SU1604163A3 - Способ выделени оксидазы D-аминокислоты из TRIGoNopSIS VаRIавILIS - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии и касаетс  выделени  оксидазы Д-аминокислот, про вл ющих активность против цефалоспорина С. Цель изобретени  - повышение чистоты целевого продукта. Фермент выдел ют из GRIGONOPSIS VARIABILIS способом, который провод т в 3 стадии, а именно: (а) подкисление и нагревание сырого клеточного экстракта с получением осадка и супернатанта (всплывшей фракции)

(б) обработку его сульфатом аммони  в количестве, достаточном дл  образовани  второго осадка, содержащего оксидазу Д-аминокислот и (в) повторное суспендирование полученного на стадии (б) осадка и выделение изоэлектрическим осаждением. 6 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии и касаетс  вьщелени  оксидазы D-аминокислот, про вл ющих активность против цефалоспорина С.

Цель изобретени  - повышение чистоты целевого продукта.

На фиг.1 приведены результаты электрофореза очищенной оксидазы D-аминокислот в полиакриламидном геле. Электрофорез в г чистого белка в додецилсульфате натри  показывает только одну полосу белка (темна  меньша  полоса, видима  слева указывает границу двух оконденсиро- ванных гелей). Дoбaвл eмyкJ к гел м

метку отрезают перед подкрашиванием белка.

На фиг.2 приведены результаты определени  молекул рной массы оксидазы D-аминокислот из Trigonopsis variabilis. Электрофорез в геле с додецилсульфатом натри  (ДСН) провод т в 12%-ном пOJIиaкpилaмидe согласно Laeimnli(Nature, 1970, 227, 680- 685). Использованы следующие белковые метки: А - альбумин (66000); OV - овальбумин (45000); Тг - трипси- ноген (24000); L- лизозим (14500).

На фиг.З показана активность окрашивани  гелей по отношению к ок- ,

О

О 4

О5

оо

СМ

сидазе D-аминокислот, Показанные фракции вз ты со стадии 111. Гели инкубируют: а) с цефалоспорином С; б) с D-лейцином.

Материалы.

Пероксидаза (тип N, из хрена обыкновенного), все аминокислоты, цефалоспорин С, динитрофенилгидра- зин и о-дианизин поставлены фирмой Sigma (Сан-Луи, США), акриламид и N,N - метиленбисакриламид - фирмой Merk-Schuchardt (Мюнхен, ФРГ), N,N, N ,N -тетраметилендиамин, перосуль- фатаммони  и пластинки, покрытые 0,25 мл силикагел  Фирмой Merk (ФРГ), питательные среды - фирмой Difco (Дейтройт, США); кислород- ньш электрод - фирмой Rank Broth ers Bottisham (Кембридж, Англи ).

Методики,

Аналитическое изоэлектрическое фокусирование провод т, использу  системы 1KB 1804-101, Используемые несущие амфолиты имеют рН в интервале 3,5-9,5. Изоэлектрическое фокусирование провод т в соответствии с опытами фирмы 1KB на амфолиновых пластинках с полиакриламидным гелем (ПА1) (1KB - Produkter АВ, Бромма, Швеци , 1979). Железо определено с помощью атомной абсорбционной спектроскопии .

Состо ние культур.

В исследовани х использованы дрожжи Trigonopsis variabilis.

Загружают большой объем культур в ферментатор емкостью 8 л. Питательна  среда состоит из дрожжевого экстракта (1%), солодового экстракта (1,5%), в которые добавлено 0,2% D, L-метионина. Среду инкубируют 44 ч при 28°С, Исходную культуру помещают в косую среду, изготовленную из той же среды с добавкой 2% агара. Клетки отдел ют центрифугированием при 4000g в течение 30 мин, промывают и хран т в замороженном состо нии до использовани . Средний выход клеток при различных фермектаци х состал ет 45-50 г клеточной пасты.

Электрофорез.

С аналитической целью провод т дисковый электрофорез в ПАГ так же, как в гел х с ДСН, при 8-10°С. Первоначально на трубку подают низкий ток в 2 мА до момента миграции красител  в разделительный гель, после чего ток повьпнают до посто нного

5

0

5

0

5

0

5

0

5

значени  4 мА на трубку. Диаметр и длина трубок соответственно 0,8 и 9,5 см. Дл  локализации белка гели окрашивают красителем Coomassie Brilliant Bluek.

Ферментативную активность на гел х обнаруживают согласно Hedrick и Smith, причем гели окрашивают детектированием образовавшейс  перекиси водорода с использованием о-диани- зидина. Гели инкубируют в 0,1 М натри- фосфатном буфере (рН 7,2), содержащем 5 мМ цефалоспорин С (или других аминокислот), пероксидазу (0,025%) и о-дианизидин (0,025%). Инкубирование провод т 30-60 мин ДО образовани  красновато-коричневого красител .

Дл  препаративного вьщелени  фермента разработано специальное оборудование . Диаметр стекл нной трубки 2 см, ее длина 14 см. Гель (8% поли- акриламида) получают согласно Hedrick и Smith, использу  в качестве буфера 0,19 М трисглицин (рН 8,3). Верхний гель полимеризован в присутствии персульфата аммони  и тетраме- тиленэтилендиамина, а вместо рибофлавина ( количество катализатора вз то согласно Laemmle. Электрофорез ведут 3-4 ч при 10°С, использу  в nep-j вые 30 мин ток в 20 мА, а затем ток в 40 мА.

Определение молекул рной массы.

Молекул рную массу определ ют по методике Hedrick и Smith, а электрофорез в геле с ДСН провод т согласно Laemmli. В первом случае используют метки дл  молекул рной массы при электрофорезе в гель неденатурированного полиакриламида (Sigma), во втором случае - метки молекул рной массы в геле с ДСН, Определение белка, провод т согласно Lowry.

Анализ активности оксидазы D-аминокислот .

Путем определени  скорости потреблени  кислорода с помощью кислородного электрода фирмы Rank провод т испытани  оксидазы D-амиНокислот при 50°С в течение 5-10 мин, в течение которых не происходит денатурирование фермента. Конечный объем испытуемой смеси составл ет 2 мл, из которых 1,8 мл приходитс  на пирофосфат- ный буфер (20 , рН 8), 0,1 мл - на цефалоспорин С (100 мМ) и соответствующее количество фермента, необходимое дл  получени  правильной начальной скорости потреблени  кислорода; I единица (Е) соответствует поглощению 1 ммоль кислорода в 1 мин в данных услови х. Врем .от времени прове-j р ют активность, измер   колометри- - ческим методом количество образовавшейс  кетокислоты с использованием 2,4-динитрофенилгидразина, а также о-диаиизидинпероксидазы при 30 С.

Пример. Очистка оксидазы D-аминокислот из Trigon opsivaria- bilis. Все операции провод т при .

Стади  I, Получение сырого экстракта .

32 ч. замороженной клеточной пасты (-20°С) оттаивают и суспендируют в 1,5 ч. буфера, содержащего 20 мМ пирофосфат натри  (рН 8,3). Клеточную суспензию смешивают с равным объемом сухого льда и размельчают в миксере. Оксидаза D-аминокислот извлекаетс  вместе с другими растворимыми белками. Разрушенные клетки центрифугируют 30 мин при 12000g

Стади  II. Тепловое осаждение.

К подкисленному всплывшему на поверхность продукту со стадии I (730 мл) дл  защиты фермента добавл ют 25 мМ Р, L-метионина.Продукт нагревают до 50°С и оставл ют при

этой температуре на вод ной бане на 10 мино Образовавшийс  осадок отдел ют центрифугированием 30 мин при 1200g, после чего отбрасывают. Всплывший на поверхность продукт диа- лизуют в течение 1 сут против буфера , содержащего 20 мМ пирофосфат натри  (рН 8,3).

Стади  III. Осаждение сульфатом аммони .

Образец со стадии II концентрируют продуванием теплового воздуха над мешком дл  диализа (содержащим образец ) с целью увеличени  количества белка на 1%. Добавлением 2 М уксусной кислоты значение рН образца снижают до 6,3, после чего перемешивают 1,5 ч с твердым сульфатом аммони . Фракцию, подсоленную 30% сульфата аммони , оставл ют дл  образовани  осадка, после чего центрифугируют 30 мин при 12000g, Осадок отбрасывают, а всплывший на поверхность продукт (после доведени  рН до 6)смешивают с твердым сульфатом аммони  (55%). Образовавшийс  спуст  2 ч осадок центри- фугируют 30 мин при 12000g и диализу55

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

ют против буфера, содержащего 20 мМ пирофосфат натри  (рН 8,3).

Стади  IV. Изоэлектрическое осаждение .

Образец со стадии III (10,3 мл) диализуют 12 ч против буфера, содержащего 25 мМ ацетат натри  (рН 5,1). Образовавшийс  осадок удал ют центрифугированием 30 мин при 12000 g. J В осадке обнаруживаетс  следы ферментативной активности. Всплывший на поверхность продукт снова диализуют 12 ч против буфера, содержащего 0,1 М ацетат натри  (рН 4-6). В образовавшемс  осадке обнаруживаетс  больша  часть активности оксидазы D-аминокислот. Осадок раствор ют в буфере, содержащем 20 мМ пирофосфат натри  (рН 8,3), и диализуют сутки против того же буфера. х

Препаративный дисковый электрофорез в геле.

Образец со стадии IV используют в препаративном электрофорезе в геле. Дл  электрофоретического испытани  используют 5 мг белка со сл-адии IV. Полосу, показывающую активность оксидазы аминокислот относительно це- фалоспорина С, отрезают и гомогенизируют 5 мин в гемогенизаторе марки Potter (1000 об/мин) в буфере, содержащем 20 мМ пирофосфат натри  (рН 8,3), затем полученную суспензию центрифугируют 20 мин при lOOOg Гель промывают 3 раза равным коли-- чеством буфера и всплывший на поверхность продукт концентрируют с помощью теплого, воздуха до конечного объема в 3 мл, которые используют дл  дальнейших исследований.

Степень очистки оксидазы D-амино- . кислот из Trigonopsxsvariabilis, активность , измеренна  относительно цефалоспорина С, содержание белка, определенное по методике Lovjry, приведены в таблице.

. Предлагаемый способ упрощает очистку оксидазы D-аминокислот до однородного состо ни . Препаративным электрофорезом в геле после изоэлект- рического осаждени  удал ют две дополнительные слабые полосы, наблюдаемые при электрофорезе в геле. При этом удельна  активность уменьшаетс  с 5,8 Е/мг (см.таблицу) до 3,8Е/мг. Это можно объ снить частичным денатурированием , происход п;им в ходе экстракции , или потерей еще неидентифицй- рованных софакторов.

Электрофорез в геле полиакрилами- да в додецилсульфате натри  дает единственную полосу (фиг,1) дл  молекул рной массы примерно 43000 (фиг,2). Молекул рна  масса белка составл ет примерно 86000,

Таким образом, оксидаза D-амино- кислот в своей активной форме существует в виде димера молекул рной мас-i сы примерно 86000 и с двум  субъеди-л ницами.

Ферментное окрашивание гелей после инкубировани  соответственно с D-лейцином и цефалоспорином показывает только одну полосу на образце, полученном препаративным электрофорезом в геле, в то врем  как менее чистый препарат (стади  III) дает три основные полосы после инкубировани  с D-лейцином и только одну полосу с цефалоспорином С (фиг.З), Это указывает на присутствие нескольких оксидаз D-аминокислот в Trigonopsis но только один из них про вл ет ак-j тивность против цефалоспорина С.

Выделенна  оксидаза D-аминокислот с активностью относительно цефалоспорина С обладает следующими свойствами

Изоэлектрическа  точка фермента - примерно 4,6, Атомный абсорбционный анализ доказывает, что фермент содержит 2 моль железа, что соответствует 1 моль на субъединицу,-После диализа против 10 мМ этилендиаминтетрауксус- ной кислоты и 1 мМ о-фенантролина соответственно активность остаетс  неизменной . Обработка арсенитом снижает активность до 46%, а цианидом - до 34% при их концентрации 0,5 мм.

Значени  Km дл  цефалоспорина С, фенил- аланина,аланина,метионина и лейцина составл ет соответственно 13, 10, 76,

0,76 и 0,12, Образец, полученный после препаративного электрофореза в геле при концентрации 5 мг/мл, не дает спектра, аналогичного спектрам зависимых от флавина ферментов, поскольку оксидаза аминокислот, извлеченна  из почек свиньи, про вл юща  активность относительно цефалоспорина С, зависи: ма от FAD (Р, Mazzeo, А, Romeo, I,C,S, Perkin, 1972 I (РЗ), 2532), Добавление различных софакторов флавйна , таких как FMN или FAD, не увеличивает удельную активностьi Попыт

0

S

5

0

5

0

5

j ки выделить из фермента фпавины успе- ха не имели. Так, экстенсивный диа- jЛИЗ против KB в кислотном растворе в щелочной среде результата не дал. Так же как ни трипсинизацией, ни кип чением или экстрагированием 85%- Iным раствором фенола не были получены флавины,

Чистый фермент в 20 мМ пирофосфат- ном буфере при рН 8,3 устойчив в замороженном состо нии. Оттаивание и замораживание не ведет к потере активности . При 8°С активность падает очень медленно, но при комнатной температуре устойчивость относительно низка. Дл  увеличени  тепловой устойчивости фермент иммобилизуют различны ми способами. Добавление 17,5 Е/мл фермента, полученного после стадии III, при 30°С в течение 30 мин к се- фарозе В, активированной CNBr, в 0,1 боратном буфере (рН 8,3) приводит к посто нной активности в 7 Е/мл сефарозы. Формула йзоб-ретени 

Claims (7)

1,Способ выделени  оксидазы D-ами- нокислоты из Frigonopsis, variabilis, предусматривающий получение сырого бесклеточного экстракта, фракционирование сульфатом аммони  до концентра- . ции примерно 30%, отделение образовавшегос  осадка, последующее фракционирование сульфатом аммони  до достижени  концентрации примерно 50%, отделение второго образовавшегос  осадка, содержащего целевой продукт, перевод его в растворимое состо ние суспендированием в буфере, содержащем пирофосфат натри , отличаю- и.

щ и и с   тем, что с целью, повьштени  чистоты целевого продукта, фракционированию сульфатом аммони  подвер- - гают супернатантнзто фракцию, полученную путем подкислени  бесклеточного экстракта до рН 4-6, нагревани  и удалени  осадка, а после переведени  второго осадка в растворимое состо ние оксидазу D-аминокислот собирают изозлектрическим осаждением,

2,Способ поп,I, отличающийс  тем, что подкисление ведут уксусной кислотой.

3,Способ ПОП.1, отличающийс  тем, что перед нагреванием добавл ют D,L-мeтиoнин до конечной концентрации 25 мМ.

4.Способ по п.1, отличающий с   тем, что перед фракционированием сульфатом аммони  осуществл ют диализ супернатанта против буфе- ра с рН 8,3, содержащего 20 мМ пиро- фосфат натри .

5.Способ поп.1 отличаю- щ и и с   тем, что перед диализом супернатант концентрируют испарением,

6.Способ non.I отличающийс  тем, что провод т дополнительную стадию очистки оксидазы Dаминокислоты , полученной изоэлектри- ческим осаждением, элекрофорезом в геле.

7. Способ поп.1,отличаю- щ и и с   тем, что изоэлекрическое осаждение ведут диализом против буфера с рН 5,1, содержащего 25 мМ ацетат натри , с последующим удалением осадка и диализом раствора, полученного в результате указанной стадии диализа против буфера с рН 4,6, содержащего 100 мМ ацетат натри .

III (NH4)4SO| (30-55%)

IV (рН 4,6)

6,0 4,9 2,8 5,8

33 39

78 40

иг. /

4.в

Ov

46

D-AAO

,4

.2

О

0.2

.З

6,6 .5

Тг

2А

145

O.Q

10