DK148809B - Fremgangsmaade til fremstilling af et antibakterielt og anti-cancervirksomt lactoyl-tetrapeptid ved dyrkning - Google Patents

Description

148809

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt lactoyl-tetrapeptid betegnet FR-900156 og med formlen OH CH.

I · J 3 (D)

CHjCHCONHCHCONHCHCOOH

CD) (L) Ϊη, I 2 • CH, I CL)

CONH(jHCONHCH2COOH

CH, ίΐ I 2 CH,

H2NCHCOOH

CD) eller salte deraf, hvilke forbindelser har biologiske egenskaber, hvorfor de kan anvendes ved fremstilling af farmaceutiske præpara-5 ter. FR-900156 og farmaceutisk tolerable salte deraf kan forøge aktiviteten af immunresponset og det reticuloendotheliale system og kan derfor anvendes f.eks. til terapeutisk behandling af infektionssygdomme forårsaget af patogene mikroorganismer, især gramnegative bakterier og grampositive bakterier og fungi, og cancer i mennesker 10 og dyr.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at en stamme af arten Streptomyces olivaceogriseus eller Streptomyces violaceus under aerobe betingelser dyrkes i et dyrkningsmedium indeholdende assimilerbare kilder til kulstof, nitrogen og uorganisk salt, hvorpå 15 det dannede FR-900156 udvindes fra kulturen i fri form eller i form af et salt heraf.

148809 2

Mikroorganismen.

Den mikroorganisme, der kan anvendes til produktionen af stoffet FR-900156, er en stamme hørende til arten Streptomyces olivaceogri-seus eller Streptomyces violaceus. Sådanne stammer er blevet isoleret 5 fra en jordprøve.

Naturlige mutanter, som er fremstillet ved naturlig mutation af organismerne, samt kunstige mutanter, som kan fremstilles ud fra de beskrevne organismer på sædvanlig måde, f.eks. ved røntgenbestråling, ultraviolet bestråling eller behandling med nitrogen-sennepsolier, 10 og som har sådanne egenskaber, at de kan henføres til arten Streptomyces olivaceogriseus eller Streptomyces violaceus, kan også anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

I. Streptomyces olivaceogriseus nov. sp. C-353:

Streptomyces olivaceogriseus nov. sp. C-353 er blevet isoleret fra en 15 jordprøve, der er opsamlet ved Kochi Prefecture, Japan, og deponeret i America Type Culture Collection under nr. ATCC 31427.

Streptomyces olivaceogriseus nov. sp. C-353 (ATCC 31427) har følgende morfologiske, kulturmæssige og fysiologiske kendetegn: 1) Morfologiske kendetegn: 20 Mikroskopiske observationer blev udført på kulturerne, som havde groet i 10 - 14 dage på saccharose-nitratagar, glycerol-asparaginagar, gær-maltekstraktagar, havremelsagar, stivelse-uorganiske salte-agar og Bennett-agar. Sporophormorfologien blev iagttaget på uforstyrrede pladekulturer. 1 1. Forgreningstype i sporedannende hyfer:

Monopodial forgrening 2. Form af sporedannende hyfer:

Retinaculiaperti (lukkede spiraler, øjer) 148809 3 3. Sporeantal: 5-20 sporer 4. Overfladeudseende og sporestørrelse:

Glat, 0,6 - 1,2 x 1,0 - 1,9 mikron 5 5. Forekomst af zoosporer:

Ikke iagttaget 6. Forekomst af sporangium:

Ikke iagttaget 7. Dannelse af sporer: 10 I luftmycelium 8. Fragmentering af substratmycelium:

Ikke iagttaget.

2) Kulturmæssige kendetegn:

De nedenfor anførte observationer blev udført på skråkulturer, som 15 var dyrket på forskellige medier ved 30°C i 10 - 14 dage.

Medium Luftmasse, Bagsiden af Opløseligt farve kolonien pigment

Saccharose-nitrat- intet eller meget lysegult, små intet 20 agar tyndt, pulverag- kolonier tigt glucose-asparagin- lysegrå til grønlig lysegul til intet agar grå, pulveragtig lys gullig-brun små kolonier 25 glycerol-asparagin- tynd, pulveragtig, lysgullig-brun, intet eller agar lys grå, små kolonier spor stivelse-uorganiske olivengrå, pulver- grålig gulbrun, intet salte-agar agtig små kolonier tyrosinagar lys olivengrå, tynd, gulligbrun, små lysebrunt 30 pulveragtig kolonier næringsmiddelagar ingen lysegul, flad intet gær-maltekstrakt- grønlig-grå, pulver- gulligbrun, intet agar agtig rynkede kolonier 4 148-809

Fortsat havremelsagar lysegrå til grønlig- farveløs, små intet grå, pulveragtig kolonier pepton-gær-jern- ingen farveløs til lys lysebrunt 5 agar gul, lidt rynket glucose-pepton-ge- hvid, tynd pulver- farveløs til lyse brunt latinestik agtig gul, rynkede ko lonier 10 mælk hvid, meget tynd, farveløs, over- intet pulveragtig fladeringvækst 3) Biologiske og fysiologiske egenskaber: 1. Temperaturbehov (på Bennett-agar-skråkulturer) 15 vækst fra 15 til 40°C, optimum ved 28°C.

2. Stivelseshydrolyse (på stivelse-uorganiske salte-agar) svagt hydrolyseret.

3. Gelatinesmeltning (ved glucose-pepton-gelatinestik) negativ.

20 4. Indvirkning på mælk ingen koagulering, ingen peptonisering.

5. Melamindannelse (på tyrosinagar, pepton-gær-jern-agar og trypton-gærvæske) positiv.

148809 5 6. Udnyttelse af forskellige kulstofkilder (på Pridham-Gottlieb basalt agarmedium) D-xylose ± D-glucose + 5 D-fructose + D-galactose + saccharose + glycerol + inositol + 10 lactose + L-rhamnose maltose + raff i nose + D-mannitol + 15 D-mannose + salicin

Symboler: + = god udnyttelse, ± = tvivlsom udnyttelse, - = ingen udnyttelse.

7. Cellevægsmønster I (LL-diaminopimelinsyre).

20 Som et resultat af undersøgelse af stammen med de ovennævnte karakteristika ved sammenligning med litteraturen, nemlig "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8. udgave (1975) og "The International Streptomyces Project Reports" af E.B. Shirling og D. Gottlieb, jfr. International Journal of Systematic Bacteriology, bind 18, side 69 25 og 279 (1968), bind 19, side 391 (1969) og bind 22, side 265 (1972), er Streptomyces eurythermus og Streptomyces galbus (Okami) blevet påvist som arter, der har karakteristika, som er relativt analoge med de for stammen ATCC 31427 angivne.

Stammen ATCC 31427 adskiller sig imidlertid fra disse analoge arter 30 ved nedenstående: 148809 6

Streptomyces eurythermus (Okami):

En stamme af arten kan assimilere arabinose og kan ikke assimilere inositol. Assimilering af rhamnose og raffinose af en stamme af arten er ubestemt. Der dannes ikke øjer. Der iagttages undertiden lige eller 5 bugtet mycelium.

Streptomyces galbus:

Der dannes almindeligvis åbne spiraler. En stamme af arten producerer et opløseligt gult-gulgrønt pigment og kan ikke assimilere saccharose.

10 I betragtning af resultatet af undersøgelsen kan stammen ATCC 31427 bedømmes som værende en hidtil ukendt art hørende til slægten Streptomyces og er blevet betegnet som Streptomyces olivaceogriseus nov. sp. C-353.

II. Streptomyces violaceus nr. 6724.

15 Streptomyces violaceus nr. 6724 blev isoleret fra en jordprøve opsamlet ved Ishigaki-øen i Okinawa Prefecture, Japan, og deponeret i organismesamlingen American Type Culture Collection under nr. ATCC 31481.

Streptomyces violaceus nr. 6724 har følgende morfologiske, kultur-20 mæssige og fysiologiske kendetegn.

1) Morfologiske kendetegn.

Mikroskopiske observationer er udført på kulturer, som er dyrket på saccharose-nitrat-agar, glycerol-asparagin-agar, stivelse-uorganiske salte-agar, gær-maltekstrakt-agar og havremels-agar ved 30°C i 10 -25 14 dage.

148809 7 1. Forgreningstype ved sporedannende hyfer:

Monopodial forgrening.

2. Sporedannende hyfers form:

Spiraler.

5 3. Antal sporer: 10 - 50.

4. Overfladeudseende og sporestørrelse:

Tornet, 0,3 - 0,7 x 0,6 - 1,1 μ.

5. Forekomst af zoosporer og sporangium: 10 Ikke observeret.

6. Sporedannelse:

Ved luftmycelium.

7. Fragmentering af substratmycelium:

Ikke iagttaget.

15 2) Kulturmæssige kendetegn.

De nedenfor anførte observationer blev udført på kulturer, som var dyrket på forskellige medier ved 30°C i 10 - 14 dage.

Medium Luftmasse, Bagside af kolo- Opløseligt farve nien pigment 20 _

Saccharose-nitrat- let blåligrød-hvid, små kolonier blåligrødt agar pulveragtig glucose-asparagin- iet blåligrød-hvid, gulligrød, lyserødt agar pulveragtig små kolonier 25 glycerol-asparagin- lysrødlighvid-lyse- gulligrød, små ko- lyserødt agar rød, pulveragtig lonier, lidt rynket stivelsen-uorganiske hvidligrød, kort gulligrød, lidt rødt salte-agar vatagtig rynket tyrosin-agar ingen rød, rynkede ko- intet eller 30 lonier spor næringsagar ingen eller meget farveløs-blåligrød rødlig-blå- tynd pulveragtig flad ligrødt gær-maltekstrakt- lyserødlig-violet rødlig brun-lys rødlig-blå- agar kort vatagtig violet-brun, ryn- ligrødt 35 kede kolonier 8 1A 8 8 O 9 havremelsagar lyserød-let blålig- farveløs-blåligrød lyserød-violet rødlyserød, pul- lyserød, små kolo-veragtig nier pepton-gær-jern- ingen farveløs, rynkede brunt 5 agar kolonier glucose-pepton-ge- hvid, tynd pul- rød, rynkede svagt brunt latinestik veragtig kononier mælk tynd pulveragtig rød vækst på rødlig-gult overfladen 10 _

Bagsidens myceliumpigment er pH-indikator, som ændres fra rødt til violet (blåligrød) ved tilsætning af 0,05N NaOH eller fra violet til rød (lyserød) ved tilsætning af 0,05N HCI. Opløseligt pigment er også pH-føIsomt og viser de samme ændringer, som er angivet for bagsi-15 dens myceliumpigment.

3. Biologiske og fysiologiske egenskaber.

1. Temperaturbehov (på Bennett-agar skråkulturer) vækst fra 15 til 40°C (optimum ved 28°C) 2. Gelatinesmeltning (på glucose-pepton-gelatinestik) 20 negativ 3. Hydrolyse af stivelse (på stivelse-uorganiske salte-agar) positiv 4. Indvirkning på mælk koagulering, ingen peptonisering 25 5. Dannelse af melanoidpigment (på tyrosinagar,pepton- gær-jern-agar og trypton-gærekstraktvæske) positiv meget svag eller slet ikke på tyrosinagar 148809 g 6. Udnyttelse af forskellige kulstofforbindelser (på Pridham-Gottlieb basalt agarmedium) L-arabinose + D-xylose + 5 L-rhamnose + D-glucose + D-fructose * D-mannose + D-galactose + 10 saccharose + lactose + maltose + raff i nose * inulin ± 15 cellulose chitin glycerol + D-mannitol + salicin + 20 inositol +

Na-acetat Na-citrat +

Na-succinat +

Symbolforklaring: + = god udnyttelse, ± = tvivlsom udnyttelse, - = ingen 25 udnyttelse.

Stoffet FR-900156.

Stoffet FR-900156 produceres, når den FR-900156-producerende stamme hørende til arten Streptomyces olivaceogriseus, f.eks. nov. sp.

C-353, eller Streptomyces violaceus dyrkes i et næringsmedium inde-30 holdende kilder til assimilerbart kulstof og nitrogen under aerobe betingelser (f.eks. rystekultur eller submers kultur).

De foretrukne kulstofkilder i næringsmediet er carbon hydrater såsom glucose, fructose, glycerol og stivelse. Andre kilder, der kan anvendes, er lactose, arabinose, xylose, dextrin og melasse.

148808 ΊΟ

De foretrukne nitrogen kilder er gærekstrakt, pepton, glutenmel, bomuldsfrømel, sojabønnerne), majsstøbevand, tørret gær og hvedekim, samt uorganiske og organiske nitrogenkilder såsom ammoniumsalte (f.eks. ammoniumnitrat, ammoniumsulfat og ammoniumphosphat), 5 urinstof og aminosyrer.

Selv om de fordelagtigt anvendes i kombination, behøver kulstof- og nitrogenkilderne ikke at anvendes i deres rene form, idét mindre rene materialer, som indeholder spor af vækstfaktorer og betydelige mængder mineralstoffer, også kan anvendes. Om ønsket kan der til mediet 10 sættes mineralsalte såsom calciumcarbonat, natrium- eller kaliumphos-phat, natrium- eller kaliumchlorid, magnesiumsalte og kobberforbindelser. Om nødvendigt kan der, især når kulturmediet skummer meget, tilsættes et skumdæmpende middel, f.eks. flydende paraffin, en fedtolie, en planteolie, en mineralolie eller silicone.

15 Som i tilfælde af de foretrukne metoder, der anvendes ved fremstilling af andre antibiotika i store mængder, foretrækkes submerse aerobe kulturbetingelser til fremstilling af stoffet FR-900156 i store mængder.

Til fremstilling i små mængder anvendes en ryste- eller overfladekultur i en kolbe eller flaske. Når væksten desuden sker i store tanke, 20 foretrækkes det at anvende den vegetative form af organismen til podning i produktionstanke for at undgå vækstforsinkelse i fremstillingen af stoffet FR-900156. Det er derfor ønskeligt først at fremstille et vegetativt inokulum af organismen ved at pode en relativt lille mængde af kulturmediet med sporer eller mycelium af organismen og 25 dyrke dette og derefter overføre det dyrkede vegetative inokulum aseptisk til store tanke. Det medium, i hvilket det vegetative inokulum fremstilles, er i det væsentlige det samme som eller forskelligt fra det medium, der anvendes til fremstilling af stoffet FR-900156.

Agitation og beluftning af kulturblandingen kan udføres på forskellig 30 måde. Agitation kan udføres af en propeller eller lignende mekanisk agitationsudstyr, ved en frem- og tilbagegående bevægelse eller rystning af fermenteringsbeholderen, af forskelligt pumpeudstyr eller ved at lede steril luft gennem mediet. Beluftning kan udføres ved at lede steril luft gennem fermentationsblandingen.

148809 11

Fermenteringen udføres sædvanligvis ved en temperatur mellem ca. 20 og 40°C, fortrinsvis ved 30°C, i en periode på mellem 50 og 100 timer.

Stoffet FR-900156 kan isoleres fra kulturmediet på de sædvanlige 5 måder, der normalt anvendes til isolering af andre kendte antibiotika.

Generelt findes størstedelen af stoffet FR-900156 i kulturvæsken, hvorfor stoffet FR-900156 kan udskilles fra filtratet, som fås ved at filtrere eller centrifugere kulturvæsken, ved sædvanlige metoder såsom inddampning under reduceret tryk, lyofilisering, indstilling af 10 pH-værdien, behandling med en harpiks (f.eks. en anion- eller kat-ion-bytterharpiks eller en ikke-ionisk adsorptionsharpiks), behandling med en adsorbent (f.eks. aktivkul, kiselsyre, silicagel, cellulose eller aluminiumoxid), krystallisation eller omkrystallisation.

Det i kulturvæsken fremstillede stof FR-900156 kan isoleres i fri form, 15 dvs. stoffet FR-900156 per se, og når opløsningen eller koncentratet deraf indeholdende stoffet FR-900156 behandles med en base, dvs. med en uorganisk base såsom en alkalimetalforbindelse (f.eks. natriumhydroxid, natriumcarbonat, natriumhydrogencarbonat eller kaliumhydroxid), en jordalkalimetalforbindelse (f.eks. calciumhydroxid eller 20 magnesiumhydroxid), ammoniak eller med en organisk base (f.eks.

ethanolamin, triethylamin eller dicyclohexylamin); eller med en syre, dvs. med en uorganisk syre (f.eks. saltsyre, svovlsyre eller phos-phorsyre) eller med en organisk syre (f.eks. myresyre, eddikesyre, p-toluensulfonsyre, citronsyre eller vinsyre) under fremgangsmåden, 25 f.eks. ekstraktion, isolering eller rensning, kan stoffet FR-900156 omdannes til og isoleres i form af de tilsvarende salte. Alternativt kan de således fremstillede salte af stoffet FR-900156 let omdannes til fri form, dvs. stoffet FR-900156 per se, på sædvanlig måde.

Endvidere kan det i fri form vundne stof FR-900156 omdannes til 30 tilsvarende salte med en base eller en syre på sædvanlig måde som ovenfor anført.

148809 12

Stoffet FR-900156 har de nedenfor anførte fysiske og kemiske egenskaber (de nedenfor anførte data er fra det produkt, der er fremstillet ved eksemplet på fermentering (3)): I) Form og farve: hvidt pulver 5 2) Stoffets natur: amfotert 3) Farvereaktion: positiv; hver reaktion med ninhydrin, kaliumpermanganat og svovlsyre negativ: Dragendorf's reaktion og Ehrlich-reaktion 10 4) Opløselighed: opløselig i vand, tungtopløselig i methanol, uopløselig i ethanol, acetone, ethylacetat, benzen, hexan og chloroform.

15 5) Smeltepunkt 143 - 148°C (sønderdeling) 6) Specifik drejning: [a]^ = -27,1° (c = 0,4 i vand).

7) Ultraviolet absorptionsspektrum: slutabsorption 8) iR-Absorptronsspektrum (KBr): 1050, 1130, 1235, 1340, 1400, 1450, 1535, 1660, 1735, 2950, 2980, 3080 og 3350 cm-1 20 9) Elementaranalyse: kvalitativ analyse viser, at stoffet FR-900156 indeholder følgende grundstoffer: kulstof, hydrogen, nitrogen og oxygen 10) Tyndtlagschromatografi:

Stationær fase Fremkaldningsmiddel R^-vaerdi 25 _

Eastman-celluloselag *1 butanol, eddikesyre, 0,35 vand (4:1:2) silicagellag Merck *2 60% isopropanol-vand 0,65 30 *1: Handelsnavn, fremstillet af Eastman Kodak Co.

*2: Handelsnavn, fremstillet af Merck & Co.

II) Molekylvægt: massespektrometri (feltdesorptionsmetode): M=519 (basespids: M+1=520) 12) NMR-absorptionsspektrum: vist i figuren på vedlagte tegning 35 (opløsningsmiddel: D2O, reference: TMSP) 148809 13 13) Aminosyreanalyse:

Molforhold

Glycin 1,00

Glutaminsyre 1,06 5 Alanin 1,04 α,ε-diaminopimelinsyre 1,03 (molforhold udtrykkes ved at sætte glycin = 1,00) 14) Molekylarformel: .j.

10 Der er endvidere målt fysiske og kemiske egenskaber på en mere renset prøve af FR-900156 (dvs. et produkt, der er fremstillet ved et fermenteringseksempel (4)), hvilket viser et smeltepunkt på 147 -153JC (sønderdeling), hvorhos andre egenskaber var de samme som ovenfor angivet.

15 Ud fra analyse af de ovenfor anførte fysisk-kemiske egenskaber og yderligere undersøgelser med henblik på fastlæggelse af den kemiske struktur er denne blevet fastlagt for stoffet FR-900156 at være følgende: OH CH„ I I ° CD)

CH3CHC0NHCHC0NHCHC00H

CD) (L) L· CH0 I CL)

C0NH(jHC0NHCH2C00H

CH,

Jh I 2 CH- i 2

H2NCHC00H

CD) (D-Lactoyl-L-alanyl-y-D-glutamyl-(L)-meso-diaminopimelyl-(L)-glycin).

148809 14

Biologiske egenskaber ved stoffet FR-900156.

Stoffet FR-900156 og de farmaceutisk tolerable salte deraf har vist sig at forøge aktiviteten i immunresponset (dvs. forøge aktiviteten af cellulær immunitet og humoral antistofdannelse) og det reticuloen-5 dotheliale system, forøge aktiviteten af blodstrømmen for kul, den mitogene aktivitet, inducere interferonaktivitet, den beskyttende virkning mod eksperimentel infektion, og have anti-cancervirkning.

Stoffet FR-900156 og de farmaceutisk tolerable salte deraf kan derfor anvendes til terapeutisk behandling af infektionssygdomme forårsaget 10 af påtogene mikroorganismer, især gramnegative bakterier og grampositive bakterier og fungi, og af cancer i mennesker og dyr.

Med henblik på at vise farmaceutisk udnyttelse af stoffet FR-900156 er der nedenfor anført farmakologiske testdata.

1. Forøgelse af aktiviteten af den cellulære immunitet og den humorale 15 antistofdannelse.

Til marsvin i grupper på fem blev administreret 0,1 ml Freund's ukomplette adjuvans-emulsion indeholdende 500 ug ovalbumin i trædepuderne på begge bagben. Til kontrolgrupper blev der givet antigen i Freund’s ukomplette adjuvans, medens testgrupperne fik antigenet 20 med stoffet FR-900156 i Freund’s ukomplette adjuvans. Dyrene blev underkastet en hudprøve den 14. dag, og der blev tappet blod den 16. dag.

Resultaterne er anført i nedenstående tabel I.

Tabel I

25 Dosis (yg/ Cellulær immunitet Humoral immunitet sted) hudreaktioner *1 hæmmagglutina- hæmolysintiter (mm diameter, tionstiter *2 *2 M±S.E.) (M±S.E.) (M±S.E.) (log2) (log2) 30 ___—— 0 0 9,1 ± 0,19 4,5 ± 0,45 0,1 8,2 ± 2,8 *3 9,9 ± 0,10 *3 6,4 ± 0,76 148809 15 tabel I fortsat 1 14,5 t 2,1 *3 11,5 ± 0,61 *3 7,7 t 0,64 *3 10 11,0 ± 1,3 *3 12,2 ± 0,56 *3 7,1 t 0,58 *3 100 4,2 t 1,7 *3 10,0 t 1,01 5,9 t 0,89 5 ___ *1: Hudtesten blev udført på ryggen ved intradermal injektion af 5 yg antigen opløst i 0,1 ml saltvand. Hudreaktionen på teststedet blev målt efter 48 timer.

*2: Antistofbestemmelsen blev udført på følgende måde: 10 Ovalbuminovertrukne røde fåreblodlegemer blev fremstillet med chromchlorid. Antistoftiteren blev udtrykt som den reciprokke værdi af den største fortynding af serum, som fremkaldte tærskelhæmagglutination og hæmolysin.

Resultaterne blev omdannet til log2_enhed.

15 *3: Signifikansen blev udregnet ved Student's t-test; P<0,05.

2. Mitogen aktivitet på miltceller fra mus. (Materialer og metoder).

1) Dyr: Mus til dette forsøg var hanmus af stammen BALB/C, 13 uger gamle (test 1) eller hunmus af stammen BALB/C, 9 uger gamle (test 20 2).

2) Vævskulturmedium: Det anvendte vævskulturmedium var et komplet medium kaldet Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640. Alle anvendte medier indeholdt 100 enheder/ml penicillin G og 100 yg/ml streptomycinsulfat og 10% føtalt kalveserum.

25 3) Cellefremstilling: Miltene blev fjernet under sterile betingelser, vasket med Hanks opløsning og derefter kradset op i vævskulturmediet. Cellerne blev suspenderet i vævskulturmediet til et indhold på 8 x 10^ celler/ml. 1

Dyrkningsbetingelser: I hvert hul i en mikrotest II vævskultur-30 plade (8 x 12 huller) (fremstillet af Falcon Plastics Co.) blev hældt 148809 16 0,1 ml af den ovennævnte cellesuspension og 0,1 ml af det foreskrevne koncentrat af testforbindelsen som beskrevet nedenfor, hvorefter kulturen blev inkuberet, tre for hver test, ved 37°C i fugtig atmosfære (95% luft, 5% CO2) i 48 timer. Kontrol kulturen indeholdt 0,1 ml 5 af kulturmediet i stedet for mediet indeholdende testforbindelsen.

5) [H]-Thymidinoptagelse: I alle tests blev der sat 20 yliter af en 10 mikro-curie (μ Ci)/ml tritieret thymidin (3H-thymidin) i hvert hul i de sidste 24 timer af dyrkningen. Efter endt dyrkning blev de resulterende celler filtreret med et filterpapir, Whatman GF83, og vasket 10 først med saltvand og derefter med 5% trichloreddikesyre. Filterpapiret blev tørret og anbragt i en scintillator (1 liter toluen indeholdende 0,1 g p-bis(5-phenyloxazoyl)benzeh og 4 g 2,5-diphenyloxa-zoyl), og 3H-thymidinet inkorporeret i DNA blev målt.

6) Stimulationsindeks: 15 3H-thymidinoptagelse (net cpm) ved behandling

Stimulationsindeks - 3H-thymidinoptagelse (net cpm) ved kontrol 7) Testforbindelse: Stoffet FR-900156.

Resultaterne ér anført i nedenstående tabel .11:

Tabel il 20 Koncentration (yg/ml) 3H-thymidinoptag- Stimulationselse net cpm: indeks gen nemsn it±S. E.

TOO 2028 ± 89 4^T

25 10 1486 + 120 3,6

Test 1 1 835 + 64 2,0 0 417 ± 13 1,0

100 ~ 3666 + 42 r 4J

30 10 3223 ± 402 3,6

Test 2 1 2741 ± 319 3,0 0 901 ± 105 1,0 3. Beskyttelsesevne ved eksperimentel infektion i mus.

148809 17

Til bestemmelse af beskyttelsesevnen mod eksperimentel infektion i mus blev stoffet FR-900156 opløst og fortyndet i sterilt vand til dannelse af tredobbelte koncentrationer af stoffet til afprøvning.

6 uger gamle hanmus af stammen DDY og med en gennemsnitsvægt på 5 24 - 26 g blev anvendt i grupper på hver 4 mus.

Kulturer, der har stået natten over, af Escherichia coli nr. 22 i Difco Næringsvæske blev fortyndet til 1/100 i frisk medium og inkuberet ved 30°C under rystning. Når der var opnået en celletæthed på 1 x

O

10 /ml, blev 0,2 ml af kulturen injiceret intraperitonealt. Alle de dyr, 10 som blev inficeret og ikke behandlet med medikamentet, døde i løbet af 48 timer efter infektionen.

0,2 ml af opløsningen indeholdende stoffet FR-900156 blev injiceret subcutant 1, 4, 5 og 6 dage før infektionen.

To dage efter infektionen blev testen bedømt som værende færdig, og 15 overlevelsesgraden blev bestemt på dette tidspunkt. Forsøgsresultaterne er vist i nedenstående tabel III.

Tabel III

Dosis (mg/mus/dag) Overlevede/inficerede 20 0,01 10/10 0,003 10/10 0,001 10/10 0,0003 8/10 0,0001 4/10 25 Kontrol 0/10 1

Anti-cancervirkning.

6 uger gamle hunrotter af stammen Donru blev anvendt i grupper på hver 3 rotter.

18 148809

En suspension af ascites hepatoma AH 66 i 0,5 ml Hank's opløsning blev transplanteret intraperitonetalt i en mængde på 5 x 10^ celler/ rotte. Ca. 13 dage’ senere var alle kontroldyrene døde af ascites. Forlængelse af overlevelsestiden i sammenligning med kontrolværdierne 5 er kriteriet for virkning.

Terapi blev givet 5, 6, 7, 8 og 9 dage før tumortransplantationen.

Stoffet FR-900156 blev opløst og fortyndet i sterilt saltvand for at give tre ganges fortyndinger til afprøvning, og disse sterile saltopløsninger af stoffet FR-900156 blev givet intraperitonealt til dyrene.

10 Resultaterne er anført i nedenstående tabel IV

Tabel IV

Dosis (mg/rotte/dag) Levetid (dage) 1,0 14, >30, >30 15 0,3 13, >30 >30 0,1 13, >30 >30 0,03 13, 13, 13

Kontrol (saltvand) 13, 13, 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 5. Blodstrømmens kulstofclearence.

2

Reagenser: 3 1. Kulstofsuspension.

4

Rotring-tegnetush (170 mg kulstof/ml) blev fortyndet til 1/5 af den 5 oprindelige koncentration i saltvand indeholdende 1% gelatine.

6 2. 0,1%'s vandig natriumcarbonatopløsning. Fremgangsmåde: 7

Hanmus (DDY 5 - 6 W) blev injiceret via halevenen med en dosis på 8 0,01 ml kulstof/g legemsvægt. Blodprøver blev udtaget ved hjælp af 9 en spids kapillarpipette kalibreret til at indeholde 50 yliter og i for 10 vejen vasket med heparin. Denne var stukket ind i den retroorbitale 11 venesinus ved øjets næsevinkel. Prøverne blev udtaget det 3. og 6.

19 U8809 minut. Blodet blev øjeblikkelig hældt ud i 3,0 ml natriumcarbonatop-løsning. Derved hæmolyseredes blodet og muliggjorde kvantitativ måling af kulstof. Prøverne blev derefter aflæst i et spektrofotometer ved 660 nm, og den logaritmiske koncentration blev bestemt fra en i 5 forvejen fremstillet standardkurve. Clearanceværdien K kan bestemmes ved at afbilde den logaritmiske kulstofkoncentration som funktion af tiden på følgende måde: (log C,| - log C2) K = - 10 T2 - t1 hvor T.j og T2 betegner den tid i minutter, hvor prøven blev udtaget, og C.j og C2 betegner koncentrationerne af kulstof i blodet til henholdsvis tidspunkt og T2-

Undersøgelse af virkningen af stoffet FR-900156 på ku I stof clearance.

15 De vandige opløsninger af medikamentet blev administreret subcutant til mus. 24 timer efter blev blodstrømmens kulstofclearance målt. De fra behandlede mus målte K-værdier blev sammenlignet med værdierne fra kontrolmus. Resultaterne er anført i nedenstående tabel V.

Virkningen af forskellige medikamenter på kulstofclearance.

20 Tabel V

Medikament Dosis Kbehandlet/Kkontrol (mg/mus)

Krestin 10 1,1 25 1 1,0

Levamisol 10 - (død) 1 0,5

Tuftsin 400 1,4 125 1,0 148809 20

Tabel V fortsat FR-900156 0,25 2,9 0,06 1,5

Kontrol (saltvand) 1,0 5 _ 6. Induktion af interferonaktivitet.

4-6 uger gamle hanmus af stammen ICR blev anvendt til disse forsøg. Milten fra disse mus blev fjernet, og miltcellernes evne til at producere interferon in vitro ved behandling med stoffet FR-900156 10 blev undersøgt.

Der blev fremstillet enkelte miltcellesuspensioner i mediet RPMI-1640 suppleret med streptomycin (100 %/ml), penicillin G (100 2f/ml), 1% _5 glutaminsyre og 2-mercaptoethanol (5 x 10 M).

Disse suspensioner blev dyrket ved 37°C ved koncentrationer på 4 x 15 107 celler/ml med eller uden stoffet FR-900156 opløst i kulturmediet (dosis: 100, 10, 1 yg/ml). Efter 24 timers forløb blev den overstående væske fra disse kulturer indsamlet, og interferonaktiviterne blev titreret med cytopatisk virkning (CPE)-inhiberingstest i L-celle-VSV-system. Den antivirale titer blev udtrykt i lU/ml baseret på stan-20 dard-interferon.

Resultaterne er anført i nedenstående tabel VI.

Tabel VI

Dosis (ug/ml) IF-titer (lU/ml) 1 100 14 10 16 1 10 0 <6,5 148809 21 7. Akut toxicitet i mus.

1 g/kg intravenøst: ingen toxicitet.

8. Celletoxicitet (muse-L-celler).

500 yg/ml: ingen toxisk virkning.

5 Til terapeutisk administration kan FR-900156 og de farmaceutisk tolerable salte deraf formuleres til administration på en hvilken som helst bekvem måde, f.eks. i form af et farmaceutisk præparat indeholdende det aktive stof i blanding med et ikke-toxisk, farmaceutisk tolerabelt bærestof.

10 Et farmaceutisk tolerabelt salt af stoffet FR-900156 kan være et salt med en uorganisk eller organisk base, f.eks. natriumsaltet, kaliumsaltet, calciumsaltet, ammoniumsaltet, ethanolaminsaltet, triethylamin-saltet og dicyclohexylaminsaltet, eller et syreadditionssalt med en organisk eller uorganisk syre, f.eks. myresyresaltet, eddikesyresal-15 tet, p-toluensulfonsyresaltet, citronsyresaltet, vinsyresaltet, saltsyresaltet, svovlsyresaltet og phosphorsyresaltet.

De omhandlede farmaceutiske præparater kan anvendes i f.eks. fast, halvfast eller flydende form, som indeholder det aktive stof i blanding med et organisk eller uorganisk bærestof eller en organisk eller 20 uorganisk excipiens, der er egnet til ekstern, enteral eller parenteral applikation. Den aktive bestanddel kan f.eks. kombineres med sædvanlige ikke-toxiske, farmaceutisk tolerable bærestoffer til tabletter, piller, kapsler, suppositorier, opløsninger, emulsioner, suspensioner og andre former til anvendelse. Bærestofferne kan være vand, glu-25 cose, lactose, gummi acacia, gelatine, mannitol, stivelsespasta, magne-siumtrisilicat, talkum, majsstivelse, keratin, kolloidt siliciumdioxid, kartoffelstivelse, urinstof og andre bærere, der er egnet til at fremstille præparater i fast, halvfast eller flydende form, som foruden kan indeholde hjælpestoffer, stabiliseringsmidler, fortykkelsesmidler og 30 farve- og duftstoffer. De farmaceutiske præparater kan også indeholde konserveringsmidler eller bakteriostatiske midler for at holde den 148809 22 aktive bestanddel i det ønskede præparat stabil med hensyn til aktivitet. Den aktive forbindelse inkorporeres i farmaceutiske præparater i en mængde, der er tilstrækkelig til at fremkalde den ønskede terapeutiske virkning, alt afhængig af sygdommen eller tilstanden.

5 Til administration af præparaterne til mennesker foretrækkes det at indgive dem ad intravenøs, intramuskulær eller oral vej. Dosen eller den terapeutisk virksomme mængde af den omhandlede forbindelse varierer og afhænger af alderen og tilstanden hos den patient, der skal behandles, hvorhos en daglig dosis på ca. 2 - 100 mg af den 10 aktive bestandde|/kg legemsvægt for mennesket eller dyret almindeligvis gives til behandling af sygdomme, almindeligvis administreret i en gennemsnitlig enkelt dosis på ca. 50 mg, 100 mg, 250 mg eller 500 mg.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående 15 eksempel:

EKSEMPEL

Fermentering: 1) Et vegetativt medium 1 (pH-værdi 7,0) fremstilles ud fra følgende bestanddele: 20 Vegetativt medium 1

Opløselig stivelse 2 vægtprocent

Glutenmel 1 vægtprocent Tørret gær 1 vægtprocent

Majsstøbevand 1 vægtprocent 25 Ledningsvand q.s.

100 ml af medium 1 i hver af 10 500 ml's kolber steriliseres på sædvanlig måde og podes derefter med et øjefuld af en kultur fra en stam-skrå kultur Streptomyces olivaceogriseus ATCC 31427. Organismen dyrkes i mediet ved 30°C i 48 timer på et rysteapparat.

148809 23 I en 30-liters fermenteringsbeholder hældes 20 liter af det vegetative medium 2 fremstillet ud fra følgende bestanddele:

Vegetativt medium 2

Opløselig stivelse 2 vægtprocent 5 Bomuldsfrømel 0,5 vægtprocent

Glutenmel 0,5 vægtprocent Tørret gær 0,5 vægtprocent

Majsstøbevand 0,5 vægtprocent

Ledningsvand q.s.

10 - Det vegetative medium 2 (pH-værdi 7) steriliseres på sædvanlig måde og podes derefter aseptisk med hele rumfanget af den på den ovenfor beskrevne måde fremstillede måde vegetative inokulumkultur. Organismen dyrkes i medium 2 ved 30°C i 24 timer.

Hele rumfanget af det således fremstillede vegetative inokulum over-15 føres aseptisk til en 2000-liters fermenteringsbeholder indende 1600 liter fermentationsmedium fremstilles ud fra følgende bestanddele:

Opløselig stivelse 2 vægtprocent

Bomuldsfrømel 0,5 vægtprocent

Hvedekim 0,5 vægtprocent 20 Tørret gær 0,25 vægtprocent

Majsstøbevand 0,25 vægtprocent K^PO^ 0,5 vægtprocent is^HPO^.^ ^O 0,5 vægtprocent ΟοΟ^.δ H2O 1,25 mg/liter 25 Ledningsvand q.s.

Organismen dyrkes i fermenteringsmediet i 72 timer ved 30°C. I vækstperioden omrøres væsken med en propeller ved 170 rpm, og der ledes steril luft igennem dyrkningsvæsken med en hastighed på 1600 liter/minut. 1

Efter endt fermentering sættes 20 kg "Radiolite" (handelsnavn, filterhjælpestof solgt af Showa Chemical Company, Japan) til kulturvæsken, og blandingen filtreres til fjernelse af myceliet. 1600 liter af filtratet ledes gennem en 800 liters kolonne med aktivkul og vaskes derefter 148809 24 med 1600 liter vand. Elueringen udføres med 3000 liter 50%'s vandigt acetone, hvorefter eluatet inddampes til et rumfang på ca. 600 liter.

Koncentratet hældes gennem en kolonne med 200 liter DEAE-"Se- phadex"® (Pharmacia A.B.), som i forvejen er pufret med phosphat- 5 puffer, pH-værdi 6,0. Kolonnen vaskes successivt med 200 liter vand og 200 liter 0,1M natriumchloridopløsning og elueres derefter med 400 liter 0,3M natriumchloridopløsning. Det vandige eluat ledes gennem en kolonne med 200 liter aktivkul, vaskes med 200 liter vand og elueres derefter med 400 liter 50%'s vandigt acetone. Eluatet inddampes og 10 frysetørres, hvorved der fås 800 g af et hvidt pulver. Pulveret opløses i 25 liter vand, og opløsningen ledes gennem en kolonne med + 25 liter CM-"Cephadex"® (H -form). Kolonnen elueres med 25 liter vand, og eluatet inddampes og frysetørres, hvorved der fås 33 g gulligt-hvidt pulver. Pulveret anbringes på toppen af en 1,2-liters 15 cellulosekolonne. Kolonnen vaskes med 1000 ml 70%'s vandigt propanol og elueres derefter med 1000 liter 60%'s vandigt propanol. Eluatet inddampes og frysetørres, hvorved der fås 4 g af et hvidt pulver.

Pulveret opløses i 150 ml vand, hvorefter opløsningen underkastes kolonnechromatografi på "Sephadex"® G-15 (2,8 liter).

20 Kolonnen fremkaldes og elueres med vand. De aktive fraktioner opsamles, inddampes og frysetørres, hvorved der fås 4 g af et hvidt pulver. Pulveret opløses i 25 ml vand, og opløsningen underkastes kolonnechromatografi på CM-"Sephadex"® (H -form), (400 ml). Kolonnen fremkaldes og elueres med vand. De aktive fraktioner opsamles, 25 inddampes og frysetørres, hvorved der fås 40 mg af stoffet FR-900156 i form af et hvidt pulver (renhed: ca. 70%).

2) Fermentering udføres på samme måde som beskrevet under I).

Efter endt fermentering sættes 20 kg "Radiolite" (handelsnavn, filterhjælpestof fra Showa Chemical Company) til kulturvæsken, og blan-30 dingen filtreres til fjernelse af mycelium. 1600 liter af filtratet ledes gennem en kolonne af 800 liter aktivkul og vaskes derefter med 1600 liter vand. Eluering udføres med 3000 liter 50%'s vandigt acetone, hvorefter eluatet inddampes til ca. 600 liter. Koncentratet hældes gennem en kolonne af DEAE-"Sephadex"® (Pharmacia A.B.) (200 148809 25 liter), som i forvejen er puf ret til pH-værdi 6,0 med phosphatpuffer.

Kolonnen vaskes successivt med 200 liter vand og 200 liter 0,IM natriumchloridopløsning og elueres derefter med 400 liter 0,3M natri-umchloridopløsning. Det vandige eluat hældes gennem en kolonne med 5 200 liter aktivkul, vaskes med 200 liter vand og elueres derefter med 400 liter 50%’s vandigt acetone. Eluatet inddampes og frysetørres, hvorved der fås 800 g af et hvidt pulver. Pulveret opløses i 25 liter vand, og opløsningen hældes gennem en kolonne med 25 liter CM-"Se-phadex"® (H -form). Kolonnen elueres med 25 liter vand, og eluatet 10 inddampes og frysetørres, hvorved der fås 33 g af et gulligt-hvidt pulver. Pulveret anbringes på . toppen af en cellulosekolonne (1,2 liter). Kolonnen vaskes med 1000 ml 70%'s vandigt propanol og elueres derefter med 1000 ml 60%'s vandigt propanol. Eluatet inddampes og frysetørres, hvorved der fås 4 g af et hvidt pulver. Pulveret opløses 15 i 300 ml vand og hældes derefter gennem en kolonne med DEAE-"Se-phadex"® (Pharmacia A.B.) (1,4 liter), som i forvejen er puf ret til pH-værdi 6,0 med phosphatpuffer. Kolonnen vaskes med 1,5 liter 0,IM natriumchloridopløsning og elueres derefter med 3 liter 0,2M natriumchloridopløsning. De aktive fraktioner opsamles og hældes derefter 20 gennem en kolonne med 300 ml aktivkul. Kolonnen vaskes med vand og elueres derefter med 800 ml 50%'s vandigt acetone. Eluatet inddam pes og frysetørres, hvorved der fås 700 mg af et hvidt pulver.

Pulveret opløses i 20 ml vand og hældes derefter på en kolonne med 500 ml CM-"Sephadex"® (H -form). Kolonnen elueres med vand, og de 25 aktive fraktioner opsamles og inddampes, hvorved der fås 10 ml koncentrat. Koncentratet underkastes søjlechromatografi på 500 ml "Sephadex" G 15 og fremkaldes med vand. De aktive fraktioner opsamles, inddampes og frysetørres, hvorved der fås 70 mg af et hvidt pulver. Pulveret opløses i 25 ml vand og underkastes præparativ 30 tyndtlagschromatografi på cellulose (fremstillet af Eastman Kodak Co.) med en blanding af butanol, eddikesyre og vand i forholdet 4:1:2 som fremkaldningsmiddel. Elueringen udføres med 50 ml vand, og eluatet inddampes og frysetørres, hvorved der fås 20 mg af stoffet FR-900156 i form af et hvidt pulver. 1 3) Fermenteringen udføres på samme måde som beskrevet under 1).

Efter endt fermentering sættes 20 kg "Radiolite" til kulturvæsken, og 148809 26 blandingen filtreres til fjernelse af mycelium. 1600 liter af filtratet ledes gennem en kolonne med 800 liter aktivkul og vaskes derefter med 1600 liter vand. Elueringen udføres med 3000 liter 50%'s vandigt acetone, hvorefter eluatet inddampes til et rumfang på ca. 600 liter.

5 Koncentratet hældes på en kolonne med 200 liter DEAE-"Sephadex"®, som i forvejen er pufret til pH-værdi 6,0 med phosphatpuffer. Kolonnen vaskes successivt med 200 liter vand og 200 liter 0,1M natrium-chloridopløsning og elueres med 400 liter 0,3M natriumchloridopløs-ning. Det vandige eluat ledes gennem en kolonne med 200 liter aktiv-10 kul, vaskes med 200 liter vand og elueres derefter med 400 liter 50%'s vandigt acetone. Eluatet inddampes og frysetørres, hvorved er fås 800 g af et hvidt pulver. Pulveret opløses i 25 liter vand, og opløsningen hældes gennem en kolonne med 25 liter CM-"Sephadex"® (H -form). Kolonnen elueres med 25 liter vand, og eluatet inddampes 15 og frysetørres, hvorved der fås 33 g af et gulligt-hvidt pulver.

Pulveret anbringes på toppen af en cellulosekolonne (1,2 liter).

Kolonnen vaskes med 1000 ml 70%'s vandigt propanol og elueres derefter med 1000 ml 60%’s vandigt propanol. Eluatet inddampes og frysetørres, hvorved der fås 4 g fint hvidt pulver. Pulveret opløses i 300 20 ml vand og hældes derefter gennem en kolonne med 1,4 liter DEAE-"-Sephadex"®, som i forvejen er puf ret til pH-værdi 6,0 med phosphatpuffer. Kolonnen vaskes med 1,5 liter 0,1M natriumchloridopløsning og elueres derefter med 300 liter 0,2M natriumchloridopløsning. De aktive fraktioner isoleres og hældes derefter gennem en kolonne med 300 ml 25 aktivkul. Kolonnen vaskes med vand og elueres derefter med 800 ml 50%'s vandigt acetone. Eluatet inddampes og frysetørres, hvorved der fås 700 mg hvidt pulver. Pulveret opløses i 20 ml vand og hældes derefter gennem en kolonne med 500 ml CM-"Sephadex"® (H -form).

Kolonnen elueres med vand, og de aktive fraktioner opsamles og 30 inddampes, hvorved der fås 10 ml koncentrat. Koncentratet frysetørres, hvorved der fås 400 mg pulver. Pulveret anbringes på toppen af en cellulosekolonne (500 ml). Elueringen udføres med en blanding af n-butanol, eddikesyre og vand i forholdet 4:1:2. De aktive fraktioner opsamles og frysetørres, hvorved der fås 200 mg af et pulver.

35 Pulveret opløses i 7 ml vand og anbringes på 250 ml "Sephadex"® G

15. De aktive fraktioner opsamles, inddampes og frysetørres, hvorved der fås 100 mg af stoffet FR-900156 i form af et hvidt pulver.

148809 27 4) Et hvidt pulver af stoffet FR-900156 fremstillet som beskrevet under 3) renses yderligere ved at gennemføre den ovenfor angivne rensningsteknik gentagne gange til dannelse af et mere renset produkt af stoffet FR-900156.

5 5) 100 ml af et medium indeholdende 2 vægtprocent majsstivelse, 1% glutenmel, 1% tørret gær og 1% majsstøbevand hældes i hver af ti 500 ml's kolber og steriliseres på sædvanlig måde, hvorefter der podes med et øjefuld af en kultur fra en stam-skråkultur af Streptomyces violaceus ATCC 31481.

10 Organismen dyrkes i mediet ved 30°C i 48 timer på et rysteapparat.

I en 30 liters fermenteringsbeholder anbringes 20 liter af samme medium som ovenfor. Mediet steriliseres på sædvanlig måde og podes derefter aseptisk med hele rumfanget af inokulumkulturen, der er fremstillet som ovenfor. Organismen dyrkes i mediet ved 30°C i 30 15 timer.

Hele volumenet af det således fremstillede inokulum overføres aseptisk i en 400 liters fermenteringsbeholder indeholdende 320 liter af et medium med pH-værdi 6,5 og indeholdende 2 vægprocent opløselig stivelse, 1% glutenmel, 1% bomuldsfrømel og 2% natriumsulfat-decahy-20 drat.

Organismen dyrkes i mediet ved 30°C i 72 timer. I vækstperioden omrøres væsken med en propeller ved 170 rpm, og der ledes steril luft gennem dyrkningsvæsken med en hastighed på 320 liter/minut.

Efter endt fermentering tilsættes 4 kg "Radiolite" til kulturvæsken, og 25 blandingen filtreres til fjernelse af mycelium. 300 liter af filtratet ledes gennem en kolonne med 150 liter aktivkul og vaskes med 300 liter vand. Elueringen udføres med 600 liter 50%'s vandigt acetone, hvorefter eluatet inddampes til et volumen på ca. 120 liter.

Koncentratet hældes gennem en kolonne med 30 liter DEAE-"Sepha-30 dex"®, som i forvejen er pufret med phosphatpuffer (pH-værdi 6,0).

Kolonnen vaskes successivt med 30 liter vand og 30 liter 0,1M natri-

Claims (2)

148809 umchloridopløsning og eiueres derefter med 0,3M natriumchloridopløs-ning. Eluatet (60 liter) hældes gennem en kolonne med 30 liter aktivkul, vaskes med 60 liter vand og eiueres derefter med 60 liter 50%'s vandigt acetone. Eluatet frysetørres, hvorved der fis 120 g af et 5 hvidt pulver. Pulveret opløses i 4 liter vand, og opløsningen hældes gennem en kolonne med 14 liter CM-"Sephadex"® (H -form). Kolonnen eiueres med vand, og eluatet inddampes og frysetørres, hvorved der fås 20 g af et pulver. Pulveret anbringes på toppen af en celluloseko-lonne. Ved eluering med vandigt propanol, opsamling af de aktive 10 fraktioner og frysetørring fås 5 g af et pulver. Pulveret opløses i 500 ml vand, og opløsningen hældes gennem en kolonne med 1,3 liter DEAE-"Sephadex"®, som i forvejen er pufret med phosphatpuffer, pH-værdi 6,0. Kolonnen vaskes med 0,IM natriumchloridopløsning og eiueres med 0,2M natriumchloridopløsning. De aktive fraktioner isole-15 res og hældes gennem en kolonne med 900 ml aktivkul. Kolonnen vaskes med vand og eiueres med 200 ml 50%'s vandigt acetone. Eluatet inddampes og frysetørres, hvorved der fås 1 g af et pulver. Pulveret opløses i 300 ml vand, og opløsningen hældes gennem en kolonne med 250 ml CM-"Sephadex"® (H -form). Kolonnen fremkaldes og eiueres 20 med vand. De aktive fraktioner opsamles, inddampes og frysetørres, hvorved der fås 800 mg af et pulver. Pulveret opløses i 20 ml vand, og opløsningen blandes med en lille mængde cellulose. Blandingen underkastes kolonnechromatografi på cellulose. Kolonnen vaskes successivt med 100 ml acetone og 300 ml af en 4:1:1-blanding af n-buta-25 nol, eddikesyre og vand og fremkaldes og eiueres derefter med 1 liter af en 4:1:2-blanding af n-butanol, eddikesyre og vand. De aktive fraktioner opsamles og frysetørres, hvorved der fås 30 mg af et pulver. Pulveret opløses i 20 ml vand, og opløsningen hældes gennem en kolonne med 250 ml "Sephadex"® G 15. Kolonnen fremkaldes og 30 eiueres med vand, og de aktive fraktioner opsamles og frysetørres, hvorved der fås 5 mg af stoffet FR-900156.

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et lactoyl-tetrapeptid betegnet FR-900156 og med formlen