HU191646B - Process for producing of glucoze-free hemoglobine controll - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás glükózmentes hemoglobinkontroli előállítására.

Cukorbetegek anyagcseréjének ellenőrzésére a vér és vizelet cukorszintjenek meghatározása mellett a glikozilált hemoglobin meghatározása lett a klinikai gyakorlat legkifejezőbb és legmegbízhatóbb eljárása.

A hemoglobin, a vörös vérsejtek színező anyaga, mintegy 5%-ban egy színezékből, a bemből, és mintegy 95%· ban egy fehéqekomponensből, a globinból áll, melyek komplex-szerűen vannak összekapcsolva.

Ismert, hogy hemoglobin oldatok oszlopkromatográfiás elválasztásánál a hemoglobin főtömege, a HbAj, inhomogén, vagyis a főfrakció előtt egy sor gyorsabban átfutó hemoglobin eluálódik, melyeket HbAj-ként jelölnek. Ez a hemoglobinfrakció felbontható a HbAj , HbAjb és HbA_{c komponensekre. A kémiai szerkezetfelderítés szerint itt glikoproteinekről, vagyis az Aj hemoglobin glikolizált termékeiről van szó, melyek szénhidrátok, így fruktőz-1,6-difoszfát, glükóz-6-foszfát, és glükóz aldehidcsoportjai és végállású aminocsoportok között lejátszódó kondenzációs reakció során képződnek. Egy egyensúlyi reakció először az instabil aldimin vegyület (Schiff bázis) képződéséhez vezet, amely egy Amadori-átrendeződéssel irreverzibilisen ketoaminná alakul. A glikozilált hemoglobin (HbAj HbAj_b és HbAj_c) egy nem enzimatikus reakció során keletkezik az eritrociták mintegy 120 napos élettartama alatt.

Egészséges embereknél a glikozilált hemoglobin mennyisége az összhemoglobinra vonatkoztatva

3,5-7,5%. Cukorbetegnél azonban ez az érték 20%· fölé is emelkedhet.

A 3 964 865 US szabadalmi leírás egy liofilizált hemoglobin-standardot ismertet az összhemoglobin kolorimetriás meghatározásához, melyet „nyers hemoglobinfrakció szűrésével úgy állítanak elő, hogy közben oxigén hozzávezetésével methemoglobinná, vagyis oximethemoglobinná oxidálják. A methemoglobint a kívánt koncentráció elérése után liofilizálják, amely ebben a formában az összhemoglobin kolorimetriás meghatározásához standardként felhasználható. Hogy teljesítsék a hemoglobinsúly meghatározására vonatkozóan a National Academy of Sciences - National Research Council, USA (NRC) és a National Committee fór Standardization in Haematology (ICSH) által előírt normákat, a liofilizált standardot felhasználás előtt ciánmethemoglobinná alakítják.

A technika állása szerint ismert fenti standarddal azonban csak az összhemoglobin spektroszkópiai meghatározása lehetséges, az egyes hemoglobinfrakcióké, Így például a HbAj-frakcióé nem, mivel a hemoglobinnak methemoglobinná történő feloxidálása során a prosztetikus csoportok, valamint a lánc töltési viszonyai megváltoznak. Ennek következtében egy ilyen standard többek között más kromatográfiás viselkedést mutat, mint a természetes vér, és így sem a hemoglobinfrakciók közvetlen meghatározásához, sem kontroll anyagként nem használható fel, például a HbAj-meghatározáshoz választott elválasztási eljárásokhoz.

A glikozilált hemoglobin mennyiségének meghatározására az összhemoglobinon belül több eljárás ismert. A HbAj glikozilált hemoglobin erős negatív töltése következteben ioncserés kromatográfia, nagy nyomású folyadekkromatográfia, izofókuszálás és elektroozmózis segítségével választható el a többi hemoglobintól. A glikolizált hemoglobin meghatározásának másik módszere a glikozilált hemoglobin oxálsavban végzett hidrolízisén, és a levált hexóz 5-hidroxi-metilfurfurálban végzett átalakításán alapszik, amely tiobarbitursawal (TBA) reagáltatva fotometrikusan kimutatható. Az elválasztás történhet az affinitás kromatográfia segítségével is, a hemoglobinhoz kapcsolódó szénhidrátok hidroxilcsoportjai kihasználásával.

A különböző meghatározási módszerek hátránya, hogy egyazon minta analízise során az alkalmazott módszertől függően különböző eredményeket kapunk. így például függetlenül attól, hogy a glikohemoglobin összetételének kromatográfiás meghatározásához makro- vagy mikrooszlopot használunk, a kémiai TBA-módszerrel kapott HbAj-értékek csak korrekciós faktor segítségével egyenlíthetők ki. Ezen kívül a szokásos analízis eljárásoknál részben a teljes HbAj frakciót, részben a szétválasztott HbAj_{a és} jj_baj_c frakciót mutatják ki, így az analíziseredmények nincsenek egységesen megadva, és ezért egymással nehezen hasonlíthatók össze. Ha például a HbAi_a+b_+c glikolizált hemoglobin részeket határozzuk meg, amely mind a konvencionális makro-oszlopkromatográfiával, mind nagy nyomású folyadékkromatográfiával kimutatható, a két eljárással kapott eredmények csak korrelálnak, de nem esnek egybe.

Összefoglalva megállapítható, hogy a glikozilált hemoglobinok meghatározására szolgáló módszerek, különösen az ioncserés kromatográfia, a frakciók szétválasztása tekintetében jó eredményeket adnak, ezek azonban az eljárás függvényében nem vihetők át, és nem hasonlíthatók össze. Az egyes elválasztási eljárások belső kontrolljaként jelenleg standard kontrollokat használnak, melyek csupán egy bizonyos eljáráshoz alkalmazhatók. A klinikai rutinvizsgálatok szempontjából azonban nagy jelentősége lenne az alkalmazott elválasztási technikák, és a kapott eredmények összehasonlításának.

A találmány feladata, hogy megfelelő eljárást dolgozzunk ki stabil glikozilált hemoglobinkontroll előállítására, amely lehetővé teszi, hogy a HbAj meghatározások belső és egymás közötti minőségi ellenőrzését minden eljárás vonatkozásában ugyanazzal az anyaggal elvégezhessük.

A találmány tárgya tehát eljárás HbAj meghatározás elválasztási eljárásai során belső kontrollként használható glükózmentes kontrollanyag előállítására, oly módon, hogy a mosott eritrocitákat desztillált vízzel vagy megfelelő reagenssel hemolizáljuk, a hemolizátumban a hemoglobint hígított K₃[Fe(CN)₆j oldattal és hígított KCN oldattal ciánmethemoglobinná alakítjuk, puffénál stabilizáljuk és megfelelő oldószerrel a lipideket és sejtmaradékokat eltávolítjuk, majd a hemolizátumot sótalanítjuk és liofilizáljuk.

A stabil glikozilált hemoglobinkontroll előállítására szolgáló eljárás a hemoglobin ciánmethemoglobinná történő átalakításán alapszik. A találmány szerint előállított ciánmethemoglobin hosszabb tárolási idő után is megtartja konstans extinkciós viselkedését, míg másképpen szubsztituált hemoglobinok hosszú tárolási idő után elve szítik a Hb-variánsokra specifikus extinkciós viselkedésüket, és így standard kontrollként nem alkalmazhatók.

A glikozilált hemoglobinstandard előállításához különösen előnyösnek mutatkozott, ha a szabad hemoglobin és a glikozilált hemoglobin megfelelő ciánmethemoglobinná történő átalakítása előtt az eritrocitákat ahemolízis előtt izotonikus NaCl oldattal többször mossuk, és ezután a hemolizátumot Na-foszfát-cianid pufferral sta-2191 646 bilizáljuk, mivel így a reakciókörülmények között egyébként instabil K₃[Fe(CN)₆]-komplex egyrészt megtartja oxidáló hatását, másrészt nem lép nemkívánatos mellékreakciókba a globinlánccal. A maszkírozó hatású CN-ion helyett használható például SCN-ion is.

A sejtmaradékok és lipiedek tiszta eltávolítása érdekénbe előnyös, ha a hemolizátumot végül CCl₄-gyel kezeljük. A CCI₄ helyett használható például más zsíroldó oldószer is, például toluol, amely azonban a hemoglobinnal szemben legyen inért.

Ha a találmány szerinti hemoglobinkontrollt nem használjuk fel közvetlenül az előállítás után, akkor magas vákuumban fagyasztással kíméletesen liofilizáljuk, először alacsony hőmérsékleten, majd ezt követő lassú hőmérsékletemeléssel. Ez az eljárás különösen jelentős, mivel a hemoglobin fehérjekomponensét nem szabad denaturálni, hogy ne veszélyeztessük a hemoglobinkontroli hatékonyságát a HbAj meghatározás minőségi ellenőrzése során. Az ily módon előállított kontrollanyag fény kizárása mellett, hűtve legalább 8 hónapon keresztül tárolható.

A TBA-módszer vonatkozásában külön ki kell emelni, hogy a találmány szerinti eljárással előállított glikohemoglobín-kontroll nem tartalmaz meg nem kötött glükózt, mivel ez már nem szükséges az egyensúly stabilizálásához, és így az előállítás és tárolás során nem képes a glikolizált hemoglobint a megfelelő hexózra és hemoglobinra hasítani. Ez megakadályozza, hogy a TBAmódszernél magasabb értékeket kapjuk az egyébként nem specifikusan sokszorozott 5-hidroxi-metíl-furfurolképződés miatt.

Mivel a hemoglobinkontroll oldhatóságát nem csökkenti egy kisózás, és így néhány módszer nem mutat hamis hemoglobintartalmat, a találmány szerinti sótalanítást például gélszűréssel vagy dialízissel végezzük.

Vizes közeg hozzáadására a liofilizált hemoglobinkontroli gyorsan és egyszerűen alkalmazásra kész formára hozható.

Á stabil, glükózmentes glikolizált hemoglobinkontroll előállítására szolgáló találmány szerinti eljárást az alábbi példa szemlélteti közelebbről.

Példa ml eritrocitát 20 ml izotónikus NaCl oldatban háromszor mosunk, miközben a felülúszót a centrifugálás után mindig eltávolítjuk. A hemolizishez 1 ml desztillált vizet adunk hozzá, és 2 percen keresztül állni hagyjuk.A hemoglobin ciánmethemoglobinná történő átalakításához hozzáadunk 80 pg 5%-os K₃[Fe(CN)₆j oldatot és 2 ml 0,5%-os KCN oldatot, miközben 2 percen keresztül állni hagyjuk, és többször intenzíven megkeverjük. Ezután a hemolizátumot 12 ml Na-foszfát-cianid pufferral hígítjuk, mintegy pH = 6,7-nél. Ez a pH-érték a szokásos módon elérhető, ha 4,59 g NaH₂P0₄xH₂0-t, 1,18 g Na₂HP0₄-t és 0,65 g KCN-t desztillált vízzel 1 literre hígítunk. A lipidek és sejtmaradékok eltávolításához 2 ml CCl₄-t adunk hozzá, és 10 percen keresztül centrifugáljuk. Ezután a szokásos módon, például gélszűréssel vagy dialízissel sótalanítjuk.

Ez a reakcióelegy mintegy 24 kontrollsíandardot ad. Az eltarthatóság érdekében magas vákuumban -40 °C hőmérsékleten, majd 48 óra alatt -20°C-ra emelkedő hőmérsékleten liofilizáljuk. Az így kapott standardkontroll sötétben, hűtés közben legalább 8 hónapon keresztül tárolható. A minőségi kontrolihoz történő felhasználáshoz a kontrollstandardot 0,5 ml, illetve 0,2 ml menynyisegu, előnyösen desztillált vízzel hígítjuk. A kontrollstandaid összhemoglobintartalma a fenti példánál 4-6 mg/0.5 ml. A pontos meghatározást a szokásos módon végezzük.

A találmány szerinti eljárással előállított standardkontroli a glikozilált hemoglobin meghatározására szolgáló bármilyen módszerhez felhasználható, a módszer sajátságainak és minőségi előírásainak figyelembevételével, így elsőízben sikerűi a hemoglobin HbAj-frakciójának meghatározásához univerzálisan alkalmazható kontrollt előállítani.

A glikolizált hemoglobin különböző elválasztási technikákkal végzett meghatározását a találmány szerinti hemoglobinkonírollnál végeztük azonos mennyiségekkel és 10 párhuzamos méréssel. A glikozilált hemoglobinfrakció mennyiségére kapott értékeket az összhemoglobinra vonatkoztatva relatív százalékban adjuk meg az 1. táblázatban.

Mint az I. táblázatból is látszik, a találmány szerinti hemoglobinkontroll alkalmazásával a különböző, mégis összehasonlítható elválasztási technikákkal, így a nagy nyomású folyadékkromatográfiával (HPLC), makro-oszloppal, mikro-oszloppal, és — bizonyos korrekciós tényezők figyelembevételével az oszlopos elválasztásokkal összehasonlítható — tiobarbitursav-módszerrel kapott eredmények a módszertől függő hibahatárokon belül mozognak, igy a találmány szerinti hemoglobinkontroll cukorbetegek anyagcseréjének vizsgálatához alkalmazott HbApmeghatározáshoz általánosan alkalmazható.

A kapott eredmények a legújabban bevezetett affinitás kromatográfiás vizsgálatnál is a várt nagyságrenden belül vannak.

1. táblázat

Meghatározási módszer	HbA{a+b (%)	HbAlc (%)	ossz HbAj %)
makro-oszlop	33	6,9	10,7
nagy nyomású fo-
lyadék-kroma-
tográfia	3,6	6,7	10,3
TEA		6,4
affinitás kroma-
tográfia			11,3
mikro-oszlop			9,8
elektroozmózis			7,3
izofokuszálás	2,8	4,2	7,0

A találmány szerinti hemoglobinstandard kontrollként történő alkalmazása lehetővé teszi, hogy olyan elválasztási technikákkal, mint az izofokuszálás és az elektroozmóás, melyek a hemoglobinfrakciók elválasztásánál mutatott eltérő mechanizmusok miatt a fenti eljárásokkal nem hasonlíthatók össze, ellenőrizzük az elválasztás megfelelő elvégzését. Mint az 1. táblázatból latható, ebben az esetben mintegy 7%-kal alacsonyabb érte'ket kapunk, de ezek a várt határokon belül vannak, ha a más eljárásokkal elért eredményeket vesszük alapul. Ugyanezt találjuk azonos összetételű natív vér vizsgálata esetén is.

Bár a teljes HbAj frakció felbontása az egyes JíbA[_a+(j és HbAj_c frakciókra ma még nem játszik fontos szerepet a gyakorlati vizsgálatoknál, az új glikolizált

-3hemoglobinkontrollal ezek a Pák ciók is meghatározhatók az elválasztási eljárástól, így a HPLC-től, TBA-tól, makro-oszlop-módszertől, vagy az izofokuszálástól függetlenül.

Claims (1)

1. Eljárás a HbAj-meghatározás elválasztási eljárásai során belső kontrollként használható glükózmentes hemoglobin kontrollanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy a mosott eritrocitákat hemolízáljak, a hemolizátumban a hemoglobint hígított K₃[Fe(CN)₆] oldattal és hígított KCN oldattal ciánmethemoglobinná alakítjuk, pufferrel stabilizáljuk és valamely zsíroldószerrel a lipideket és sejtmaradékokat eltávolítjuk, majd a hemolizátumot sótalanítjuk és liofilizáljuk.