스미스의 방식으로 측정하고 SDS 전기영동은 라에밀리의 방식으로 실시한다.
먼저, 폴리아클리아미드 겔 전기영동(SIGMA)이 변성되지 않도록 하기 위하여 분자량이 있는 표지물을 만들어서 사용하고, 나중에 SDS분자량 표지물을 준비하여 사용한다.
이때, 단백질은 로워리(Lowory, O. H., Rosebrough, N. J., Ferr, A. L., 와 Randall, R. J. (1951). Biol, Chem, 193, 265-275)방식으로 만든 것이다.
D-아미노산 옥시다아제 활성에 대한 분석
랜크(Rank) 산소적극으로 산소 소모율을 측정하여 50℃의 온도하에서 5 내지 10분 동안 효소가 변성되어 없어질 때까지 아미노산 옥시다아제를 분석평가한다.
상기 분석혼합물을 최종부피가 2㎖인데, pH가 8.0인 피로인산나트륨이 1.8㎖(20mM)이고, 세팔로스포린 C가 0.1㎖(100mM)이며 산소초기소모율을 조정하기 위한 적당량의 효소가 포함되어 있다. 이때 단위로(U)는 상기와 같은 조건하에서 1분에 산소 1μmol에 상당한 것을 나타내는 것이다.
때때로, 활성은 O-디아니시딘-페록시다아제(상술한바와 같음)은 마찬가지로 2, 4-디니트로페닐 히드라진을 사용하여 30℃의 온도하에서 비색법으로 형성된 케토산을 측정하여 기록한다.
이하 본 발명을 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
트리고놉시스 버리어빌리스로부터된 D-아미노산 옥시다아제의 정제
모든 과정은 5℃의 온도저건하에서 실시한다.
[단계 1 : 조추출물의 제조]
냉동 세포페이스트(-20℃) 32g을 녹이고, pH가 8.0인 20mM의 피로인산나트륨 버퍼에서 1.5배 부피로 현탁시킨 다음 상기 세포 현탁액을 분말로 된 동등부피의 드라이 아이스에 혼합시킨 다음 혼합기에서 용융시킨다. 이 때 D-아미노산 옥시다아제는 다른 가용성 단백질과 함께 방출시키고 전열된 세포는 30분동안 12,000g에서 원심분리시킨 다음 새로운 버퍼의 분액으로 여러번 세척시키고 다시 원심분리한다.
여기서 분취된 상청물은 2㎖의 아세트산으로 pH가 5.3 정도 되게 산성화시키고 잔유침전물은 12,000g에서 30분동안 원심분리하여 제거시킨다.
[단계 2 : 가열침전]
상기 1단에서 제조된 상청물(730㎖)에 효소보호를 위하여 DL-메티오닌 20mM을 첨가하고, 50℃의 온도로 가열시킨 다음 수소속에서 10분 동안 상기 온도로 유지된 상태로 방치시켜둔다.
이 결과 생성된 침전물을 12,000g에서 30분동안 회전시키고, 여기서 다시 침전되는 것은 버리지만 상청액은 하룻밤 동안 pH가 8.3인 20mmM의 피로인산나트륨에 투석시킨다.
[단계 3 : 인산암모늄 침전]
상기 단계 2에서 얻어진 시료를 투석포대에 투입하고 ㎖당 단백질의 양(1%)을 증가시키면서 더운공기 기류하에서 농축시킨다.
이때 상기 시료는 pH가 6.3인 3M의 아세트산과 같이 낮아지게 되고 그런후에 약 1 내지 2시간동안 고체의 황산암모늄과 혼합시킨다.
여기서 30%의 황산암모늄에 담그어 낸 상기 분획물은 침전형태로 남게되고, 그런 후에 12,000g에서 30분동안 원심분리시킨 다음 침전물은 버리고 상청액(pH가 6.0으로 조정된 것)은 고체의 황산암모늄(55%)과 혼합시킨다.
이때 2시간 후에 형성된 침전물을 12,000g에서 30분동안 원심분리시키고, pH가 8.3인 20mM 피로인산나트륨에서 투석시킨다.
[단계 4 : 등전침전]
상기 단계 3에서 얻어진 시료(10.3㎖)를 pH가 5.1인 25mM의 아세트산나트륨에서 12시간 동안 투석시킨 다음, 그 결과 생성된 침전물을 12,000g에서 30분동안 원심분리시킨 다음 제거해 버린다. 이 침전물에는 미량의 효소활성이 포함되어 있다.
한편 상기에서 얻어진 상청액은 pH가 4.6인 0.1M의 아세트산나트륨버퍼에서 12시간 동안 재차 투석시켜서 침전시킨다.
이 침전물에는 다량의 D-아미노산 옥시다아제 활성이 포함되어 있으므로 상기 침전물을 pH 8.3인 20mM의 피로인산버퍼에 용해시키고, 하룻밤동안 상기의 버퍼에서 투석시킨다.
[예비 디스크 겔 전기영동]
상기 단계 4에서 시료를 예비 겔 전기영동을 위하여 사용하되 상기 단계 4에서의 단백질 5㎎을 전기영동시험으로 사용한다.
여기서 세팔로스포린 C에 대하여 아미노산 옥시다아제 활성을 나타내는 밴드를 잘라내고 pH가 8.3인 20mM의 피로인산버퍼에서 포터(Potter) 균질기(1000rev./min)로 5분동안 균질화시킨다.
이게 따라 얻어진 현탁액을 1000g에서 20분동안 원심분리시킨 다음 버퍼에 충진되어 있는 양과 동일한 양으로 상기 겔을 세척하고, 이때 분취된 상청액을 상술한 바와 같은 더운공기로 농축시켜서 최종부피가 3㎖가 되도록 하여 또 다른 실험에 사용되도록 한다.
[결과 및 평가]
[표 1]
트리고놉시스 버티어빌리스로부터 얻어진 D-아미노산 옥시다아제의 정제, 세팔로스포린C에 대한 활성도, 상술한 로워리 방식으로 측정된 단백질 용적
Figure kpo00002
이와같은 본 발명은 균질하게 D-아미노산 옥시다아제를 정제하는 방법을 제공하기 위한 것으로써, 등전침전단계 이후에 실시하는 예비 겔 전기영동으로 인하여 전기영동에서 관찰되어지는 2개의 약한 밴드들이 제거되게 된다.
따라서, 상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 특수활성도는 5.8U/㎎에서 3.8U/㎎로 감소하게 되는게, 이것은 추출과정동안에 발생되는 부분적인 변성때문이거나 아직도 동일하지 못한 보조인자의 손실때문인 것으로 추측된다.
한편, 황산도데실나트륨에서의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동은 분자량이 약 43,000정도(제 2 도)이고, 단일밴드(제 1 도)로 산출되게 된다.
여기서 생단백질의 분자량은 헤드릭과 스미스(Hedrick, T. L., 과 Smith, A. J., (1068), Arch. Biochem. Biophys. 126, 155-164)의 방식에 따라 결정되어지며, 약 86,000정도로 평가된다.
이에 따라 D-아미노산 옥시다아제는 약 86,000정도의 분자량과 2개의 소단위로된 이합체로써 활성상태로 존재한다.
D-류우신과 세팔로시핀 C로 배양시킨 후 겔의 효소염색은 대체적으로 예비겔 전기영동 후에 얻어지는 시료 때문에 하나의 밴드로 나타나게 되며, 이에 반하여 다소적게 정제된 준비물(단계 3)은 D-류우신으로 배양된 후에 3개의 주밴드가 나타나며, 세팔로스포린C에 대해서는 하나의 밴드로 나타남을 알 수 있다. (제 3 도)
이러한 것은 트리고놉시드 내에 여러 가지의 D-아미노산 옥시다아제와 동위요소가 존재하는 것을 의미하지만 이들 중 하나만은 세팔로스포린C에 대한 활성을 나타내는 것이기도 하다.
이와 같이 트리고놉시스 버리어빌리스로부터 얻어진 D-아미노산 옥시다아제를 정제시키는 것에 관한 기술문헌은 이미 소개되어 있으나(Berg, C. P., 와 Rodden, F. A. (1976) And. Biochem. 71, 214-222), 여기에서는 상기의 단백질을 단지 D-류우신에 대한 활성만 실험하였었으며, 효소제조물 균질성에 대해서는 관찰하지 않았었다. 이에따라 생성물은 불순물이 섞인 혼합물로 산출되었으며, 일부 단백질은 아미노산 옥시다아제와 유사하게 나타나기도 하였다.
한편, 세팔로스포린C에 대하여 활성을 가지는 단리된 D-아미노산 옥시다아제는 다음과 같은 특성을 나타낸다. 즉, 효소의 등전점은 4.6이고, 원자흡수분석결과 철 2몰을 포함하는 효소는 소단위당 1몰에 상당하는 것으로 나타내어지며, 10mM의 EDTA와 1mM의 O-펜안트롤린에 투석시킨 후에도, 그 활성은 변하지 않으며, 0.5mM의 농도하에서 아비산염(Arsenite)으로 처리한 후의 활성은 46%로 감소하였고, 시안화물로 처리한 후에는 활성이 34%로 감소하였다.
또한, 세팔로스포린C와 페닐알라닌, 알라닌, 메티오닌 및 류우신에 대한 kM의 값은 대체적으로 13, 10, 76, 0.76 및 0.12이었다.
5㎎/㎖의 농도에서 예비 겔 전기영동을 실시한 후 얻어진 시료는 예측했던 바와 같이 플라빈에 의존하는 효소가 아니므로 세팔로스포린C에 대하여 활성인 돼지신장에서 얻어진 아미노산 옥시다아제는 FAD의존효소(Mazzeo, P. 와 Romeo, A. (1972). J, C, S, Perkim I (p3), 2532)인 것이다.
여기서, 여러 가지의 플라빈보조효소, 예를들면, FMN 또는 FAD는 특수활성을 증가시키지 못한다.
따라서, 플라빈을 효소로부터 단리시키고자 하는 시도는 성공적이지 못하였을 뿐 아니라, 알카리성(Massey, V., and Curti, B. (1966). J. Biol. Chem. 241, 3417-3429)의 산용용액(Mayhew, S. G. (1971), Biochim, Biophys. Acta 235, 289-302)하에서 KBr에 대한 광범위한 투석은 모두 실패작이었다.
예컨대, 85%의 페놀 용액으로 트립신화, 가열용융, 또는 추출하지 않고서는 절대로 어떠한 플라빈도 석출해 낼 수 없는 바, 이러한 사실은 아스퍼질러스 니거(Asrergillus Miger)로부터 얻어지는 D-아미노산 옥시다아제에 관한 연구에서 잘 나타나 있으며 이 자료에서도 어떠한 플라빈도 검출할 수 없다고 하였다. (Kishore, G. and Vaidyanathan, C. S. (1976)m Indian J. Biochem. Biophys. 13, 216-222).
한편, 순수효소를 pH가 8.3인 20mM 피로인산 버퍼에 냉동상태로 저장할 수 있는데 이렇게 얼리고 녹인다고 하여도 활성은 파괴되지 않지만, 단지 8℃에서 그 활성은 매우 서서히 떨어지게 되고, 실온상태에서는 그 안정성은 매우 낮아지게 된다.
또한, 이 효소는 열안정성을 개선시키기 위하여 다른방법으로 부동화되는 바, 일예로 상기 단계 3에서 얻어진 효소 17.5U/㎖를 pH가 8.3인 0.1M 보레이트버퍼 내에서 30분동안 30℃의 온도로 ONBr-활성화된 "Sepharose4B"1㎖에 첨가하게 되면 7U/㎖ "Sepharose"의 지속활성이 나타나게 된다.
한편, 본 발명에서의 생장기를 버지와 로덴(Berg, C. P. 와 Rodden, F. A. (1976). And Biochem. 71. 214-222)방식으로 교체시킨결과 배양시간이 약 5시간이나 감소되었으며 상기기에 0.2%의 DL-메티오닌을 첨가시켰더니 효소산출량이 5배로 증가하였다.

Claims (2)

  1. 세팔로스포린 C에 활성인 대체적으로 순수한 형태의 D-아미노산 옥시다아제를 단리시키는데 있어서 (a) 트리고놉시스 버리어빌리스의 조세포 추출물을 침전물과 상청액으로 분획시키기 위하여 산성화하고 가열시키는 단계와 : (b) D-아미노산 옥시다아제를 포함하고 있는 제 2 침전물을 제조하기 위하여 상기 (a) 단계에서 얻어진 상청액 분획물을 황산 암모늄으로 충분히 처리하는 단계 ; (c) 상기 (b) 단계에서 얻어진 침전물을 재현탁시키는 단계 ; (d) 등전침전에 의하여 D-아미노산 옥시다아제를 모으는 단계 ; 및 (e) 상기 D-아미노산 옥시다아제를 제조전기영동벙으로 정제하는 단계를 포함하여서 되는 D-아미노산 옥시다아제의 단리방법.
  2. 세팔로스포린 C에 활성인 대체적으로 순수한 형태의 D-아미노산 옥시다아제를 단리시키는데 있어서, (a) 추출물을 침전물과 상청액으로 분획시키기 위하여 pH가 약 5.3 정도가 될 때까지 아세트산을 첨가하여 트리고놉시스 버리어빌리스의 조세포 추출물을 산성화시키는 단계와 ; (b) 상기의 상청액의 최종농도가 25밀리몰로 되도록 D, L-메티오닌을 첨가하는 단계 ; (c) 상기의 상청액을 50℃의 온도로 가열한 다음 가열된 상청액을 50℃에서 10분 동안 방치하여 제 2 침전물과 그 상청액으로 만드는 단계 ; (d) 상기 (c) 단계에서 얻어진 상청액을 pH가 8.3인 20밀리몰 피로인산나트륨 버퍼에서 투석시키는 단계 ; (e) 최종농도가 30%가 되도록 상기 (d) 단계에서 제조된 용액에 황산 암모늄을 첨가하고 이에 따라 생성된 침전물을 제거하는 단계 ; (f) 최종농도가 55%가 되도록 상기 (e) 단계에서 제조된 용액에 황산 암모늄을 다시 첨가하고 여기서 생성된 침전물을 분취하는 단계 ; (g) 상기 (f) 단계에서 제조된 침전물을 먼저 pH가 8.3인 20밀리몰 피로인산나트륨 버퍼에서 투석시키고, 다음에 pH가 5.1인 25밀리몰 아세트산나트륨 버퍼에서 투석시킨 다음게 잔존하는 불용성 침전물을 제거시키는 단계 ; (h) 상기 (g) 단계에서 얻어진 용액을 pH가 4.6인 100밀리몰 아세트산나트륨 버퍼에서 투석시키고 D-아미노산 옥시다아제를 함유하고 있는 침전물을 분취하는 단계와 ; (i) 제조전기영동법에 의하여 상기 침전물내에 존재하는 D-아미노산 옥시다아제를 정제하는 단계로 이루어지는 D-아미노산 옥시다아제의 단리방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP0600247A3 (de) * 1992-11-05 1995-05-10 Hoechst Ag Verfahren zur selektiven Desaktivierung von unerwünschten Proteinen in einem Proteingemisch mittels Mikrowelleneinstrahlung.
US6316235B1 (en) * 1995-05-26 2001-11-13 Igen, Inc. Preparation and use of magnetically susceptible polymer particles
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RU2507262C1 (ru) * 2012-09-25 2014-02-20 Общество с ограниченной ответственностью "Инновации и высокие технологии МГУ" Мутантная оксидаза d-аминокислот (варианты)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1272769A (en) * 1968-08-02 1972-05-03 Glaxo Lab Ltd Improvements in or relating to cephalosporin derivatives
GB1385685A (en) * 1971-04-21 1975-02-26 Glaxo Lab Ltd Cephalosporin derivatives
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