HU187421B - Process for producing inactivated, adjuvated serum against aujeszky's illness - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás az Aujeszky-féle betegség elleni inaktivált, adjuvált oltóanyag előállítására.

A háziállatok régóta ismert, súlyos gazdasági veszteséget okozó betegsége az Aujeszky-féle betegség, amely nevét első leírójáról, a magyar Aujeszkv Aladártól kapta (Zbl. Bakt. Őrig. 1903 I, 32, 353-357). A betegség elsősorban a sertésállomá nyokban, a fiatal malacoknál okoz nagy veszteségeket. Az életkor előrehaladtával az Aujeszky-féle betegség okozta malacelhullás aránya csökken, de a légzőszervi megbetegedés, az idegrendszeri bán talmak, és a szövődmények az állattartás gazdasá gosságát erősen lerontják. A vírussal fertőzött álla tok a kórokozót hosszabb ideig (1-2 évig) hordoz hatják, és stressz hatások - mint például az ellés után vírusürítés révén a betegséget terjeszthetik (J. Am. Vet. Med. Áss. 176, 1980, 998-1000,

1345-1347). A fertőzött kocák magzataikat gyakran elvetélik (Acta Vet. Acad. Sci. Hung, 12, T962,

17-23). A fertőzött sertések nagy szerepet játszanak a kérődző állatok (szarvasmarha, juh) Aujész· ky-féle betegségének terjesztésében is (Acta. Vet Acad. Sci. Hung. 12,1962,53-58, J. Am. Vet. Med Áss. 176, 1980, 1001-1003). A fertőzött kocák a tej útján a vírust és a kolosztrális ellenanyagot egyaránt üríthetik (Acta. Vet. Acad. Sci. Hung. 7, 1957, 273-276, Acta. Vet. Sci. Hung. 13, 1963, 111-118). Az Aujeszky-betegség elleni védekezési eljárások alapvetően arra irányulnak, hogy a beteg ség iránt legfogékonyabb szopós malacokat életük első heteiben specifikus ellenyagokkal megvédjék.

Hazánkban a betegség elleni védekezés céljából első lépésként a szopós malacok preventív kezelésé! célzó hiperimmun szérum termelési technológiáját dolgozták ki (Acta. Vet. Acad. Sci. Hung., 7, 1957, 423-427). A sertésekből termelt hiperimmun szérum kellő időben alkalmazva a veszteségeket csökkenti, azonban hátrányai jelentősek: a szérum előállítása nagyon költséges, és a szérum gyorsan (10-14 nap alatt) kiürül a szervezetből. A szérum > magas költsége miatt alkalmazása nem kerülhet szóba a süldőknél és a felnőtt állatok esetében.

Az Aujeszky-bétegség elleni védekezés következő lépése a betegség elleni aktív immunizálási eljárás bevezetésé volt, amelynek során különböző módon és mértékben gyengített vírustörzseket állítottak elő vakcinagyártás céljára. Hazánkban 1961 óta van forgalomban csökkentett virulenciájú élővírus vakcina, amelyet sertések, kérődzők, és az ebek aktív immunizálására használnak (MÁL. 16 1961, 42-45). A betegség gazdasági kártétele a széleskörű vakcinázási program bevezetése óta csökkent hazánkban, (Cah. Med. Vet. 43, 1974,240-247) azonban az élővírus vakcina alkalmazásának v^n néhány hátránya:

1. Vemhes kocák immunizálása után a kolosztrum és a. tej ellenanyagtartalma egyedenként változó ideig, 4-6 hétig a malacoknak passzív immunitást biztosít. Ezidő alatt az élővírus vakcinával eredményesen immunizálni nem lehet, mert a kiürülőfélben lévő kolosztrális ellenanyagok alacsony szintje is képes megakadályozni a vakcinavírusnak az aktív immunitás kialakulásához szükséges mértékű elszaporodását. *

2. A fenti okok miatt lehetnek az állományban olyan állatok, amelyeknél a vakcinázás eredménytelen volt, és fertőzött állományban ezek a hiányos immunállapotú egyedek biztosítják a virulens vírus fennmaradását.

3. Az élő vakcinák alkalmazását néhány országban hatóságilag tiltják, és egyes esetekben ezt a tilalmat kiterjesztik az élő vakcinával immunizált állatokból származó húsra is, így a hazai húsexport lehetőségei beszűkülnek.

4. Bár a hazai attenuált vakcina ezideig ártalmatlannak és genetikailag stabilnak bizonyult, külföldi megfigyelések beszámolnak egyes esetekben a különböző attenuált vakcina vírustörzsek virulenciájának váratlan fokozódásáról (The Vet. Bull. 43, 1973, 465-480, Dtsch. Tierarzt. Wschr., 85, 1987, 381-420), amely a vakcinával oltott állatok súlyos oltási reakciójában nyilvánul meg.

5. A hazai attenuált vakcina ebek és nyércek számára nem teljesen ártalmatlan, macskát nem ' immunizál.

Az élő vakcinával kapcsolatos problémák miatt már korábban próbálkoztak inaktivált vakcina előállításával, formalint, UV-sugárzást, hőt, bétapropíolaktont, szaponínt, kristályibolyát, etanolt használva inaktiválásra, alumínium hidroxid-gélt adjuválásra (Acta Microbiol. Hung. 2 151-160 1954, Arch. exp. Vet. Med. 17 595-613, 1963, Arch. Vet. 5 107-14, 1968 Arch. Exp. Vet. Med. 21 501-507 1967). Az inaktiválási eljárások és az adjuválás módja azonban nem eredményezett kellő hatékonyságú vakcinát. A vírus nukleinsavára ható alkilező inaktiváló ágensek alkalmazásával etiletiléúiminnel inaktivált, DEAE dextránnal adjuvált vakcina előállításáról számoltak be kutatók (Zbl. Vet. Med, B, 20, 127-138, 1973).

A DEAE-dextrán adjuválás azonban allergiás reakciókat váltott ki.

A fentieket figyelembe véve a találmány célja tehát az Aujeszky-féle betegség ellen egy olyan inaktivált vakcina előállítása, amely

1. hatékonyság tekintetében az élő attenuált Aujeszky vakcinával azonos vagy jobb eredményt ad,

2. bármely korú és fajú, a betegség iránt fogékony állat számára ártalmatlan, és megfelelő szintű aktív immunitás létesítésére alkalmas,

3. kolosztrális immunitással rendelkező malacok aktív immunizálására is felhasználható.

Ezt a feladatot olyan eljárással oldottuk meg, amelynek során

- az Országos Közegészségügyi Intézetnél 00 236 sz. alatt letétbe helyezett virulens vírustörzzsel nyulakat fertőzünk meg, az elpusztult állatpk agyából szuszpenziót készítünk, a nyúlagyszuszpenzió 1-3. szövetpaszázsával

-.előkeltetett SPF tyúkembrióból trípszines emésztéssel előállított primer egyrétegű, vagy fiatal borjak heréjéből trípszines emésztéssel kézült primer egyrétegű, vagy BHK sejtvonal felhasználásával készült egyrétegű, szuszpenziós vagy mikrohordozós kultúrát fertőzünk, a kultúrát 37 ’C-on a teljes sejtkárosító hatás megjelenéséig inkubáljuk,

- majd a learatott vírusszuszpenziót felhasználás előtt brómetilaminból ciklizált etilén-iminnel inak-2. 187 4i tiváljuk és olajos inkomplett adjuvánssal adjuváljuk.

A találmány szerint előállított vakcina kiváló immunizáló hatása több tényezőre vezethető viszsza. A felhasznált vírustörzs egy hazai járványeset- ⁵ bői származik, biológiai tulajdonságaira jellemző az eredményes szaporíthatóság, sejttenyészetben és fogékony állatban egyaránt, valamint a magas infektív titer, a jó immunizálóképesség. Az utóbbi megőrzésében a protektív antigéneket kímélő inak- ¹⁰ tiválási eljárásnak fontos szerepe van. összehasonlító inaktiváláskinetikai vizsgálatok során választottuk ki ismert anyagok közül azt az inaktiválószert, annak koncentrációját, az inaktiválási eljárás hőmérséklet- és idő paramétereit, amely a haté- ¹⁵ konysági vizsgálat során a legjobb eredményt adta.

Az inaktiválásra előnyösen használt etilénimint az általunk kifejlesztett eljárás alapján híg vizes, így veszélytelen oldat formájában felhasználás előtt ciklizáljuk. ²⁰

Az inaktivált vírusanyagot olajos inkomplett adjuvánssal adjuváljuk. Előnyösen az általunk kifejlesztett „phylaxia” adjuvánst alkalmazzuk, amely 73% Marcol 52 olaj (ESSO), 12% Span 80 (Atlas),

3% Span 20 (Atlas) és 12% Tween 60 (Atlas) keve- 25 réke.

A szövettenyészet kialakítására a szokásos Roux palackokat alkalmazhatjuk, de előnyösen laboratóriumi forgató torony (Gyártó: Elektromos Fémipari és Szolgáltató Szövetkezet) vagyis rolling be- 30 rendezés alkalmazásával készítjük a szövettenyészetet, mert ez nagyon gazdaságos. A rolling berendezés egyrétegű sejttenyészetek előállítására szolgáló, lassan forgó elektromos meghajtású készülék.

A tenyészedények (csövek vagy henger formájú 35 palackok) a készülék állványára helyezve hosszanti tengelyük mentén 10—15 perc’¹ fordulatszámmal forognak. A sejttenyészet beindításakor a bevitt sejtek az edény falán körben megtapadnak, és szaporodásuk következtében a henger felületét teljesen ⁴⁰ benövik. A lassan mozgó tápfolyadék a sejtek felületéről eltávolítja az anyagcseretermékeket, így jobb szaporodási feltételek alakulnak ki, mint az állandó helyzetű kultúra esetén. Míg egy hagyományos Roux palack hasznos felülete mintegy 45 300 cm², addig a rolling palack használható felülete 650-660 cm², ami nagyobb sejtszámot, magasabb vírushozamot és magasabb virustitert jelent [Gey, G. O.: Am. J. Cancer 17, 752 (1933); Ray-, mond C. Parker: „Methods of tissue culture, Hoe- 50 bér Medical Division USA 1961”, harmadik kiadás].

Amennyiben a szövettenyészethez a BKH 21 sejtvonalat alkalmazzuk (újszülött hörcsög veséjéből kialakított sejtvonal, lásd: J. Natl. Cancer Inst. 55 1963, 30, 795; beszerezhető: Flow Laboratories Limited, P. O. Box 17, Irvine, Ayrshire, Scotland), szuszpenziós vagy mikrohordozós tenyészetet is alakíthatunk ki. A mikrohordozós tenyészet lényege, hogy az összefüggő sejtréteg nemcsak a tápkö- θο zeget tartalmazó edény falán, hanem a tápoldatban lebegő műanyaggömbök felületén is kialakul, ami nyilván a hasznos felület növekedésével jár (van Wenzel, A. L., Natúré 216, 64-65 (1967)].

A találmányt az alábbi példákkal közelebbről ismertetjük. A példákban említett tápközegek öszszetételét az alábbi irodalmi helyek tárgyalják:

Earle oldat: Earle, W. R.: Arch. exp. Zellforsch. 76 116 (1934),

Hanks oldat: Hanks, J. H.: J. cell. comp. Physi□1.31,235 (1948)

MEM-E: Earle, W.: J. Nat. Cancer Inst. 4, 165 (1943)

Eagle, H.: Science 130, 433 (1959)

MEM-H: Hanks, H.: Proc. Soc. Exp. Bioi. Med. 196 (1949).

1. példa

a) Az oltóvírus előállítása

Az Aujeszky-féle betegség heveny járványesetből izolált, és az OKI-nél 00 236/82 szám alatt deponált ú.n. Phylaxia virulens vírustörzzsel 2-2,5 kg-os nyulakat intracerebrálisan fertőzünk. Az Aujeszkyféle betegségre jellemző tünetek mellet 72-96 órás lappangási idő után elhullott nyulak agyvelejét steril körülmények között kivesszük és fiziológiás konyhasó-oldattal készített 10%-os szuszpenzióját használjuk tömeges vírusszaporításra.

b) A vírusszuszpenzió előállítása

Az a) pont szerint előállított „Phylaxia” jelű virulens Aujeszky vírustörzset primer tyúkembriófibroblaszt, vagy primer borjúhere egyrétegű sejttenyészetben, 2000 ml-es Roux palackokban vagy rolling berendezés forgó palackjaiban elszaporítjuk. A sejtszaporítás történhet sejtvonalakon (BHK-21) szuszpenziós vagy mikrohordozós kultúrában is. A sejttenyészetek növesztő folyadékának Hanks vagy MEM-H oldatot, fenntartó és vírusszaporító folyadéknak Earle vagy MEM-E oldatot használunk. A sejtszaporításhoz használt Hanks vagy MEM-H oldatot 10% növendék marhasavóval kiegészítve alkalmazzuk, a vírusszaporítc oldatok savót nem tartalmaznak. Az egyrétegű sejttenyészet kialakulása után a növesztő folyadékot leváltjuk, majd a tenyészetekre vírustartalmú fenntartó folyadékot öntünk. A tenyészeteket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk a teljes sejtkárosító hatás megjelenéséig (48-72 óra). A learatott virusszuszpenzió akkor alkalmas az inaktivált Aujeszky vakcina előállítására, ha steril, és sejttenyészetben mért infektív titere legalább 10⁷ TCID₅₀/ mh

c) Inaktiválás, adjuválás, kiszerelés

A b) pont szerint előállított vírusszuszpenziót inaktiváljuk. Az inaktiválást 200 tm/ml koncentrációjú, felhasználás előtt brómetilaminból ciklizált etilénimin oldattal végezzük, 37 °C hőmérsékleten, 6 órán át. Az etilénimint nátrium-tioszulfáttal semlegesítjük, majd az inaktivált vírusszuszpenzió pHját 7,2-7,4 értékre állítjuk be. Az élővírustartalom inaktiválódását az előbb leírt sejttenyészetekre való oltással valamint 2-2,5 kg-os nyulak és 25-30 kgos juhok oltásával lehet ellenőrizni.

A vírusanyagot ezután az immunizálóképesség fokozása érdekében azonos mennyiségű „Phylaxia” inkomplett olajos adjuvánssal keverjük össze. A vizes fázisú szuszpenziót és az olajos adjuvánst

187 421 magasnyomású készülék segítségével stabil emulzióvá alakítjuk, amely 0-+45 ’C hőmérséklet közölt nem válik szét. Az inaktivált és olajos adjuvált vakcinát sterilen üvegekbe töltjük és légmentesen zárjuk.

d) Oltási reakció vizsgálata A fentiek szerint előállított vakcinával nyulakat, juhokat, ebeket, két napos, 3 hetes, 8 hetes korú malacokat, valamint vemhességük utolsó harmadában lévő kocákat oltunk izomba ismételten a vakcina 2 ml-es adagjával. A kísérleti vakcinával okolt nyulakat és juhokat 6 hétig, a sertéseket 3 hónapig tartjuk megfigyelés alatt, amely idő alatt semmiféle oltási reakció nem jelentkezik.

2. példa

Malacok immunizálása

A vakcina 2 ml-es adagjával 2 napos, 3 hetes, 8 hetes korú fogékony malacokat vakcinázunk intramuszkulárisan, 3 hetes időközzel kétszer. A kezek sertésekben specifikus ellenanyagok keletkeznek, amelyek a vakcinázott állatokat megvédik a 2 x 10® TCID₅₀ virulens Aujeszky vírussal végzett íntrana záiis felületfertőzés során, míg a nem vakcinázott fogékony malacok a felülfertőzés következtében elhullanak.

3. példa

Kolosztrális immunitás létrehozása

A vakcina 2 ml-es adagjával fogékony vemhes kocákat vakcinázunk 3 hetes időközzel, kétszer, a vemhesség utolsó harmadában úgy, hogy a várható ellés előtt két héttel az immunizálás befejeződjön Az immunizált kocák kolosztrumában specifikus ellenanyagok jelennek meg, amelyek következtében a malacok vérsavójának 7 napos korban mért vírussemlegesítő titere átlagosan 1 : 16. Ez az ellenanyagszint a 2 x 10⁶ TCIDj₀ titerű virulens vírussal végzett felülfertőzéssel szemben meglévő védettséget ad. A 30., 60. és 90. napon végzett ellenőrző felülfertőzés 'során a csökkenő szintű kolosztrális ellenanyagokkal rendelkező malacoknak csupán 18, 26, illetve 40%-a hullik el. A nem immunizált kocáktól származó azonos korú kontroll malacoknál ez az elhullás 100%.

A tej útján kapott specifikus ellenanyagok tehát megvédik a szopós malacokat a betegség iránt legfogékonyabb életkorban.

4. példa

Kolosztrális immunitással rendelkező malacok vakcinálása

A 3. példa szerint immunizált fogékony kocáktól származó, kolosztrális immunitással rendelkező malacokat 7 napos és 28 napos korukban kétszer oltjuk a találmány szerint készült vakcina 2 ml-es adagjával. A malacoknál magas titerben (1 :44) keletkeznek specifikus ellenanyagok,, A malacokat napos korukban 2 x 10® TCID_S0 titerű virulens vírussal intranazálisan felülfertőzzük. A kolosztrális alapimmunitással rendelkező, kétszer vakcinázott malacok tünetmentesen átvészelik a felülfertőzést, mig az oltatlan kocáktól származó nem vakcinázott kontroll malacok 100%-a elhullik. Kolosztrális immunitással rendelkező szopós malacok tehát eredményesen immunizálhatok az inaktivált vakcinával.

5. példa

Az oltás gyakorisága

A 3. példa szerint kétszer vakcinázott fogékony kocák újabb vemhességük alatt egy alkalommal emlékeztető oltásban részesülnek, az 1. példa szerint készített vakcina 2 ml-es adagjával. Az emlékeztető oltás hatására a kocák kolosztrumának specifikus ellenanyagszintje újra magas lesz, így malacaik 2x 10® TCID₅₀ titerű virulens vírussal végzett ellenőrző felülfertőzése alkalmával a 3. példában leírt eredményeket kapjuk. A második vemhesség alatt pótoltásban nem részesült kocák malacai a felülfertőzés során nagyobb %-ban mutatnak elhullást, (6 hetes korban 35%), tehát a megfelelő szintű kolosztrális védelem érdekében az alapimmunitással rendelkező kocákat minden vemhességük idején egy alkalommal pótoltásban kell részesíteni.

6. példa

Juhok immunizálása

Az 1. példa szerint készített vakcina 2 ml-es adagjával egy, három és hat hónapos korú juhokat immunizálunk, majd az oltás utáni 15. napon 1000 TCID₅₀ virulens Aujeszky vírussal felülfertőzzük. A vakcinázatlan kontroll juhok 100%-a elhullik a fertőzés következtében, mit az immunizált juhok tünetmentesen átvészelik a felülfertőzést.

7. példa

Ebek immunizálása

Az 1. példa szerint készített vakcina 2 ml-es adagjával egy hónapos, valamint 6 hónapos korú ebeket oltunk 3 hetes időközzel, kétszer. A második oltás utáni 15. napon a vakcinázott ebeket oltatlan kontroll ebbel együtt 10® TCID_S0 virulens vírussal felülfertőzzük. Az oltott ebek specifikus ellenanyagszintje magas (1 ; 32) és a fertőzést tünetmentesen átvészelik, míg az oltatlan kontroll a betegségre jellemző tünetek mellett elhullik.

Claims (1)

1. Szabadalmi igénypontok

   I. Eljárás az Aujeszky-féle betegség elleni inaktivált vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy

   - az Országos Közegészségügyi Intézetnél 00 236 sz. alatt letétbe helyezett virulens vírustörzzsel nyu-4187421 lakat fertőzünk meg, az elpusztult állatok agyából szuszpenziót készítünk, a nyúlagyszuszpenzió 1-3. szövetpaszázsával

   - előkeltetett SPF tyúkembrióból tripszines emésztéssel előállított primer egyrétegű, vagy fiatal ⁵ borjak heréjéből tripszines emésztéssel készült primer egyrétegű, vagy a BHK sejtvonal felhasználásával készült egyrétegű, szuszpenziós vagy mikrohordozós kultúrát fertőzünk, a kultúrát 37 ’C-on a teljes sejtkárosító hatás megjelenéséig inkubáljuk,.

   - majd a learatott vírusszuszpenziót felhasználás előtt brómetilaminból ciklizált etilén-iminnel inaktiváljuk és olajos inkomplett adjuvánssal adjuváljuk.