HU201338B - Process for producing peptides and pharmaceutical compositions containing them - Google Patents

Process for producing peptides and pharmaceutical compositions containing them Download PDF

Info

Publication number
HU201338B
HU201338B HU872570A HU257087A HU201338B HU 201338 B HU201338 B HU 201338B HU 872570 A HU872570 A HU 872570A HU 257087 A HU257087 A HU 257087A HU 201338 B HU201338 B HU 201338B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
met
gly
trp
thr
phe
Prior art date
Application number
HU872570A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT44581A (en
Inventor
Waleed Danho
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of HUT44581A publication Critical patent/HUT44581A/hu
Publication of HU201338B publication Critical patent/HU201338B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/595—Gastrins; Cholecystokinins [CCK]
    • C07K14/5955—Gastrins; Cholecystokinins [CCK] at least 1 amino acid in D-form
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Találmányunk új peptidek és az e vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására vonatkozik.
Találmányunk tárgya eljárás (I) általános képletű peptidek [mely képletben X jelentése CO-R5;
n értéke 1 vagy 0;
R jelentése NH2C2H4-Gly;
R1 jelentése Met vagy Nle;
R2 jelentése Gly, Alá vagy (D)Ala;
R3 jelentése Trp vagy Trp(CHO);
R4 jelentése Thr(SO3H) és
R5 jelentése 1-3 szénatomos alkilcsoport] előállítására.
Az aminosavakat a szokásos és közismert hárombetűs jelölés formájában adjuk meg. A leírásban az L-izomert értjük, feltéve, hogy mást nem közlünk.
Az (I) általános képletű peptidek sói alkálifém- vagy alkáliföldfémsók (pl. nátrium-, kálium- vagy kalciumsók), ammóniumsók, alkil-amin-sók, (pl. di- vagy trietil-amin-sók) vagy savaddíciós sók (előnyösen hidrokloridok) lehetnek. Ezek előállítása azonban nem képezi a találmány tárgyát.
Előnyösek azok az (1) általános képletű vegyületek, amelyekben X propionilcsoportot vagy különösen előnyösen acetilcsoportot (AC) képvisel és Y jelentése metil-amino-csoport vagy különösen előnyösen aminocsoport, továbbá R1 jelentése Met, R2 jelentése Gly és R4 jelentése Thr(S03H) és n értéke 0.
Az (I) általános képletű vegyületek különösen előnyös képviselői az alábbi peptidek:
Ac-Tyr (SO3H )-Met-Gly-Trp(CHO )-Met-Thr(SO3H)-(NCH3-Phe)-NH2,
Ac-Tyr(SO3H)-Nle-(D)Ala-Trp-Met-Thr(SO3H)-(NCH3-Phe)-NH2,
Ac-(NH2C2H4-Gly)-Tyr (SO3H )-Met-Gly-Trp(CHO)-Met-Thr(SO3H)-(NCH3-Phe)-NH2 és különösen
Ac-Tyr(SO3H )-Met-Gly-Trp-Met-Thr (SO3H )-(NCH3-Phe)-NH2.
Az (I) általános képletű peptideket szilérdfázisú szintézis felhasználáséval állíthatjuk eló, például a J.A.C.S. 85, 2149 (1963) közleményben leírtak szerint. A szilárd fázisú szintézist a peptid C-végcsoportjén kezdjük oly módon, hogy a védett oC-aminosavat amidkötéssel megfelelő gyantához [pl. benzhidrilamin (BHA) vagy metil-benzhidrilamin] kapcsoljuk. BHA gyantaként sztirol - 1% divinilbenzol kopolimert alkalmazhatunk, előnyösen csepp formában (200-400 mesh).
A szilérdfázisú szintézis során a különböző aminosavcsoportok reakcióképes oldallánc-csoportjait a kémiai reakcióktól megfelelő védócsoportok segítségével megvédjük, majd a védócsoportokat végül eltávolítjuk. A karboxilcsoport védőcsoportjai közül pl. az észtereket, mint pl. arilésztereket (pl. adott esetben kis szénatomszámú alkil-, halogén-, nitro-, tio- vagy 1-7 szénatomos alkil-tio-helyettesítőt hordozó fenilésztereket) említjük meg. Az oC-amino-csoportok tercier butoxikarbonil-csoporttal (Boc) védhetők meg. Az Asp, Ser, Thr oldalláncán levő csoportok benzilcsoporttal; a Trp oldallánccsoportjai formilcsoporttal; a Tyr oldalláncában levő csoportok 2,6-diklór-benzil-csoporttal; míg az amino-etil-glicin (NH2C2H4-Gly) oldallánccsoportjai benziloxikarbonilcsoporttal védhetők meg.
A Boc-(NCH3-Phe)-t a BHA gyantához diciklohexil-karbodiimid (DCC) jelenlétében 0 °C-on kapcsolhatjuk: a megkötés (terhelés) aminosav-analizis szerint 0,20 millimól/g gyanta.
A szintézis-ciklus tipikus esetét bemutató alábbi kísérleti jegyzőkönyvben a következő rövidítéseket alkalmazzuk: EDT = = 1,2-etán-ditiol; TFA = trifluorecetsav;
DIPEA = diizopropil-etil-amin; DMF = dimetil-formamid.
Lépés Reagens Idő
1. 1% EDT/CH2CI2 30 mp
2. 50% TFA(CH2Ch)
1 tómeg% EDT 1 perc
3. 1. lépést megismételni
4. 50% TFA(CH2Ch)
1 tömeg% EDT 15 perc
5. CH2CI2 30 mp
6. 2-propanol 30 mp
7-8. 5. és 6. lépést megismételni
9. CH2CI2 2x30 mp
10. 8% DIPEA 2x2 perc
11-15. 5-9. lépést megismételni
16. 5 ekvivalens Boc-aminosavanhidrid 30 perc
17. 1% DIPEA 5 perc
18-19. 6-9. lépést megismételni
20-21. 16-17. lépést megismételni, ha a kapcsolás a 19. lépés után teljes
22. 2-propanol 30 mp
23-24. 5. és 6. lépést megismételni
25. CH2C12 30 mp
26. DMF 2x30 mp
27. CHaCh 2x30 mp
Az oldószereket az összes mosási és kapcsolási művelethez 10-20 ml/g gyanta térfogatban alkalmazzuk. A kapcsolásokat a Boc-aminosavak szimmetrikus anhidridjeivel végezzük el. A kapcsolásokat diklór-metánban 0 °C-on 15 perc alatt, 10 ekvivalens Boc-aminosav és 5 molekvivalens DCC felhasználásával hajtjuk végre. A teljes ciklusidő maradékonként 54-160 perc.
A védőcsoportok eltávolítását és a teljesen összekapcsolt peptid-gyanták hasítását fluor-hidrogénsavval, dimetil-szulfiddal és p-krezollal 0 °C-on hajtjuk végre. Az ily módon kapott nem-szulfatált peptideket preparatív HPLC (nagynyomású folyadék kromatográfiai úton tisztítjuk.
HU 201338 Β
A találmányunk tárgyát képező eljárással az (II általános képletű peptideket oly módon állíthatjuk eló, hogy a megfelelő nem-szulfatált peptidet valamely szulfatálószerrel reagáltatjuk, majd kívánt esetben a kapott (I) általános képletű formilezett peptidet valamely, a formilcsoport eltávolítására képes szerrel hozzuk reakcióba.
Szulfatáló szerként piridinium-acetil-szulfátot (PÁS) vagy kéntrioxid-piridin komplexet alkalmazhatunk. A reakciót 60 °C-on végezhetjük el. A kapott (I) általános képletű szulfátéit peptidet fordított fázisú preparativ HPLC segítségével tisztíthatjuk.
Az (I) általános képletű pepiidben levő formilcsoportot 0,1 n ammónium-hidroxiddal vagy 0,1 n nátrium-hidroxiddal szobahőmérsékleten távolíthatjuk el, majd liofilizálást alkalmazunk.
A hasnyálmirigyben és agyban levő receptor-helyekhez kötődő CCK-8-al [Life Sciences 30 (1982, 479., 485-488. oldal] ellentétben az (I) általános képletű peptidek elsősorban a hasnyálmirigyben levő receptor-helyekhez kapcsolódnak. Ezenkívül az (I) általános képletű peptidek a gyomor-bél-rendszerben levő különböző peptidáz-enzimek lebontó hatásának jobban ellenállnak, mint a CCK-8. Következésképpen a találmányunk szerinti eljárással előállítható peptidek hatásukat hosszabb időn át fejtik ki, mint a CCK-8.
Az alábbi vizsgálati módszer segítségével a találmányunk szerinti eljárással előállítható peptidek receptorokhoz való speciális kötődését mutatjuk be patkány hasnyálmirigy sejtekből és szarvasmarha striátumból készített homogenizált preparátumokban; az eredményeket a természetes CCK-8 kapcsolódásával hasonlítjuk össze; radioligandként 3H-CCK-8-(SO3H)-t alkalmazunk.
Mintegy 5 g fagyasztott szarvasmarha striátumot és kb. 5 g friss patkány hasnyálmirigyet pufferben (pH = 7,4) homogenizálunk. A szöveteket 48 000 g mellett 10 percen át 0 °C-on centrifugáljuk, majd újra szuszpendáljuk; 1 rész striátum szövet/80 rész puffer illetve 1 rész hasnyálmirigy szövet/70 rész puffer arányban. Az inkubálást oly módon indítjuk meg, hogy CCK-8-at vagy az (I) általános képletű peptidet különböző koncentrációban 3H-CCK-8-(SO3H)-al (végső koncentráció 0,15 nmól) és szövethomogenizá5 tummal (striátum ~ 0,26 mg fehérje 2 ml végső térfogatban; hasnyálmirigy ~ 0,165 mg fehérje 1 ral végső térfogatban) kombináljuk. A mintákat 30 percen át 25 °C-on inkubáljuk és az inkubálást az elegy szűrésével befe10 jezzük. A szűrőt levegőn szárítjuk, majd 12 ml szcintillációs cocktaillal együtt szcintillációs ampullába helyezzük. Az ampullákat 2 órán át rázatjuk, majd szcintillációs spektrométer segítségével megszámláljuk. A nemspe15 cifikus kötődést 1 uniói CCK-8 segítségével meghatározzuk és a specifikus kötés meghatározása céljából valamennyi mintaeredményből levonjuk. A 3H-CCK-8-(SO3H) teljes specifikus kötődése 50%-os gátlásához szükséges peptidkoncentrációt (ICm) meghatározzuk. Az eredményeket az 1. táblázat tartalmazza.
Két etetési vizsgálat során 180-200 g testsúlyú hím patkányokat 2 napon át éheztetünk, az állatokat lemérjük, egyesével ket25 recekbe helyezzük és 4 napos etetési edzést kezdünk meg. Ez alatt az idő alatt a patkányok 9:00 és 10:00 a.m. között csészékben élelmet kapnak; a csészéket 10:00 a.m. és 12:00 p.m. között eltávolítjuk; majd 12:00 és 30 1:00 p.m. között a ketrecekbe visszahelyezzük. A 4. napon a patkányok testsúlyát ismét megmérjük és a kísérletből kizárjuk azokat az állatokat, amelyek testsúlya 5 g-nál jobban csökken. Az állatokat kísérleti- és kont35 rollcsoportokba osztjuk. Az oldható (I) általános képletű peptideket nátrium-klorid-oldatban, míg az oldhatatlan peptideket 1%-os gumiarábikumban szuszpendáljuk, 0-32 ug/ml/kg testsúly koncentrációban, majd az ete40 tési időszak 5. napján 15 perccel az első etetés előtt intraperitoneálisan beadjuk. A patkányokat ezután ugyanúgy etetjük, mint a megelőző négy napon és a táplálékfogyasztás meghatározása céljából a táplálékot tar45 talmazó csészéket minden étkeztetés előtt és után lemérjük. A kezelt csoport táplálékfelvételét összehasonlítjuk a kontrollcsoportéval. Az eredményeket az 1. táblázatban foglaljuk össze.
1. táblázat
Peptid példa száma Szarvasmarha striátum (nM) Patkányhas nyálmirigy (nM) Táplálékfelvétel %
1. étkezés 2. étkezés
1. 1000 9.4 23 i 13 55 * 10
2. 100, 500 2.2 8 ± 1 26 £ 4
3. 100 100 34 i 6 164 i 16
4. 100 44 5 ± 5 79 ± 13
5. 4100 4200 70 ± 2 133 í 9
6. 1750 100 14 ± 6 114 ± 9
7. 1000 14.5 · 17 95
CCK-8 1-4, 6 1-32 27 ± 17 149 ± 6
HU 201338 Β
Az alábbi vizsgálat segítségével a 2. példa szerinti peptid telítettséget előidéző hatását határozzuk meg.
Hím patkányokat a fentiekben ismertetett etetési tréningnek vetünk alá. A 2. pél- g da szerinti peptidet nátrium-klorid-oldatban oldjuk és a patkányoknak intranazálisan beadjuk. Kontrollként CCK-8 nátrium-kloridos-oldattal képezett oldatát alkalmazzuk. Az eredményeket a 2. táblázat tartalmazza.
2. táblázat
Kezelés Dózis mg/kg Táplálékfelvétel, elfogyasztott g (és %)
1. etetés 2, etetés
Nátrium-klorid-oldat 7.4 ± 0.5 (100) 5.6 i 0.3 (100)
2. példa szerinti peptid 3 7.5 ± 0.8 (102) 6.1 ± 0.3 (109)
10 5.5 ± 0.6 (74) 6.3 ± 0.4 (112)
30 5.8 ± 0.7 (78) 4.3 t 0.6 (76)
100 3.4 + 0.4 (46) 4.6 í 0.5 (82)
CCK-8 1000 400 4.9 ± 0.7 (66) inaktív 6.3 ± 0.5 (112)
Az alábbiakban igazoljuk, hogy a találmányunk szerinti eljárással előállítható pép- 25 tidek enzimes lebontással szemben jobban ellenállnak, mint a CCK-8. Patkány vese metallo-endopeptidázt (0,01 Mg) és 5 nmól peptidet 2 uniói trisz-HCl-pufferben (pH 7,6) 37 °C-on különböző idótartalmokon át inkubálunk. A 30 peptid lebomlását analitikai HPLC segítségével követjük nyomon és az eredményeket a
3. táblázatban foglaljuk össze. A bomlás mértékét CCK-8 esetében az Asp-Tyr(S03H)-Met-Gly feltételezett termelésére, míg a 2. és 3. 35 példa szerinti peptidek esetében az Ac-Tyr(S03H)-Met-Gly feltételezett termelésére alapítjuk.
3. táblázat
Peptid példa száma Inkubációs idő (perc) %-os lebomlás (magasság) Csúcsok száma
2. 0 0
60 19.4
120 30.3
240 56.4 2»
3. 0 0
60 0
120 0
240 0 0
CCK-8 0 0
15 6.2
30 33.2
60 69.7 4
Az (I) általános képletű peptidek és gyógyászatilag alkalmas sóik emberen és állaton a táplálékfelvétel visszaszorítására és ezáltal a testsúly szabályozására vagy csökkentésére alkalmazható. A hatóanyagok intravénásán, szublingválisan, rektálisan, intranazálisan, bukálisan vagy transzdermálisan adagolhatok.
Találmányunk tárgya továbbá eljárás humán- vagy állatgyógyászati készítmények előállítására oly módon, hogy valamely (1) általános képletű peptidet és/vagy sóját szokásos gyógyászati hordozó- és/vagy hígítóanyagokkal ismert módon összekeverünk. Az injekció formában kikészített (I) általános képletű peptideket előnyösen steril por formájában hozzuk forgalomba, amelyet röviddel a beadás előtt injekciós célokra alkalmas vízben vagy más megfelelő steril hordozóanyagban felveszünk. így pl. intravénás injekció készítéséhez steril vizes izotóniás oldatokat - különösen előnyösen nátrium-klorid izotóniás vizes oldatát - alkalmazhatjuk. A steril port előnyösen liofilizálás útján nyerjük; ez esetben a hatóanyagot célszerűen inért hordozóanyaggal (laktózzal) keverjük össze.
Eljárásunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátozzuk.
“ egy kimutatott csúcsot és egy, a szubsztrátummal együtt eluált csúcsot jelez, amelyet aminosav analízis után a mólarányok alapján differenciálunk. 65
HU 201338 Β
1. példa g (17,8 mmól) Boc-(NCH3-Phe) 50 ml metilén-kloriddal és 50 ml dimetil-formamiddal képezett oldatát 0 °C-ra hütjük, 1,8 g (9 mmól) DCC-t adunk hozzá és az elegyet 60 percen át 0 °C-on keverjük. 5 g BHA gyantát (sztirol-1% divinil-benzol kopolimer, össznitrogéntartalom 0,56 mmól/g) 10% DIPEA metilén-kloridos oldatával 30 percen át mosunk, szűrjük és metilén-kloriddal, dimetil-formamiddal, majd metilén-kloriddal mossuk. A lehűtött elegyet a gyantához adjuk és 24 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A gyantát szűrjük, metilén-kloriddal, dimetil-formamiddal és izopropanollal mossuk, majd magasvákuumban szárítjuk.
Az aminosav-anaUzis szerint a gyanta 0,20 mmól/g Boc-(NCH3-Phe)-t tartalmaz. A reagálatlan aminocsoportok lekötése céljából 20 a gyantát 5 ml ecetsavanhidriddel és 5 ml DIPEA metilén-kloridos oldatával 60 percen át rázzuk. A gyantát szűrjük és metilén-kloriddal, izopropanollal és dimetil-formamiddal mossuk. 25
4,8 g (0,96 mmól), Boc-(NCH3-Phe)-t tartalmazó gyantát a fentiekben leírt szekvenciális szilárdfázisú szintézisnek vetjük alá a fent ismertetett eljárást alkalmazva, valamennyi kapcsolásnál Boc-aminosavak színimet- 30 rikus anhidridjeit használjuk. A 16. és 20. lépésben az aktivált aminosavakat a következőképpen adagoljuk, a megfelelő reakcióidőket alkalmazva: hat különálló ciklus Boc-O-benzil-Thr-el (1,5 g, 5 mmól, 60 perc, két- 35 szer), Boc-Met (1,25 g, 5 mmól, 30 perc, kétszer), Boc-N^-TrptCHO) (1,7 g, 5 mmól, 30 perc, kétszer), Boc-Gly (900 mg, 5 mmól, perc, kétszer), Boc-Met (1,25 g, 5 mmól, perc, kétszer) és Boc-2,6-diklór-benzil- 40 -Tyr (2,2 g, 5 mmól, 30 perc, kétszer).
A Boc-védőcsoport lehasitását és a gyanta acetilezését 20 ml ecetsavanhidriddel és 20 ml piridinnel metilén-kloridban végezzük 60 percig. 5,3 g, acetilezett heptapepti- 45 det tartalmazó gyantát kapunk, amelyet 12 ml fluor-hidrogénsavval, 31 ml dimetil-szulfiddal és 4,6 ml p-krezollal 1 órán át 0 °C-on végzett kezeléssel hasítunk. Bepárlás után 42 ml vízmentes fluor-hidrogénsavat a reakció- 50 edénybe desztillálunk, 2 órán át 0 °C-on végzett 2. kezelés céljából. Alapos elpárologtatás után a gyantát 2 térfogat etil-acetáttal mossuk, négyszer 15 ml 30%-os ecetsavval kezeljük, szűrjük és liofilizáljuk. 400 mg 55 nyers peptidet kapunk.
140 mg nyers peptidet preparativ HPLC segítségével 2,5x50 cm-es mikronizált szilikagél-oszlopon tisztítunk, az eluálást TFA(CH3CN 5-65%) 0,022% arányú elegyével vé- 60 gezzük el, a csepegési sebesség 8 ml/perc. A detektálást 280 nm mellett végezzük el. A fő csúcsot összegyűjtjük és liofilizáljuk. 55 mg (16,1%) nemszulfatált peptidet kapunk.
Iáit
-on mg PAS-hez 10 ml vízmentes desztilpiridint adunk. A kapott elegyet 60 °Ckeverés közben 10 percen át melegítjük. Az oldatot lehűlni hagyjuk, majd 10 mg Ac-Tyr-Met-Gly-Trp(CHO)-Met-Thr-(NCH3-Phe)-NH2 10 ml piridinnel képezett oldatát adjuk hozzá. A reakcióelegyet egy órán át 60 °C-on keverjük, majd 2 térfogat 0,05 mólos ammónium-hidrogén-karbonát-oldattal semlegesítjük 10 és liofilizáljuk. A termék tisztítását fordított fázisú HPLC segítségével, 10 μ részecskeatméröjű kovasavon végezzük el; eluálószerként 0,05 mólos ammónium-hidrogén-karbonát/metil-cianid elegyet alkalmazunk. 5 mg 15 Ac-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp(CHO)-Met-Thr(SO3H)-(NCH3-Phe)-NH2-t kapunk, kitermelés: 43%.
UV spektrum: 0,37 mg peptid 1 ml 0,1 n
kálium-hidroxid- oldatban
λ max 271 nmJ £ - 5880
Xmax 278 nm : E = 5900
Λ max 287 nm .: £ = 5080
IR spektrum: mikro KBr pell
3125 cm'1: széles OH + NH
1650 cm'1: amid és karbonil
1662 cm'1: karboxilát
1200 cm*1: szulfát
702 cm'1: fenil
2. példa mg, az 1. példa szerint előállított terméket 2,0 ml 0,1 n ammónium-hidroxidban (pH 10,5) oldunk és az oldatot szobahőmérsékleten egy órán át állni hagyjuk. Az oldatot liofilizáljuk. 1,7 mg Ac-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Thr(SO3H)-(NCH3-Phe)-NH2-t kapunk, kitermelés: 90%.
UV spektrum: 0,1 mg peptid 3 ml 0,1 n kálium-hidroxid-oldatban
Xmax 271 nm: £ - 4154
Xnax 277 nm: £ = 4285
Xoax 288 nm: £ = 3692
IR spektrum: mikro KBr pellet
3396 \ \ cm-1: széles OH + NH
3306 )
1726 í cm*1: amid és karbonil
1649')
1271 \ ) cm-1: szulfát
1245 )
3. példa
4,6 g (0,9 millimól) Boc-(NCH3-Phe)-t tartalmazó gyantát készítünk és az 1. példában leírt szekvenciális szilárdfázisú szintézisnek vetjük alá. A szintézis 16. és 20. lépésében az aktivált aminosavakat az alabbi reakcióidőkkel adjuk hozzá:
HU 201338 Β
Boc-O-benzil-Thr-el hat külön ciklust végzünk el (1,5 g, 5 mmól, 60 perc, kétszer), Boc-Met (1,25 g, 5 mmól, 30 perc, kétszer), Boc-Nin-Trp(CHO) (1,7 g, 5 mmól, 30 perc, kétszer), Boc-(D)-Ala (950 mg, 5 mmól, 30 5 perc), Boc-Nle (1,15 g, 5 mmól, 60 perc) és Boc-2,6-diklór-benzil-Tyr (2,2 g, 5 mmól, 30 perc, kétszer).
A Boc-védócsoport eltávolítását és a gyanta acetilezését az 1. példa szerint elvé- 10 gezve 5,2 g acetilezett heptapeptidgyantát kapunk. A termék hasítását dimetil-szulfidot tartalmazó fluor-hidro'génsavval és p-krezollal történő kezeléssel, az 1. példa szerint végezzük el. A gyantát dietil-éterrel és etil- 15 -acetáttal mossuk, négyszer 15 ml 30%-os eeelsavval kezeljük, szúrjuk és liofilizáljuk.
mg nyers peptidet kapunk, amelyet preparativ HPLC kromatográfiával, az 1. példában leirt eljárással analóg módon tisztítunk. 20 50 mg nemszulfatált peptidet kapunk, kitermelés: 5,36%.
mg Ac-Tyr-Nle-(D)Ala-Trp(CHO)-Met-Thr-(NCH3-Phe)-NH2-t PAS-el reagáltatunk, majd preparatív HPLC úton az 1. példában 25 leírt módon tisztítjuk. 8 mg Ac-Tyr(SO3H)-Nle-(D)Ala-Trp(CHO)-Met-Thr(SO3H)-(NCH3-Phe)-NH2-t kapunk, kitermelés: 70%.
UV spektrum: 0,12 mg peptid 1 ml 0,1 n kálium-hidroxid-oldatban 30
Xaax 272 nm: £ = 4500
Xaax 279 nm: £ = 4600
Xaax 288 nm: £ — 3880
IR spektrum: mikro KBr pellet
3300 cm'1: széles OH + NH 35
1665 cm*1: amid és karbonil
1530 cm*1: amid II
1200 cm*1: szulfát
4. példa mg, a 3. példa szerint előállított terméket a 2. példában ismertetett eljárással analóg módon kezelünk. 1,8 mg Ac-Tyr- 45 (SO3H)-Nle-(D)Ala-Trp-Met-Thr(SO3H)-(NH3-Phe)-NH2-t kapunk, kitermelés: 93%.
UV spektrum: 0,17 mg peptid 1 ml 0,1 n kálium-hidroxid-oldatban
Xaax 271 nm: £ = 5075 50
Xaax 279 nm: £ = 5100
Xaax 288 nm: £ - 4000
IR spektrum: mikro KBr pellet
3301 cm*1: széles OH + NH
1650 cm*1: amid és karbonil 55
1527 cm*1: amid II
1570 cm*1: tirozin
1200 cm*1: szulfát
5. példa
2,4 g (0,384 millimól), az 1. példa szerint előállított Boc-(NCH3-Phe) gyantát az 1. példában ismertetett szilárdfázisü szekvenciális szintézisnek vetünk alá. A 16. és 20. lépésben az aktivált aminosavakat a megfelelő reakcióidőkkel adunk hozzá: Boc-O-benzil-Thr-t hat különböző ciklusban (1,5 g, 5 mmól, 60 perc; 1,5 g, 5 mmól, 30 perc), Boc-Met (1,25 g, 5 mmól, 30 perc, kétszer), Boc-N““-Trp(CHO) (1,7 g, 5 mmól, 30 perc, kétszer), Boc-Ala (0,95 g, 5 mmól, 30 perc), Boc-Met (1,25 g, 5 mmól, 30 perc, kétszer) és Boc-2,6-diklór-benzil-Tyi' (2,2 g, 5 mmól, 30 perc, kétszer).
Λ Hu<—védóc.soport. eltávolítása és a gyanta acetilezése után az 1. példában leírt módon 3,0 g acetilezett heptapeptidgyantát kapunk. A gyantát hasítjuk, mossuk, ecetsavval kezeljük, szűrjük és liofilizáljuk. 100 g nyers peptidet kapunk, amelyet az 1. példában leírt HPLC módszerrel tisztítunk. 25 mg nemszulfatált peptidet kapunk, kitermelés: 6,6%.
mg Ac-Tyr-Met-Ala-Trp(CHO)-Met-Thr-(NCH3-Phe)-NHz-t PAS-el kezelünk és tisztítunk, az 1. példában leírt módon. 9,8 mg Ac-Tyr(SO3H)-Met-Ala-Trp(CHO)-Met-Thr(SO3H)-(NCH3-Phe)-NH2-t kapunk, kitermelés: 70%.
UV spektrum: 0,24 mg peptid 1 ml 0,1 n kálium-hidroxid-oldatban
Xaax 272 nm: £ = 5350
Xaax 279 nm: £ = 4445
Xaax 288 nm: £ = 3730
IR spektrum: mikro KBr pellet
3389 cm*1: széles OH + NH
1659 cm*1: amid és karbonil
1521 cm*1: amid II
1507 cm*1: tirozin
1250 J ) cm*1: szulfát
1230 }
6. példa mg, az 5. példa szerint előállított terméket a 2. példában leírt módon kezelünk.
1,9 mg Ac-Tyr(S03H)-Met-Ala-Trp-Met-Thr(SO3H)-(NCH3-Phe)-NH2-t kapunk, kitermelés: 95%.
UV spektrum: 0,19 mg peptid 2 ml 0,1 n kálium-hidroxid-oldatban
Xaax 272 nm: £ — 5300
Xaax 279 nm: £ = 5430
Xaax 288 nm: £ — 4600
IR spektrum: mikro KBr pellet
3310 cm*1: széles OH + NH
1658 cm*1: amid és karbonil
1521 cm*1: amid II
1508 cm*1: tirozin
12521
1232}cm*1: szulfát
1046)
-611
HU 201338 Β
7. példa
4,4 g, (0,9 millimól) az 1. példa szerint előállított Boc-(NCH3-Phe) gyantát az 1. példában ismertetett módon szekvenciális szi- 5 lárdfázisú szintézisnek vetünk alá. A 16. és 20. lépésben az aktivált aminosavakat a megfelelő reakcióidőkkel a következőképpen adunk hozzá: hét külön ciklus O-benzil-Thr-el (1,5 g, 5 mmól, 60 perc, kétszer), Boc-Met 10 (1,25 g, 5 mmól, 30 perc, kétszer), Boc-N1-Trp(CHO) (1,7 g, 5 mmól, 30 perc, kétszer), Boc-Gly (900 mg, 5 mmól, 30 perc, kétszer), Boc-Met (1,25 g, 5 mmól, 30 perc, kétszer), Boc-2,6-diklór-benzil-Tyr (2,2 g, 5 mmól, 30 15 perc, kétszer), Boc-(NH2C2H4-Gly)-OH (3,5 g, mmól, 60 perc, 3,5 g, 5 mmól, 30 perc).
A Boc-védőcsoport lehasítása és a gyanta acetilezése után az 1. példában leírt módon 5,6 g acetilezett oktapeptíd-gyantát ka- 20 púnk, amelyet hasításnak vetünk alá, etil— -acetáttal mossuk, ecetsavval kezelünk, szűrünk és liofilizálunk, az 1. példában leírt módon. 582 mg nyers peptidet kapunk.
mg nyers peptidet az 1. példában le- 25 irt módon preparativ HPLC úton tisztítunk.
mg nemszulfatált peptidet kapunk, kitermelés: 6,2%.
Ac-(NH2C2H4-Gly)-Tyr-Met-Gly-Trp(CHO)-Met-Thr-(NCH3-Phe)-NH2. 30
A kapott terméket az 1. példában leírt módon kezelve 45 mg Ac-(NH2C2H4-Gly)-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp(CHO)-Met-Thr(SO3H)-(NCH3-Phe)-NH2-t kapunk, kitermelés: 45%.
UV spektrum: 0,1 mg peptid 1 ml 0,1 n 35 kálium- hidroxid-oldatban
Xoax 273 nm: ε = 4400
Xaax 280 nm: £ = 4500
Xmax 289 nm: £ — 3840
IR spektrum: mikro KBr pellet 40
3409 cm'1: széles OH + NH
1653 cm1: amid és karbonil
1529 cm1: amid II
1509 cm1: tirozin
1233 ) 45 ) cm1: szulfát
1045 )

Claims (6)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás (I) általános képletű peptidek [mely képletben
    X n jelentése CO-R5; értéke 1 vagy 0; R jelentése NH2C2H4-Gly; R1 jelentése Met vagy Nle; R2 jelentése Gly, Alá vagy (D)Ala; R3 jelentése Trp vagy Trp(CHO); R4 jelentése Thr(SO3H) és R5 jelentése 1-3 szénatomos alkilcsoport]
    előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely megfelelő (I) általános képletű nemszulfatált peptidet valamely szulfatálószerrel reagáltatunk, majd kívánt esetben a kapott (I) általános képletű formilezett peptidet hidrolizáljuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás X helyén propionilcsoportot vagy acetilcsoportot tartalmazó (I) általános képletű vegyületek - ahol n, R, R1, R2, R3, R4 és R5 jelentése az 1. igénypont szerinti - előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás R1 helyén Met csoportot, R2 helyén Gly csoportot és R4 helyén Thr(SO3H) csoportot tartalmazó (I) általános képletű vegyületek - ahol X, n, R3 és R5 jelentése az 1. igénypont szerinti - előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
  4. 4. Az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás n = 0 jelentésnek megfelelő (I) általános képletű vegyületek - ahol X, Rl, R2, R3, R4 és R5 jelentése az 1. igénypont szerinti előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás Ac-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp(CHO)-Met-Thr -(SO3H)-(NCH3-Phe)-NH2,
    Ac-Tyr (SO3H )-Nle-(D)Ala-Trp-Met-Thr(SO3H )-(NCH3-Phe)-NH2,
    Ac-(NH2C2H4-Gly)-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp(CH0)-Met-Thr(SO3H)-(NCH3-Phe)-NH2 és Ac-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Thr(SO3H)-(NCH3-Phe)-NH2 előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
  6. 6. Eljárás gyógyászati készítmények különösen táplálékfelvétel-visszaszoritó vagy -csökkentő és étvágyszabályozó hatású gyógyászati készítmények - előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1. igénypont szerinti eljárással előállított (I) általános képletű vegyületet (mely képletben X, n, R, R1, R2, R3, R4 és R5 jelentése az 1.
    igénypontban megadott inért szilárd vagy folyékony gyógyászati hordozó- és/vagy segédanyagokkal összekeverjük és gyógyászati készítménnyé alakítjuk.
    Kiadja az Országos Találmányi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: dr Szvoboda Gabriella osztályvezető R 4964 - KJK
HU872570A 1986-06-06 1987-06-05 Process for producing peptides and pharmaceutical compositions containing them HU201338B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US87172186A 1986-06-06 1986-06-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT44581A HUT44581A (en) 1988-03-28
HU201338B true HU201338B (en) 1990-10-28

Family

ID=25357979

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU872570A HU201338B (en) 1986-06-06 1987-06-05 Process for producing peptides and pharmaceutical compositions containing them

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP0248440A3 (hu)
JP (1) JPS62292799A (hu)
KR (1) KR880000469A (hu)
AU (1) AU596665B2 (hu)
DK (1) DK290187A (hu)
FI (1) FI872527A (hu)
HU (1) HU201338B (hu)
IL (1) IL82780A0 (hu)
MC (1) MC1830A1 (hu)
NO (1) NO872386L (hu)
NZ (1) NZ220561A (hu)
PT (1) PT85033B (hu)
ZA (1) ZA873796B (hu)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4808701A (en) * 1987-03-30 1989-02-28 Hoffmann-La Roche Inc. Cyclic peptides having appetite regulating activity
ZA883929B (en) * 1987-06-22 1990-02-28 Hoffmann La Roche Cholecystokinin analogs for controlling appetite
US5128448A (en) * 1990-01-10 1992-07-07 Hoffman-La Roche Inc. CCK analogs with appetite regulating activity

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3435727A1 (de) * 1984-09-28 1986-04-10 Victor Dipl.-Chem. Dr.med. 6200 Wiesbaden Brantl Pharmakologisch aktive peptide

Also Published As

Publication number Publication date
AU596665B2 (en) 1990-05-10
FI872527A (fi) 1987-12-07
NO872386D0 (no) 1987-06-05
DK290187A (da) 1987-12-07
EP0248440A3 (en) 1989-09-20
IL82780A0 (en) 1987-12-20
KR880000469A (ko) 1988-03-26
HUT44581A (en) 1988-03-28
FI872527A0 (fi) 1987-06-05
EP0248440A2 (en) 1987-12-09
NZ220561A (en) 1990-11-27
ZA873796B (en) 1987-12-07
JPS62292799A (ja) 1987-12-19
DK290187D0 (da) 1987-06-04
PT85033A (en) 1987-07-01
NO872386L (no) 1987-12-07
PT85033B (pt) 1990-03-08
AU7388087A (en) 1987-12-10
MC1830A1 (fr) 1988-06-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR940001007B1 (ko) 펩타이드의 제조방법
AU625598B2 (en) Peptides having t cell helper activity
JP2679786B2 (ja) 非ペプチド結合を有するペプチド合成方法
JP2542362B2 (ja) 新規ハロ低級アルキルグアニジノ置換アミノ酸化合物およびその製法
US4372884A (en) Pharmaceutically active peptides
HU211603A9 (en) Nonapeptide bombesin antagonists
US4490364A (en) CCK Agonists II
JPH0378374B2 (hu)
JP2569316B2 (ja) 硫酸エステル基を有するペプチド
US4473555A (en) Nona- and dodecapeptides for augmenting natural killer cell activity
EP0037516A1 (en) N-omega substituted derivatives of 1-Desamino-vasopressin analogs
DK164875B (da) Gonadoliberinderivater og deres farmaceutisk acceptable syreadditionssalte eller metalcomplexer, en fremgangsmaade til fremstilling heraf samt et farmaceutisk praeparat indeholdende disse
EP0268297A2 (en) Peptides with sulfate ester groups
HU201338B (en) Process for producing peptides and pharmaceutical compositions containing them
US4820804A (en) Analogs of [1,7-di-alanine, des-19-leucine]calcitonin
AU644128B2 (en) Hexapeptides with sulphate ester groups
US5668109A (en) Peptides for inhibiting pepsin release
US5502164A (en) Peptide compounds having therapeutic activity
JPH0135839B2 (hu)
FI96115B (fi) Menetelmä peptidien valmistamiseksi, joilla on T-soluavustaja-aktiivisuutta
JPS6330499A (ja) オピオイドペプチド・ポリペプチド複合体
NZ246195A (en) Peptides useful as therapeutic agents particularly in feeding inhibition and compositions thereof
HU190207B (en) Process for production of new gonadoliberine derivatives
EP0109117A1 (en) Peptides
JPH0770181A (ja) 血液凝固を阻害するペプチドおよびそれらの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee