HU181756B

HU181756B - Eljárás ergotamin előállítására

Info

Publication number: HU181756B
Application number: HU272780A
Authority: HU
Inventors: Alfred Baumert; Dieter Erge; Detlef Groeger; Walter Maier; Hans-Peter Schmauder; Brigitte Schumann; Klaus Breul; Lieselotte Hoehne
Original assignee: Dresden Arzneimittel
Priority date: 1980-11-14
Filing date: 1980-11-14
Publication date: 1983-11-28

Description

A találmány tárgya új eljárás ergotamin előállítására. A több mint ötven ismert természetes anyarozs-alkaloidok közül a peptidcsoport képviselőinek különösen nagy jelentősége van a gyógyászatban. A legismertebbek közöttük az ergotamin, ergokornin, ergokriptin és ergokrisztín. Az ergotamin növeli a vérnyomást,, erősíti és gyorsítja a-méh kontrakcióját és gátolja 'az adrenerg idegrostokat. Az ergotamint a nőgyógyászatban és a belgyógyászatban alkalmazzák, emellett — a molekula részleges szintetikus átalakí- 10 tása útján - egyéb gyógyászati célokra alkalmas vegyületek állíthatók elő belőle.

Az ergotamin szaprofitikus előállításával kapcsolatban a technika állását három eljárás határozza 15 meg.

A Claviceps purpurea (Fr.) Túl. ATCC 15383 sz. törzs tenyészlé milliliterenként 900-1450 Mg ergotamint képez. Az alkaloidák (ergotamin/ergotaminin) — mind ebben az esetben, mind a többi ismert 20 eljárás esetében — részben a tenyészlében, részben a micéliumban vannak (1 210 128 számú NSZK-beli közzétételi irat).

Egy másik eljárás szerint a Qaviceps purpurea FI 32/17 sz. törzs segítésével ergotamin és ergokriptin, 25 illetve izomeqeinek, azaz ergotaminin és ergotkiiptinin elegyét kapják 1200—3800 Mg/ml tenyészlé mennyiségben: az ergotamin és ergokriptin részarányát mintegy azonosnak adják meg (1 792 038 számú NSZK-beli közrebocsátási irat).

A Claviceps purpurea OKI 56/70 sz. törzs szaprofitikus tenyészetében az alkaloidák 1300-1850 Mg/ml mennyiségben dúsulnak fél, körülbelül 80%-uk ergotamin és ergotaminin (161 654 számú magyar szaba5 dalmi leírás).

A fenti eljárások közös hátránya, hogy az alkaloidák elkülönítése céljából a tenyész-szuszpenzió teljes mennyiségét kell feldolgozni. Az eljárások technikai hátránya, hogy az alkaloidákat mind a tenyészléből, mind a micéliumból kell extrahálni. A Claviceps purpurea FI 32/17 sz. törzzsel végzett eljárás további hátránya, hogy két rokon peptid-alkaloida, az ergotamin és az ergokriptin közel azonos mennyiségben képződik, ami költséges elválasztási műveletek beiktatását teszi szükségessé.

A találmány célja olyan eljárás kidolgozása, amellyel az ergotamin kedvezőbb módon állítható elő.

A találmány szerint az ergotamin előállítását olyan eljárással kell megoldani, amelynél az alkaloidát csak a tenyészléből kell izolálni, és rokon peptid-alkaloidák költséges elválasztása nem szükséges. Ahhoz olyan törzseket kell elkülöníteni, amelyek

1. peptidcsoport-beli mellékalkaloidáktól közel mentes ergotamint szaprofitikusan képesek termelni,

2. a képzett alkaloidák több mint 95%-át a környező tenyészlébe választják ki, és

3. jó stabilitással, alkaloida termeléssel és ked³⁰ vező fermentációs tulajdonságokkal rendelkeznek.

f/'

-1181756

A találmány értelmében az ergotamin előállításához a Claviceps purpurea (Fr.) Túl. IBP 74 sz. törzset, mutánsait vagy variánsait használjuk fel.

A Claviceps purpurea (Fr.) Túl. IBP 74. sz. új törzs az NDK Tudományos Akadémiájának Mikro- 5 biológiai és Kísérleti Terápiái Intézetében (Jena, NDK) van letétben IMET PA 135 szám alatt. A törzs 900-1500 Mg/ml koncentrációban alkaloida-elegyet termel, amelynek legalább 50%-a szerves oldószerrel extrahálható, és az extrahálható rész 75-80%-át az 10 ergotamin-ergotaminin izomer-pár képezi. Az elegy kísérő alkaloidáikként az alábbiakat tartalmazza:

Kanoklavin: az extrahálható rész 10-15%-a, ergometrin az extrahálható rész 6— 6%-a, ergozin az extrahálható rész 0- 4%-a, ergokriptin az extrahálható rész — 5%-a, egyéb klavinok az extrahálható rész nyomokban.

Az extrahált tenyészlé egyebek között lizergsavat is tartalmaz. Az alkaloidákat önmagában ismert módon izolálhatjuk a tápközegből. Minden alkaloidát izomerjévé is alakíthatunk.

Az új törzs jellemzője, hogy a képzett alkaloidák legalább 95%-át a környező tápközegbe választja ki, továbbá, hogy a kísérő alkaloidák viszonylag egyszerű módon választhatók el.

A Claviceps purpurea (Fr.) Túl. IBP 74, IMET PA 135 sz. törzset — jellemzése céljából - az 1. ¹⁵ táblázatban összefoglalt tápközegekben tenyésztettük.

1. Táblázat

Az alkalmazott tápoldatok összeállítása (adatok g/l-ben)

	NL 849	NL 720	NL833	NL126	NL 829
szacharóz	300,00	200,0	300,0	-	100,0
sovány tej	100 ml	-	-	-	-
sörcefre	-	-	-	150 ml	-
ammónium-citrát	10,0	15,0	20,0	1,0	-
aszparagin	-	-	-	-	10,0
élesztő-kivonat	-	-	-	5,0	0,5
Ca(NO₃)₂	-	1,0	1,0	-	1,0
KH₂PO₄	0,25	0,25	0,25	-	0,25
(NH₄)₂HPO₄	-	-	-	5,0	-
MgSO₄ x7H₂O	0,3	0,3	0,3	-	0,25
FeSO₄ x7H₂O	-	0,010	0,010	-	0,020
ZnSO₄ x 7H₂ O	-	0,0308	0,0308	-	0,02
KC1	-	0,1	-	-	-
deszt. víz ad	1000,0	1000,0	1000,0	1000,0	1000,0
agar	-	-	-	30,0	30,0
csíramentesítés előtti pH-érték	5,4	5,8-6,0	5,4	6,0	5,4
pH beállítva	NaOH	NaOH	NaOH	NaOH	NaOH
csíramente sités		autoklávban 30 percen át 110	°C-on

-2181756

Az új törzsnek az alábbi mikroszkopikus és makroszkopikus tulajdonságai vannak:

Makroszkopikus külső A tenyészetek kora: 3 hét agar NL 126 lapos, világos-barna, finomszálú, ráncos gyep. Az egyes telepek 0,8—1,3 cm átmérőjűek, világos-barnák, finomszálúak, ultraibolya fényben enyhén fluoreszkálnak.

agar NL 829

Domború kiemelkedő, erősen ráncos gyep, felső oldala szürkés-barna, pereme éles. Az egyes telepek 0,8-1,3 cm átmérőjűek, magasságuk az 1 cm-t is eléri. A kuglóf alakú, élesen elhatárolódó telepek felső oldala szürkés barna, alsó oldala fiatal telepek esetén sárgás-barna, öreg telepek esetén közepesen barna. Ultraibolya fényben fluoreszkálnak.

Mikroszkopikus külső

Előtenyészet NL 849 sz. tápközegben — 3 napos korban — viszonylag rövid, erősen elágazódó hifák. A hifák többé-kevésbé szeptáltak, erősen szemcsések, 50-200 gm hosszúak: botszerű megvastagodásokkal, ritkán artrospórákkal rendelkeznek. 10 gm méretű hólyagszerű megvastagodások.

Főtenyészet NL 833 sz. tápközegben — 7 napos korban —

A micéliumot hosszú, elágazódó hifák képezik. A hifa fala normál, és fel nem tűnő módon szépiáit. A hifák szemcsések, plazmájuk a középen, vagy a fal mentén helyezkedik el. Többnyire a hifa végén hólyagszerű duzzanat. Néha spórák (klamido- vagy artrospórák). A hifák átmérője: 5—7 μτη, a hólyagszerű duzzanatok átmérője: 8—lOgm.

— 14 napos korban —

A hosszú, elágazódó hifákból álló micélium erősen szeptált, plazmája a középen vagy a fal mentén helyezkedik el. A hifák átmérője 5-7 gm, bunkószerű elvastagodások átmérője: 8—12gm, Néhány artrospóra.

A micélium lipid-cseppeket tartalmaz, előfordulási arányuk az alkaloida-termelő kultúrákban különösen magas.

A tenyészeteket 24 ± 1 °C hőmérsékleten, rázóasztalon (frekvencia 240 perc^-1) inkubáljuk.

A termelő törzset aerób módon, folyékony tápközegben úsztatott és/vagy süllyesztett tenyészetben tenyésztjük. A tápközeg asszimilálható szénforrást, például szacharózt, glükózt, mannitot, szorbitot, glicerint, citrom- vagy borostyánkősavat, továbbá asszimilálható nitrogénforrást, például ammóniát, aszparagint, peptont, kazein-hidrolizátumot vagy valamilyen ammóniumsót, végül ásványi sókat tartalmaz. A fermentációt Fernbach- vagy Erlenmeyer-lombikban, rázólombikban vagy fermentorbam végezhetjük.

A tenyésztés előnyösen egy-, két- vagy háromlépcsős. Előnyösen a 4-14 napos előtenyészetet :5-1 :20 arányban oltjuk a főtenyészet tápközegébe. A főtenyészetet 7—20 napig inkubáljuk 4,0 és

6.2 közötti pH-érték mellett; a hőmérséklet 20 és 30 °C közötti. Optimális az inkubálás 22-25 °C-on,

5.2 és 5,9 közötti pH-érték mellett.

A törzs fenntartása protoplazma-kultúrák vagy védőkolloid alkalmazása mellett végzett mélyfagyasztás segítségével oldható meg. Alkalmas védőkolloid például a 60%-os szacharóz-oldat és a sovány tej :1 arányban készített elegye.

A találmányt az alábbi kiviteli példákkal közelebbről megvilágítjuk.

1. példa

A Claviceps purpurea (fr.) Túl. IBP 74 törzs konzervált anyagától kiindulva 500 ml-es rázólombikban levő 100-100 ml NL 849 jelű tápközeget beoltunk, és az előtenyészetet 7 napon át 24 + 1 °C-on 240 perc^-1 frekvencia mellett inkubáljuk. A kapott tenyészetek 10%-ával 500 ml-es lombikokban levő 100—100 ml NL 833 jelű közeget oltunk be. A leírt körülmények között 14 napig inkubálva a tenyészet 1450gg/ml koncentrációban tartalmazza a fent megadott összetételű alkaloidot.

2. példa

Az 1. példa szerint NL 849 jelű tápközeggel készített előtenyészettől kiindulva ugyanazzal a tápközeggel 1:10 oltási arány mellett második előtenyészetet készítünk elő. Az oltóanyagot 7 napig inkubáljuk, majd fermentorban levő 2 liter NL 833 jelű tápközeget oltunk be: 1:10 arányban, oltóanyagként a második előtenyészetet használva.

Hőmérséklet: 24 °C

Keverési sebesség: 280-450 perc^-1 (a szaporodástól függően)

Levegőáram: 0,2—0,65 1/perc (növekvő micélium sűrűségétől függően) nap elteltével a tény észlé 900gg/ml alkaloidát tartalmaz.

3. példa

Az alkaloidák azonosítása céljából mindegyik tény észléből 1—5 ml-t lúgosítunk, majd háromszor kloroformmal extrahálunk. Az extraktumot bepároljuk, a maradékot kevés kloroformban oldjuk, majd preparatív rétegkromatográfla segítségével (Kieselgél, fluoreszcens indikátor) szétválasztjuk az alkaloidákat. Oldószerként kloroform és etanol 9 :1 arányban készített elegyét használjuk. Az alkaloidazónákat a lemezről leemeljük, külön-külön víz, metanol 3

-3181756 és jégecet 45 :45 :10 arányban készített elegyében kioldjuk az alkaloidákat, az oldatokhoz 2 :4 arányban Urk féle reagenst adunk, a mintákat kvarclámpával 5—5 percig besugározzuk, centrifugáljuk, majd az extinkciót fotometrikusan meghatározzuk. Az alkaloidák mennyiségei kalibrált görbék segítségével állapíthatók meg.

Párhuzamosan készített mintákból az ergotaminhoz, illetve ergotamininhoz rendelhető zónákat külön eluálhatjuk, majd az alkaloidát azonosíthatjuk, amire az alábbi módszerek különösen alkalmasak:

Tömegspektrográfia (m/e: 581 (M⁺), 314, 296, 286, 271, 267, 244, 223, 221, 215, 180, 167, 153, 131, 125;

továbbá az UV-, IR- és NMR-színképelemzés, kromatográfiás módszerek, savas hidrolízis, majd a jellemző aminosavak, azaz prolin és fenilalanin kimutatása. Lúgos hidrolízis esetén lízergsav (ergotaminból), illetve izolízergsav (ergotaminból) mutatható ki.

Claims

Eljárás ergotamin előállítására fermentáció útján asszimilálható nitrogénforrást, asszimilálható szénforrást és ásványi sókat tartalmazó folyékony tápközegben végzett aerob fermentálással, azzal jellemezve, hogy a Claviceps purpurea (Fr.) Túl. IBH 74, IMET PA 135 sz. törzset, mutánsait vagy variánsait úsztatott és/vagy süllyesztett tenyészetben 20— -30 °C-on 4,0 és 6,2 közötti pH-érték mellett 7-35 napon át inkubáljuk, majd a képződött ergotamin/ /ergotaminin alkaloidákat önmagában ismert módon a tápközegből kinyerjük.