HU194721B - Process for preparing feed additives containing a metabolyte of streptomyces - Google Patents

Description

Atalálmány tárgya eljárás Streptomyces eredetű metabolitot tartalmazó takarmányadalék előállítására, amely Streptomyces lavendulae aerob tenyészetéből izolálható C = 33,O8%, N= 13,88%, H = 6,68%, 0=38,41%, S = l,80%, hamu=6,15% összetételű, E/240 jelű pepiid típusú metabolit, továbbá ezen hatóanyagot tartalmazó takarmányadalék előállítására. A vegyület alkalmas a tömeges állattartásnál gyakran fellépő coli eredetű gyomor-bélgyulladások megelőzésére és megszüntetésére.

Ismeretes, hogy a haszonállatok takarmányozásában nemcsak testépítő és energiaszolgáltató anyagokra, hanem ún. specifikus szabályozó anyagokra is szükség van. Ez utóbbiak közé sorolunk bizonyos ásványi anyagokat, vitaminokat, különböző spektrumú biocidanyagokat és a közelebbről meg nem határozott, növekedést serkentő, ún. UGF-anyagokat. (Bianchi, G.: Nuove evidenze spezimentali ed ipotesi interpretative in matéria U.G.F. Riv. Avic. Bologna, 1981. 50. (9).

13-19.p.) Ezek az anyagok a következő előnyös hatásokat fejtik ki:

1. A nemkívánatos mikroflóra jelenlétét az alsó bélszakaszokra korlátozzák, ahol egészséges állatokban egyébként is található.

2. Kedvezően befolyásolják az emésztőcsatorna bioszintetikus folyamatait, vitaminok és aminosavak szintézisét, transzamináló folyamatokat, vízfelvételt, fokozzák nélkülözhetetlen ásványi anyagok és nyomelemek abszorpcióját.

Kedvezőén befolyásolják továbbá az ezen anyagokhoz kapcsolódó anabolikus folyamatokat, mint pld. a csontképződést.

3. Igen jó eszköznek mutatkoznak az ún. latens bélfertőzések elhárításában.

4. Fokozzák a vékonybélfal vérkeringését, illetve a táplálék felszívódását. (Müller Z. 1961. Az antibiotikumok szerepe az állattenyésztésben, Bp. Mg. Kiadó, 47-106.)

A gazdasági állatok bélmikroflórájában kiemelkedően fontos szerepet játszik a E.coli a B12-vitami’n szintézisen keresztül. Emellett hathatósan képes korlátozni anyagcseretermékei közreműködésével kórokozó mikroszervezetek nem kívánatos hatását is. (Szilvinyi, A. és Leithenmayer, H. 1955. Mitt. d. Versuchstation f.d. Garungsgewerbe in Wien, 9. 5/6, 95.)

A colicsoport rendkívül variábilis és számos olyan variánsa lehet, amely kórokozó vagy veszélyes toxintermelő. A colicsoport a vékonybél felső részében a hámszövet súlyos gyulladását idézheti elő, a felszabaduló endotoxin a véráramba kerülhet és elhullást okozhat. (Lásd fentebb: Müller Z. 1961.)

A metabolitok és az antibiotikumok etetésével elérhető súlygyarapodás-többlet, vagy pld. tojáshozam-növekedés. (10-15% Müller Z. 1961, Az antibiotikumok szerepe az állattenyésztésben, Budapest, Mg. Kiadó 346., Krüger, L. (1969) Dér Einsatz von Flavomycin in dér Geílügelfütterung. Archív fúr Geflügelkunde, Heft. 3/4.)

A takarmányozási célra felhasznált antibiotikumok rendszerint nem izolált, kémiailag tisztított készítmények, hanem csupán a megfelelő aktivitású fermentfolyadékok különböző eljárásokkal vízmentesített homogenizált formái. A különböző premixekbe, illetve tápokba a rendeltetési feladatoknak megfelelően ebben a formában kerülnek felhasználásra. Ez a technológia biztosítja a felhasználás gazdaságosságát.

Az antibiotikumok takarmányozási célra történő rendszeres felhasználása - hasonlóan a kifejezetten terápiás alkalmazásokhoz - felvetheti az érintett mikroszervezet-populációkban a rezisztens vonalak szelektálódásának problémáját.

A humán és az állatgyógyászatban számos antibiotikumot használnak terápiás célra. Ugyanazon antibiotikumoknak nagytömegű használata a takarmányozásban rezisztens törzsek szelektálódásához és ezen keresztül az antibiotikumok terápiás hatástalanságához vezethetne. Ennek viszont, különösen a humán gyógyászatban végzetes következményei lehetnek.

A Hoechst cég „Flavomycin” néven hoz forgalomba moenomycin (Walhauser, et al. /1965/ Moenomycina New Antibiotic. Antimicrobial Agents and Chemotherapy.) tartalmú takarmánykiegészítő szert. A fermentációs úton előállított, porlasztva szárított biomasszában az előállító 5 g flavofoszfolipol hatóanyagot garantál kg-onként. A készítményt a Német Szövetségi Köztársaság és a Közös Piaci Államok Tanácsa (Brüsszel), mint takarmánykiegészítésre felhasználható antibiotikumot regisztrálta. A „Flavomycin” azonban főként Gram pozitív patogén baktériumok ellen hatásos. Az üzemi állattartásban (sertés, borjú, baromfi) a legsúlyosabb problémát jelentő Gram negatív patogén kórokozók ellen (E. colu, Salmonellák) gyenge hatású.

Az utóbbi években legelterjedtebben alkalmazott Streptomyces eredetű takarmányadalék a monenzinNa („Rumenzin”) kérődzőkben alkalmazva csökkenti a CO₂- és a metánképződésből származó veszteséget, csökkenti az ecetsavképződést, növeli a propionsavtermelést, ami az anyagcsere szempontjából kedvező. Javul a takarmányértékesítés (Ushida et al.: Effect of monensin on ruminál gas and VFA prodnetion of methers fed high ronghage ráfion. Jap. J. Zootechn. Sci., Tokyo, 1982. 43./6., 412-416 p., Sharow, S. H. et al. szerint bárányoknál viszont csökkentette az átlagos napi súlygyarapodást és a takarmányértékesítést (Sharow, S. H. - Thomas, D. L, - Kennick, W. H.: Effect of monensin on the performance of forage-fed lambs. J. Anim. Sci 1981. 53./4., 869-872 p.)

Húshasznosítású teheneknél és borjaknál nem találtak szignifikáns különbséget a súlygyarapodásban 0,50, 200 és 300 mg dózisok mellett 194 napos kísérlet alatt. (Clanton, D. C. - England, Μ. E. - Perott, J. C.: Effect of monensin on efficiency of production in leef cows. J. Amin. Sci. 1981. 53./4., 873-880. p.)

Preese, E. et al. 326 000 borjút vizsgálva megállapították, hogy a 0-3 hónapos időszakban a borjak 43%nál jelentkezik főleg coli eredetű gyomor- és bélmegbetegedés. Az elhullások évente 0,5%-kal növekednek, ez évente 200 millió márka veszteséget jelent. (Preese, E. - Granert Η. O. - Pabst K.: Nenre Ergebnisse zűr Statistik von Kalherverhusten. Tierzüchter, Holdesheim, 1981. 33.8, 342-343 p.).

Baromfiaknál 100-122 ppm mennyiségben alkalmazva csökkentette a súlygyarapodást és gátolta a tollazat fejlődését (Lokner, M.: Einfluss von Kokzidiostatika auf die Mastleistung von Broilern. D. G. S, Stuttgart, 1981. 33./43. 1241-1244. p.).

Antibiotikumos készítményhez a Spiramycint a Rhone Poulanc francia gyógyszergyár kutatólaboratóriumában Pinnert-Sindico et. al. izolálták először a

-2194721

Streptomyces ambofaciens nevű sugárgomba tenyészetből. A Spiramycin makrolid típusú antibiotikum és három hasonló molekula kombinációja. (Pinnert-Sindico et al.: A New Antibioíic-Spiramycin. Antibiotics Ann. 1954/1955. 1724). A Spiramycin elsősorban Gram pozitív csírákkal (Staphylococcus, Streptococcus) szemben aktív, a Gram negatív csírákra jóformán hatástalan. A baromfifélék légzőszervi megbetegedései esetén 400 mg/kg adagban terápiás célra is alkalmazzák. (Horváth B.: Antibiotikumok a takarmányozásban. Phylaxia. Állategészségügyi és Takarmányozási Közlemények. 1982/4. 201-208. p.)

Hátránya, hogy gyorsan rezisztencia alakul ki vele szemben és gyakori a keresztrezisztencia előfordulása is. Orális alkalmazás esetén a Spiramycin felszívódik a vékonybélből. A Spiramycin tehát több szempontból sem felei meg a Swann-bizottság ajánlásainak. (Gale, E. F. et al.: The Molecular Basis of Antibiotic Action. Wiley, London, 1972.). Ezért és viszonylag kisebb nutritív hatása miatt háttérbe szorult a Flavomycin, a Bacitracin és a Virginiamycin mögött. Magyarországon jelenleg kísérleti felhasználás alatt áll.

A Virginiamycint termelő sugárgombát, a Streptomyces virginiae-t, 1954-ben izolálta Belgium különböző helyeiről származó talajmintákból De Somer és Van Dijck. A Virginiamycin az ún. M-faktor (makróciklikus polipeptid) és az ún. S-faktor (ciklikus polipeptid) szinergizáló keverékéből áll. Hatásspektruma főként a Gram pozitív baktériumokra (Staphylococcus, Streptococcus) terjed ki. A Gram negatívokra szinte hatástalan. Bakteriosztatikus hatását a riboszómális fehérjeszintézis gátlásával fejti ki. Kb. 10-15 éves alkalmazása során rezisztenciát nem mutattak ki vele szemben, a bélcsatomából nem szívódik fel, a talajba jutva gyorsan lebomlik. A takarmányozásban nem a beszárított fermentlevet használják fel, hanem a precipitált tiszta anyagot. Gyakorlati körülmények között, mind a sertés-, mind a baromfitakarmányokban 10-30 mg hatóanyag/takarmány kg alkalmazható gazdaságosan. Magyarországonjelenleg kísérleti célra engedélyezett. (Horváth, B.: Antibiotikumok a takarmányozásban. Phylaxia. Állategészségügyi és Takarmányozási Közlemények 1982./4. 201-208. p.)

Hasonló kutatási célzattal a Tylosint Hamill et al. 1959-ben fedezték fel a Streptomyces fradiae tenyészetében. Fermentációs úton történő előállításának körülményeit 1961-ben írták le először. A Tylosin makrolid antibiotikus, laktongyűrűje 18 szénatomos. Elsősorban a Gram pozitív baktériumok ellen hat, de érzékenyek iránta az intenzív állattenyésztést folytató üzemekben nagy járványtani veszélyt jelentő mikoplazmák, vibriók, pasztörellák, spirohéták, treponémák. Magyarországon a tylosintartalmú gyógytápok elsősorban légzőszervi és dizentériás megbetegedések megelőzésére és gyógyítására csak orvosi kiírásra és ellenőrzéssel használhatók. A makrolid antibiotikumokkal szemben könnyen kialakuló rezisztencia és keresztrezisztencia, a bélcsatomából való felszívódása teszi indokolttá felhasználásának orvosi ellenőrzéshez való kötését. (Állatgyógyászati és takarmányozási készítmények. Kőbányai Gyógyszerárugyár. Kutatásszervezési és Gyártmányfejlesztési Főosztály Kiadványa, 1982.)

Ugyancsak takarmányozási célra felhasználható antibiotikum-készítmény előállítására vonatkozik a 4,127.446 számú USA-szabadalom szerinti eljárás, azonban a benne szereplő törzs nem azonos a találmányban szereplő Streptomyces lavendulae törzzsel, sem a törzs fertását célzó glükoz-aszparagin-aglükonnal. Ugyanis a találmány szerinti eljárásban a Streptomyces lavendulae E/240 törzs zablisztfőzetagaron tartható fenn.

A találmány szerinti eljárás azonban a felismerésen alapul, hogy a Streptomyces lavendulae E/240 sugárgomba olyan metabolitet termel, amellyel a tömeges állattartásnál fellépő súlyos coli eredetű gyomor- és bélgyulladások megelőzhetők, illetve gyógyíthatók, amellett előnyös nutritív hatással rendelkezik, gazdaságosan nagyüzemileg előállítható, könnyen applikálható.

A törzs jellemzőit az International Bulletin of Bacteriological Nomenciature and Taxonomy alapján a következőkben foglaljuk össze:

a) Morfológiai tulajdonságok: (lásd 1-4 ábrák)

1. Egyenes, hosszú spórahordozó légmicélium kissé ellipszoid spórákkal.

2. Egy spóraláncban több, mint 10 spóra található.

3. A spórák átlagos mérete: 0,6x1,0 - 0,8x1,8 μ

4. A spórákon ostorok nem találhatók.

5. Légmicéliumot képez.

6. Gömb alakú spórangiumot nem képez.

7. Légmicéliumon konidiumokat és konidiumtartókat képez.

8. A micélium nem fragmentálódik.

9. A spórák felülete elektronmikroszkóppal vizsgálva sima.

10. Sklerociumot nem képez.

b) Szín:

A vizsgálathoz használt táptalaj: Lindenbein-féle szintetikus glicerinagar. Inkubáció: petri csészében 28°C-on 14 napon keresztül. A vegetatív micélium világos-sárgásbarna, fehér légmicéliumot képez.

Az érett (spórás) légmicélium színe barnáslila. A táptalajba sárgásbarna pigmentet ad le.

c) Fiziológiai jellemző:

1. Pepton-vas-agaron és Gauze-féle szerves táptalajon melanint képez.

2. Szénforrásként hasznosítja a glükózt, fruktózt, arabinózt, xilózt, inozitot. Nem hasznosítja a mannitot és a szaharózt.

d) 50°C-nál nem képes növekedni.

e) Mikroaerofil módon nem növekszik. Figyelembe véve a fenti tulajdonságokat az E/ 240 jelzésű törzset a Streptomyces lavendulae fajcsoportba soroltuk Hütter rendszere szerint.

f) Gram pozitív és Gram negatív mikroszervezetekre ható antibiotikumot termel. Antibiotikus aktivitás keresztcsíkos teszteléssel a következőnek mutatkozott (lásd 1. sz. táblázat).

A Streptomyces lavendulae E/240 törzs antibiotikus aktivitása (1. sz. táblázat).

Tesztorganizmusok gátlás mm-ben

Staphylococcus aureus PCI 209 P 15,0

Eschericha coli B ATCC 9723 20,0

Bacillus subtilis ATCC 6633 25,0

Bacillus radiobacter ATCC 6466 5,0

Sarcina lutea ATCC 9341 31,0

Serratia marsectens NRRL-B 486 6,0

Mycobacterium phlei ATCC 10142 23,0

Mycobacterium smegmatis ATCC 607 30,0

Streptomyces griseus SCS 3496 26,0

A találmány eljárás az E/240jelű metabolit előállítására, mely összetevők: C=33,08%, N= 13,88%, H= 6,68%, O=38,41%, S = 1,80%, (hamu) 15%, Op.: 198°C, vizes oldatban felvett ultraibolya spektrumában = nmnél jellemző maximum van, infravörös spektrumában értékelhető abszorpciós sávok vannak a 2200-3600 cm¹ (C-H, OH, NH, N-H) 1645 cm'¹, (amid I sáv, C=O, amid II sáv C-N), 1390 cm¹ (CH₃) 1310 cm¹ (C-N), 1240 cm¹ (C-C, C-O) tartományokban, antibiotikus aktivitása: 500 Str. U/mg az 1. táblázat szerinti spektrummal, úgy hogy a metabolit előállítását a 00285 OKI MNG számon deponált Streptomyces lavendulae törzzsel 0,5-15,0% polihidroxi-vegyületet, mint szénforrást, továbbá szerves nitrogénforrást, valamint szervetlen sókat tartalmazó táptalajon, aerob szubmerz tenyésztéssel inokulumot készítünk, a kapott inokulumot egyedüli szénfonásként 2-10% természetes polihidroxi-vegyületet, továbbá szerves nitrogénforrást, nitráttól eltérő szervetlen nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajra oltjuk, és aerob szubmerz körülmények között tenyésztjük 48-150 órán át, majd az E/240 metabolittartalmú fermentlevet eredeti állapotában, adott esetben sűrítve, dehidrálva hozamfokozó és/vagy terápiás hatású takarmányadalékként felhasználjuk, vagy az E/240 hatóanyagot izoláljuk és takarmányadalékként v. direkt terápiás célra felhasználjuk. Továbbá az eljárást jellemzi, hogy szénfonásként polihidroxi-vegyületet, előnyösen keményítőt alkalmazunk, valamint szerves nitrogénfonásként növényi fehérjét, szervetlen nitrogénforrásként nitráttól eltérő vegyületet, előnyösen ammónium-kloridot használunk. Az eljárásra jellemző, hogy a táptalajok kémhatását pH: 4,0-8,0, előnyösen pH: 7,2 értéken tartjuk, valamint a fermentációt 15-40°C-on, előnyösen 34°C-on végezzük. A fermentációt 0,2-1,5 liter levegő/liter táptalaj/perc, előnyösen 0,5 liter levegő/liter táptalaj/perc levegőztetés mellett végezzük, továbbá a fermentációt 48-150 óráig, előnyösen 96 óráig végezzük.

További jellemzői az eljárásnak, hogy az E/240 hatóanyag-tartalmú fermentlevet vagy annak sűrítményét használjuk takarmányadalékként 0,2-10%, előnyösen 1,5% mennyiségben, vagy hogy az E/240 hatóanyag-tartalmú fermentlevet dehidráljuk, és ezt használjuk takarmányadalékként 0,1-2,0%, előnyösen 1,0% mennyiségben.

A találmány szerinti eljárás foganatosítási módja még, hogy az E/240 hatóanyagot fermentléből v. koncentrátumból izoláljuk és takarmányadalékként v. terápiás célra felhasználjuk.

A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg:

1. példa:

A Streptomyces lavendulae E/240 tenyészetek átoltását 1-4 havonta végeztük úgy, hogy kémcsövekben, ferdített burgonya- vagy zablisztfőzetes agaira vonáskultúrákat készítettünk aszeptikus körülmények között.

Az átoltott kultúrákat 28 °C-on 6 napig inkubáltuk. A kifejlett telepeket tartalmazó kémcsöveken- 4°C hőmérsékleten maximum 1 hónapig, steril paraffinolaj alatt - hasonló hőmérsékleten - maximum 4 hónapig károsodásmentesen tároltuk.

A Blake-tenyészetek táptalaja burgonya- vagy zablisztfőzetes agar. A Blake-kultúrát a kémcsőről készített csíraszuszpenzió 5 ml-ével oltottuk be. (5xl0⁶ csíra/ml). Az inkubálást 25-28 °C-on 14 napig végeztük.

A kifejlett tenyészeteket+4 °C-on 3 hónapig tároltuk.

Az oltóanyagot Blake-tenyészetekről állítottuk elő úgy, hogy a Blake-kultúrákat l%o -es Tween -80 steril csapvízzel lemostuk. Egy Blake-tenyészet lemosásához 150 ml mosóoldatot használtunk. A kapott sejtszuszpenzió 2xl0¹⁰ élő csírát tartalmazott ml-enként.

A fermentációs táptalajt egy 1000 1-es rozsamentes fermentorban készítettük el. A tápoldat mennyisége 700 1 volt.

Összetétele: Dextrózl,00%

Keményítő 0,50%

Szójaliszt 1,00%

Nátrium-klorid 0,20%

Kalcium-karbonát 0,10%

Olaj (pálma) 0,20%

A sterilezést 120 °C-on 30 percig végeztük.

A fermentor beoltásához 2 db Blake-tenyészetről lemosott, 300 ml térfogatú csíraszuszpenziót használtunk fel. A fermentálást 100 órán keresztül végeztük 28 °C-on. A tápoldaton 350 liter levegőt fúvattunk át percenként. A fermentálás során vizsgáltuk a fermentlé hidrogénion-koncentrációját, a sejtszaporodást, a hatóanyag képződését. (Az eredmény az 5. és 6. ábrán látható.)

Kivett mintákban vizsgáltuk a tenyészlé szénhidrátkoncentráció vátozását, az elmenő levegő széndioxid-tartalmát, a habzásintenzitást és a habzási periódusokat.

A fermentáció befejezésekor a lé szárazanyag-tartalma 1,2%, hatóanyag-tartalma 1100 mg/liter volt. A fermentlevet bepárlás nélkül közvetlenül porlasztva szárítóra juttattuk. A kapott poralakú félkész termék menynyisége 7,9 kg, hatóanyagtartalma pedig 0,9% volt. Az így kapott félkész termék homokszínű, enyhén higroszkópos por.

Megvizsgáltuk a Str. lavendulae E/240 fermentált biomassza legfontosabb nélkülözhetetlen aminosavtartalmát %-ban összehasonlítva a „Flavomycin” biomasszák aminosav tartalmával. Megállapítható, hogy a találmány szerint előállított takarmányadalék előnyösebb mennyiségben tartalmazza a legfontosabb nélkülözhetetlen aminosavakat is.

2. példa:

A zablisztes, ferdített agaron fenntartott kémcsőtenyészetről Tween-80 l%o -es csapvizes steril oldatával mostuk le a spórákat. Az így kapott spóraszuszpenzió 5-5 ml-ével Erlenmayer-lombikokban elkészített, steril 100-100 ml tápoldatot oltottunk be.

Az Erlenmayer-lombik-tenyészet táptalaj-összetétele:

Dextróz 2,50%

Keményítő 1,50%

Szójaliszt 2,00%

Nátrium-klorid 0,30%

Kalcium-karbonát 0,15%

Olaj (pálma) 0,20% pH 6,5

A táptalajt autoklávban 30 percen keresztül 120 °Con sterileztük.

Inkubálás: 28 °C-on, 48 órán át.

A jól fejlett, 48 órás tenyészetekkel 200 literes előinokulumot oltottunk.

194 721

Az előinokulutn táptalaj-összetétele:

Dextróz 1,00%

Keményítő 3,00%

Szójaliszt 2,00%

Nátrium-klorid 0,30%

Kalcium-karbonát 0,15%

Olaj (pálma) 0,30% pH: 6,5

Sterilezése: a készülékkel együtt, 120 °C-on, 60 percig. Inkubálás: 28 °C-on, 48 órán át. Levegőztetés: 100 liter/perc. A jól fejlett, steril, 48 órás, 200 literes előinokulummal 1,800 liter oltás előtti térfogatú, főinokulumot oltottunk. A főinokulum táptalaj-összetétele, sterilezése, inkubálása megegyezik az előinokuluméval.

A 48 órás főinokulum-tenyészettel egy 50 000 literes, rozsdamentes fermenterben sterilezett 33 000 liter oltás előtti térfogatú fermentációs táptalajt oltottunk. A főinokulum mennyisége 2000 liter volt. A fermentációs végtérfogat 35 000 literre egészült ki. A fermentációs táptalaj-összetételt 35 000 liter végtérfogatra számítottuk.

A táptalaj összetétele:

Dextróz 0,50%

Keményítő 4,00%

Szójaliszt 4,00%

Nátrium-klorid 0,30%

Nátrium-karbonát 0,20% pH: 6,5

A fermentálás folyamán a habzás gátlására további 1,7% pálmaolajra volt szükség.

A tápoldat sterilezését 120 °C-on 60 percig végeztük.

Hőmérséklet: szaporodási fázisban: 28 °C, termelési fázisban 34 °C.

Levegőztetés: 9 000 liter/perc.

A tiszta fermentációs idő 100 óra volt.

A kész fermentlé szárazanyag-tartalma: 2,7-3,0%, a fermentlé hatóanyag-tartalma: 5 400 g/m³. (A tartalom alakulása a 7. ábrán.)

A kész fermentlevet 30-60 °C-on vákuumbepárlóval 20-30% szárazanyag-tartalomig koncentráltuk. A koncentrátumot porlasztva szárítóval szárítottuk meg. A 35 m³-es fermentációból nyert porított félkész termék súlya 1 tonna volt, amely 15% hatóanyagot tartalmazott. A félkész termék homokszínű, higroszkópos por.

A porlasztott, higroszkópos félkész terméket Sirály típusú keverőműves dobszitán átszitáltuk. Az áteső hányad szalagkeverős homogenizátorba jutott. A visszamaradó hányadot Perplex-darálóval megdaráltuk, és újból a Sirály-szitára juttattuk. A homogenizátort 20 percen keresztül üzemeltettük, majd a homogenizált félkész terméket polietilénnel bélelt nátronzsákokba gyűjtöttük. A homogenizált félkész termék hatóanyagtartalmát búzakorpával 4,0%-ra állítottuk be.

3. példa

A metabolit E/240 hatóanyag izolálását előnyösen úgy végezhetjük el, hogy az 1. vagy 2. példák szerint aktív anyagot tartalmazó fermentlevet állítottunk elő. A pH-t foszforsavval 2,0-ra állítjuk be, majd a micéliumot szűréssel eltávolítjuk. Szűrés után NaOH-dal a pH-t visszaállítjuk 7,0-ra. A közömbösítéskor keletkező finom csapadékot szintén szűréssel távolítjuk el. Az élesre szűrt fermentlevet egy Na-ciklusban levő karboxil típusú ioncserélő gyantával töltött oszlopon folyatjuk át. (Átfolyási sebesség: a gyanta térfogatának lesz 10-szerese óránként.) Az ioncserélő gyantáról a megkötött aktív anyagot N HCL-al eluáltuk. Az eluátumot NaOH-dal közömbösítjük, majd szűrjük. A megkötés folyamata agargél-diífúziós módszerekkel követhető nyomon. A fenti eljárással az aktív anyag 95%-a kinyerhető az oszlopra a fermentléből. A neutrális pH-jú eluátumot vákuumban 60 °C-ra bepároljuk. A bepárlási maradékból az aktív anyagot metanollal oldjuk viszsza, pH-ját NCL-al pH 2,0-ra állítjuk be, majd négyszeres térfogatú absz. acetonba csöpögtetve az aktív anyag hidrokloridja kicsapható. Az oldószerelegyet dekantálással eltávolítjuk, és a csapadékot 50 °C-on vákuumban megszárítjuk. A metanolos oldást és acetonos kicsapást ismételve 2-3-szor a szervetlen kísérő szennyezők túlnyomó része eltávolítható. A tisztított aktív anyag enyhén sárgás színű, igen higroszkópos por. Az eljárás 70-90%-os kitermelést biztosít.

Eljárhatunk úgy is, hogy az aktív anyagot valamely szerves oldószerrel, előnyösen 80%-os vizes metanollal a szárított biomasszából extraháljuk, acetonban kicsapjuk, majd a csapadékot vákuumban megszárítjuk.

A fenti eljárásokkal előállított metabolit aktivitása sterptomycin egységben .kifejezve: 500 E/mg. Az anyag jól oldódik a vízben, metanolban gyengén, etanolban alig. Nem oldódik acetonban, éterben és más organikus oldószerekben. pH: 2,0-8,0 között a forrás hőmérsékletét 20 percig aktivitáscsökkenés nélkül elviseli. Op: 198 °C (bomlás mellett). Mikroégetést végezve, a C, Ν, Η, O, S, és hamuanalízis adatai a következők: C = 33,08%, H = 6,68%, O = 38,41%, S = 1,80%, hamu =6,15%.

Az anyag aktív csoportjainak és karakterénekjellemzésére elvégeztük a szokásos vizsgálatokat. Megállapítható volt, hogy az aktív anyag az itt figyelembe vehető fontosabb antibiotikumokkal egyező reakciókat nem ad.

A csoportreakciók, valamint az ultraibolya és az infravörös abszorpciós spektrum alapján a fenti eljárással előállított antibiotikus hatású metabolit egy peptid karakterű vegyület. (Lásd a 8. és 9. ábrán.)

A tisztított, kristályos anyagból 10%-os oldatot készítettünk. Száz, egyenként 28-30 grammos fehéregérnek intraperitonialisan, lege artis 0,5 ml-t (5cg hatóanyagot) fecskendeztünk be. Az injekciózás után az állatok kb. 1/2 órán át bágyadtak voltak, majd fokozatosan felélénkültek. Ivóvíz- és takarmányfogyasztásuk, székletük, vizeletürítésük normális volt. A külső ingerekre élénken reagáltak. Egyetlen elhullás volt oltási baleset következtében (bélperforáció).

Az applikációt követően 48 óra múlva tíz egeret felboncoltunk. A szúrás helyén, a hasfal belső felületén subserosus parenchimákat és a hasüregben megnövekedett, halványrózsaszín, nem bűzös, nem nyúlós folyadékot találtunk. Egyéb kimutatható patalógiás tünet nem volt.

Ezt követően, hasonló körülmények között, a dózist 0,75 ml-re (7,5 cg) emeltük. A vizsgálati eredmény itt is azonos volt a fent leírtakkal.

A kb. 2 g/testsúlykilogramm-os dózissal az LD-50-et nem sikerült megállapítani. Az anyag gyakorlatilag nem toxikus.

A fermentációs folyamat 1. és 2. példái szerint előállított fermentlevet a fentebb ismertetett eljárás szerint bepároljuk, szárítjuk, majd homogenizáljuk. Az így előállított anyag az antibiotikus aktivitás kémiai és biológiai ellenőrzése után alkalmas takarmánykiegészítő

194 721 szerként, esetenként direkt terápiás szerként való felhasználásra, különböző haszonállatoknál a takarmány 0,5-5,0%-ában alkalmazva. Eljárhatunk úgy is, hogy a

3. példa szerint előállított tisztított anyagot használjuk 0,01-0,2% mennyiségben az etetett takarmányban.

4. példa

A 3. példa szerint izolált és kémiailag tisztított hatóanyagot, valamint 800 gamma/ml hatóanyag-tartalmú natív fermentlevet használtunk. New hampshire csibéken végzett etetési kísérletben. A 6 vizsgált csoportban 40-40 csibe került vizsgálatra. Az anyag hatását magas (A) és alacsony (B) fehérjetartalmú alaptakarmány mellett vizsgáltuk. Ezek összetétele a következő volt:

Alaptakarmány „A (1-3. hétig)
kukoricadara	40%
árpadara	29%
halliszt	10%
szódadara,
extrahált	16%
szárított élesztő	3%
lucernaliszt	2%
Alaptakarmány „A” (4-7. hétig)
kukoricadara	40%
árpadara	34%
szójaliszt,
extrahált	13%
szárított élesztő	3%
lucemaliszt	2%
Alaptakarmány „A (8-9. hétig)
kukoricadara	40%
árpadara	40%
halliszt	5%
szójaliszt,
extrahált	5%
napraforgó pog.
dara extr.	5%
szárított élesztő	3%
lucemaliszt	2%
Alaptakarmány „B” (9. hétig)
kukoricadara	50%
árpadara	40%
halliszt	4%
szójaliszt
extrahált	2%
szárított élesztő	2%
lucemaliszt	2%
Takarmánykiegészítő anyagok az.	„A” és „B” alapta-

karmányok 1 kg-jához:

„Foszkál” 20,0 g

Tak.mész. 30,0 g

MnSO₄ 0,05 g „Phylapolivit” 3,00 g

NaCl, jódozott 3,5 g

E-vitamon 30 NE/1 kg tak.

A kezelt csoportok 50 mg/E/240 hatóanyagot, illetve 100 ml natív fermentlevet kaptak takarmány kg-onként. A kontrollcsoportok csak az „A” és „B” alaptakarmányokat, valamint a takarmánykiegészítő ásványi, illetve vitaminkeveréket kapták.

A vizsgálat eredményeként megállapítható, hogy az E/240 metabolit etetés hatása az átlag súlygyarapodásra a 8. héten a legszembetűnőbb. Magas fehérjetartalmú alaptakarmány (A) esetén a kontrolihoz viszonyított átlagos súlygyarapodás-többlet %-ban a következőképpen alakult:

Hatóanyag E/240 7,5%

Fermentlé E/240 9,0%

Alacsony fehéijetartalmú alaptakarmány (B) mellett a különbségek lényegesen nagyobbak, azonos idő (8. hét) után mérve:

Metabolit E/240 4,9%

Fermentlé E/240 10,2%

A takarmányértékesítés alacsony fehérjetartalmú alaptakarmány etetése mellett a kontrolihoz viszonyítva nem adott értékelhető különbséget. A nagy fehérjetartalmú alaptakarmány etetése esetén azonban a takarmányértékesítés mindkét kezelésben jobb volt, mint a kontrollcsoportban.

kg hús előállításához 25 dkg-mal kevesebb takarmány került felhasználásra a E/240 hatóanyaggal etetett csoportokban.

5. példa

A 2. példa szerint előállított koncentrátumból 6,4% hatóanyag-tartalmú takarmánykiegészítő szert állítottunk elő korpa és koncentrátum keverésével. Ennek hatását vizsgáltuk növendék ludakon.

Fajta: az alábbi módon előállított hibrid:

Magyar	x Landesi F,
Fi	x Magyar Bl
A kísérlet a B,-ből került beállításra:

Etetett takarmány: GFFV lúdnevelő táp. Az állományban paratífusz és kolera lépett fel, amit a szokásos terápiás eljárásokkal nem sikerült leküzdeni.

A kísérlet első részében a már megbetegedett állatokon vizsgáltuk az E/240 hatóanyag hatását. Kísérleti állatonként naponta 5 g készítményt adtunk per os. Azoknál az állatoknál, amelyek már önként nem vettek fel táplálékot, kényszerbevitelt alkalmaztunk. A még takarmányfogyasztó beteg állatok a lúdnevelő táphoz keverve 2% E/240 készítményt kaptak. A kísérletbe bevont állatlétszám: 50 db növendék lúd. A kísérlet napjai (20) alatt 11 db elhullás történt, ami a vizsgált létszám 22%-a.

Az E/240 készítménnyel nem etetett álományban (3512 db) azonos idő alatt 34%-os (!) elhullás alakult ki. Klinikailag nem beteg növendék ludakkal 2% hatóanyag-tartalmú E/240 készítményből 1%-ot adagoltunk a lúdnevelő táphoz.

Adagolt takarmánymennyiség: 20 dkg/nap/állat.

A kísérletbe vont állatlétszám: 3617.

Összesen 133 db, azaz az induló állomány 3,7%-a hullott el csupán.

Ezen elhullások 70%-a a kezelés megkezdésének első 5 napján (!) következett be. A továbbiakban az elhullás 0-4,5% között változott. Megállapítható, hogy az E/240 hatóanyag mind a súlyosan beteg állományban, mind pedig a veszélyeztetett állományban meglepően jó hatást fejtett ki.

6. példa

A 2. és 5. példa szerint előállított 6,4% hatóanyag-tartalmú E/240 készítmény hatását vizsgáltuk az elhullások (E. coli okozta gyomor és bélgyulladás) és a súlygyarapodás alakulására. Összehasonlításként OTC- és

-611

194 721

Zn-bacitracin-tartalmú készítményeket használtunk. Az abszolút kontrollt az antibiotikummal nem etetett csoport képezte. A 2. sz. táblázatban megadjuk összehasonlító adatként 3 év folyamán a malacelhullások alakulását is (lásd 2. sz. táblázat).

A malacelhullás alakulása a kísérleti gazdaság állományában

Született malac	Elhullás %
db	db
4624	499	10,79
5268	610	11,57
3613	233	6,45

A kísérletbe vont fajta:

Large white	X	Landrass
	F,

A kísérletbe 335 db hibrid szopós malacot vontunk be. A választás ideje: átlagosan a 28. napon.

Etetett takarmány: a Phylaxia Oltóanyag és Tápszertermelő Vállalat által forgalmazott malactápszer. A kísérlet befejezése: átlagosan 43 napos kor után. A malacok előhasú kocáktól származtak.

A vizsgálatok eredményeit a 8. sz. táblázat tartalmazza.

A kísérletbe vont állomány már a választás előtt erősen fertőzött volt, E. coli-val. A választást követően a hasmenés mindegyik alomban gyakorlatilag megszűnt. Ennek magyarázata részben a kocatej teljes megvonásában, másrészt a takarmányfogyasztás kezdeti, igen alacsony szintjében (bakteriális szubsztráthiány) keresendő, 2-3 nappal a választást követően a takarmányfogyasztás emelkedésével együtt rohamosan szaporodott ismét a hasmenéses állatok száma, és amint azt a kísérletek adatai mutatják, elhullások is jelentkeztek.

Az E/240 hatóanyaggal etetett csoportokban hasmenés egyáltalán nem jelentkezett. Az állatok kezdettől fogva feltűnően jó étvággyal ettek. Ebben a csoportban elhullás nem jelentkezett.

A különböző készítmények hatását vizsgálva a súlygyarapodásra összefoglalóan az alábbiakat állapíthatjuk meg:

1. A súlygyarapodási intenzitás 21 napos kornál érte el a legmagasabb értéket, a kísérlet befejezéséig azonban lényegesen nem emelkedett és valamenynyi csoport közül a legalacsonyabb értékkel zárult.

2. A legnagyobb napi súlygyarapodások azokban a csoportokban jelentkeztek, amelyek a 2. példa szerint előállított E/240 hatóanyagot 1,0 illetve 1,5% mennyiségben fogyasztották.

3. igen figyelemreméltó, hogy az E/240 hatóanyag 0,5%-os mennyiségben is rendkívül kedvező hatást fejtett ki a hasmenés, ill. elhullás kizárására.

Claims (10)

1. 5 Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás Streptomyces eredetű metabolitot tartalmazó takarmányadalék előállítására, azzal jellemezve, hogy a metabolit előállítása során a 00285

   10 OKI. MNG számon deponált Streptomyces lavendulae törzzsel 0,5-5,0% polihidroxi-vegyületet, mint szénforrást, továbbá szerves nitrogénforrást, valamint szervetlen sókat tartalmazó táptalajon, aerob szubmerz tenyésztéssel inokulumot készítünk, a kapott

   15 inokulumot egyedüli szénforrásként 2-10% természetes polihidroxi-vegyületet, továbbá szerves nitrogénforrást, nitráttól eltérő szervetlen nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajra oltjuk, és aerob szubmerz körülmények között tenyésztjük 48-150

   20 órán át, majd az E/240 metabolíttartalmú fermentlevet adott esetben sűrítjük, dehidáljuk, vagy az E/240 hatóanyagot izoláljuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy szénforrásként polihidroxivegyületet,

   25 előnyösen keményítőt alkalmazunk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy szerves nitrogénforrásként növényi fehérjét, szervetlen nitrogénforrásként nitráttól eltérő vegyületet, előnyösen ammónium-kloridot használunk.

   30
4. 4.Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a táptalajok kémhatását pH: 4,0-8,0 előnyösen pH: 7,2 értéken tartjuk.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fermentációt 15-40 °C-on, előnyösen

   35 34 °C-on végezzük.
6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fermentációt 0,2-1,5 liter levegő/liter táptalaj/perc, előnyösen 0,5 liter levegő/liter táptalaj/ perc levegőztetés mellett végezzük.

   40
7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fermentációt 48-150 óráig, előnyösen 96 óráig végezzük.
8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az E/240 hatóanyag-tar45 talmú fermentlevet vagy annak sűrítményét használjuk takarmányadalékként 0,2-10%, előnyösen 1,5% mennyiségben.
9. 9. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás a z zaljellemezve, hogy az E/240 hatóanyag-tartalmú

   50 fermentlevet dehidráljuk, és ezt használjuk takarmányadalékként 0,1-2,0%, előnyösen 1,0% mennyiségben.
10. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az E/240 hatóanyagot fermentléből vagy koncentrátumból izoláljuk, és takar55 mányadalékként v. terápiás célra felhasználjuk.