HU189998B - Process for producing anti-t-limphocyta-globuline - Google Patents

Description

A találmány anti-T-Umfocita-globulin előállítási eljárására vonatkozik,

A nagy hatású immunszupresszív anyagokat a szervátültetéseknél arra használják, hogy megakadályozzák velük a transzplantátum kilökődését, továbbá a csontvelő átültetés után az átültetett szerv megbetegedése a szervezetben (graft versus hőst) hatás ellen alkalmazzák. Ezeket a hatóanyagokat napjainkig úgy állították elő, hogy állatok - mint pl. lovak vagy házinyulak - szervezetébe injekcióval limfatikus sejteket fecskendeztek, be, majd az immunizált állatok szérumából az anti-limfocita-gjobulint kinyerték. Az eljárás hátránya az, hogy lomfatikus sejteket kell használni, ezek beszerzése bizonyos etikai problémákat vet fel és csak korlátozott mértékben állnak rendelkezésre.

A találmány célkitűzése immunszupresszív hatóanyagok előállítására szolgáló eljárás kidolgozása, melynek során in vitro tenyésztett sejteket használunk fel.

Azt találtuk, hogy a JM-sejtsor sejteseiből kiváló hatásó immunszupresszív hatóanyagot lehet előállítani. A JM-sejtsor előállítása és tulajdonságai Scheider, U., Schwenk H.U. és IBernkamm publikációjából (j. Cancer 19, 6210626 /1977/)ismertek. A JMsejtsort az Institut Pasteur Collectrion Nationale de Culture des Microorganismes-nél (C.N.C.M) 1-147 szám alatt deponáltuk. A sejteket tetszés szerint lehet szaporítani in vitro anélkül, hogy tulajdonságait elveszítenék.

Az alábbiakban példát ismertetünk az anti-T-limfodta-globulin előállítására, melynek során JM-sejtsor ba tartozó T-limfoblaszt sejteket használunk.

A globulint előnyösen a következő lépésekben állítjuk elő:

ELŐÁLLÍTÁSI ELJÁRÁS

I. Antigének előállítása (sejtek tenyésztése)

Limfoblasztoid T-sejteket (JM-sejtsor) tenyésztünk szuszpendált tenyészetben.

Táptalaj: RPMI-1640 közeg, amelyhez még magzati boqúszérumot, újszülött borjak szárúmét, emberi szérumot továbbá sztreptimicint, penicillint és L-glutamint adunk.

Optimális hőmérséklet: 37 °C.

Optimális pH-érték: 7,2 —fenolvörös Indikátor).

Normális szaporodási sebesség: a sejtszám 48 óránként megkétszereződik. A sejteket minden 48. órában megszámoljuk és számukat milliliterenként 0,5 millióra állítjuk be.

Az élettelen sejtek száma a 10%-ot nem haladhatja meg.

A többlet-sejteket eltávolítjuk, majd centrifuáljuk 1000 dord/perc forgási sebességgel 10 percen át, háromszor mossuk és immunizálásra felhasználjuk.

Mosáskor és immunizáláskor használt oldat: Leibowitz közeg (L-l 5).

Immunizáló dózis házinyúlra: 100.10⁶ sejt/3 ml Leibowitz-L-15 közeg.

Az immunizáláshoz használt sejtek (szabályozott. fagyasztása

Az összes eltávolított többlet-sejtet három ízben L-l 5 közeggel mossuk, majd 10%-os dimetíl-szulfoxid-oldat hozzáadása után -90°C hőmérsékleten fagyasztjuk. Ezt automatikusan vezérelt fagyasztóberendezésben végezzük, ahol a hőmérséklet precenként 1 °C-kal csökken. Immunizáláshoz ezeket a fagyasztott sejteket 37 °C hőmérsékleten hagyjuk kiengedni és ezt követően azonnal mossuk a DMSO eltávolítása végett. Az első immunizálásra kizárólag friss sejteket használunk, míg az immunnizálás megerősítésére (azaz a további immunizáláshoz) a fagyasztott sejtek is alkalmasak.

A továbbtenyésztéshez szükséges sejtek fagyasztása

Ezeket a sejteket cseppfolyós nitrogénben fagyasztjuk, az előkezelést a fentiekben leírtakkal azonos módon végezzük. 3—4 hónaponként az ilyen módon fagyasztott sejtekegy részét további tenyésztéshez felolvaszjuk. Érre azért van szükség, mert a szaporodó sejtvonal megváltozhat, és/vagy a felületi T-antigént elveszti (ezt spontán rozetta-teszttel ellenőrizzük).

A szükséges közegek elkészítése

1. ) RPMI-1640 közeg

Az RPMI-1640 közeget Moore, G. E, és társai írták el, (J .A .M.A. 199,519/1967/)

A közeg elkészítéséhez alkalmas poralakú készítményt a Fresenius cég (Bad Homburg) állít elő és azt 1 x 10 liter folyékony közeg elkészítése» alkalmas kiszerelésben hozza forgalma (Dr. Kempf).

Az említett poralakú készítményt hűtőszekrényben kell tárolni.

A poralakú készítmény 10 liter injekciós célokra alkalmas vízben (aqua ad injection, Ampuwa) oldjuk, 20 g nátrium-hidrogén-karbonát hozzáadásával. Az oldat pH-értékét 1 n sósav hozzáadásával?,05-re beállítjuk, majd keveijük. Ezután sterilre szüljük, végül 500 ml-es palackokba töltjük.

A palackokat 37 °C hőmérsékleten 5 napon át inkubáljuk és terilitásukat ellenőrizzük.

Az inkubálás után a palackokat 6-8 °C hőmérsékleten hűtőszekrényben tároljuk.

2. ) L-l 5 Leibowitz-közeg

A fenti L-l 5 közeget Leibowitz A. és társai írták le, Am.J. Hyg. 78, 173/1963/). A közeget az immunizálásra szolgáló sejtek szuszpendálására használjuk.

A poralakú készítményt a Dynatech vállalattól (Plochiger) lehet beszerezni.

Ezt a poralakú készítményt 10 liter injekciós célokra alkalmas vízben (Ampuwa) oldjuk. Az oldatot sterilre szűrjük, majd 500 ml-es palackokba töltjük, inkubáljuk és hűtőeszekrényben tároljuk.

II. Ántiszérum előállítása

A nyulak immunizálása és kivéreztetése

A szérumokra és a vakcinákra vonatkozó 1972. november 144 rendelet előírásainak (15. szakasz) megfelelően az állatok elhelyezése az alábbi módon történt:

Első ól: Raucherberg-nél (8121 Wíelenbach), bérlő a Fresenius cég. Felügyeslő állatorvos: Dr. Theimel-Baumer (F resenius A .G.).

Ellnőrző körzet állatorvos: Dr. Hanfstingl, Állami Állategészségügyi Hivatal, 8120 Weílheim. Boncolás: Bajor Állategészségügyi Intézet (Tiergesundheitsdienst Bayem e.v.), 8011 Grub (München mellett), Senator Geraueistrasse 23.

Második ól: Dr. Ivanovas GmbH, amelyek kísérleti állatok tenyésztésével foglalkozik, 7964 Kisslegg, Allgau. Állatorvos: Dr. Albus.

Az immunizálásra, kivéreztetésre és boncolásrá vonatkozó feljegyzéseket készítettünk és azokat megőriztük.

-2Az állatokat a IM-sejtsor sejtjeivel immunizáljuk. Első immunizálás: az első napon, az állatok fülvénájába adott Ív. injekcióval, 80-100.10* sejtet tartalmazó 3 ml sejtszuszpenzióval.

Második immunizálás: a 14. napon a fentiekben leírt módon. Harmadik immunizálás: a 17. napon, a fentiekben leírt módon.

Kivéreztetés: a 21. vagy a 22. napon, érzéstelenítést közben végzett szívpunkclóval.

Érzéstelenítés: intravénásán beadott 37 mg/testsúly kg nembutallal (5-etil-5-(l'-metiI-butil)-barbltur·

Szlvpunkció: 180/1,8 K-kanüllel és 50ml-es E-fecskendővel, 100 ml-es centrifugaedényekbe, melyek rácsavarható fedővel vannak ellátva.

Az egyes vérmintákat egy éjjelen át 4 °C hőmérsékleten tartjuk, majd a következő napon feldolgozzuk. A kapott vér mennyisége általában véve függ az állatok krától és súlyától, ez a mennyiség kb. 150 miig terjed.

III. A nyers szérum készítése

Az egyes vérmintákkal végzett további műveletek

Centrifugálás, kb. 3000 g, 15 percig, 4—8 °C hőmérsékleten.

A szérum leszivatása és második centrifugálása.

Az egyes minták betöltése rácsavarható fedéllel ellátott palackokba. Az átlagos hozam kb. 70 ml állatonként.

Minták vétele sterilitási és aktivitási vizsgálatokhoz.

A szérumot inaktiváljuk úgy, hogy 56 °C hőmérsékletű vízfürdőben tartjuk 30 percen keresztül.

Az egyes mintákat -18 °C hőmérsékleten tároljuk.

Közbenső vizsgálatok: sterilitási és hatás vizsgálatokat végzünk.

A minták egyesítése

250—300 állattól származó szérumot egyesítünk az elvégzett közbenső vizsgálatok eredményétől függően:

A kombináció, melyben a perifériás lomfocitákka a KBR-titere (komplentkötési reakció) 1:256 vagy ennél több,

B kombináció, melyben a perifériás lomfocítákkal a KBR-titer 1:64 és 1:128 közötti,

C kombináció, ahol a perifériás limfocitákkal a mért KBR-titer 1:64-nél kevesebb.

A hemagglutinációs titer rendszerint nem több az 14000 értéknél.

A fenti A és B kombinációt ezután összekeverjük oly módon, hogy az egész titere ne legyen 1:256 értéknél alacsonyabb. A C kombinációt (ez az egyes minták 10-20%-át jelenti) kiöntjük.

Az egyesített szérumokat 500 ml-es palackokba töltjük és -18 °C hőmérsékleten tároljuk.

A következő közbenső vizsgálatokat végezzük

a) Minden egyes palack sterilitás vizsgálata,

b) Az A, B és C szérumkombinációk KBR-tlterének meghatározása.

Ezen közbenső vizsgálatok után a.palackokba töltött szérumkombinációkkal végezzük az eljárás további fázisait.

IV. Abszorbensek készítése

A placentával végzett műveletek

A kórházból kapott friss emberi méhlepényeket az alábbi műveletek elvégzéséig fagyasztott állapotban tartjuk.

A fagyasztott placentát fokozatosan hagyjuk felengedni és n nátrium-klorid-oldattal alaposan mossuk. Ezután a köldökzsinórt és a fasciát eltávolítjuk. Hepatitis-tesz céljára a köldökzsinórból vérmintát veszünk. A placentát feldaraboljuk, majd egy turmixberendezésben pépesítjük. A homogenizátumot hűtött centrifugában 15 percig centrifugáljuk (3000 g), majd három ízben n nátrium-klorid-oldattal rfiossuk, végül 500 ml-es palackokba töltjük. Bakteorológiai vizsgálat céljából mintát veszünk és azt a közbensovizsgálatok befejezéséig -18 °C hőmérsékleten tároljuk.

Közbenső vizsgálatok:

a) Sterilitás és

b) májgyulladást okozó vírusok vizsgálata.

Eritrocita-koncentrátum

A mosott, steril vörösvérsejt-koncentrátumot vérbankokból szerezzük be, ahol azt előzetesen megvizsgálták.

V. További műveletek a nyers szérumkombináei óval a végtermék kinyeréséig

1. Abszorbensek

a) Abszorpció 8 placentán

A fagyasztott állapotból kiengedett placenta-homogenizátumot újból centrifugáljuk és mossuk. Az üledéket méijük.

Az abszorpciós arány: 1 rész piacénta és 6 rész szérum.

A szérumot ráöntjük a placentapépre, majd ezeket fél órán át rázzuk, utána centrifugáljuk.

A nem abszorbeált szérumból álló felülúszó folyadékot eltávolítjuk és a következő abszorpcióhoz eltesszük.

A közvetlen hemagglutináció céljára mintát veszünk, a titer rendszerint 1512.

b) Abszorpció az eritrocitákon

Vérbankból friss, mosott, steril eritrocita-koncentrátumot kapunk zacskóban, amelyet azonnal felhasználunk.

Két abszorpciós műveletet végzünk, az arány: 1 rész eritrocita és 5 rész szérum.

Az eritrocitákat óvatosan adjuk a szérumhoz. A keveréket ugyancsak óvatosan összerázzuk, majd 15 órán át 37 v hőmérsékletű vízfürdőben inkubáljuk, miközben 10 percenként összerázzuk.

A fenti keveréket ezután egy hűtött centrifugában 15 percig 1000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk.

A felülúszó folyadékot újból egy abszorpciós kezelésnek vetjük alá.

Az abszorbeált szérum mennyisége körülbel ugyanannyi, mint a nyers szérum kezdeti mennyisége.

A hemagglutinációs titert mindegyik abszorpciós művelet után meghatározzuk. Ennek értéke az első abszorpció után 1:128 és 1:64 között, míg a második abszorpció után 1:8 és 1:4 között van.

2. Ammónium-szulfáttal végzett kicsapás és dialízis

Az abszorbeált szérumot azonos mennyiségű Injekciós célokra alkalmas vízzel (Ampuwa) összekeverjük. Ezután lassú ütemben hozzácsepegtetünk olyan steril, telített ammónium-szulfát oldatot (NH₄)aSO₄, amelynek pH-ját ammónium-hidroxiddal 7,2 értékre állítottuk be. Az arány: 100 rész hígított szérumra 82 rész fenti ammónium-szulfát-oldat. A kicsapást úgy végezzük, hogy egy éjjelen át keverjük a fenti elegyet.

A csapadékot 30 percig tartó centrifugálással (5000-6000 g) elválasztjuk és a felülúszó folyadékot

-3leöntjük. A csapadékot ezután három Ízben, 45%-os ammónium-szulfát-oldattal mossuk.

A végső csapadékot a nyers szérum kezdeti menynyiségének felével együtt 8,0-8,1 pH értékű trisz-HCl-pufferben oldjuk. Ezt az oldatot dializiszsákokba töltjük és trisz-HQ-puffer-oldattal 24 órán át dializáljuk, miközben a pufferloldatot négyszer cseréljük. Ezután a globulinfrakciót 500 ml-es palackokba töltjük és -18 °C tároljuk. Sterilitási vizsgálat céljából mintát veszünk.

3. Ioncserélő kromatográfia

A kromatográfiás oszlopot cellulózzal töltjük meg és trlsz-HCl-pufferoldattal egyensúlyba kezeljük (sterilezzük). Az oszlop bemenete elé egy steril szűrőt csatlakoztatunk.

A dializált globulinfrakciót tartalmazó mintátszivattyú segítségével felvisszük az oszlopra, majd azt 8,0-8,1 pH-jú 0,05 mólos trisz-HCl-pufieroldattal eluáljuk. Az első csúcs az egyéb immunglobulinokkal szennyezett IgG:ezt összegyűjtjük és 0,9%-os nátrium-klorid-oldat hozzáadása után betöményítjük.

4. Ultraszűrés

Az ioncserénél kapott első frakciót egy Diaflo Hollow Fiber Apparátus (Amicon) berendezésben végzett ultraszűrés útján betöményítjük, emellett a visszatartási határérték: 50.000 M. Az eluátumot legalább 25 mg/ml proteinkoncentrációig töményítjük be, amit spektrofotométerrel határozunk meg 280 nm hullámhosszon. Az immunglobulint a kiindulási mennyiségre számítva kb. 50%-os kitermeléssel kapjuk meg. A legnagyobb veszteség az oszlopon végzett frakcionálás során lép fel.

5. Dialitis, ultracentrifugálás, sterilre szűrés

Az ultraszűrést követően a koncentrátumot dializiszsákokba töltjük és ezeket 7,0 pH-jú,foszfáttal pufferezett nátrium-klorid-oldattal dializáljuk. A dialízist 24 órán át 4 °C hőmérsékleten végezzük és a pufferoldatot 4 alkalommal cseréljük.

A nagy komplexmolekulák, valamint a zsírmolekulák eltávolítása céljából a már dializált proteinoldatot 60 percig 18,000 fordulat/perc sebességgel (kb. 50,000 g) centrifugáljuk.

A globulinoldatot ezután sterilre szűrjük. Ezt a műveletet acélból készült nyomásálló edénybe, a környezetinél nagyobb nyomású nitrogénatmoszférában végezzük egy redőzött membránkapszulában (membránszűrőben), melynek pórusmérete 0,22 pm és buborékpont-tesztnek (bubble point test) volt alávetve. A globulinoldatot ezt követően 20 ml/ml proteintartalomra beállítjuk, majd 500 ml-es palackokba töltjük és ezeket a kisebb edényekbe történő szétosztásig hűtőszekrényben tároljuk. A közbenső vizsgálatokhoz mintát veszünk.

6. Letöltés

A globulinoldatot üvegből készült, 5 ml-es és 10 ml-es üvegedényekbe töltjük és ezeket gumidugóval és alumínium-zárólemezzel látjuk el., Ezeket az edényeket közvetlenül a betöltés előtt autoklávban sterilezzük. A letöltés előtt a töltőberendezés esetleges fertőzöttségét ellenőrizzük (letéphető lemezek, levegővel bejutott csírák meghatározásai. A letöltés előtt azt a helyességet, ahol ezt végezzük, egy éjjelen át porlasztott formaiinnal ferőtlenítjük. A letöltéshez használt csöveket autoklávban végzett hőkezeléssel sterilezzük.

S terilitási tesztek: sterilizációs tesztcsík, autoklávozási tesztcsík, bioindikátorok, hőmérséklet mérése.

A proteinoldatot a letöltést közvetlenül megelőzően még egyszer sterilre szűrjük, majd automata töltőberendezéssel (Perfill) letöltjük.

A gumidugót és a fémből készült záróelemet jelenleg még kézzel helyezzük el, majd azokat egy pneumatikus perembehajtó szerszámmal rögzítjük.

A letöltési művelet közben a végső vizsgálatok és az újrabeállítás céljából mintákat veszünk,

A terméket 4 C hőmérsékleten karantén hűtőszekrényben tároljuk.

Ebből a terméket kivesszük és 4 °C-on tároló hűtőszekrényben tartjuk.

Ellenőrző vizsgálatok az eljárás egyes fázisaiban

I. A sejtvonal vizsgálata

A T-antigén kvantitatív meghatározására: spontán rozetta-tesztet alkalmazunk.

II. A házinyulak vizsgálata

Az állatok állatorvosi felügyelet alatt állnak (dr, Ibiméi-Baumer) a szérumokra és vakcinákra vonatkozó rendelet 15. szakaszában levőelőírásoknak,megfelelően. Kivéreztetés után az állatokat boncolás céljából a Bajor Állategészségügyi Intézetnek adjuk át.

III. Közbenső termékeken végzett vizsgálatok

1. ) Az egyes házinyúlszérum-minták

a) Sterilitási vizsgálat (baktériumok, gombák).

b) Fajlagos hatás vizsgálata (kimplement-kötésl reakció).

c) Toxicitás vizsgálata emberi vörösvérsejtekkel (közvetlen hemagglutináció),

2. Abszorbensek

a) Plaxenta:

1. Májgyulladást okozó vírusok vizsgálata (HbsAG-RlA), Pettenkofer- Intézet

2. Sterilitási vizsgálat.

b) Mosott eritrocita-koncentrátum: Májgyulladást okozó vírusok és sterilitási vizsgálat (a vérbank végzi).

3. ) Az ammónium-szulfáttal végzett kicsapást és a dialízist követően végzett sterilitási vizsgálat.

4. ) Pirogén anyagok vizsgálata in vitro az oszlopon végzett frakcionálás előtt és után.

IV. A végtermék vizsgálata a letöltés előtt

1. Sterilitási vizstálat a Ph. Eur. (Európai Gyógyszerkönyv) előírásainak megfelelően.

2. Ártalmatlansági vizsgálat (Limulus-teszt-pyrogenitás) vizsgálata.

3. A hatás vizsgálata

Komplementkötési reakció

Proteinmeghatározás.

V. A végtermék vizsgálata széttöltés után (szabálytalan időközökben vett mintákból)

1. Sterilitási vizsgálat a Ph. Eur. (Európai Gyógyszerkönyv) előírásainak megfelelően (Fresenius A.G. (Bad Homburg) bakterológiai kísérleti laboratóriuma)

2. Vírusok vizsgálata

Szabálytalan időközökben vett minták vizsgálata, Max-von-Pettenkofer-Intézet, München

3. Ártalmatlansági teszt

Pirogenitási vizsgálat házlnyulakon (Ph. Eur. Európai Gyógyszerkönyv bakteriológiai kísérleti laboratóriuma, Bad Homburg)

Lumulus-teszt (Pyrogenitás) - Bad Homburg és Grafelfingg

4. Hatás és azonossági vizsgálat

Rozetta-gátlás

Limfotoxicitási vizsgálat (Haematológiai Intézet,

-4München)

Kompíementkötiési-reakdó

Közvetlen hemagglutinádó . Immunelektroforézis

Immundiffúzió

Poliakrilamld-gél-elektroforézis (Haematológiai Intézet, München)

HPLC gélszűrés (Haematológiai Intézet, München)

Proteinmeghatározás

Imminszupresszív tulajdonságok (átültetett bőr túlélési ideje majmokon: TNO Primates Center, Rijswijk).

ATG-Fresenius® (Anti-human-T-limfocita-globulin)

Vizsgálati módszerek

1. A közbenső termékek vizsgálata (az eljárás folyamán végzett vizsgálatok)

1.1 Egyedi házinyúlszérum-minták

a) Sterilitási vizságlat (baktériumok és gombák) a Ph. Eur. előírásai szerint,

b) Hatás vizsgálata az antitest-titer meghatározása perifériás emberi limfocitákkal komplement-kötési reakcióban).

c) Toxicítási vizsgálat emberi eritrocitákkal (a hemagglutináló antitestek meghatározása közvetlen hemagglutinációs teszttel).

A nem steril szérumokat kiöntjük.

A komplementkötési reakció alsó határértéke 1:64. Az ennél kisebb értéket mutató szérumokat kiőntjük. A komplementkötési reakcióhoz a felső határértéket nem kell megállapítani, minthogy a JM-sejtvonallal történő immunizálás nem eredményez 14000 feletti hemagglutinációs értéket.

1.2 Házinyulaktó származó szérumkombinációk

A vizsgálatokat lásd: 1.1 a) — 1.1 c).

A komplementkötési reakció alsó határértéke = « 1:256.

1.3 Abszorbensek

a) Placenta (köldökzsinórból származó vér): Májgyulladást okozó vírusok (HbsAG-RIA) vizsgálata. Pettenkofer-Intézet, München.

b) Placenta (pépesített és mosott): Sterilitási vizsgálat a Ph. Eur. előírásai szerint. A vírusokkal fertőzött, illetve a nem steril placentákat eldobjuk.

c) A mosott eritrocita-koncentrátum sterilitás és a májgyulladást okozó vírusok vizsgálatát a vérbank végzi.

1.4 Kicsapott szérum

Az ammónium-szulfáttal végzett kicsapás és az ezt követő dialízis után:

a) Sterilizátis vizsgálat a Ph: Eur. előírásai szerint.

b) Az lmmónium-szulfáttal dialízissel végzett eltávolítását úgy ellenőrizzük, hogy egy mintához salétromsavat és bárium-kloridot adunk.

1.5 A cellulóz ellenőrzése

Ez az oszlopfrakcionálás előtt és után végezzük oly módon, hogy az eluátum pirogenitását vizsgáljuk (Limulus-teszt -Pyrogenitás).

1.6 Letöltés előtti végtermék-ellenőrzés

a) Sterilitási vizsgálat (baktériumok és gombák).

b) Pirogenitás vizsgálata in vitro (Limulus).

c) Komplementkötési reakció perifériás limfovítakkal.

d) Fotometriás proteinmeghatározás 280 nm hullámhosszon.

2. A végtermék vizsgálata (Végső ellenőrzés)

2.1 A beadásra alkalmas termék általános jellemzőinek vizsgálata

a) Szin: színtelen, víztisztától gyengén opalizálóigb) Szag: speciális szag nem észlelhető.

c) A szuszpendált anyag vizuális vizsgálata,

d) A pH-értéke =6,8-7,1.

2.2 Azonossági vizsgálat és a hatóanyag-tartalom mégha tározása

a) Immunelektroforézis házinyulak teljes szérumával, valamint házinyúl-immunglobulinokkal.

b) Pliakrilamid-gél-elektroforézis.

c) HPLC-gélszűrés.

d) Proteinmeghatározás (fotometria, 280 nm, kvóciens: 1,4). Az átengedés tűrési határa: ± 10% protein.

2.3 A hatás vizsgálata

a) Komplementkötési reakció.

b) Antitest-titer rqeghatározása emberi perifériás limfocitákkal.

c) Limfocita toxicítási vizsgálat Az 50%-os citotoxicitás alsó határértéke = 1:2000.

d) Közvetlen hemagglutinádó Emberi eritrodtákat hemagglutináló antitestek meghatározása.

2.4 A végtermék tisztaságának vizsgálata

a) Baktériumok és gombák vizsgálata a Ph, Eur. II előírásai szerint.

b) Pirogenitásí vizsgálat a Ph. Eur. (1975) előírásai szerint.

c) Vírusok vizsgálata (Pettenkofer-Institut).

d) Idegen proteinek vizsgálata (Ouchterlony),

e) Antitestek vizsgálata emberi szérummal (ímmunelektroforézis).

f) Antitestek vizsgálata emberi trombocltákkal (trombocitaaggregáció).

Claims (5)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás anti-T-limfocita-globulin előállítására immunizált állatok, előnyösen házinyúl szérumából, azzal jellemezve, hogy az anti-T-limfocita globulínt JM-sejtsorral immunizált állatok szérumából állítjuk elő.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás anti-T-limfocitaglobulin előállítására immunizált állatok, előnyösen házinyúl szérumából, azzal jellemezve, hogy az anti-T-limfocita-globulint a JM-sejtvonalnak a Pasteur Intézetben 1-147 szám alatt deponált törzsével immunizált szérumából állítjuk elő.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az anti-T-limfodta-globulint immunizált házinyulak szérumából állítjuk elő.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás anti-T-limfocita-globulin előállítására, azzaljellemezve, hogy a JM-sejtsor lomfoblasztoid T-sejtjeinek tenyésztésével nyert termékkel antiszérumot készítünk in vivő és az anti-T-limfocitákat kinyerjük.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a JM-sejtsor limfoblasztoia sejtE szuszpendált tenyészetben tenyésztjük, a kapott foblasztoid T-sejtekkel állatokat Immunizálunk, az állatokat kivéreztetjük, a vért centrifugáljuk és az

   -5189.998 anti-T4omfocita globullnt tartalmazó nyers szérumokat egyesítjük, először placenta-homogenizátumon, ezt követően erltrocita-koncentrátumon abszobeáltatiuk. a részben tisztított nyers szérumhoz ammó· nium-szulfátot adunk a kapott csapadékot dializáliuk, az így elkülönített globulinfrakcióból ioncserélő

   5 Kromatografálással az IgG-frakciót elkülönítjük és tisztítjuk.

   rajz nélkül