HU181434B - Process for preparing the biologically active - Google Patents

Description

Eljárás biológiailag aktív FR—900 156 anyag előállítására

A találmány tárgya eljárás (I) általános képletü új, biológiailag aktív FR—900 156 jelű vegyület és ennek gyógyszerészeti szempontból elfogadható sói előállítására.

Részletesebben, a találmány az új FR—900 156 vegyületre és ennek gyógyszerészeti szempontból elfogadható sóira vo- 5 natkozik, amelyek hatásosak az immún és reticulo-endoteriális rendszerre, és eszerint például a patogén mikroorganizmusok által okozott fertőző betegségek és a rák terápiás kezelésére használhatók embernél és állatnál.

A találmány tárgya eljárás a patogén mikroorganizmu- 10 sok, különösen a Gram-negatív és Gram-pozitív baktériumok és gombák okozta fertőző megbetegedések és az emberi és állati rák terápiás kezelésére használható új FR—900 156 jelű vegyület és ennek gyógyszerészeti szempontból elfogadható sóinak előállítására. 15

A találmány szerinti FR—900 156 vegyületet FR— 900 156 jelű vegyületet termelő törzs fermentációjával, például a Streptomyces olivaceogriseus vagy a Streptomyces violaceus és hasonlóak tenyésztésével állítjuk elő.

Az FR—900 156 előállítására használható mikroorganiz- 20 musok a Streptomyces nembe tartoznak, ezek közül a Streptomyces olivaceogriseust és Streptomyces violaceust földmintából újonnan izoláltuk, mint a Streptomyces nemhez tartozó FR—900 156 jelű vegyület termelésére képes törzset.

Érthető, hogy az FR—900 156 vegyület előállítására vo- 25 natkozóan a leírás nem korlátozódik egyes mikroorganizmusokra, mint az itt leírtakra, amelyeket csak szemléltető jelleggel ismertetünk. A találmány oltalmi köréhez tartoznak mindazon mutánsok, amelyek az FR—900 156 vegyületet termelik, ide tartoznak a természetes mutációval kapott tér- 3 ) mészetes mutánsok és a mesterséges mutánsok is, amelyeket a leírt mikroorganizmusból ismert módszerekkel, például Röntgen-sugarakkal, ultraibolya sugarakkal, nitrogénmustárral és másokkal előállíthatunk.

Az alábbiakban megadjuk az FR—900 156 vegyületet termelő Streptomycesek részletes leírását.

I. Streptomyces olivaceogriseus nov. sp. C—353

A Streptomyces olivaceogriseus nov. sp. C—353 törzset a Kochi prefektúrában, Japánban gyűjtött földmintából izoláltuk, és letétbe helyeztük az American Type Culture Collection törzsgyüjteményében, ahol az ATCC 31 427 számot kapta.

A Streptomyces olivaceogriseus nov. sp. C—353 (ATCC 31 427) a következő morfológiai, tenyésztési és élettani tulajdonságokkal rendelkezik.

1. Morfológiai tulajdonságok

A mikroszkopikus vizsgálatokat 10—14 napon át szacharóz-nitrát-agaron, glicerin-aszparagin-agaron, élesztőkivonat-malátakivonat-agaron, zabliszt-agaron, keményítő-szervetlen só-agaron és Bennett-agaron nőtt tenyészeteken végeztük. A spóratartók morfológiáját érintetlen lemez-tenyészeteken vizsgáltuk.

1. A spóraképző hifák elágazásának típusa: monopodiális elágazás.

2. A spóraképző hifák alakja: retinaculiaperti (zárt spirálok, hurkok).

3. A spórák száma:

5—20 spóra.

-1181434

4. A spórák felülete és nagysága: sima

0,6—l,2x 1,0—1,9 mikron.

5. Zoospórák jelenléte: nincs.

6. Sporangiumok jelenléte: nincs.

7. Spórák keletkezése:

a légmicéliumon.

8. A szubsztrátmicélium fragmentációja: nem megfigyelhető.

2. Tenyésztési tulajdonságok:

A következő megfigyeléseket tettük olyan ferdeagar-tenyészeteken, amelyek különböző táptalajokon nőttek 30 C° hőmérsékleten 10—14 napon át:

Táptalaj	LégmicéHum színe	A telepek hátoldala	Oldódó színanyag
Szacharóz-	nincs, vagy	halványsárga,	nincs
-nitrát-agar	nagyon vékony, porszerű	kis telepek
Glükóz-	világosszür-	halványsárga-	nincs
-aszparagin-	ke-zöldes	halvány
-agar	szürke, porszerű	sárgásbarna, kis telepek
Glicerin-	vékony,	halvány	nincs vagy
-aszparagin-	porszerü,	sárgásbarna,	nyomokban
-agar	világosszürke	kis telepek
Keményítő-	szürkés,	szürkés	nincs
-szervetlen só-agar	porszerű	sárgabarna, kis telepek
Tirozin-agar	világos-olaj-	sárgásbarna,	világosbar-
	bogyó-szürke, vékony porszerü	kis telepek	na
Tápagar	nincs	halvány sárga, lapos	nincs
Élesztőkivo-	zöldesszürke,	sárgásbarna,	nincs
nat-malátakivonat-agar	porszerű	ráncos telepek
Zabliszt-agar	világosszürke-zöldesszürke, porszerű	színtelen, kis telepek	nincs
Pepton-élesz-	nincs	színtelen,	világosbar-
tőkivonat-vas-agar		halványsárga, enyhén ráncos telepek	na
Glükóz-	fehér,	színtelen,	barna
-pepton-	vékony,	halványsárga,
-zselatin-agar	porszerű	ráncos telepek
Tej	fehér, igen vékony, porszerű	színtelen, a felületen gyűrűszerű növekedés	nincs

3. Biológiai és élettani tulajdonságok:

1. Hőmérséklet-igény Bennett-agaron;

C’ és 40 C° közötti hőmérsékleten növekszik, az optimum

	2. Keményítő-hidrolízis keményítő-szervetlen só-agaron:
	gyengén hidrolizál.
	3. Zselatin-elfolyósítás glükóz-pepton-zselatin táptalajon:
	negatív.
5	4. Hatás a tejre: nincs koaguláció, nincs peptonizáció.
	5. Melamin-termelés a	tirozin-agaron, pepton-élesztőki-
	vonat-vas-agaron és tripton-élesztőkivonat-folyékony hal-
10	mazállapotú táptalajon: pozitív.
	6. Különböző szénvegyületek hasznosítása Pridham-Gott-
	lieb agaron: L-arabinóz	_
15	D-xilóz	±
	D-glükóz	+
	D-fruktóz	+
	D-galaktóz	+
	Szacharóz	+
20	Glicerin	+
	Inozit	+
	Laktóz	+
	L-rhamnóz	-
	Maltóz	+
25	Raffinóz	-
	D-mannit	+
	D-mannóz	+
	Szalicin	-

Kulcs: + jó hasznosítás; ± kétséges hasznosítás; — nincs 30 hasznosítás.

7. A sejtfal összetétele (típusa)

I (LL-diamino-pimelinsav)

A fenti tulajdonságok és az irodalomban, nevezetesen a

Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology 8. kiadásá35 bán (1975); továbbá a The International Streptomyces Project Reports (Shirling és Gottlieb, International Journal of Systematic Bacteriology, 18. kötet, 69—279. oldal, 1968,19. kötet, 391. oldal, 1969. és 22. kötet 265. oldal, 1972) megadott adatok alapján a Streptomyces eurythermus és a Strep40 tomyces galbus (Okami) az a két törzs, amely viszonylag hasonló tulajdonságokkal rendelkezik, mint az ATCC 31 427 törzs.

Az ATCC 31 427 törzs ugyanakkor az alábbiakban különbözik a rokon fajoktól:

Streptomyces eurythermus (Okami):

a faj egy törzse hasznosítja az arabinózt és nem hasznosítja az inozitot. A rhamnóz és a raffinóz hasznosítása a faj egy törzse által nem definiált. Hurkok nem keletkeznek. Esetenként egyenes vagy flexozus micélium figyelhető meg.

Streptomyces galbus:

általában nyitott spirálok képződnek. A faj egy törzse sárga-sárgászöld színanyagot termel, és nem képes a szacharóz felhasználására.

A megfigyelések eredménye alapján az ATCC 31 427 tör55 zset új, a Streptomyces nembe tartozó törzsnek kell tekinteni, és Streptomyces olivaceogriseus nov. sp. C—353-nak neveztük el.

II. Streptomyces violaceus No. 6724

A Streptomyces violaceus No. 6724 mikroorganizmust az 60 Ishigaki szigeten Okinawa Prefektúrában, Japánban gyűjtött földmintából izoláltuk, és letétbe helyeztük az American Type Culture Collection állandó törzsgyüjteményében, ahol az ATCC 31 481 számot kapta. A Streptomyces violaceus No. 6724 mikroorganizmus az alábbi morfológiai, tenyésztési és élettani tulajdonságokkal rendelkezik.

-2181434

1. Morfológiai tulajdonságok:

A mikroszkopikus megfigyeléseket szacharóz-nitrátagaron, glicerin-aszparagin-agaron, keményítő-szervetlen só-agaron, élesztőkivonat-malátakivonat-agaron és zablisztagaron növesztett tenyészetekkel végeztük, a növekedés 30 C° hőmérsékleten 10—14 napon át történt.

1. A spóraképző hifák elágazásának típusa: monopodiális elágazás.

2. A spóraképző hifák alakja: spirál.

3. A spórák száma:

10—15 spóra.

4. A spórák felülete és nagysága: tüskés, 0,3—0,7 x 0,6—1,1 mikron.

5. Zoospórák és sporangiumok jelenléte: nincs.

6. A spórák keletkezése: a légmicéliumon.

7. A szubsztrátmicélium fragmentációja: nem megfigyelhető.

2. Tenyésztési tulajdonságok:

A következő megfigyeléseket tettük olyan ferdeagartenyészeteken, amelyek különböző táptalajokon nőttek 30 C° hőmérsékleten 10—14 napon át:

Táptalaj	Légmicélium színe	A telepek hátoldala	Oldódó színanyag
Szacharóz-	pirosas-fehér,	kis telepek	pirosas
-nitrát-agar	porszerű
Glükóz-	pirosas-fehér,	sárgásvörös,	rózsaszín
-aszparagin-	porszerű	kis telepek
-agar Glicerin-	rózsaszínes-	sárgásvörös,	rózsaszín-
-aszparagin-	fehér-rózsa-	kis telepek,	vörös
-agar	szín, porszerű	enyhén ráncos
Keményítő-	fehéres-vörös,	sárgásvörös,	vörös
-szervetlen	rövid	enyhén
só-agar	vattaszerű	ráncos
Tirozin-agar	nincs	vörös, ráncos	nincs vagy
		telepek	nyomokban
Tápagar	nincs vagy	színtelen-	pirosas
	nagyon vékony	pirosas, lapos	rózsaszín
Élesztőkivo-	porszerű rózsaszín-	vörösesbar-	vörösespi-
nat-malátaki-	pirosas	na-pirosas-	ros
vonat-agar	rózsaszín,	barna, ráncos
	rövid vattaszerű	telepek
Zabliszt-agar	rózsaszín-	színtelen	rózsaszín-
	pirosas	pirosas	piros
	rózsaszín,	rózsaszín, kis
	porszerű	telepek
Pepton-élesz-	nincs	színtelen,	barna
tőkivonat-		ráncos
-vas-agar		telepek
Glükóz-	fehér, vékony	vörös, ráncos	halványban
-pepton-zsela-	porszerű	telepek	na
tin-agar Tej	vékony,	vörös szín	vörösessár·
	porszerü	jelenik meg a felületen	ga

A micéliutn hátoldalának festékanyaga pH indikátor, színe 0,05N nátrium-hidroxid adagolásakor vörösről ibolya (pirosas) színre változik, míg 0,05N hidrogén-kloriddal a szín ibolyáról vörösre (rózsaszínre) változik.

A diffundáíó színanyag szintén pH-érzékeny, a micélíum színanyagához hasonlóképpen változtatja a színét.

3. Biológiai és élettani tulajdonságok:

1. Hőmérséklet igény Bennett-agaron: 15 C° és 40 C° közötti hőmérsékleten növekszik, az optimum 28 C°.

2. Zselatin-elfolyósítás glükóz-pepton-zselatin táptalajon: negatív.

3. Keményítő-hidrolízis keményítő-szervetlen só-agaron: pozitív.

4. Hatás a tejre: koaguláció figyelhető meg, peptonízáció nincs.

5. Melanoid színanyag termelés tirozin-agaron, peptonélesztőkivonat-vas-agaron és tripton-élesztőkivonat folyékony halmazállapotú táptalajon:

pozitív, tirozin-agaron nagyon gyenge vagy negatív.

6. Különböző szénvegyületek hasznosítása Pridham-Gott-

lieb-agaron:
L-arabinóz	+
D-xilóz	+
L-rhamnóz	+
D-glükóz	+
D-fruktÓz	+
D-mannóz	+
D-galaktóz	+
Szacharóz	+
Laktóz	+
Maltóz	+
Raffinóz	+
Imulin	±
Cellulóz	-
Kitin	-
Glicerin	+
D-mannit	+
Szalicin	+
Inozit	+
Na-acetát	-
Nátrium-citrát	+
Nátrium-szukcinát	+

Kulcs: + jó hasznosítás; ± kétséges hasznosítás; - nincs hasznosítás.

A találmány szerinti FR—900 156 vegyületet úgy állítjuk elő, hogy egy a Streptomyces nembe tartozó ilyen vegyületet termelő törzset, például a Streptomyces olivaceogriseus nov. sp. C—353 vagy a Streptomyces violaceus stb. törzset felhasználható szénforrást és nitrogénforrást tartalmazó táptalajon növesztjük, levegőztetett körülmények között, például rázott tenyészetben, süllyesztett tenyészetben stb.

Szénforrásként előnyösen glükózt, fruktózt, glicerint, keményítőt vagy hasonlókat használunk. Használhatunk laktózt, arabinózt, xilózt, dextrint, melaszt és másokat is.

Nitrogénforrásként előnyösen élesztőkivonatot, peptont, gyapotmaglisztet, szójabablisztet, kukoricalekvárt, száraz élesztőt, gabonacsirát és másokat használunk, adagolhatunk a táptalajhoz szervetlen és szerves nitrogénvegyületeket, például ammóniumsókat, például ammónium-nitrátot, ammónium-szulfátot, ammónium-foszfátot, karbamidot, aminosavat és másokat.

A szén- és nitrogénforrásokat, bár előnyösen kombinálva használjuk őket, nem szükséges tiszta alakban alkalmazni, mivel növekedési faktorokat és meglehetősen nagy mennyiségű ásványi tápanyagot tartalmazó, kevésbé tisztított ter181434 mékek is használhatók. Adhatunk a táptalajhoz adott esetben ásványi sókat, például kalcium-karbonátot, nátriumvagy kálium-foszfátot, nátrium- vagy kálium-kloridot, magnézium-sókat, réz-sókat és másokat. Adott esetben, különösen, ha a táptalaj habzik, úgy habzásgátló szert, például 5 folyékony paraffint, állati, növényi vagy ásványi olajat vagy szilikon olajat adagolunk.

Az FR—900 156 vegyület nagy mennyiségben való előállítását előnyösen más antibiotikumok előállításánál használt süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között 10 végezzük. Kis mennyiségű hatóanyag előállítására rázott tenyészetet vagy felületi tenyésztést használunk lombikban. Abban az esetben, ha a tenyésztést nagyméretű tartályokban végezzük, úgy a termelő fermentort előnyösen a mikroorganizmus vegetatív tenyészetével oltjuk, mivel ily módon elke- 15 rüljük az FR—900 156 vegyület termelésekor a növekedési lagot (növekedési szünet). Ily módon előnyösen úgy járunk el, hogy viszonylag kis térfogatú táptalajt beoltunk a mikroorganizmus spóráival vagy micéliumával, majd tenyésztést követően ezt a vegetatív oltóanyagot steril körülmények 20 között beöntjük a termelő fermentorba. A vegetatív oltóanyag beoltására használt táptalaj az FR—900 156 vegyület termelésekor használt táptalajjal azonos, vagy attól különböző lehet.

A táptalaj levegőztetését és keverését különböző úton vé- 25 gezhetjük. A keverés történhet hagyományos keverővei, vagy hasonló mechanikus működésű berendezéssel, a fermentor forgatásával vagy rázásával, különböző szivattyúkkal, vagy a steril levegő táptalajon való átvezetésével. A levegőztetésre steril levegőt vezetünk át a fermentációs táptala- 30 jón.

A fermentációt általában 20 C° és 40 C° közötti, előnyösen 30 C° hőmérsékleten végezzük, 50 óra és 100 óra közötti időn át.

Az FR—900 156 vegyületet a táptalajból ismert módsze- 35 rekkel, más ismert antibiotikumok izolálásához hasonló módon nyerjük ki.

A termelt FR—900 156 antibiotikum nagy része a táptalaj folyékony részében található meg, ily módon az a szűrletből különíthető el, amit viszont a táptalaj szűrésével vagy centri- 40 fugálásával kapunk meg. Ez az elkülönítés ismert módszerekkel történik, például csökkentett nyomáson való koncentrálással, fagyasztva szárítással, pH-beállítással, anionvagy kation-cserélő gyantával, nem ionos adszorpciós gyantával való kezeléssel, adszorbenssel, például aktivált szénnel, 45 szilikagéllel, szilíciumsavval, cellulózzal, alumíniumoxiddal stb. való kezeléssel, kristályosítással, újra kristályosítással és más hasonlókkal.

A fermentlében lévő FR—900 156 vegyületet szabad alakban izolálhatjuk, de izolálhatjuk megfelelő sójaként is, ha a 50 feldolgozás során, például extrakciókor, elkülönítéskor vagy tisztításkor az FR—900 156 vegyületet tartalmazó oldatokhoz vagy sűrítményekhez bázist, például szervetlen bázist, mint például alkálifém-vegyületet, például nátrium-hidroxidot, nátrium-karbonátot, nátrium-bikarbonátot, kálium- 55 -hidroxidot stb., alkáli-földfém-vegyületet, például kalcium-hidroxidot, magnézium-hidroxidot stb., ammóniát és másokat, szerves bázist, például etanol-amint, trietil-amint, diciklo-hexil-amint stb., vagy például savat, mint például szervetlen savat, például hidrogén-kloridot, kénsavat, foszforsavat 60 stb., szerves savat, mint például hangyasavat, ecetsavat, para-toluol-szulfonsavat, citromsavat, borkősavat stb. adunk. Az így előállított sókat könnyen átalakíthatjuk az FR— 900 156 szabad alakjává.

A szabad alakként előállított FR—900 156 vegyületet bá- 65 zissal vagy savval kezelve ismert módon megfelelő sókká alakíthatjuk át.

A találmány oltalmi köréhez tartozik mind az FR— 900 156 vegyület szabad alakja, mind pedig sói.

Az FR—900 156 jelű vegyület az alábbi fizikai és kémiai tulajdonságokkal rendelkezik (az alábbi adatokat a 3. példában megadottak szerint előállított vegyülettel kaptuk):

1. Alak és szín: fehér por.

2. Az anyag természete:

amfoter.

3. Színreakciók:

pozitív: ninhindrinnel, kálium-permanganáttal és kénsavval pozitív reakciót ad;

negatív; negatív a Dragendorff-reakció és az Ehrlich-reakció.

4. Oldhatóság:

vízben oldódik, metanolban gyengén, etanolban, acetonban, étil-acetátban, benzolban, hexánban és kloroformban nem oldódik.

5. A vegyület olvadáspontja:

143—148 C° hőmérsékleten bomlás közben olvad.

6. Specifikus forgatás:

[α]ο⁵: -27,1° (konc.: 0,4, vízben).

7. Ultraibolya abszorpciós spektrum: végabszorpció.

8. Infravörös abszorpciós spektrum (kálium-bromid):

1050, 1130, 1235, 1340, 1400, 1450, 1535, 1660, 1735,2950, 2980, 3080, 3350 cm -¹

9. Elemanalízis:

a minőségi analízis adatai szerint az FR—900 156 vegyület az alábbi elemeket tartalmazza: szén, hidrogén, nitrogén és oxigén.

10. Vékonyrétegkromatográfia:

Stacioner fázis	Oldószerelegy	Ráérték
Eastman cellulóz*	butanol, ecetsav és víz 4:1:2 arányú elegye	0,35
Szilikagél, Merek**	60% izo-propanol és víz	0,65

* kereskedelmi név, az Eastman Kodak Co. gyártmánya; ** kereskedelmi név, a Merek és Co. gyártmánya.

11. Molekulasúly:

tömegspektrometriás (meződeszorpciós módszer):

519 (alapcsúcs: M = 520).

12. Mágneses magrezonancia spektrum:

a spektrumot a mellékelt ábrán adjuk meg (oldószer: D₂O, standard TNSP).

13. Aminosav-analízis:

Aminosav Mólarány

Glicin1,00

Glutaminsav1,06

Alanin1,04 a, ε-diamino-pimelinsav1,03 (a mólarányt a glicin 1,00-ra számítva adjuk meg).

Tapasztalati képlet:

C₂H₃3N50n

Az FR—900 156 vegyület tisztább mintájának (a 4. példában megadottak szerint előállított anyag) fizikai és ké-4181434 miai tulajdonságait meghatároztuk, a minta olvadáspontja 147—153 C° (bomlik); a minta további tulajdonságai az előzőekben megadottal azonosak voltak.

A fenti fiziko-kémiai tulajdonságok analízise és további, a kémiai szerkezet meghatározására végzett vizsgálatok alapján a találmány szerinti FR—900 156 jelű vegyület kémiai szerkezetét az (I) képléten megadottal tekintjük azonosnak. A vegyület D-laktil-L-alanil-y-D-glutamil-(L)-mezo-diamino-pimelil-L-glicin.

Az alábbiakban ismertetjük az FR—900 156 vegyület biológiai tulajdonságait.

Az FR—900 156 vegyület és a gyógyszerészeti szempontból elfogadható sói hatásosak az immúnválaszra (azaz aktívak a sejtimmunitás és a humorális antitest képzésben), és a retikulo-endotheriális rendszerre, aktivitással rendelkeznek a szénnek a vérből való kiürülésére, nitrogén aktivitással bír, interferon inducer, kísérleti fertőzéssel szemben véd, és rákellenes hatással rendelkezik.

A fentiek alapján az FR—900 156 jelű vegyületet és gyógyszerészeti szempontból elfogadható sóit patogén mikroorganizmusok, különösen Gram-negatív, Gram-pozitív baktériumok és gombák okozta fertőző megbetegedések terápiás kezelésére és az ember és az állatok rákos elváltozásának kezelésére használjuk.

Az alábbiakban az FR—900 156 jelű vegyület gyógyszerészeti felhasználhatóságának bizonyítására farmakológiai vizsgálatokat ismertetünk.

1. A sejtimmunitás és a humorális antitest képzés növelése állatot tartalmazó tengerimalac csoportoknak 50 pg ovalbumint tartalmazó 0,1 ml FIA (Freund Inkomplett Adjuváns) emulziót adunk a hátsó lábakba. A kontroll csoportok a FIA-ban antigént kapnak, míg a vizsgált csoport az antigént és az FR—900 156 vegyületet kapja a FIA emulzióban. Az állatokat a 14. napon a bőrükön vizsgáljuk, a 16. napon pedig a vérüket teszteljük.

A kísérletek eredményeit az 1. táblázatban adjuk meg.

1. táblázat

	Sejtimmunitás t>orreakciók (mm átmérő, S. E.)·	Humorális	immunitás
Dózis (gg/hely)	Hemaggl útin áci ós titer (M * S. E.) <iog2r*	Hcmilizin titer (M* S. E.) (logi)**
0	0	9,1 ±0,19	4,5 ±0,45
0,1	0,2 ±2,8***	9,9±0,10***	6,4 ±0,76
1	14,5±2,1***	ll,5±0,61***	7,7 ±0,64***
10	11,0 ±1,3***	12,2±0,56***	7,1 ±0,58***
100	4,2±1,7***	10,0± 1,01	5,9±0,89

Megjegyzés:

* A bőrvizsgálatot a háton végeztük oly módon, hogy 0,1 ml fiziológiás sóoldatban lévő 5 pg mennyiségű antigént intradermálisan injektáltunk. A vizsgált helyen a bőrreakciót 48 óra múlva vizsgáltuk.

** Az antitest becslést az alábbiak szerint végeztük: króm-kloriddal ovalbuminnal kezelt juh vörösvérsejteket állítunk elő. Az antitest titert annak a legnagyobb szérumhígításnak a reciprokával adjuk meg, amely küszöb hemoagglutinációt és hemolízist okoz. Az eredményeket kettes alapú logaritmus egységekben adjuk meg.

*** A szignifikanciát Student t-számítással számítjuk; P<0,05.

Az FR—900 156 mitogén aktivitása egér rosszindulatú sejtekben

Anyagok és módszerek

1. Állat:

A kísérlet során hím BALB/C törzsbe tartozó egereket használunk, koruk 13 hét (első vizsgálat). A második vizsgálat során 9 hetes BALB/C törzsű nőstény állatokat vizsgálunk.

2. Szövettenyészet táptalaja:

A használt szövettenyésztő táptalaj a Roswell Park Memóriái Institute (RPMI)—1640 jelű komplett táptalaj. Az összes táptalaj 100 egység/ml G penicillint és lOOpg/ml sztreptomicin-szulfátot, továbbá 10% borjúszérumot tartalmaz.

3. Sejtpreparáció:

A rosszindulatú daganatokat steril körülmények között eltávolítjuk, Hanks-oldattal mossuk, és ezt követően szövettenyésztő táptalajba helyezzük. A szövettenyésztő táptalaj ily módon milliliterenként 8x10® sejtet tartalmaz.

4. A tenyésztés körülményei:

Mindegyik Microtest II szővettenyésztő lemez lyukaiba (8x12 lyuk) (Folcon Plastics Co. terméke) 0,1 ml fenti sejtszuszpenziót és 0,1 ml az alábbiakban megadottak szerint előállított és vizsgált vegyületet tartalmazó koncentrátumot helyezünk, majd 37 C° hőmérsékleten nedves légben (95% levegő és 5% széndioxid) 48 órán át inkubáljuk.

A kontroll tenyészetek 0,1 ml táptalajt tartalmaznak a vizsgált vegyületet tartalmazó koncentrátum helyett.

5. Timidin^3H-felvétel:

Mindegyik vizsgálat során a tenyésztés utolsó 24 órájában 20 pl milliliterenként 10 pCi aktivitású triciált timidint (3H-timidin) adunk mindegyik lyukba. A tenyésztés befejezését követően szűrőpapírral (Whatman GF 83) szűrjük a sejteket, fiziológiás sóoldattal, majd 5%-os triklór-ecetsavval mossuk a szűrési maradékot. Megszárítjuk a szűrőpapírt, és szcintillátorba helyezzük (0,1 g para-bisz-[5-fenil-oxazolil]-benzolt és 4 g 2,5-difenil-oxazolilt tartalmazó 1 liter térfogatú toluol), és mérjük a dezoxi-ribonukleinsavba beépült radioaktív timidin^3H-t.

6. Stimulációs index: timidin^3H-felvétel (tiszta beütés/perc) a kezeiteknél timidin^3H-felvétel (tiszta beütés/perc) a kontrolinál

7. Vizsgált vegyület:

FR—900 156 jelű vegyület.

Az eredményeket a 2. táblázatban adjuk meg.

2. táblázat
Koncentráció (pg/ml)	Timidin3H-felvétel, tiszta beütés/perc: av±S. E.	Stimuláció index
1. vizsgálat 100	2028± 89	4,9
10	1486± 120	3,6
1	835± 64	2,0
0	417± 13	1,0
2. vizsgálat 100	3666± 42	4,1
10	3223 ±402	3,6
1	2741 ±319	3,0
0	901 ±105	1,0

-5181434

A találmány szerinti vegyület védőhatása egerek kísérleti fertőzésekor

Az egerek kísérleti fertőzéssel szembeni védőhatás meghatározására az FR—900156 jelű vegyületet steril vízben oldjuk, és háromszoros hígításokat készítünk szintén steril vízzel.

A kísérlet során 6 hetes és 24—26 g súlyú hím DDY-törzsbe tartozó egereket használunk csoportonként 4 állattal.

Difco Nutrient Broth-ban (Difco) Escherichia coli No. 22 sejteket tenyésztünk egy éjszakán át, majd friss táptalajjal 100-szorosra hígítjuk a tenyészetet, és 30 C° hőmérsékleten rázás közben folytatjuk a tenyésztést. Amikor a tenyészet milliliterenként 1 x 10⁸ sejtet tartalmaz, 0,2 ml tenyészetet intraperitoneálisan beoltunk az állatoknak. Az összes, az antibiotikummal nem kezelt állat a fertőzést követő 48 órán belül elpusztul.

A fertőzést megelőző első, negyedik, ötödik és hatodik napon 0,2 ml FR—900156 jelű vegyületet tartalmazó oldatot injektálunk szubkután. A fertőzést követően két nap múlva a kísérlet befejeződik, és meghatározzuk a túlélők számát. A kísérlet eredményeit a 3. táblázatban adjuk meg.

3. táblázat

Dózis (μ/egér/nap)	Túlélők száma/fertőzöttek száma
0,01	10/10
0,003	10/10
0,001	10/10
0,0003	8/10
0,0001	4/10
kontroll	0/10
4. Rákellenes hatás

A kísérlet során nőstény patkányokat használunk (Donru törzs), koruk hat hét, csoportonként három állat.

Az állatoknak 0,5 ml Hank-oldatban lévő ascites hepatoma AH66 sejteket transzplantálunk intraperitoneálisan, állatonként 5 x 10⁴ sejtet. 13 nappal később az összes állat aszkitesz rákban elhullik. A hatás kritériuma a túlélési idő meghosszabbítása a kontrollal szemben.

A terápiás kezelést a tumor transzplantációját megelőző

5., 6., 7., 8. és 9. napon végezzük. Az FR—900156 vegyületet steril fiziológiás sóoldatban oldjuk, és hígítjuk, oly módon, hogy háromszoros hígításokat kapjunk. Az oldatot intraperitoneálisan adjuk az állatoknak. A kísérletek eredményeit a 4. táblázatban adjuk meg.

4. táblázat

Dózis (mg/patkány/nap)	Élettartam (nap)
1,0	14	>30	>30
0,3	13	>30	>30
0,1	13	>30	>30
0,03	13	13	13
kontroll (sóoldat)	13	13	13

5. A szén kitisztulása a véráramból

Reagensek;

1. Szén-szuszpenzió: tus, amely milliliterenként 170 mg szenet tartalmaz, és amit 1% zselatint tartalmazó fiziológiás sóoldattal eredeti koncentrációjának '/s-ére hígítottunk.

2. 0,1 %-os vizes nátrium-karbonát oldat.

Az eljárás leírása:

Hímnemű DDY 5—6 W egereket a farki vénán beoltunk testsúlykilogrammra számítva 0,01 ml szénkészitménnyel. A vérmintákat előzőleg heparinban mosott 50 μΐ térfogatú kalibrált pipettával vesszük. A pipettát a retroorbitális vé5 nába juttatjuk a szem n-izális sarkában. A mintákat 3 és 6 percenként vesszük. A vért a mintavételt követően azonnal 3,0 ml nátrium-karbonát oldatba engedjük. Ez az oldat hemolizálja a vért, és így lehetővé válik a szén mennyiségi meghatározása. Ezután 660 nm hullámhosszon spektrofoto10 méteren vizsgáljuk a mintákat, a szén logaritmikus koncentrációját előzőleg meghatározott standard görbéből számítjuk. A K tisztulási értéket úgy kapjuk meg, hogy a szén koncentrációját a megfelelő időben az alábbi egyenlet szerint számítjuk:

¹⁵ κ - ^{(log C1}~^{10g Cz)}

T₂-T₂ ahol Τχ és T₂ azt a percben megadott időt jelenti, amikor a vérmintát vettük, és ahol C] és C₂ a T, és T₂ időben vett 20 vérminta szénkoncentrációja.

Az FR—900156 jelű vegyület szén kitisztulásra kifejtett hatásának vizsgálata.

A hatóanyagot az előzőekben ismertetett módon előállított vizes oldatban adagoljuk szubkután az egereknek. 24 25 órával később meghatározzuk a szén eltűnését a vérből.

A kezelt egerekkel kapott K-értéket összehasonlítjuk a kontroll állatokkal kapott eredménnyel. A kísérlet eredményeit az 5. táblázatban adjuk meg.

5. táblázat

Különböző hatóanyagok hatása a szén-kitisztulásra

Hatóanyag	Dózis (mg/egér)	Kezelt/ Kontroll
Krestin	10	1,1
	1	1,0
Levamisol	10	— (halál)
	1	0,5
Tuftsin	400	1,4
	125	1,0
FR—900156	0,25	2,9
vegyület	0,06	1,5
Kontroll (sóoldat)		1,0

6. Interferon-indukáló aktivitás

4—6 hetes hím ICR egereket használunk a kísérlet során. Az egerek lépét eltávolítjuk, és a lépsejtek interferon termelő képességét in vitro vizsgáljuk FR—900156 vegyület jelenlété50 ben.

Lépsejt szuszpenziót állítunk elő 100 μ/ml sztreptomicinnel, 100 μ/ml G penicillinnel, 1% glutaminnal és 5 x 10 ^{5 *} mól 2-merkapto-etanollal kiegészített RPMI—1640 táptalaj.55 jal.

A szövetsejt tenyészetet 37 C° hőmérsékleten addig inkubáljuk FR—900156 jelű vegyület jelenlétében, vagy anélkül, míg 4 x 10⁷ sejt/ml koncentrációt érünk el; a hatóanyag dózisa: 100, 10 és 1 pg/ml.

24 óra múlva összegyűjtjük a tenyészetek felülúszóját, és citopatikus hatás gátláson alapuló L sejt—VSV rendszerben meghatározzuk az interferon-aktivitásokat. A vírusellenes titert IU/ml-ben adjuk meg standard interferonra vonatkoztatva.

A kísérlet eredményeit a 6. táblázaton adjuk meg.

-6181434

6. táblázat

Dózis (pg/ml)	IF-titer lU/mí
100	14
10	16
1	10
0	<6,5

7. Akut toxicitás egerekben g/kg intravénásán adagolva nem toxikus.

8. Sejttoxicitás L egérsejtekben

500 gg/ml nem okoz toxikus hatást.

A találmány szerinti FR—900156 vegyületet és gyógyszerészeti szempontból elfogadható sóit terápiás adagoláshoz többféle alakban kiszerelhetjük, például előállíthatunk olyan gyógyszerészeti készítményt, amely a találmány szerinti aktív vegyületet nem toxikus, gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivőanyaggal együtt tartalmazza.

Az FR—900156 jelű vegyület gyógyszerészeti szempontból elfogadható sója lehet szervetlen vagy szerves bázissal alkotott só, például nátriumsó, káliumsó, kalciumsó, ammóniumsó, etanol-aminsó, trietilaminsó, diciklo-hexil-aminsó és más hasonló; lehet savaddíciós só, amely szerves vagy szervetlen savval keletkezett, például hangyasavas só, ecetsavas só, para-toluol-szulfonsavas só, citromsavas só, borkősavas só, hidrogén-kloridos só, kénsavas só, foszforsavas só és mások.

A találmány szerinti gyógyszerészeti készítményt gyógyszerészeti preparátum alakjában használhatjuk, például szilárd, félszilárd vagy folyékony alakban, amely készítmények a találmány szerinti aktív vegyületet tartalmazzák szerves vagy szervetlen vivőanyaggal, vagy hígítóanyaggal együtt oly módon, hogy alkalmas legyen külső, belső vagy parenterális adagolásra. A hatóanyagot keverhetjük például a szokásosan használt nem toxikus, gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivőanyagokkal, tabletták, kapszulák, szuppozitóriumok, oldatok, emulziók, szuszpenziók és más előnyös gyógyszerészeti készítmények előállítására. Vivőanyagként használhatunk vizet, glükózt, laktózt, akáciagumit, zselatint, mannitot, keményitőpasztát, magnézium-triszilikátot, talkumot, kukoricakeményitőt, keratint, kolloid szilícium-dioxidot, burgonyakeményítőt, karbamidot és más szilárd, felszilárd vagy folyékony alakú előnyös vivőanyagot. Kiegészíthetjük a készítményt segédanyagokkal, stabilizálószerekkel, keményítő- és színezőanyagokkal, továbbá szagositókkal. A gyógyszerészeti készítmények tartalmazhatnak konzerválószereket vagy bakteriosztatikus hatású anyagokat abból a célból, hogy a készítmény aktivitása stabilan megmaradjon. A hatásos összetevő a gyógyszerészeti készítményben olyan mennyiségben van jelen, hogy a kívánt terápiás hatást elérjük, a betegségtől függően.

A készítményt embernek előnyösen intravénásán, intramuszkulárisan vagy orálisan adagoljuk. A találmány szerinti vegyület dózisa vagy terápiásán hatásos mennyisége a kezelendő egyes betegek korától és állapotától függ, a napi dózis általában az ember vagy az állat testsúlykilogrammjára számítva 2 mg és 100 mg között változik, általában egy átlagos dózist adagolunk, amely 50 mg, 100 mg, 250 mg vagy 500 mg hatóanyagnak felel meg.

A találmány szerinti eljárást a továbbiakban példákkal szemléltetjük.

1. példa

Az alábbi összetételű vegetatív, 7,0 pH-jú táptalajt állítjuk elő:

Oldható keményítő	2%
Rizsliszt	1%
Száraz élesztő	1%
Kukorica lekvár	1%
Csapvíz
(1. vegetatív táptalaj)
100 ml fenti összetételű	vegetatív táptalajt tíz, 500 ml tér-

fogatú lombikokban ismert módon sterilizálunk, majd mind a tíz táptalajt egy-egy kacsnyi tenyészettel oltunk be, amit a Streptomyces olivaceogriseus ATCC 31427 mikroorganizmus ferdeagar tenyészetéről nyertünk. A tenyészeteket 30 C° hőmérsékleten 48 órán át rázógépen rázzuk.

liter össztérfogatú tankfermentorba 20 liter vegetatív táptalajt (2. táptalaj) töltünk, amelynek összetétele a következő:

Oldható keményítő	2%
Gyapotmagliszt	0,5%
Rizsliszt	0,5%
Száraz élesztő	0,5%
Kukorica lekvár	0,5%
Csapvíz
A vegetatív 2. táptalaj pH-ját 7,0-re állítjuk be, majd is-

mert módon sterilizáljuk, és steril körülmények között beoltjuk a fentiek szerint előállított vegetatív inokulum tenyészettel. 24 órán át 30 C° hőmérsékleten folytatjuk a tenyésztést.

A fentiek szerint előállított vegetatív inokulummal sterilen 2000 liter térfogatú 1600 liter fermentációs táptalajt tartalmazó fermentort oltunk. A fermentációs táptalaj összetétele

a következő:
Oldható keményítő	2%
Gyapotmagliszt	0,5%
Gabonacsíra	0,5%
Szárított élesztő	0,25%
Kukorica lekvár	0,25%
Kálium-dihidrogén-foszfát	0,5%
Nátrium-hidrogén-foszfát
x12H2O	0,5%
Kobalt(II)-klorid x 6 H2O	1,25 mg/1

Csapvíz

A tenyésztést 72 órán 30 C° hőmérsékleten folytatjuk. A növekedési szakasz alatt a táptalajt percenként 170-et forduló keverövel kevertetjük, és percenként 16001 steril levegőt vezetünk át a táptalajon.

A fermentáció végén 20 kg Radiolite (kereskedelmi név a Showa Chemical Company, Japán) szűrési segédanyagot adunk a tenyészethez, majd a micéliumok eltávolítására szűrjük. Az 1600 1 térfogatú szűrletet 800 1 aktivált szénnel töltött oszlopon vezetjük át, amit ezt követően 1600 1 vízzel mosunk. Az eluálást 3001 50%-os vizes acetonnal végezzük, az eluátumot ezután 6001 térfogatúra töményítjük.

A sűrítményt 2001 DEAE-Sephadex gyantával (kereskedelmi név Pharmacia A. B.) töltött oszlopon vezetjük át, a gyantát előzőleg 6,0 pH-jú foszfát-pufferral pufferoltuk. 2001 vízzel és ezt követően 20010,1 M nátrium-klorid oldattal mossuk az oszlopot, az eluálást 4001 0,3 M nátrium-klorid oldattal végezzük. A vizes eluátumot 2001 aktív szénből készült oszlopon kromatografáljuk, 2001 vízzel mossuk az oszlopot, és ezt követően a hatóanyagot 4001 50%-os vizes acetonnal eluáljuk. Az eluátumot koncentráljuk, és fagyasztva szárítjuk, amiután 800 g fehér színű poralakú terméket kapunk. A poralakú terméket 25 vízben old7

-7181434 juk, az oldatot 251 CM-Sephadex H⁺ -ciklusú gyantából készült oszlopra vezetjük. Az oszlopot 251 vízzel eluáljuk, az eluátumot töményítjük, és fagyasztva szárítjuk, amiután 33 g sárgás fehér színű port kapunk. Ezt 1,21 cellulózból készült oszlop tetejére töltjük. 1000 ml 70%-os vizes propanollal mossuk az oszlopot, majd 1000 ml 60%-os vizes propanollal eluálunk. Az eluátumot töményítjük, és fagyasztva szárítjuk, amiután 4,0 g fehér színű port kapunk. Ezt a port 150 ml vízben oldjuk, az oldatot 2,81 Sephadex G—15 gyantából készült oszlopon kromatografáljuk.

Az oszlopot vízzel eluáljuk. Összegyűjtjük az aktív frakciókat, töményítjük, és fagyasztva szárítjuk, amiután 4,0 g fehér színű port kapunk. A poralakú terméket 25 ml vízben oldjuk, az oldatot 400 ml H⁺ ciklusú CM-Sephadex gyantából készült oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot vízzel eluáljuk. összegyűjtjük az aktív frakciókat, töményítjük, és fagyasztva szárítjuk, amiután fehér színű poralakú termékként 70%-os tisztaságú, 40 mg súlyú FR—900156 jelű anyagot kapunk.

2. példa

Az 1. példában megadottak szerint eljárva fermentálunk. A fermentáció befejezése után 20 kg Radiolite (Showa Chemical Company) szűrési segédanyagot adunk a fermentléhez, majd a micélium eltávolítására szűrjük. 1600 1 szűrletet 8001 aktív szénből készült oszlopon vezetünk át, az oszlopot 16001 vízzel mossuk. 30001 50%-os vizes acetonnal eluáljuk a hatóanyagot, az eluátumot 6001 térfogatúra töményítjük. A sűrítményt DEAE-Sephadex (Pharmacia A. B.) gyantából (2001) készült oszlopon vezetjük át, az oszlopot előzőleg 6,0 pH-jú foszfát-pufferral pufferoltuk. 2001 vízzel, ezt követően 200 1 0,lN nátrium-klorid oldattal mossuk az oszlopot, majd 400 1 0,3M nátrium-klorid oldattal eluáljuk a hatóanyagot. A vizes eluátumot 2001 aktív szénből készült oszlopon vezetjük át, 2001 vízzel mossuk az oszlopot, a hatóanyagot 400 1 50%-os vizes acetonnal eluáljuk. Töményítjük az eluátumot, majd fagyasztva szárítjuk, amiután 800 g fehér színű poralakú terméket kapunk. Ezt 25 1 vízben oldjuk, az oldatot 251 ΡΓ-ciklusú CM-Sephadex gyantából készült oszlopra vezetjük. 25 1 vízzel eluáljuk az oszlopot, az eluátumot töményítjük, a sűrítményt fagyasztva szárítjuk, ezután 33 g sárgás fehér színű poralakú terméket kapunk. Ezt 1,21 cellulóz gyantából készült oszlopra juttatjuk. 1000 ml 70%os vizes propanollal mossuk az oszlopot, a hatóanyagot 1000 ml 60%-os vizes propanollal eluáljuk. Töményítjük az eluátumot, a sűrítményt fagyasztva szárítjuk, azután 4g fehér színű port kapunk. Ezt 300 ml vízben oldjuk, az oldatot 1,41 DEAE-Sephadex gyantából készült oszlopon vezetjük át, az oszlopot előzőleg 6,0 pH-jú foszfát-pufferral pufferoltuk. 1,510,1 M nátrium-klorid oldattal mossuk az oszlopot, az eluálást 31 0,2M nátrium-klorid oldattal végezzük, összegyűjtjük az aktív frakciókat, majd egyesítjük őket, és 300 ml aktív szénből készült oszlopon kromatografáljuk. Vízzel mossuk az oszlopot, a hatóanyagot 800 ml 50%-os vizes acetonnal eluáljuk. Az eluátumot töményítjük, és fagyasztva szárítjuk, amiután 700 mg fehér színű poralakú terméket kapunk. Ezt 20 ml vízben oldjuk, az oldatot 500 ml H' -ciklusú CM-Sephadex gyantából készült oszlopon vezetjük át. Az oszlopot vízzel eluáljuk, az aktív frakciókat összegyűjtjük, és töményítjük, amiután 10 ml sűrítményt kapunk.

A sűrítményt 500 ml Sephadex G 15 gyantából készült oszlopon kromatografáljuk, az eluálást vízzel végezzük. Összegyűjtjük az aktív frakciókat és töményítjük őket, a sűrítményt fagyasztva szárítjuk, amiután 70 mg fehér színű terméket kapunk. Ezt 25 ml vízben oldjuk, és preparatív vékonyrétegkromatográfiát végzünk cellulózon (Eastman Kodak Co.). Oldószerelegyként butanol, ecetsav és víz 4 : 1 : 2 arányú elegyét használjuk. Az eluálást 50 ml vízzel végezzük, az eluátumokat töményítjük, a sűrítményt fagyasztva szárítjuk, amiután fehér színű poralakú termékként 20 mg FR—900156 jelű vegyületet kapunk.

3. példa

Az 1. példában megadottak szerint eljárva fermentálunk. A fermentáció befejezését követően 20 kg Radiolite (kereskedelmi név, Showa Chemical Company) szűrési segédanyagot adunk a fermentléhez, majd ezt követően a micélium eltávolítására szűrjük. 8001 aktív szénből készült oszlopon 16001 szűrletet vezetünk át, az oszlopot 16001 vízzel mossuk. 3000 1 50%-os vizes acetonnal eluáljuk a hatóanyagot, az eluátumot 6001 térfogatra töményítjük. A sűrítményt DEAE-Sephadex oszlopon vezetjük át, a gyanta térfogata 2001 (kereskedelmi név, Pharmacia A. B.). Az oszlopot előzőleg 6,0 pH-jú foszfát pufferral pufferoltuk, 2001 vízzel, majd ezt követően 2001 O,1M nátrium-klorid oldattal mossuk az oszlopot, az eluálást 0,3M nátrium-klorid oldattal végezzük. A vizes eluátumot 2001 aktív szénből készült oszlopon kromatografáljuk, az oszlopot 2001 vízzel mossuk, az eluálást 400 1 50%-os vizes acetonnal végezzük. Töményítjük az eluátumot, majd ezt követően fagyasztva szárítjuk, amiután 800 g fehér színű poralakú terméket kapunk. Ezt 251 vízben oldjuk, az oldatot H⁺-ciklusú CM-Sephadex gyantából készült 251 térfogatú oszlopon vezetjük át. 251 vízzel eluáljuk a hatóanyagot, az eluátumot töményítjük, és fagyasztva szárítjuk, amiután 33 g sárgás fehér színű poralakú termékhez jutunk. Ezt 1,2 1 cellulóz gyantából készült oszlopra helyezzük. 1000 ml 70%-os vizes propanollal mossuk az oszlopot, az eluálást 1000 ml 60%-os vizes propanollal végezzük. Töményítjük az eluátumot, majd fagyasztva szárítjuk, amiután 4 g fehér színű port kapunk. Ezt 300 ml vízben oldjuk, az oldatot 1,41 DEAE-Sephadex (kereskedelmi név, Pharmacia A. B.) gyantából készült oszlopon vezetjük át, az oszlopot előzőleg 6,0 pH-jú foszfát-pufferral pufferoltuk. 1,51 0,1 M nátrium-klorid oldattal mossuk az oszlopot, a hatóanyagot 30010,2M nátrium-klorid oldattal eluáljuk. Összegyűjtjük az aktív frakciókat, és 300 ml aktív szénből készült oszlopon vezetjük át. Vízzel mossuk az oszlopot, a hatóanyagot 800 ml 50%-os vizes acetonnal eluáljuk. Töményítjük az eluátumot, és azután fagyasztva szárítjuk, amiután 700 mg fehér színű port kapunk. Ezt 20 ml vízben oldjuk, az oldatot 500 ml H ’ -ciklusú CM-Sephadex gyantából készült oszlopon vezetjük át. A hatóanyagot vízzel eluáljuk, az aktív frakciókat összegyűjtjük, majd töményítjük, amiután 10 ml sűrítményt kapunk. Ezt fagyasztva szárítva 400 mg poralakú termékhez jutunk. Ezt 500 ml cellulóz gyantából készült oszlopra helyezzük. A hatóanyag eluálását n-butanol, ecetsav és víz 4: 1: 2 arányú elegyével végezzük. Összegyűjtjük az aktív frakciókat, és fagyasztva szárítjuk, amiután 200 mg poralakú terméket kapunk. Ezt 7 ml vízben oldjuk, az oldatot 250 ml Sephadex G 15 gyantából készült oszlopon kromatografáljuk. Összegyűjtjük az aktív

-8181434 frakciókat, és töményítjük, a sűrítményt fagyasztva szárítjuk, amiután 100 mg fehér színű porként FR—900156 vegyületet kapunk.

4. példa

A 3. példában megadottak szerint előállított FR—900156 jelű vegyület fehér poralakját a fenti tisztítási eljárásokat megismételve tovább tisztítjuk, amiután még tisztább terméket vagy FR—900156 vegyületet kapunk.

5. példa darab 500 ml térfogatú lombikba 100—100 ml alábbi összetételű táptalajt öntünk:

Kukoricakeményítő 5%

Rizsliszt 1 %

Szárított élesztő 1%

Kukoricalekvár 1%

A táptalajokat ismert módon sterilezzük, majd beoltjuk a Streptomyces violaceus ATCC 31481 mikroorganizmus ferdeagar tenyészetéről nyert spóráival.

C° hőmérsékleten 48 órán át rázógépen tenyésztünk.

301 össztérfogatú tankfermentorba 201 fenti összetételű táptalajt töltünk. Ismert módon sterilizáljuk a táptalajt, majd steril körülmények között beoltjuk a fenti módon előállított jnokulummal. 30 órán át 30 C° hőmérsékleten fermentálunk.

4001 össztérfogatú fermentorba 320 1 6,5 pH-jú alábbi összetételű táptalajt töltünk:

Oldható keményítő 2%

Rizsliszt 1 %

Gyapotmagliszt 1%

Nátrium-szulfát x 10 H₂O 2%

A fenti módon előállított 20 1 inokulummal steril körülmények között beoltjuk a táptalajt.

órán át 30 C° hőmérsékleten tenyésztjük a mikroorganizmust. A tenyésztés közben percenként 170-et forduló keverőt működtetünk, és percenként 3201 levegőt vezetünk át a táptalajon. A fermentáció befejezését követően 4 kg Radiolite szűrési segédanyagot adunk a fermentléhez, majd a micélium eltávolítására szűrjük. 3001 szürletet 1501 aktivált szénből készült oszlopon kromatografálunk, az oszlopot 3001 vízzel mossuk. Az eluáíást 600 1 50%-os vizes acetonnal végezzük, az eluátumot 1201 térfogatra töményítjük.

A sűrítményt 301 előzőleg 6,0 pH-jú foszfát pufferral pufferolt DEAE-Sephadex gyantából készült oszlopon vezetjük át. 301 vízzel, majd ezt követően 301 0,1 M nátrium-klorid oldattal mossuk az oszlopot, a hatóanyagot 0,3M nátrium-klorid oldattal eluáljuk. A 601 térfogatú eluátumot 301 aktív szénből készült oszlopon kromatografáljuk, az oszlopot 601 vízzel mossuk, a hatóanyagot 60 1 50%-os vizes acetonnal eluáljuk. Fagyasztva szárítjuk az eluátumot, amiután 120 g fehér színű poralakú terméket kapunk. Ezt 41 vízben oldjuk, az oldatot H* -ciklusú CM-Sephadex gyantából készült 141 térfogatú oszlopon vezetjük át. Vízzel eluáljuk a hatóanyagot, az eluátumot töményítés után fagyasztva szárítjuk, így 20 g poralakú terméket kapunk. Ezt cellulózból készült oszlopra helyezzük. Az eluáíást vizes propanollal végezzük, az aktív frakciókat összegyűjtjük, és fagyasztva szárítjuk, amiután 5 g porhoz jutunk. Ezt 500 ml vízben oldjuk, az oldatot 1,3 1 DEAE-Sephadex gyantából készült oszlopra vezetjük, az oszlopot előzőleg 6,0 pH-jú foszfátpufferral pufferoltuk. 0,lM nátrium-klorid oldattal mossuk az oszlopot, a hatóanyagot 0,2M nátrium-klorid oldattal eluáljuk. Összegyűjtjük az aktív frakciókat, és 900 ml aktivált szénből készült oszlopra vezetjük. Vízzel mossuk az oszlopot, az eluáíást 200 ml 50%-os vizes acetonnal végezzük. Töményítés után fagyasztva szárítjuk az eluátumot, ily módon 1 g poralakú termékhez jutunk.

Ezt 300 ml vízben oldjuk, az oldatot 250 ml H ^-ciklusú CM-Sephadex gyantából készült oszlopra vezetjük. Az oszlopot vízzel eluáljuk. Összegyűjtjük az aktív frakciókat, majd töinényítést követően fagyasztva szárítjuk, amiután 800 mg poralakú termékhez jutunk. Ezt 20 ml vízben oldjuk, az oldatot kevés cellulózzal keverjük. A szuszpenziót cellulóz oszlopon kromatografáljuk. 100 ml acetonnal, majd ezt követően 300 ml n-butanol, ecetsav és víz 4:1:1 arányú elegyével mossuk az oszlopot, a hatóanyagot n-butanol, ecetsav és víz 4 : 1 : 2 arányú elegyének egy literével eluáljuk. Összegyűjtjük az aktív frakciókat, és fagyasztva szárítjuk, amiután 30 mg poralakú terméket kapunk. Ezt 20 ml vízben oldjuk, az oldatot 250 ml Sephadex G 15 gyantából készült oszlopon kromatografáljuk. Az eluáíást vízzel végezzük, az aktív frakciókat összegyűjtjük, és fagyasztva szárítjuk, amiután 5 mg FR—900156 jelű vegyületet kapunk.

6. példa

Ismertetjük a gyógyszerészeti készítmények előállítását.

a) Injekció előállítása

A szükséges mennyiségű FR—900156 vegyületet ampullákba töltjük, oly módon, hogy mindegyikük 500 mg aktív hatóanyagot tartalmazzon. A baktériumok kizárására hermetikusan zárjuk az ampullákat. Használat előtt 2 ml steril desztillált vizet adagolunk, majd a vizes oldatot injekcióval juttatjuk a szervezetbe.

b) Tabletták előállítása

Az alábbi összetételű keveréket állítjuk elő:

FR—900156 vegyület 200mg

Mannit 400mg

Keményítő 50mg

Magnézium-sztearát 10mg

A keverékből tablettákat készítünk.

c) Kapszulák előállítása

Az alábbi vegyületeket keverjük: FR—900156 vegyület 300 mg

Magnézium-sztearát 15 mg

A fenti keveréket ismert módon kemény zselatin kapszulákba töltjük.

7. példa

260 mg D-Lac-L-Ala-r-D-Glu(a-(OH)-(L)-mezoDAP-(L)-Gly-t 10 ml 0,1 N nátriumhidroxidban oldunk és az oldatot vákuumban bepároljuk. A maradékot 5 ml metanolban oldjuk és etanollal kicsapjuk. A szilárd anyagot kiszűrjük, etanollal mossuk és szárítva 270 mg megfelelő dinátrium-sót kapunk, op.: 224—228 °C. (bomlás közben). IR(nujol): 3270, 1650, 1605 cm

8. példa mg p-toluolszulfonsav-monohidrátot adunk 260 mg

-9181434

D-Lac-L-AIa-r-D-Glu(a-OH)-(L)-mezoDAP-(L)-Gly 10 ml vízzel készített oldatához. Az oldatot liofilizálva kapjuk a 360 mg megfelelő p-toluolszulfonátot. Op.: 109—115 ’C. IR(nujol): 3270, 1730, 1640 cm Λ

Claims (1)

1. Eljárás az (I) képletü FR-900156 jelű vegyület és sói előál lítására, azzal jellemezve, hogy Streptomyces olivaceogriseus ATCC 31427 illetve Streptomyces violaceus ATCC 31481 törzseket illetve ezeknek az FR—900156 vegyületet termelő mutánsait levegőztetett fermentációs körülmények között 5 felhasználható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sót tartalmazó táptalajon tenyésztünk, és kívánt esetben a keletkezett FR—900156 vegyületet savval vagy bázissal kezeljük.