HU185022B - Process for the preparation of biologically active tetrapeptide derivatives - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás egy új, fájdalomcsillapító hatást mutató tetrapeptid-származékok előállítására.

A közelmúltban emlősök agyából és agy-gerincvelői folyadékából merfinszerű tulajdonságokkal rendelkező endogén anyagokat vontak ki. E vegyületeket enkefalinoknak nevezik, szerkezetüket Hughes és munkatársai (Natúré 258, 577 /1975/) derítették fel, eszerint az enkefalinok az alábbi összetételű pentapeptidek:

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH.

E két vegyületet metionin-enkefalinnak, illetve leucin-enkefalinnak nevezik.

Habár kimutatták, hogy a metionin-enkpdalin és a leucin-enkefalin fájdalomcsillapító hatást mutat, ha egerek agykamrájába adjuk be őket (Buscher és munkatársai, Natúré 261,423 /1976/), gyakorlatilag mégis használhatatlanok, mivel parenterálisan (a gyomorés bélrendszer megkerülésével) adagolva nincs fájdalomcsillapító hatásuk.

Ezért az enkefalinok felfedezése óta sok új enkefalin-analógot állítottak elő, abban a reményben, hogy hatásuk nagyobb lesz és, hogy parenterális vagy orális (szájon át) adagolás esetén biológiai hozzáférhetőségük (bioavailability) révén gyakorlatban is alkalmazhatók lesznek.

Dutta és munkatársai, Life Sciences 21, 559-562 (1977) leírtak bizonyos szerkezeti változtatásokat, amelyek szerintük megerősítik az új származékok biológiai hatását. Szerintük az enkefalin-származékok hatását az alábbi szerkezeti változtatások egyikének vagy összességének bevezetésével lehet felerősíteni:

a) A 2-es helyen lévő glicin helyettesítése bizonyos D- vagy a-aza-aminosavakkal,

b) a terminális karboxilcsoport átalakítása metilészterré vagy amiddá,

c) a 4-es helyzetben lévő fenil-alanin módosítása α-aza helyettesítéssel, N-metilezéssel vagy az aromás gyűrű hidrogénezésével.

Ezenkívül Roemer és munkatársai, Natúré 268, 547-549 (1977) azt javasolják, hogy az 5-ös helyzetben lévő metionint a megfelelő karbinollá kell átalakítani, és a metioninban szereplő kénatomot S-oxiddá (szulfoxiddá) kell oxidálni.

Egy további jelentős szerkezeti változtatást ismertet a 859.026. számú belga szabadalmi leírás, Eszerint az enkefalin-származékok hatását és biológiai hozzáférhetőségét azzal lehet megnövelni, ha a 2-es helyzetbe egy D aminósavat iktatnak he, a terminális karboxilcsoportot amiddá alakítják és az 5-ös helyzetben lévő aminósavat N-alkilezik.

Felfedeztük az enkefalin-analógoknak egy olyan családját, amely erős fájdalomcsillapító hatást mutat. Ezek a halogénezett tetrapeptidek, amelyek nagymértékben specifikusak mind a halogénatom anyagi minőségét, mind pedig a halogénatom helyzetét tekintve. Az alábbi I általános képletű vegyületek olyan tetrapeptidek, ahol a peptid 4-es helyzetében p-fluor-helyettesített L-fenil-alanin szerepel.

Az irodalom ismertet más, halogénezett 4-fenil-alanil-enkefalin-analógokat is, ezek azonban nem tetrapeptidek, és nem is p-fluor-belyettesített 4-fenil-alanil-enkefalin-analógok. A. R. Day és munkatársai (Rés. Comm. in Chem. Path. and Pharmacol. 14 (4), 597-603 /1976/) leírja a H-Tyr-Gly-Gly-pCIPhe-Nle-OH-t. R. J. Miller és munkatársai (Vitamins and Hormones 36, 297-382, Academic Press /1978/) megemlíti az alábbi vegyületeket: H-Tyr-D-Ala-Gly-pClPhe-D-Leu-OH, H-Tyr-D-Ala-Gly-pCIPhe-D-Leu-OMe és H-Tyr-D-Ala-Gly-pCIPhe-D-Leu-NHEt. Pless és munkatársai a 15. Európai Peptidszimpóziumon tartott előadásukban (1978. szeptember 4--9., Gdansk, Lengyelország) beszámoltak a H-Tyr-D-AJa-Gly-pClPhe-Met(O) OH összetételű vegyületükről. D. H. Coy és munkatársai (BBRC 83 (3), 977-983 /1978/) említik a H-Tyr-D-Ala-Gly-FjPhe-Met-NH₂-t.

A fenti közlemények egyike sem ír le az alábbi I általános képletű vegyületek körébe tartozó származékokat, azt találtuk, hogy az enkefalin-analógok fájdalomcsillapító hatása tekintetében a halogénatomnak mind az anyagi minősége, mind pedig a helyzete döntő jelentőségű.

A találmány tárgya eljárás az I általános képletű, ahol

R. jelentése hidrogénatom vagy 1—3 szénatomot tartalmazó, primer alkilcsoport,

R₂ jelentése etilcsoport vagy 1 -hidroxi-etil-csoport

Rj jelentése 1—4 szénatomot tartalmazó, primer alkilcsoport, és

L és D az illető szénatom konfigurációját jelölik, tetrapeptid-származékok acetátjainak előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, a peptidkémiában szokásos módon védett I általános képletű, ahol R,,R₂ és a fenti vegyületről a védőcsoportot (vagy védocsoportokat) szokásos módon lehasítjuk, majd a terméket ecetsawal kezeljük.

Az I általános képiéiü vegyületekben lévő aszimmetriacentriumok konfigurációja e vegyületek igen lényeges vonása. Kényelmi okokból az I általános képletű pentapeptidekben szereplő aminosav-egységek a terminális aminocsoporttól kezdve megszámozzuk. Az egyes aminosav-egységek aszimmetriacentrumának konfigurációja az 1-es helytől a 4-es helyzet felé haladva: L, D, — és L. A 3-as helyzetben glicin szerepel, és ezért ezen egységek esetében nem beszélhetünk aszimmetriacentrumról.

Az Rj jelentése a fentiek szerint lehet 1-3 szénatomot tartalmazó, primer alkilcsoport is. Az 1—3 szénatomot tartalmazó, primer alkilcsoport lehet metil-, etil- vagy n-propilcsoport.

Az Rj jelentése a fenti meghatározás szerint lehet 1-4 szénatomot tartalmazó, primer illetve szekunder alkilcsoport. Az 1^4 szénatomot tartalmazó, primer alkilcsoport lehet metil-, etil-, η-propil-, n-butil-, butilcsoport.

Az I általános képletű tetrapeptidekben szereplő egyes aminosav-egységek tekintetében a következő szempontok érvényesülnek:

Á/l-es hely

Ez a peptid N-terminális része. Ezt az egységet az L-tirozinból származtatjuk el. Ezen egység aminocsoportja lehet helyettesítetlen, ekkor Rj jelentése hidrogénatom. Ezenkívül ezen aminosav-egység aminocsoportja viselhet egy 1—3 szénatomot tartalmazó, primer alkil-helyettesítőt, tehát lehet Ν-métil-, N-etilvagy N-n-propil-származék. Ahhoz, hogy parenterális adagolás mellett rendkívül erős fájdalomcsillapító hatású vegyületeket kapjunk, az 1-es helyzetben lévő tirozilcsoportnak előnyösen az aminocsoportján helyettesítetlennek kell lennie. Ahhoz, hogy orális adagolás mellett rendkívül erős fájdalomcsillapító hatású ve-21 gyületeket kapjunk, az 1-es helyzetben lévő tirozilcsoport aminocsoportjának előnyösen helyettesítettnek kell lennie. E helyettesítő előnyösen metilcsoport

Β/2-es hely

Az I általános képletű peptidek 2-es helyzetében lévő aminosav aszimmetria-centrumának D-konfigurációjúnak kell lennie, ezen a helyen több aminosáv is szerepelhet. Ilyenek a D-alanin (Alá) (lejelentése metilcsoport), D-norleucin (Nle) (R2 jelentése n-butilcsoport), D-treonin (Thr) (R2 jelentése 1-hidroxi-etilcsoport). A peptid 2-es helyzetében előnyösen D-alanin van.

C/3-as helyzet

A peptid ezen helyzetében glicin (Gly) áll,

D/4-es helyzet

A peptid 4-es helyzetében para-helyzetben fluoratommal helyettesített L-fenil-alanin (Phe/F/) áll. Ezen aminosav-egység aminocsoportja lehet helyettesítetlen vagy helyettesített (R3). Abban az esetben, ha az ezen a helyen szerepló aminosav-egység aminocsoportja helyettesített, akkor a helyettesítő lehet metil-, etil-, propil-, izopropil-, η-butil-, izobutil-, szekunderbutil-csoport. Ezen aminocsoport előnyösen helyettesített, vagy R₃ jelentése hidrogénatomtól eltérő. R3 jelentése előnyösen 1 —4 szénatomot tartalmazó, primer vagy szekunder alkilcsoport. R₃ jelentése legelőnyösebben metil-, etil-csoport.

Az I általános képletű vegyületek C-terminális helyzetében lévő csoport valamely amlnosavból leszármaztatható amid (-CO-NH2).

Az I általános képletű vegyületeket a peptidszintézis szokásos módszereivel állítjuk elő. Egyes I általános képletű vegyületek előállítása során részleges racemizáció következhet be. Ha ilyen racemizáció be is következik, ez sohasem olyan mértékű,hogy az I általános képletű vegyületek fájdalomcsillapító hatása ezáltal szignifikánsan megváltozzék.

Az I általános képletű vegyületeket előállíthatjuk szilárd fázisú, vagy klasszikus, oldatban lefolytatott peptidszintézis útján. Ha a szilárd fázisú módszert követjük, akkor a peptidláncot valamely gyanta hordozón fokozatosan építjük ki, általában valamely benzhidril-amin típusú gyantán, vagy klórmetilezett polisztirol-gyantán. Végül a terméket hidrogén-fluoriddal körülbelül 0 °C hőmérsékleten hasítjuk le a gyantáról, és általában kromatográfiás úton tisztítjuk.

Bármelyik módszert is követjük, az I általános képletű vegyületek előállítása abban áll, hogy aminosavakat, vagy peptidgrafmenseket reagáltatunk egymással oly módon, hogy az egyik aminosav vagy peptidfragmens aminocsoportját a másik aminosav vagy peptidfragmens karboxilcsoportját a másik aminosav vagy peptidfragmens aminocsoportjával reagáltatjuk, s így amidkötést hozunk létre. A hatékony kapcsolás érdekében kívánatos, hogy egyrészt a reakcióban közvetlenül részt nem vevő valamennyi reakcióképes csoportot megfelelő védőcsoportok segítségével inaktiváljuk, másrészt pedig, hogy a kapcsolni kívánt karboxilcsoportot a kapcsoláshoz megfelelő módon aktiváljuk. Ennek érdekében gondosan kell meghatározni mind az egymást követő reakciók sorrendjét és reakciókörülményeit, továbbá megfelelő védőcsoportokat kell alkalmaznunk ahhoz, hogy a kívánt pepiidet elő tudjuk állítani. Az I általános képletű vegyületek előállítása során felhasznált valamennyi aminosavat, amely a szükséges védőcsoportokat és aktiváló csoportokat tartalmazza, a peptidszintézisben szokásos, ismert módszerekkel állítjuk elő.

Az I általános képletű vegyületek totálszintézisének minden egyes lépéséhez a védó'csoportok meghatározott kombinációját alkalmazzuk. Azt találtuk, hogy a szintézist ezen kombinációk alkalmazásával lehet a legkönnyebben végrehajtani. Alkalmazhatnánk az I általános képletű vegyületek szintézise során más kombinációkat is, azonban feltehetőleg kevesebb sikerrel. így például az I általános képletű vegyületek szintézise során amin-védőcsoportként használhatunk például benziloxi-karbonil-, tercier-butoxikarbonil-, tercier-amiloxikarbonil-, p-metoxi-benziloxi-karbonil-, adamantiloxi-karbonil- és izoborniloxi-karbonil-csoportot, továbbá a tirozin hidroxilcsoportjának védésére általában benzilcsoprtot (Bzl) alkalmazunk, bár jó eredménnyel alkalmazhatunk más csoportokat is, például p-nitro-benzil-(PNB), p-metoxi-benzilcsoportot (PMB) ás más hasonló csoportokat.

Az I általános képletű vegyületek előállítása során a karboxilcsoportok védésére használhatunk bármilyen tipikus észterképző csoportot, így például metil-, etil-, benzil-, ρ-nitrobenzil-, p-metoxibenzil-, 2,2,2-triklór-etil-csoportot és más hasonló csoportokat.

Az I általános képletű vegyületek előállítása során valamely, az aminocsoportján (vagy aminocsoportjain) megfelelően védett aminosavat vagy peptidfragmenst úgy kapcsolunk össze valamely, a karboxilcsoportján védett aminosavval vagy peptidfragmenssel, hogy az aminocsoportján (vagy aminocsoportjain) védett aminosav vagy peptidfragmens szabad karboxilcsoportját aktiváljuk. Ezt végrehajthatjuk többféle ismert módszer bármelyikével. Az egyik ilyen aktiválási módszer során a karboxilcsoportot vegyes anhidriddé alakítjuk. E célból a szabad karboxilcsoportot valamely más sav, általában a szénsav valamely származékával, például savkloridjával reagáltatjuk. A vegyes anhidridek előállításához savkloridként használhatunk például klórhangyasav-etil-észtert, klórhangyasav-fenil-észter, klórhangyasav-szekunder-butil -észtert, klórhangysav-izobutil-észtert, pivaloil-klorídot vagy más hasonlókat. Előnyösen klórhangysav-ízobutil-észtert alkalmazhatunk.

Egy másik módszer szerint a kapcsolási reakcióhoz úgy aktiváljuk a karboxilcsoportot, hogy valamely aktív észterré alakítjuk. Ilyen aktív észterek például a 2,4,5-triklór-fenil-észteT, a pentaklór-fenil-észter, a p-nitro-fenil-észter és más hasonló észterek. Egy további alkalmazható kapcsolási módszer a jól ismert azídos kapcsolási módszer.

A találmány szerinti eljárás egyik előnyös kivitelezési változata szerint az I általános képletű vegyületek előállítása során a szabad karboxilcsoportokat Ν,Ν’-diciklohexil-karbodiimíddel (DCC) aktiváljuk a kapcsoláshoz. Ezt az aktiválást és kapcsolást úgy végezzük, hogy a kapcsolni kívánt aminosav vagy peptidfragmens mennyiségével molárisán azonos mennyiségű DCC-t használunk, és az átalakítást 1-hidroxi-benzotriazol (HBT) molárisán azonos mennyiségének jelenlétében végezzük. Az 1 -hidroxi-benzotriazol segítségével visszaszoríthatjuk a nem-kívánatos mellékreakciókat, így a racemizációt is.

Az I általános képletű vegyületek előállításának bizonyos fázisaiban le kell hasítanunk a védőcsoportokat. Egy átlagosan képzett peptidkémikus könnyen kl tudja választani a védőcsoportok közül azon csopor-31 tokát, amelyek egymással összeférhetők olyan értelemben, hogy az adott aminosavon vagy peptidfragmensen lévő egy vagy több védőcsoportot (de nem az összesét) szelektíven le lehessen hasítani. Ezek a módszerek a peptidkémiában jól ismertek. A védőcsoportok szelektív lehasításának módszereit az irodalom részletesen ismerteti, lásd például Schröder és Lübke, The Peptide (A peptidek), I. kötet, Academic Press, New York (1965), és különösen az idézett pű 72-75. oldalán található táblázat.

A karboxil-védőcsoportokat lúgos hidrolízis útján hasíthatjuk le. A védett karboxilcsoportok szabaddá tételére viszonylag erősen lúgos reagenseket használunk, általában valamely alkálifém hidroxidját, például nátrium-hidroxidot, kálium-hidroxidot, lítiumhidroxidot és más hasonlókat. E hidrolízis körülményei a szakemberek által jól ismertek. Számos karboxil-védőcsoportot katalitikushidrogenolízisútján is lehasíthatunk, például csontszenes palládium katalizátor jelenlétében. Ezenkívül, ha a karboxil.védőcsoport p-nitrobenzil- vagy 2,2,2,-triklór-etil-csoport, akkor e csoportokat cinkkel és sósavval végzett redukció útján is lehasíthatjuk.

Az amih-védőcsoportok közül sokat lehasíthatunk úgy, hogy a védett anúnosavat vagy pepiidet valamely savval, például hangyasavval, trifluo-ecetsavval (TFA), p-toluol-szulfonsawal (TSA), benzol-szulfonsavval (BSA), naftalin-szulfonsavval vagy más hasonlókkal kezeljük, és ilyenkor a termék megfelelő savaddíciós sója keletkezik. Más védőcsoportokat, például a benziloxi-karbonilcsoportot lehasíthatjuk oly módon, hogy a védett aminosavat vagy pepiidet hidrogénbromid és ecetsav elegyével kezeljük, ekkor a megfelelő hidrobromid keletkezik. Egy adott védett aminosav vagy peptidfragmens védőcsoportjainak eltávolítására kiválasztott módszer az adott vegyület kémiai és fizikai sajátságaitól függ. A reakcióban keletkező savaddiciós sót átalakíthatjuk valamely, gyógyászatilag elfogadható sóvá oly módon, hogy a sót valamely alkalmas ioncserélő gyantával kezeljük, például DEAE Sephadec A25-tel, Amberlyst A27-tel és más hasonlókkal.

A hi'droxil-védőcsoportot a termék előállítása során végig megtarthatjuk, és a szintézis utolsó lépésében, az amin-védőcsoportokkal együtt hasíthatjuk le, a karboxil-védőcsoport lehasítása során ’ alkalmazott reakciókörülmények függvényében azonban korábban is lehasíthatjuk. Ha a karboxil-védőcsoportot lúgos hidrolízis útján hasítjuk le, akkor a hidroxil-védőcsoport rajta marad a molekulán, ha azonban a karboxil-védöcsoportot katalitikus hidrogenolizis útján távolítjuk el, akkor a hidroxil-védőcsoport is lehasad. Ez azonban nem okoz problémát, mivel az I általános képletű vegyületeket előállíthatjuk szabad hidroxilcsoportot viselő tirozilcsoport jelenlétében is.

Az 1 általános képletű tetrapeptidek előállítását az A-reakcióvázlattal szemléltetjük. A reakcióvázlatban a Z jelentése a C-terminális csoport-, mégpedig akár végső formájában, akár e csoport prekurzorának formájában, az AA jelentése az adott aminosav-egység, és ezen AA jelölés alsó indexeként megadott szám az illetű anrinosav-egységnek a peptid végtermékben elfoglalt helyzetét jelöli.

Az A-reakcióvázlat az I általános képletű vegyületek előállításának egyik lehetőségét szemlélteti. Az I általános képletű vegyületeket más úton is előállíthatjuk. így például alkalmazhatjuk azt a módszert, amelynek során a reakciókat szintén oldatban végezzük ei, és a peptidláncot úgy építjük ki, hogy a C-terminális aminosavból kiindulva és az egyes aminosavakat egyenként rákapcsolva építjük ki a kívánt pentapeptic’eket. Akár a fentiekben ismertetett, akár valamely más reakciósorozatot alkalmazunk, az egyes reakciókat a fentiekben ismertetett módszerekkel hajtjuk végre.

Egyes I általános képletű vegyületekben Rj és Rí jelentése lehet alkáli-, csoport lehet. Ezen vegyületek előállítása során a megfelelő N-helyettesített aminosavakat alkalmazzuk. Az aminocsoportjukon védett aminosavakból, mint kiindulási anyagokból a B-reakcióvázlaton szemléltetett módon állítjuk elő. Amint ezt a B-reakcióvázlat szemlélteti, az aminosavat először káíium-hidriddel kezeljük, valamely alkalmas kőronaéter jelenlétében, és így a megfelelő dianion (kétszeres negatív töltésű ion) keletkezik. Ezután ezt a dianiont kezeljük a megfelelő alkil-jodiddal, és így a kívánt N-helyettesített aminosavhoz jutunk.

Egy átlagosan képzett peptidkémikus előtt nyilvánvaló, hogy erősen lúgos körülmények között, például a fent ismertetett alkilezés körülményei között az α-szénatomon racemizáció játszódhat le. A racemizáció mértéke az adott aminosavtól függ. A racemizáció mértékét minimálisra szoríthatjuk vissza oly módon, hogy az alkilezőszert fölöslegben alkalmazzuk, és a reakciót a lehető legrövidebb idő alatt végezzük el. Ha azonban nem-kívánatos mértékű racemizáció következik be, akkor a terméket úgy tisztíthatjuk meg, hogy valamely alkalmas királis aminnal, például d-(+)-ö-fenil-etil-aminnal képzett sóját átkristályosítjuk.

Az I általános képletű vegyületek értékes gyógyászati hatással rendelkeznek. E vegyületeknek fájdalomcsillapító és neuroleptikus hatásuk van. Emlősöknek, beleértve az embert is, parenterálisan vagy orálisán adagolva különösen alkalmasak a fájdalom enyhítésére és érzelmi zavarok kiküszöbölésére.

Az I általános képletű vegyületeket adagolhatjuk önmagukban, vagy gyógyászatilag elfogadható vivőanyagokkal együtt, amely vivőanyagok mennyisége az adott vegyület oldhatóságától és kémiai természetétől az adagolás módjától és a szokásos gyógyszerészeti gyakorlattól függ.

Előnyösek a parenterálisan adagolható gyógyászati készítmények, vagyis az izomba (intramuszkuláris), bőr alá (szubkután) vagy vénába (intravénás) adható készítmények. Ilyenek a steril, injektálható oldatok vagy szuszpenziók, és a steril, injektálható depet-(lassan felszívódó) készítmények. Különösen kényelmesen alkalmazhatók az izotóniás (a vérrel azonos ozmózisnyomású) konyha só-oldattal, vagy izotóniás dextróz-oldattal készült steril injektálható oldatok. A steril injektálható készítményeket elkészíthetjük előre, és tárolhatjuk őket kész állapotban, vagy pedig elkészíthetjük őket közvetlenül a felhasználás előtt oly módon, hogy valamely steril közeget - például vizet - adunk valamely, egy fiolában vagy ampullában lévő, ismert mennyiségű steril hatóanyaghoz. Ez esetben a fiola vagy ampulla sterilen tartja a készítményt. A steril hatóanyag mellett jelen lehet olyan mennyiségű steril dectróz vagy nátrium-klorid, amely biztosítja, hogy a steril közeg hozzáadása után az oldat vagy szuszpenzióa vénei izotóniás legyen.

185.022

Előnyösen az orálisan adagolható készítmények is.

Ezek lehetnek például kapszulák, tabletták és más hasonló gyógyszerformák, amelyekben a hatóanyag 5 meghatározott mennyisége van jelen. Alkalmas orális készítmények még például a porok, granulátumok, valamely vizes vagy nem vizes közeggel készült oldatok, szuszpenziók vagy emulziók.

A tablettákat préselés útján állíthatjuk elő, általábán egy vagy több segédanyag felhasználásával. A . ^υ tablettákat úgy készítjük el, hogy a hatóanyagot pof vagy granulátum formájában általában összekeverjük egy vagy több segédanyaggal,például kötőanyagókkal csúsztatószerekkel, semleges hígítószerekkel, felületaktív anyagokkal, pufferoló anyagokkal, ízesítő anya- (5 gokkal, sűrítőszerekkel, konzerválószerekkel, diszpergálószerekkel vagy más hasonlókkal, és ezt a keveréket préseljük.

Az I általános képletű vegyületek pontos dózisát a kezelőorvos állapítja meg. A kiválasztott dózis az adagolás módjától, az adott hatóanyagtól, a kezelt beteg- 20 tői és a kezelés módjától függ. Általában azonban, ha a hatóanyagot intramuszkulárisan vagy szubkután adagoljuk, akkor a dózis testsúly-kilogrammonként körülbelül 0,5 gg és körülbelül 2 mg között van, és előnyösen körülbelül 10 gg és körülbelül 100 jug kö- __ zött. Ha viszont a hatóanyagot intravénásán adagoljuk, akkor a dózis testsúly-kilogrammonként körülbelül 0,1 gg és körülbelül -200 gg között van, és előnyösen körülbelül 1 gg és körülbelül 50 gg között. Ha a hatóanyagot orálisan adagoljuk, akkor a dózis testsúly -kilogramonként körülbelül 100 gg és körülbelül θθ 100 mg között, és előnyösen körülbelül 500 gg és körülbelül 50 mg között van. Még előnyösebben az orális dózis testsúly-kilogrammonként körülbelül 1 ggés körülbelül 10 gg között van.

A találmány szerinti eljárást a továbbiakban, a találmány oltalmi körének szűkítése nélkül, példákkal 35 szemléltetjük.

1. példa

L-Tirozil-D-alanil-glicil-L-CN^-etilj-p-fluor-fenil-alanin-amid, ecetsavas só

a) lépés

N⁰-Trifluor-acetil-D,L-p-fluor-fenil-alanin 40

100 ml trifluor-ecetsavhoz hozzáadunk 25 g (0,137 mól) D,L-p-fluor-fenil-alanint. Az elegyet 0 °C hőmérsékletre hűtjük, majd 5 pere alatt hozzáadagolunk 21 ml (0,149 mól) trifluor-ecetsav-anhidridet.

Az elegyet 2 órán át 0 °C hőmérsékleten keverjük, ._ majd az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A maradékot 100 ml vízzel hígítjuk, a kivált csapadékot kiszűrjük és megszárítjuk. Ily módon 30,1 g (hozam: 79%) cím szerinti vegyületet kapunk, op.: 140-143 °C.

Analízis a C, 1 HqN0^F₄ (279.2) képlet alapján, cn számított: C*.47,32%, N: 3,25%, N: 5,02%, talált: C: 47,03%, H: 3,41%, N: 5,16%.

b) lépés

L-p-FIuor-fenil-alanin

500 ml vízhez hozzáadunk 28 g (0,1 mól), az a) lépésben leírt módon nyert terméket. Az elegyhez ke- 55 verés közben annyi 2 n nátrium-hidroxid-oldatot adunk, hogy pl 1=7,2-nél tiszta oldatot kapjunk. Az oldathoz hozzáadunk 35 mg karboxipeptidáz A enzimet. és az elegyet 5 napon át lassú keverés mellett 37 °C hőmérsékleten, _PH=7,2 értéken tartjuk. Utána az oldat pllját 5,0-ra állítjuk, szenezzük rs megszűrjük. 60

A szűrlet pH-ját 1 n sósavval 3,0-ra állítjuk, és etil-acetáttal háromszor kírázzuk. Ezután a vizes oldat pH-ját 2 n nátrium-hidroxid-oldattal 7,0-ra állítjuk, és csökkentett nyomáson addig töményítjük, míg az L-izomer el nem kezd kristályosodni. Utána a csapadékos oldatot hagyjuk szobahőmérsékletre hűlni, a csapadékot kiszűrjük és megszárítjuk, ily módon 8,8 g (hozam,· 96%) cím szerinti vegyületet kapunk.

[a]⁷⁵D =-2,75° (c = 0,51 1 nHCl).

c) lépés

Jv^-tercier-butoxi-karbonil-L-p-fluor-fenil-alanin 25 ml tercier-butil-alkohol, 5 ml víz és 20 ml 2 n nátrium-hidroxid-oldat (0,04 mól) elegy éhez hozzáadunk 7,32 g (0,04 mól), a b) lépésben leírt módon előállított terméket. Ezután az elegyhez hozzáadunk 8,9 g (0,041 mól) di-tercier-butil-karbonátot, és a reakcióelegyet 4 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután hozzáadunk 50 ml vizet, és dietil-éterrel kirázzuk. A vizes részt leválasztjuk,-hideg 1 n sósavval pH=2,5-re savanyítjuk és etil-acetáttal kirázzuk. Az etil-acetátos részt vízzel egyszer kimossuk, magnézium-szulfáton megszárítjuk és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Az olajos maradékot petroléterben feloldjuk, és éjszakán át 4 “C hőmérsékleten állni hagyjuk. Az ily módon kapott kristályos anyagot kiszűrjük és megszárítjuk, így 11,3 g (hozam: 100%) cím szerinti vegyületet kapunk, op.: 104-108 °C.

Analízis a C.₄HioNCLF-re (283,3) képlet alapján: számított: C: 59,36%, Η: 6,40%, N: 4,94%,

d) lépés

N®-tercier-butoxi-karbonil-L-p-fluor-fenil-alanin-amid ml dimetil-formamidhoz hozzáadunk 10 g (0,035 mól), a c) lépésben leírt módon nyert terméket. Utána az elegyet -15 °C hőmérsékletre hűtjük, és hozzáadunk 3,9 ml (0,035 mól) N-metil-morfolint és 4,6 ml (0,035 mól) klórhangyasav-izo-butil-észtert. A reakcióelegyet 5 percig -15 v hőmérsékleten keverjük, majd 1 órán át vízmentes ammóniát vezetünk bele. Ezután a reakcióelegyet további 4 órán át -15 °C hőmérsékleten keverjük, majd jég és 1 n nátrium-hidrogén-karbonát-oldat elegyére öntjük. A vizes elegyet etil-acetáttal kirázzuk, a szerves részt vízzel, utána 1,5 n citromsav-oldattal, és végül vízzel mossuk. A szerves részt magnézium-szulfáton megszárítjuk, és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A maradék olajat dietil-éterben feloldjuk, és az oldatot éjszakán át 4 °C hőmérsékleten állni hagyjuk. A kivált csapadékot kiszűrjük és megszárítjuk, ily módon 8,1 g (hozam: 82%) cím szerinti vegyületet kapunk, op.: 149-152 °C.

l“]²⁵n = ⁺⁷-⁹²° (^c = °-⁵> metanol).

Analítís C^HjnlWbF-re (282,3):

számított :C: 57,50%,%!: 6,79%, N: 9,92%, talált: C: 59,31%, H: 6,85%, N: 9,90%.

e) lépés

L-p-Fluor-fenil-alanin-amid, sósavas só ml, frissen készített, 1 n, ecetsavas sósav-oldat és 5 ml anizol elegyéhez. hozzáadunk 7,8 g (0,028 mól), a d) lépésben leírt módon előállított terméket. Az elegyet fél órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd dietil-éterbe öntjük, és a kivált csapadékot ki-51 szűrjük és megszáritjuk. Ily módon 6,0 g (hozam: 98%) cím szerinti vegyületet kapunk, op.: 249-251 °C [«],-> = * 15,77° (c = 0,51, metanol).

Analízis a CqII , -jNaOCIF (218,66) képlet alapján: számította. 49/44%, H: 5,53%, N: 12,81%, talált; C. 49,64%, Ii: 5,83%,N: 13,08%.

f) lépés

L-(N^a-l.til)-p-nuor-fenil-alanin-aniid ml vízmentes etanolhoz hozzáadunk 4,4 g (0,02 mól), az e) lépésben leírt módon előállított terméket, majd 6,72 g (0,08 mól) szilárd, vízmentes nátrium-hidrogén-karbonátot, és ezután 1,6 ml (0,02 mól) etil -jodidot. Utána a reakcióelegyet 5 órán át forraljuk, majd az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Az olajos maradékot kloroformban feloldjuk, és az oldatot felvisszük egy 40x3 cm méretű, szilikagéllel (Grace és Davison, grade 62) töltött oszlopra. Az oszlopot kloroformmal, majd 10%-ig növekvő mennyiségű metanolt tartalmazó kloroformmal eluáljuk, és a frakciókat vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel értékeljük. A megfelelő frakciókból 2,0 g (hozam: 47%) cím szerinti vegyületet kapunk. NMR-spektrum: δ - 1,2 (H-N-), 6,8-7,3 (p-fluor-fenil-csoport).

g) J^épés \-tercier-butoxi-karbonil-D-alalnil-glicil-L-(N-eti])-p-fluor-fenil-alanin-amid 20 ml dimetil-formamidhoz hozzáadunk 1,9 g (9 mmól), az f) lépésben leírt módon nyert terméket, az elegyet 0 °C hőmérsékletre hűtjük, és hozzáadunk 2,4 g (9 mmól) N^-tercier-butoxi-karbonil-D-alanil-glicint, utána 1,22 g (9 mmól) 1-hidroxi-benzotriazolt, és végül 1,86 g diciklohexil-karbodiimidet. A reakcióelegyet 4 órán át 0 °C hőmérsékleten, majd 72 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután (J C hőmérsékletre hőtjük, és a csapadékot kiszűrjük. A szűrletről az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, a maradékot feloldjuk etil-acetátban és az oldatot 1 n nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, utána vízzel, ezután 1,5 n citromsav-oldattal, és végül megint vízzel mossuk. Vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk, és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Az olajos maradékot acetonban feloldjuk, és felvisszük három preparatív vékonyréteg-kromatográfiás lemezre. A lemezeket kloroform és metanol 9:1 arányú elegyében futtatjuk, a fő komponenst tartalmazó szilikagélt lekaparjuk a lemezről, és a terméket leoldjuk róla. Ily módon 1,7 g (hozam:43%) cím szerinti vegyületet kapunk.

[«] D = 32,17° (c = 0,516, metanol).

Analízis a C->|IU. N₄0cF (438,5) képlet alapján: számított: C/5772%; Ií:7,13%, N: 12,78%, talált: C: 57,42%, H: 7,29%, N: 12,81%.

h) lépés

I.-Tirozil-D-alanil-glicil-L-(N^a-etil)-p-fluor-fenil-alanin-amid, ecetsavas só ml trifluor-ecetsav és 3 ml anizol elegy éhez hozzáadunk 1,5 g (3,6 mmól), a g) lépésben leírt módon nyert terméket. A reakcióelegyet fél órán át 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd az oldószert csökkentett nyomáson, melegítés nélkül ledesztilláljuk. Az olajos maradékot dietil-éterrel hígítjuk, az oldószert leöntjük, és a maradék olajat csökkentett nyomáson megszárítjuk.

1,03 g (3,6 mmól) N^-lercier-butoxi-karbonil-L-tírozint feloldunk 5 ml dimetil-formamidban, és az oldahoz -15 °C hőmérsékleten, keverés közben hozzáadunk 0,4 ml (3,6 mmól) N-metil-morfolint és 0,48 ml (3,6 mmól) klórhangyasav-izobutil-észtert. A reakcióelegyet -15 °C hőmérsékleten tovább keverjük, és eközben elkészítjük az alábbi elegyet:

A fenti, első bekezdésben leírt módon elkészített tripeptid-trifluor-ecetsavas sót feloldjuk 5 ml dimetil-formamidban, és az elegyhez 0 °C hőmérsékleten egyszerre hozzáadunk 0,4 ml N-metil-morfolin, és a reakció teljessé tétele érdekében az oldatot keverjük. Ezt az oldatot hozzáadjuk a vegyes anhidrid fent leírt módon elkészített oldatához, és a reakcióelegyet 4 órán át keverjük. Utána az elegyet jeges 1 n nátríum-liidrogcn-karbonát-oldatra öntjük, cs a vizes oldatot etil-acetáttal kirázzuk. Az etil-acetátos részt vízzel, utána 1,5 n citromsav-oldattal, majd megint vízzel mossuk, magnéziumszulfáton megszáritjuk, és csökkentett nyomáson ledesztilláljuk.

Az olajos maradékot (súlya: 1,7 g) feloldjuk 15 ml trifluor-ecetsav és 3 ml anizol elegyében, és az elegyet fél órán át 0 °C hőmérsékleten keverjük. Ezután az oldatot fagyasztva szárítjuk, a szilárd maradékot puffer-oldatban (amely 1% pirídint és 0,05% ecetsavat tartalmaz) 10 ml térfogatra oldjuk. Az oldatot felvisszük egy 2,5x9,0 cm méretű, DEAE Sephadex A 25-tel töltött oszlopra, amelyet előzőleg ugyanezzel a puffer-oldattal egyensúlyba hoztunk. Az oszlopot a fenti puffer-oldattal eluáljuk, a frakciókat 280 nmnél vizsgáljuk, a megfelelő frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. A fehér színű, szilárd maradékot feloldjuk 10 ml 0,2 n ecetsavban, és az oldatot felvisszük egy 2,5x90 cm méretű Saphadex G-10-zel töltött oszlopra. Az oszlopot 0,2 n ecetsawal eluáljuk, a frakciókat 280 nm-nél vizsgáljuk. A megfelelő frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk, ily módon fehér színű, szilárd anyag formájában 1,18 g (hozam: 58%) cím szerinti vegyületet kapunk.

[a]²⁵D = +14,62° (c = 0,5,1 n sósav).

Analízis a (%₇Hi,-Ní-O₇F (561,6) képlet alapján: számított: C: 577%,Ή: 6,46%, N: 12,47%, talált: C: 57,53%, H: 6,65%, N: 12,19%. Aminosav-analízis: Tyr: 9,88, Alá: 0,99, Gly: 1,00, NH₃:1,06.

Z. példa

L-Tirozil-D-treonil-glicil-L-(N^a-etil)-p-fiuor-fenil-alanin-amid

a) lépés

N^ö-tercier-butoxi-karbonil-glicil-L-(N^ö-etii)-p-fluor-fenil-alanin-amid ml dimetil-formamidhoz hozzáadunk 2,4 g (11,4 mmól) L-(N^ö-etii)-p-fiuor-fenil-alanin-amidot, majd az elegyhez 0 °C hőmérsékleten hozzáadunk 1,99 g (11,4 mmól) b^-tercier-butoxi-karbonil- glicint, majd 1,54 g (11,4 mmól) 1-hidroxi-benzotriazolt, és végül 2,35 g (11,4 mmól) diciklohexil-karbodiimidet. A reakcióelegyet 2 órán át 0 °C hőmérsékleten, maid 72 órán át szobahőmérsékleten keveijük. Ezután 0 ^dC hőmérsékletre hűtjük, a csapadékot kiszűrjük és a szűrletről az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A maradékot feloldjuk etil-acetátban, majd az oldatot 1 n nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, utána vízzel, ezután 1,5 n citromsav-oldattal, és végül megint vízzel mossuk. Vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk, és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Az olajos maradékot feloldjuk kloroformban, és felvisszük egy 40x3 cm méretű, szí-61 likagéllel (Grace és Davison, grade 62) töltött oszlopra, Az oszlopot kloroformmal, majd 5%-ig növekvő mennyiségű metanolt tartalmazó kloroformmal eluáljuk, és a terméket vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel azonosítjuk. A megfelelő frakciókat egyesítve

2,9 g (hozam: 69%) cím szerinti vegyületet kapunk. [α]^”_η = -93,2° (c = 0,5, metanol).

Analízis a C, _sH_7flNoO₄F (367,4) képlet alapján: számított:H: 7,13%, Ν: 11,44%, talált: C: 58,74%, H: 7,24%,Ν: 11,13%.

b) lépés

N^-tercier-butoxi-karbonil-L-triazol-D-treonil-gíicil-LJN^-etilj-p-fluor-fenil-alanin-amid ml trifluor-ecetsav és 3 ml anizol elegyéhez hozzáadunk 1,47 g (4 mmól), az a) lépésben leírt módon nyert terméket. Az elegyet fél órán át 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd az oldószert csökkentett nyomáson, melegítés nélkül ledesztiliáljuk. Az olajos maradékhoz dietil-étert adunk, majd az oldószert leöntjük, és a maradék olajat csökkentett nyomáson megszárítjuk.

i ,6 g (4 mmól) N^a-tercier-butoxi-karbonil-D-treonin, diciklohexil-amin-sót feloldunk etil-acetát és 1,5 n citromsav-oldat kétfáziú elegyében. Az etil-acetátos részt elválasztjuk, vízzel egyszer mossuk, magnézium-szulfáton megszárítjuk, és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Az olajos maradékot feloldjuk 5 ml dimetil-formamidban, az oldatot -15 °C hőmérsékletre hűtjük, és keverés közben gyorsan hozzáadunk 0,44 ml (4 mmól) N-metil-morfolin, és 0,53 ml (4 mmól) klórhangyasav-izobutil-észtert. Az elegyet -15 °C hőmérsékleten tovább keverjük, miközben elkészítjük az alábbi elegyet:

Az első bekezdésben leírt módon előállított dipeptid-trifluor-ecetsavas sót feloldjuk 5 ml dimetil-formamidban, és 0 °C hőmérsékleten egyszerre hozzáadunk 0,44 ml N-metil-morfolint. A reakció teljessé tétele érdekében az oldatot keverjük. Ezt a keveréket gyorsan hozzáadjuk a fenti bekezdésben leírt módon elkészített vegyes anhidrid-oldathoz, és a reakcióelegyet 4 órán át keverjük. Utána jeges In nátrium-hidrogén-karbonát-oldatra öntjük, és a vizes oldatot etil-acetáttal kirázzuk. A szerves részt vízzel, utána 1,5 n citromsav-oldattal, és végül megint vízzel mossuk, vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztiliáljuk. Az olajos maradék súlya: 1,6 g.

A fenti olajos maradékból 1,5 g-ot (3,21 mmól) feloldunk 15 ml trifluor-ecetsav és 3 ml anizol elegyében. A reakcióelegyet fél órán át 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd az oldószert csökkentett nyomáson, melegítés nélkül ledesztiliáljuk. Az olajos maradékhoz dietil-étert adunk, és a kapott csapadékot kiszűijük és csökkentett nyomáson megszárítjuk.

902 mg (3,21 mmól) N^a-tercier-butoxi-karbonil-L-tirozint feloldunk 5 ml dimetil-formamidban, és az oldathoz -15 °C hőmérsékleten, keverés közben gyorsan hozzáadunk 0,35 ml (3,21 mmól) N-metil-morfolint, és 0,42 ntl (3,21 mmól) klórhangyasav-izobutil-észtert. A reakcióelegyet -15 °C hőmérsékleten tovább keveijük, miközben elkészítjük az alábbi elegyet.

A fenti leírt módon elkészített tripeptid-trifluor-ccetsavas sót feloldjuk 5 ml dimetil-formamidban, és az oldahoz 0 °C hőmérsékleten egyszerre hozzáadunk 0,35 ml N-metil-morfolin. A reakció teljessé tétele érdekében az elegyet keveijük. Ezután ezt az elegyet hozzáadjuk az előző bekezdésben leírt módon elkészített vegyes anhidrid oldatához, és a reakcióelegyet 4 órán át -15 °C hőmérsékleten, majd éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután 1 n jeges nátrium-hidrogén-karbonát-oldatra öntjük, és a vizes oldatot etil-acetáttal kirázzuk. A szerves részt elválasztjuk, vízzel, utána 1,5 n citromsav-oldattal, és végül megint vízzel mossuk, vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk, és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Az olajos maradékot feloldjuk acetonban, és az oldatot felvisszük három preparatív vékonyréteg-kromatográfiás lemezre. A lemezeket kloroform és metanol 9:1 aránü elegyében futtatjuk, a fő komponenst tartalmazó szilikagélt lekaparjuk, és a terméket leoldjuk róla. Ily módon 1,4 g (hozara.,55%) cím szerinti vegyületet kapunk.

[a] P = -36,14° (c= 0,5, metanol).

Analízis a CA iH₄₉N_s0oE (631,7) képlet alapján: számított: Cl 58^9%, rf: 6,70%, Ν: 11,09%, talált: C: 57,24%, H: 6,70%,N: 10,46%.

c) lépés

L-Tirozil-D-treonil-L-(N -etil)-p-íluor-fenil-alanin-amid, ecetsavas só ml trifluor-ecetsav és 2 ml anizol elegyéhez hozzáadunk 1,3 g (2,06 mmól), a b) lépésben leírt módon nyert terméket. Az elegyet fél órán át 0 °C hőmérsékleten keveijük, majd fagyasztva szárítjuk. A szilárd maradékot puffer-oldattal (amely 1% piridint és 0,05% ecetsavat tartalmaz), 10 ml térfogatra oldjuk, és az oldatot felvisszük egy 2,5x90 cm méretű, acetát-formában lévő DEAE Sephadex Α-25-tel töltött oszlopra, amelyet előzőleg ugyanezzel a puffer-oldattal egyensúlyba hoztunk. Az oszlopot a fenti puffer-oldattal eluáljuk, a frakciókat 280 nm-nél vizsgáljuk, és a megfelelő frakciókat egyesítjük, majd fagyasztva szárítjuk. A szilárd maradékot feloldjuk 10 ml 0,2 n ecetsavban, és az oldatot felvisszük egy 2,5x90 cm méretű, Sephadex G-10-zel töltött oszlopra, amelyet előzőleg 0,2 n ecetsav-oldattal hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot 0,2 n ecetsav-oldattal eluáljuk, a frakciókat 280 nm-nél vizsgáljuk, a megfelelő frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. Ily módon 1,6 g (hozam: 87%) cím szerinti vegyületet kapunk.

[α]^4, θ = -8,66° (c = 0,5,1 n sósav).

Analízis a CAoHooNcOoF (591,6) képlet alapján: számított: C 5 6^4%) rf: 6,47%, Ν: 11,84%, talált: C: 56,93%, H: 6,48%, Ν: 11,94%. Amionsav-analízis: Tyr: 1,00, Thr: 0,99, Gly: 0,99, NHj: 1,09.

3. példa

L-N^-metil-tirozil-D-alanil-glicil-L-írf^-etilj-p-fiuor-fenil-alanin-amid ecetsav só a) lépés

N^a-butoxi-karbonil-N^a-metil-O-benzil-L-tirozin, d(+)-a-metil-benzíl-amin-só ml, molekulaszűrőn szárított tetrahidro-furánhoz hozzáadunk 9,28 g (25 mmól) N^-butoxi-karbonil-O-bcnzil-L-tirozint. Ezt az oldatot fél. óra alatt hozzácsepegtetjük 75 mmól káliunt-hidrid és 0,125 g 18-korona-6-éter 100 ml vízmentes tetrahidro-furánnal készült, nitrogén-atmoszférában 0 °C hőmérsékleten kevert elegyéhez. Ezután a reakcióelegyhez 5 perc alatt hozzácsepegtetjük 3,12 ml (0,05 mól) metil-jodid 10 ml vízmentes tetrahidro-furánnal készült oldatát. A reakcióelegyet 2,5 órán át 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd hozzáadunk 5 ml ecetsavat, és 10 ml etil-alkoholt. A kész elegyet 200 g darabos jégre öntjük, és a vizes elegy pH-ját 1 n kálium-hidroxid -oldattal 10-11-re állítjuk, majd dietil-éterrel kétszer kirázzuk. Ezután a vizes részt pH-ját hideg citromsav-oldattal 3,O-ra állítjuk, majd dietil-éterrel háromszor kirázzuk. A szerves részt vízzel kétszer kimossuk, vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk, és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Az olajos maradékot feloldjuk dietil-éterben, és az oldathoz hozzáadunk 3,22 ml (0,025 mól) d/+)-a-metil-benzil-amint. Az elegyhez petrolétert adunk, és a kikristályosodó csapadékot kiszűrjük és megszárítjuk. Ily módon 11,59 g (hozam: 91%) cím szerinti vegyületet kapunk, op'126-128°C.

[tt] β = -31,4° (c = 1, kloroform).

Analízis a CoqHtoN^Üc- (506,6) képlet alapján: számított:C:71 ;i2< rf: 7,56%, N: 5,53%, . talált: C: 71,38%, H: 7,33%, N: 5,71%.

b) lépés hP-tercier-butoxi-karbonil-N⁰-metil-L-tirozil-D-aíanin ml dimetil-formamidhoz hozzáadunk 2,73 g (7,1 mmól) N^ö-tercier-butoxÍ-karbonil-N^QÍ-metil-O-benzil-L-tirozint (amelyet 3,6 g, az a) lépésben leírt módon nyert termékből savanyítás és dietil-éteres kirázás útján nyerünk), majd az oldathoz 0 °C hőmérsékleten hozzáadunk 2,36 g (7,1 mmól) D-alanin-benzil-észter, p toluol-szulfonsavas sót, és utána 0,794 g (7,1 mmól) trietilén-diamint. Az elegyet 5 percig 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd hozzáadunk 0,96 g 1-hidroxi-benzotríazolt és 1,46 g (7,1 mmól)diciklohexil-karbodiimidet. A reakcióelegyet 2 órán át 0 °C hőmérsékleten, majd 24 órán át szobahőmérsékleten keveijük. Ezután 0 °C hőmérsékleten hűtjük, a csapadékot kiszűrjük, és a szűrletről az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Az olajos maradékot feloldjuk etil-acetátban, és az oldatot 1 n vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, utána vízzel, ezután 1,5 n citromsav-oldattal, és végül megint vízzel mossuk, és vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk. Az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, a maradék olajat feloldjuk 60 ml etanolban, és az oldathoz vizes szuszpenzió formájában hozzáadunk 1,5 g 5%-os csontszenes palládium katalizátort. A reakcióedényt nitrogénnel átöblítjük, majd az elegyet 24 órán át hidrogénezzük. Ezután az edényt megint nitrogénnel átöblítjük, a katalizátort kiszűqük, és a szűrletről az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Ily módon amorf, szilárd anyag formájában 2,5 g (hozam: 99%) cím szerinti vegyületet kapunk.

[α]² θ = -54,11° (c = 0,5, metanol).

Analízis a CioH_7íiN₇0<; (366) képlet alapján: számított: C:39ÍJ0< rf: 7,15%, N: 7,65%, talált:C: 63,30%, H: 7,65%,N: 8,51%.

c) lépés

N^-tercier-butoxi-karbonil-N¹ -metil-L-tirozil-D-alanil-glicil-L/N^-etilj-p-fluor-fenil-alanin-amid ml triíluor-ecetsav és 3 ml anizol elegyéhez hozzáadunk 1,1 E (2,99 mmól) N^a-tercier-butoxi-karbonil-glicil-L-(N“-etiy-p-fluor-fenil-aIanin-amidot, az elegyet fél órán át 0 C hőmérsékleten keverjük, majd az oldószert csökkentett nyomáson melegítés nélkül ledesztilláljuk. Az olajos maradékhoz dietil-étert adunk, majd az oldószert leöntjük, és a maradék olajat csökkentett nyomáson megszárítjuk. 5 ml dimetil-formamidhoz hozzáadunk 1,09 g (2,99 mmól), a b) lépésben leírt módon nyert terméket. Az oldathoz -15 C hőmérsékleten, keverés közben gyorsan hozzáadunk 0,3 ml (2,99mmól) N-metil-morfolint és 0,39 ml (2,00 mmól) klórhangyasav-izobutil-észtert. Az elegyet -15 °C hőmérsékleten tovább keveqük, miközben elkészítjük az alábbi elegyet:

A fent leírt módon elkészített dipeptid-trifluor-ecetsavas sót feloldjuk 5 ml dimetil-formamidban, és 0 °C hőmérsékleten egyszerre hozzáadunk 0,3 ml N-metil-morfolint. A reakció teljessé tétele érdekében az oldatot keverjük. Ezt az elegyet egyszerre hozzáadjuk a vegyes anhidrid fent leírt módon elkészített oldatához, és a reakcióelegyet 4 órán át -15 °C hőmérsékleten keveqük. Utána jeges 1 n nátrium-hidrogén-karbonát-oldatra öntjük, és a vizes oldatot etil-acetáttal kirázzuk. A szerves részt elválasztjuk, vízzel, utána 1,5 n citromsav-oldattal, majd megint vízzel mossuk, és vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk. Az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, ily módon 2 g olajos terméket kapunk. Ezt az olajos terméket feloldjuk acetonban, és az oldatot felvisszük három preparatív vékonyréteg-kromatográfiás lemezre. A lemezeket kloroform és metanol 9:1 arányú elegyében futtatjuk, a fő komponenst tartalmazó szilikagélt lekaparjuk, és a terméket leoldjuk róla. Ily módon 1,3 g (hozam: 71%) cím szerinti vegyületet kapunk.

[a] l₃ = -76,8° (c - 0,5, metanol).

Analízis a CiiH942NrÓ₇ (615,7)képlet alapján: számított: C: 60,47%,Ή: 6,88%, N: 11,37%, talált: C: 60,27%, H: 6,61%, N: 11,14%.

d) lépés

L-N“-metil-tirozil-D-alanil-g]icil-L-(N^a-etil)-p-fluor-fenil-alanin-amid, ecetsavas só . 15 ml trifluor ecetsav és 3 ml anizol elegyéhez hozzáadunk 1,1 g (1,78 mmól), a c) lépésben leírt módon előállított terméket. Az elegyet fél órán át 0 °C hőmérsékleten keveqük, majd fagyasztva szárítjuk. A szilárd maradékot puffer-oldatban (amely 1% piridint és 0,05% exetsavat tartalmaz) 10 ml térfogatra oldjuk, és az oldatot felvisszük egy 2,5x90 cm méretű, acetát-formában lévő Sephandex DEAE Α-25-tel töltött oszlopra, amelyet előzőleg ugyanezzel a puffer-oldattal egyensúlyba hoztunk. Az oszlopot a fenti puffer-oldattal eluáljuk, a frakciókat 280 nmnél vizsgáljuk, a megfelelő frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. A szilárd maradékot feloldjuk 10 ml 0,2 n ecetsav-oldatban, és az oldatot felvisszük egy 2,5x90 cm méretű, 0,2 n ecetsav-oldattal egyensúlyba hozott Sephandex G-10-zel töltött oszlopra. Az oszlopot 0,2 n ecetsav-oldattal eluáljuk, a frakciókat 280 nm-nél vizsgáljuk, a megfelelő frakciókat egyesítjük, és fagyasztva szárítjuk. Ily módon 0,801 g (hozam: 78%) cím szerinti vegyületet kapunk.

[α]² η ⁼ Ί ,57° (c = 0,5 In sósav).

Analízis a C₇oH_7SN<-0₇F (575,64) képlet alapján: számított:C:58,42%,Tl: 6,65%, N: 12,17%, talált: C: 58,67%, H: 6,40%, N: 12,42%. Aminosav-analízis: Alá: 0,99, Gly: 1,01, NH^: 0,96.

Az 1 általános képletű vegyületek fájdalomcsillapító hatását egéren hot-plate (fűtőlapos)-módszerrel mutatjuk ki. E célból a kísérleti állatot egy függőlegesen álló, plexiüvegből készült hengerbe helyezzük, amelynek alaplapjasgy 52 °C hőmérsékletre felmelegített fűtőlap. Áz egereknek orálisan vagy szubku-81

185.022 tán injekció formájában beadjuk a vizsgálandó anyag megfelelő mennyiségének valamely vivőanyaggal készült oldatát vagy szuszpenzióját, és az állatot 15 perc δ múlva rátesszük a fűtőlapra. Meghatározzuk azt a másodpercekben mért késleltetési időt, amelynek elteltével az egér felugrik a forró felületről. Ha valamely anyagnak fájdalomcsillapító hatása van, akkor ezt beadva hosszabb késleltetési időt mérünk, mint azoknál _n az egereknél, amelyek csak a vivőanyagot kapják. A , mérést olyan dózistartományban kell végeznünk, amely dózis még nem zavarja meg az állatok mozgásának koordináltságát, és nem teszi őket mozgásképtelenné. Az alábbi táblázatban megadjuk a fent leírt módon mért EdjQ-értékeket. ·, g

Táblázat

Fájdalomcsillapító hatás hót-plate módszer

Vegyület ED™, mg/kg ED₅₀, mg/kg 20 .__szubkután orális _

Epélda 0,00018 19,00

2. példa 0,01210

3. példa 0,01170 3,55

Claims (6)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás az I általános képletű, ahol Rí jelentése hidrogénatom vagy 1-3 szénatomot tartalmazó, primer alkilcsoport,

   R2 jelentése metilcsoport vagy hidroxi-etil-csoport Rj jelentése hidrogénatom, 1-4 szénatomot tartalmazó, primer alkilcsoport és

   L és D az illető szénatom konfigurációját jelölik, tetrapeptid-származékok acetátjainak előállítására, a z · zal jellemezve, hogy valamely, a peptidkémiában szokásos módon védett I általános képletű, ahol Rj, R₇ és Rj a fenti, vegyületről a védőcsoportot (vagy vedőcsoportokat) szokásos módon lehasítjuk, majd a terméket ecetsawal kezeljük.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, azzal jellemezve, hogy a védőcsoportok le hasítására trifluo-ecetsavat használunk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, azzal jellemezve, hogy gyantahordozóra felvitt kiindulási anyagot használunk, és a védőcsoportokat 0 °C hőmérsékleten hidrogén-fluoriddal hasítjuk le.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, L-tirozil-D-alanil-glicil-L-ÍN^-eti^-p-fluor-fenil-alanin-amid-acetátsó előállítására, azzal jellemezve , hogy N^-tercier-butoxi-karbonil-L-tírozil-D-alanin-glicil-L-ÍN^{* 1}-etil)-p-fluor-fenil-alanin-amidot trifluor-ecetsavval, majd ecetsavval kezelünk.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja L-tirozil-D-treonil-glicil-L/fN^-etilj-p-fluor-feníl-alanín-amid-acetátsó előállítására, a z z a 1 jellemezve, hogy h^-etercier-butoxi-karbonil-L-tirozil-D-t reonil -glicil -L-(N^a-etil )-p-fluor-fenil -alanin -ami dót trifluor-ecetsavval, majd ecetsavval kezelünk.
6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja L-N^-metil-tirozil-D-alanil-glicil-L-ÍN^-etilj-p-fluor-fenil-alanin-amid-acetátsó előállítására, azzal jellemezve , hogyN^ö-tercier-butoxi-karbonil-br-metil-L-tirozil-D-alanil-glicil-L-ÍN^-etiO-p-fluor-fenil-alanin-amidot trifluor-ecetsavval, majd ecetsavval kezelünk.