HRP20040515A2 - Combination of a selective pde4 inhibitor and an adrenergic 2 receptor agonist - Google Patents

Description

Područje izuma

Ovaj izum odnosi se na inhaliranu kombinaciju selektivnog inhibitora PDE4 i adrenegrgičkog agonista β2 receptora, na farmaceutske pripravke, uključujući opremu za primjenu, i na uporabe takvih kombinacija.

Kombinacija selektivnog inhibitora PDE4 i agonista adrenergičkog β2 receptora učinkovita je u liječenju opstruktivnih dišnih putova i ostalih upalnih bolesti, osobito bolesti opstruktivnih dišnih putova astme, kronične opstruktivne bolesti pluća (COPD) i ostalih bolesti opstruktivnih dišnih putova pojačanih uslijed povišenih bronhijalnih refleksa, upale, bronhijalne hiperreaktivnosti i bronhospazma. Kombinacija je osobito učinkovita u liječenju COPD-a.

Primjeri određenih bolesti koje se mogu liječiti ovim izumom uključuju respiratorne bolesti astmu, akutni sindrom respiratornog stresa, kroničnu plućnu upalnu bolest, bronhitis, kronični bronhitis, kroničnu opstruktivnu bolest pluća (dišnih putova), te silikozu i bolesti imuno sustava kao što su alergijski rinitis i kronični sinusitis.

Fosfodiesteraze 3',5'-cikličkog nukleotida (PDEs) čine veliki razred enzima podijeljen u najmanje jedanaest različitih porodica koje se razlikuju jedna od druge strukturno, biokemijski i farmakološki. Enzimi unutar svake porodice uobičajeno se nazivaju izoenzimima ili izozimima. Ukupno više od petnaest genskih produkata uključeno je unutar ovog razreda, a daljnja raznolikost potječe zbog diferencijalnog izrezivanja i post-translacijskih promjena tih genskih produkata. Ovaj izum se u prvom redu bavi s četiri genska produkta iz četvrte PDEs porodice tj., s PDE4A, PDE4B, PDE4C, i PDE4D. O ovim enzimima se zajednički govori kao o izoformama ili podtipovima porodice izoenzima PDE4 (PDE4s).

PDE4s su karakterizirani selektivnom, hidrolitičkom razgradnjom visokog afiniteta drugog glasnika cikličkog nukleotida, adenozin 3',5'-cikličkog monofosfata (cAMP), te osjetljivošću prema inhibiciji rolipramom. Posljednjih godina otkriven je niz selektivnih inhibitora PDE4s-a, i pokazani su korisni farmakološki učinci koji rezultiraju iz te inhibicije na različitim modelnim bolestima: vidi, npr. Torphy i suradnici, Environ. Health Perspect. 102 Suppl. 10, 79-84, 1994; Duplantier i suradnici, J. Med. Chem. 39 120-125, 1996; Schneider i suradnici, Pharmacol. Biochem. Behav. 50 211-217, 1995; Banner i Page, Br. J. Pharmacol. 114 93-98, 1995; Barnette i suradnici, J. Pharmacol. Exp. Ther. 273 674-679, 1995; Wright i suradnici ʺDifferential in vivo and in vitro bronchorelaxant activities of CP-80633, a selective phosphodiesterase 4 inhibitorʺ, Can. J. Physiol. Pharmacol. 75 1001-1008, 1997; Manabe i suradnici ʺAnti-inflammatory and bronchodilator properties of KF19514, a phosphodiesterase 4 and 1 inhibitorʺ, Eur. J. Pharmacol. 332 97-107, 1997; i Ukita i suradnici ʺNovel, potent, and selective phosphodiesterase-4 inhibitors as antiasthmatic agents: synthesis and biological activities of a series of 1-pyridylnaphthalene derivativesʺ J. Med. Chem. 42 1088-1099, 1999.

Adrenergički β receptori pojavljuju se u simpatičkom živčanom sustavu. Postoje najmanje dva tipa. Adrenergički β1 receptori nađeni su u srcu i igraju glavnu ulogu u regulaciji brzine otkucaja srca kroz djelovanje agonista epinefrina i norepinefrina. Adrenergički β2 receptori prisutni su u nizu staničnih tipova u plućima (npr. glatke mišićne stanice dišnog puta, epitelne stanice, i različite upalne stanice) i agonisti adrenergičkog β2 su učinkoviti bronhodilatatori, uzrokujući opuštanje glatkog mišićja dišnog puta. Simpatomimetički amini imaju dugu povijest uporabe u liječenju kroničnih bolesti dišnog puta karakteriziranih djelomično reverzibilnim suženjem dišnog puta kao što su COPD i astma i prvi puta su uporabljeni kao bronhodilatatori u obliku intravenoznog epinefrina. Kasnije, su rabljeni inhalirani β-adrenergički agensi kao što je izoprenalin koji su bili relativno neselektivni za receptor β2 pored β1 i time uzrokovali tahikardiju pri učinkovitim dozama bronhodilatatora. U zadnje vrijeme, rabljeni su β-adrenergički agensi kao što je salbutamol koji su selektivniji za receptor β2, ali kratkog vremena djelovanja. Inhalirani β-adrenergički agensi formoterol, N-[2-hidroksi-5-(1-hidroksi-2-((2-(4-metoksifenil)-1-metiletil)amino)-etil)fenil] formamid, i salmeterol su i selektivni za receptor β2 i dugotrajnog su djelovanja.

Sada je iznenađujuće pronađeno da kombinacije određenih selektivnih inhibitora PDE4 i agonista adrenergičkog β2 receptora pružaju značajne pogodnosti u liječenju opstruktivnih dišnih putova i ostalih upalnih bolesti pred liječenjem putem ili samo jednog agensa ili ostalim poznatim kombinacijama. Prednost ove kombinacije je osiguravanje optimalne kontrole širine dišnog puta kroz mehanizam najpogodniji za patologiju bolesti, naime agonizam adrenergičkog β2 receptora, zajedno s učinkovitim savladavanjem neprikladne upale. Na ovaj način, simptomi bolesti se kontroliraju kroz ispravljanje neprikladnih živčanih refleksa dišnog puta koji potiču kašalj, stvaranje sluzi i otežano disanje. Primjenom kombinacije agonista adrenergičkog β2 receptora i selektivnog PDE4 inhibitora putem inhalacije, ostvaruju se pogodnosti svake skupine bez neželjenih popratnih učinaka. Nadalje, određene kombinacije ovog izuma rezultiraju neočekivanim sinergizmom, stvarajući veću učinkovitost od maksimalno toleriranih doza svake od skupina agensa kada se rabe pojedinačno.

Izum, dakle, donosi inhaliranu kombinaciju (a) selektivnog PDE4 inhibitora formule (I)

[image]

ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvata, gdje:

R1 predstavlja H, (C1-C6) alkil, (C1-C6) alkoksi, (C2-C4) alkenil, fenil, -N(CH3)2, (C3-C6) cikloalkil, (C3-C6) cikloalkil(C1-C3) alkil ili (C1-C6) acil, gdje alkil, fenil ili alkenil skupine mogu biti supstituirane s do dvije -OH, (C1-C3) alkil, ili -CF3 skupine ili s do tri halogena;

R2 i R3 su svaki neovisno odabrani iz skupine koja se sastoji od H, (C1-C14) alkil, (C1-C7) alkoksi(C1-C7) alkil, (C2-C14) alkenil, (C3-C7) cikloalkil, (C3-C7)cikloalkil(C1-C2) alkil, zasićene ili nezasićene (C4-C7) heterocikličke (CH2)n skupine gdje je n 0, 1 ili 2, koje sadrže kao heteroatom jednu ili dvije skupine koje se sastoje od kisika, sumpora, sulfonila, dušika i NR4 gdje R4 predstavlja H ili (C1-C4) alkil; ili skupina Formule (II):

[image]

gdje je a cijeli broj od 1 do 5; b i c su 0 ili 1; R5 predstavlja H, -OH, (C1-C5) alkil, (C2-C5) alkenil, (C1-C5) alkoksi, (C3-C6) cikloalkoksi, halogen, -CF3, -CO2R6, -CONR6R7, -NR6R7, -NO2, ili -SO2NR6R7 gdje R6 i R7 predstavljaju svaki neovisno H, ili (C1-C4) alkil; Z je -O-, -S-, -SO2-, -CO- ili -N(R8)- gdje R8 predstavlja H ili (C1-C4) alkil; i Y je (C1-C5) alkilen ili (C2-C6) alkenilen prema izboru supstituiran s do dvije (C1-C7) alkil ili (C3-C7) cikloalkil skupine; gdje svaka alkil, alkenil, cikloalkil, alkoksialkil ili heterociklička skupina može biti supstituirana s 1 do 14, najpogodnije 1 do 5, (C1-C2) alkil, CF3, ili halo skupinama; i R9 i R10 su neovisno odabrani iz skupine koja se sastoji od H, (C1-C6) alkil, (C1-C6) alkoksi, (C6-C10) aril i (C6-C10) ariloksi;

i (b) agonista adrenergičkog β2 receptora.

Nadalje, izum daje inhaliranu kombinaciju selektivnog PDE4 inhibitora formule (I), kako je definirano gore, i agonista adrenergičkog β2 receptora za uporabu u svojstvu lijeka.

Pored toga, izum donosi inhaliranu kombinaciju selektivnog PDE4 inhibitora formule (I), kako je definirano gore, i agonista adrenergičkog β2 receptora za istovremenu, uzastopnu ili odvojenu primjenu u liječenju opstruktivnih dišnih putova ili drugih upalnih bolesti.

Dalje, izum donosi farmaceutski pripravak koji se sastoji od selektivnog PDE4 inhibitora formule (I), kako je definirano gore, agonista adrenergičkog β2 receptora i farmaceutski prihvatljivog ekscipijensa, diluensa ili nosača, za primjenu putem inhalacije u liječenju opstruktivnih dišnih putova ili drugih upalnih bolesti.

Nadalje, izum donosi uporabu selektivnog PDE4 inhibitora formule (I), kako je definirano gore, ili agonista adrenergičkog β2 receptora u proizvodnji lijeka za istovremenu, uzastopnu ili odvojenu primjenu oba agensa putem inhalacije u liječenju opstruktivnih dišnih putova ili drugih upalnih bolesti.

Pored toga, izum daje postupak liječenja opstruktivnih dišnih putova ili drugih upalnih bolesti koji se sastoji od istovremene, uzastopne ili odvojene primjene, putem inhalacije, u sisavaca kojima je potrebno takvo liječenje, učinkovite količine selektivnog PDE4 inhibitora formule (I), kako je definirano gore, i agonista adrenergičkog β2 receptora.

Dalje, izum donosi opremu za inhalaciju za istovremenu, uzastopnu ili odvojenu primjenu selektivnog PDE4 inhibitora formule (I), kako je definirano gore, i agonista adrenergičkog β2 receptora u liječenju opstruktivnih dišnih putova ili drugih upalnih bolesti.

Selektivni PDE4 inhibitor je onaj koji ima veći afinitet prema PDE4 izoenzimu nego svi ostali poznati PDE izoenzimi. Još pogodnije, afinitet selektivnog PDE4 inhibitora je, prema ovom izumu, najmanje 100 puta veći prema PDE4 izoenzimu u usporedbi s njegovim afinitetom prema drugim PDE izoenzimima.

Pogodniji spojevi formule (I) uključuju one u kojima R1 predstavlja metil, etil ili izopropil i one u kojima R3 predstavlja (C1-C6) alkil, (C2-C6) alkenil, (C3-C7) cikloalkil, (C3-C7)cikloalkil(C1-C6) alkil ili fenil prema izboru supstituiran s 1 ili 2 skupine koje se sastoje od H, -OH, (C1-C5) alkil, (C2-C5) alkenil, (C1-C5) alkoksi, halogena, trifluorometila, -CO2R6, -CONR6R7, -NR6R7, -NO2 ili -SO2NR6R7 gdje R6 i R7 predstavljaju neovisno H ili (C1-C4) alkil.

Pogodniji pojedinačni spojevi formule (I) uključuju:

9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-fenil-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin;

9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(furan-2-il)-9H-pirazolo[3, 4-c]-1,2, 4-triazolo[4,3-α]piridin;

9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(2-piridil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin;

9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(4-piridil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin;

9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(3-tienil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin;

3-benzil-9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin;

9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-propil-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin;

3,9-diciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin;

9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(1-metilcikloheks-1-il)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin;

3-(terc-butil)-9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin;

9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(2-metilfenil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin;

9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(2-metoksifenil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin;

9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(tien-2-il)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin;

3-(2-klorofenil)-9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin;

9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(2-jodofenil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo [4,3-α]piridin;

9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(2-trifluorometilfenil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin; i

5,6-dihidro-7-etil-9-(4-fluorofenil)-3-(1-metilcikloheks-1-il)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin;

i njihove farmaceutski prihvatljive soli i solvati.

Još pogodniji spojevi formule (I) uključuju 9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(2-tienil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin i 9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(terc-butil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin i njihove farmaceutski prihvatljive soli i solvate.

Sinteza spojeva formule (I) opisana je u WO-A-96/39408.

Što je pogodnije, agonist adrenergičkog β2 receptora koji se rabi u kombinaciji u skladu s ovim izumom je selektivni agonist adrenergičkog β2 receptora, tj. ima veći afinitet prema adrenergičkom β2 receptoru nego prema svim drugim poznatim adrenergičkim β2 receptorima. Još bolje, afinitet takvog selektivnog agonista adrenergičkog β2 receptora je najmanje 100 puta veći prema adrenergičkom β2 receptoru u usporedbi s njegovim afinitetom prema drugim adrenergičkim β2 receptorima.

Pogodniji agonisti adrenergičkog β2 receptora za uporabu u ovom izumu uključuju salmeterol, formoterol i njihove farmaceutski prihvatljive soli i solvate.

Osobito pogodne kombinacije uključuju:

9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(2-tienil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu sol ili solvat, i salmeterol, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu sol ili solvat;

9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(2-tienil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu sol ili solvat, i formoterol, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu sol ili solvat;

9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(terc-butil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu sol ili solvat, i salmeterol, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu sol ili solvat; i

9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(terc-butil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu sol ili solvat, i formoterol, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu sol ili solvat.

Selektivni PDE4 inhibitor ili agonist adrenergičkog β2 receptora koji se rabe u skladu s ovim izumom mogu se prema izboru rabiti u obliku farmaceutski prihvatljive soli ili solvata. Takva sol može biti kiselinski dodatak ili bazična sol.

Pogodne soli kiselinskog dodatka nastaju iz kiselina koje daju netoksične soli i njihovi primjeri su soli klorovodične, bromovodične, jodovodične kiseline i soli sulfata, bisulfata, nitrata, fosfata, hidrogenfosfata, acetata, maleata, fumarata, laktata, tartarata, citrata, glukonata, sukcinata, saharata, benzoata, metansulfonata, etansulfonata, benzensulfonata, p-toluensulfonata i palmoata.

Pogodne bazične soli nastaju iz baza koje daju netoksične soli i njihovi primjeri su soli natrija, kalija, aluminija, kalcija, magnezija, cinka i dietanolamina.

Za pregled pogodnih soli vidi Berge i suradnici, J. Pharm. Sci., 66, 1-19, 1977.

Farmaceutski prihvatljivi solvati selektivnih PDE4 inhibitora i agoinsta adrenergičkog β2 receptora koji se rabe u skladu s ovim izumom, ili njihove soli, uključuju i njihove hidrate.

Selektivni PDE4 inhibitori i agonisti adrenergičkog β2 receptora iz ovog izuma mogu postojati u jednom ili više polimorfnih oblika.

Selektivni PDE4 inhibitori i agonisti adrenergičkog β2 receptora iz ovog izuma (ubuduće 'spojevi ovog izuma') mogu sadržavati jedan ili više asimetričnih ugljikovih atoma i time postoje u dva ili više stereoizomernih oblika (npr. R,R' formoterol je pogodnija izvedba). U slučaju da takav spoj sadrži alkenil ili alkenilen skupinu, može se pojaviti također i cis/trans (ili Z/E) izomerizam. Ovaj izum uključuje te pojedinačne stereoizomere spojeva izuma i, kada je prikladno, njihove pojedinačne tautomerne oblike, zajedno s njihovim smjesama.

Razdvajanje diastereoizomera ili cis i trans izomera može se postići konvencionalnim postupcima, npr. frakcijskom kristalizacijom, kromatografijom ili HPLC-om smjese stereoizomera spoja ovog izuma ili njegove odgovarajuće soli ili derivata. Pojedinačni enantiomer spoja ovog izuma može se također pripraviti iz odgovarajućeg optički čistog prijelaznog spoja ili putem ponovnog otapanja, kao što je pomoću HPLC-a odgovarajućeg racemata uporabom pogodne kiralne podrške ili frakcijskom kristalizacijom diastereoizomernih soli pomoću reakcije odgovarajućeg racemata s pogodnom optički aktivnom kiselinom ili bazom, kako je prikladno.

Ovaj izum također uključuje sve pogodne izotopne varijante spoja ovog izuma ili njihovu farmaceutski prihvatljivu sol. Izotopna varijanta spoja ovog izuma ili njena farmaceutski prihvatljiva sol definirana je kao ona u kojoj je najmanje jedan atom zamijenjen atomom istog atomskog broja ali različite atomske mase od atomske mase koja se uobičajeno nalazi u prirodi. Primjeri izotopa koji mogu biti uklopljeni u spojeve ovog izuma i njihove farmaceutski prihvatljive soli uključuju izotope vodika, ugljika, dušika, kisika, fosfora, sumpora, fluora i klora kao što su 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 17O, 18O, 31P, 32P, 35S, 18F i 36Cl. Određene izotopne varijante spojeva ovog izuma i njihove farmaceutski prihvatljive soli, na primjer, one u kojima je uklopljen radioaktivni izotop kao što je 3H ili 14C, korisne su u istraživanjima raspodjele lijeka i/ili supstrata u tkivima. Izotopi tricij, tj. 3H, i ugljik-14, tj. 14C, osobito su pogodni zbog jednostavnosti njihove priprave i određivanja. Nadalje, supstitucija s izotopima kao što je deuterij, tj. 2H, može pružiti određene terapijske prednosti koje proizlaze iz veće metaboličke stabilnosti, na primjer, povećanog in vivo vremena poluživota ili smanjene potrebne doze i time može imati prednost u određenim okolnostima.

Tipovi bolesti koji se mogu liječiti uporabom kombinacije ovog izuma uključuju, ali nisu ograničene na njih, astmu, kroničnu ili akutnu bronhokonstrikciju, kronični bronhitis, opstrukciju malih dišnih putova, emfizem, kroničnu opstruktivnu bolest pluća (COPD), COPD uz kronični bronhitis, plućni emfizem ili s njime povezano otežano disanje i COPD koja je karakterizirana ireverzibilnom, progresivnom opstrukcijom dišnih putova.

Astma

Jedna od najznačajnijih respiratornih bolesti koja se može liječiti kombinacijama terapeutskih agensa ovog izuma je astma, kronični, u porastu uobičajeni poremećaj koji se javlja u cijelom svijetu i karakteriziraju ga povremena reverzibilna opstrukcija dišnog puta, preosjetljivost dišnog puta i upala. Uzrok astme još nije određen, ali najčešće se patološki izražava kroz upalu dišnih putova, koja može biti značajna čak i za dišne putove pacijenata s blagom astmom. Ova upala potiče refleksne događaje u dišnom putu koji dovode do ekstravazacije proteina plazme, poremećaja disanja i bronhokonstrikcije. Temeljeno na bronhijalnoj biopsiji i istraživanjima ispiranja jasno je pokazano da astma uključuje infiltraciju mast stanica, eozinofila i T-limfocita u dišne putove pacijenta. Ispiranje bronhoalveola (BAL) u atopičnih astmatičara pokazuje aktivaciju interleukina (IL)-3, IL-4, IL-5 i stimulirajućeg faktora kolonije granulocit/makrofag (GM-CSF) koji ukazuju na prisutnost populacije T2-pomoćničkih stanica poput (Th-2) stanica.

Kombinacije terapijskih agensa ovog izuma korisne su u liječenju atopične i neatopične astme. Izraz ʺatopijaʺ odnosi se na genetičku predispoziciju prema nastajanju reakcija hipersenzitivnosti tipa I (neposredne) prema uobičajenim antigenima iz okoliša. Najčešća klinička slika je alergijski rinitis, dok se bronhijalna astma, atopični dermatitis, i alergija na hranu pojavljuju rjeđe. Prema tome, izraz ʺatopična astmaʺ ovdje se rabi s namjerom da bude sinonim s izrazom ʺalergijska astmaʺ, tj. bronhijalna astma koja je alergijska manifestacija u osjetljive osobe. Izraz ʺneatopična astmaʺ ovdje se rabi s namjerom da se odnosi na sve druge oblike astme, osobito na osnovnu ili ʺpravuʺ astmu, koja je izazvana različitim čimbenicima, uključujući snažno vježbanje, čestice koje nadražuju, psihološke stresove, itd.

Kronična opstruktivna bolest pluća (COPD)

Kombinacije terapijskih agensa ovog izuma nadalje su korisne u liječenju COPD-a ili COAD-a uključujući kronični bronhitis, plućni emfizem ili s njime povezan poremećaj disanja. COPD je karakteriziran slabo reverzibilnom, progresivnom opstrukcijom dišnih putova. Kronični bronhitis je povezan s hiperplazijom i hipertrofijom žlijezda koje izlučuju sluz, a nalaze se u submukozi velikih hrskavičnih dišnih putova. U terminalnim i respiratornim bronhiolama nađena je hiperplazija goblet-stanica, prodiranje upalnih stanica mukoze i submukoze, edem, fibroza, mukusni čepovi i povećani glatki mišići. Poznato je da su mali dišni putovi glavno mjesto opstrukcije dišnih putova. Emfizem je karakteriziran uništavanjem alveolarne stjenke i gubitkom elastičnosti pluća. Ustanovljen je cijeli niz čimbenika rizika kao veza s pojavom COPD-a. Veza između pušenja u COPD-a je dobro utvrđena. Ostali čimbenici rizika uključuju izloženost ugljenoj prašini i različite genetičke čimbenike. Vidi Sandford i suradnici,ʺGenetic risk factors for chronic obstructive pulmonary diseaseʺ, Eur. Respir. J. 10 1380-1391,1997.

Pojavljivanje COPD-a je u porastu i predstavlja značajno ekonomsko opterećenje na populacije industrijaliziranih nacija. Sam po sebi COPD se također predstavlja klinički sa širokim rasponom različitosti od jednostavnog kroničnog bronhitisa bez onesposobljenosti do pacijenata u teškom onesposobljenom stanju s kroničnom nemogućnošću disanja.

COPD je karakteriziran upalom dišnih putova, kao što je slučaj kod astme, ali upalne stanice nađene u tekućini bronhoalveolarnog ispiranja i sputumu pacijenata predstavljaju prije neutrofile i makrofage nego eozinofile. Povišeni nivoi upalnih posrednika također su nađeni u COPD pacijenata, uključujući IL-8, LTB4, i TNF-α, a ustanovljeno je da površinu epitela i subepitela bronhija takvih pacijenata prožimaju T-limfocifi i makrofagi. Olakšavanje simptoma COPD pacijente može se postići uporabom β-agonista i antikolinergičkih bronhodilatatora, ali napredovanje bolesti ostaje nepromijenjeno. COPD se liječio uporabom teofilina, ali bez većeg uspjeha, dijelom zbog njegove sklonosti izazivanju neželjenih učinaka. Steroidi također nisu uspjeli dati bolja obećanja kao zadovoljavajući agensi u liječenju COPD-a budući da su relativno neučinkoviti kao protuupalni agensi.

Prema tome, uporaba kombinacija terapijskih agensa ovog izuma u liječenju COPD-a i s njime povezanih i uključenih opstruktivnih bolesti dišnih putova, predstavlja značajan napredak u struci. Ovaj izum nije ograničen na bilo koji određeni način djelovanja niti na bilo koju pretpostavku putem kojih se postižu željeni terapijski ciljevi kroz uporabu kombinacija terapijskih agensa ovog izuma.

Bronhitis i bronhiektaza

U skladu s određenim i raznolikim inhibitornim djelovanjima opisanim gore koja posjeduju kombinacije terapijskih agensa ovog izuma, one su korisne u liječenju bronhitisa bilo kojeg tipa, etiologije, ili patogeneze, uključujući, npr. akutni bronhitis koji ima kratak ali snažan tijek i uzrokovan je izlaganjem hladnoći, udisanjem tvari koje nadražuju, ili akutnom infekcijom; kataralni bronhitis koji je u obliku akutnog bronhitisa s preobilnim oslobađanjem gnojne sluzi; kronični bronhitis koji predstavlja dugotrajni oblik bronhitisa s više ili manje izraženom sklonošću ponovnog pojavljivanja nakon stadija smirivanja, uslijed ponavljanja napada akutnog bronhitisa ili kronične opće bolesti, karakteriziran napadima kašlja, oskudnim ili obilnim iskašljavanjem, te sekundarnim promjenama na tkivu pluća; suhi bronhitis koji je karakteriziran oskudnim izlučivanjem gustog sputuma; infektivni astmatični bronhitis koji predstavlja sindrom označen razvojem simptoma bronhospazma koji slijede nakon infekcije respiratornog trakta u osoba s astmom; produktivni bronhitis koji predstavlja bronhitis popraćen s produktivnim kašljem.

Učinkovitost kombinacija terapijskih agensa ovog izuma u liječenju atopične astme ili neatopične astme, COPD-a ili drugih kroničnih upalnih bolesti dišnih putova može se prikazati kroz uporabu niza različitih modela poznatih u struci uključujući modele koji su opisani ispod.

Bronhodilatatorsko djelovanje - cAMP je uključen ne samo u opuštanje glatkih mišića, već također pokazuje općeniti inhibitorni utjecaj na razmnožavanje glatkih mišića dišnog puta, obje situacije mogu nastati zbog povišenja cAMP-a koje izaziva PDE4 komponenta izuma. Hipertrofija i hiperplazija glatkih mišića dišnog puta mogu se prilagoditi putem cAMP-a, a ova stanja su uobičajene morfološke osobine kronične astme.

Bronhospazmolitičko djelovanje in vitro - Sposobnost kombinacije terapijskih agensa ovog izuma da uzrokuju opuštanje glatkih mišića dušnika u zamorca prikazana je slijedećim test postupkom. Zamorci (350-500 g) se usmrte s natrijevim pentotalom (100 mg/kg i.p.). Dušnik se secira i izreže se odsječak duljine 2-3 cm. Dušnik se presječe u poprečnoj ravnini na naizmjeničnim hrskavičnim pločicama tako da se dobiju prsteni tkiva debljine 3-5 mm. Proksimalni i distalni prsteni se odbace. Pojedinačni prsteni postave se vertikalno na potporanj od nehrđajućeg čelika, jedan od njih je fiksiran na podlozi kupelji s organom, dok je drugi pričvršćen za izometrički pretvornik. Prsteni se nalaze u kupelji Krebsove otopine (sastav u μM: NaHCO3 25; NaCl 113; KCl 4,7; MgSO4⋅7H2O 1,2; KH2PO4 1,2; CaCl2 2,5; glukoza 11,7) pri 37°C uz propuštanje plina O2/CO2 (95:5, v/v). Prsteni pripremljeni na ovaj način kontrahiraju se stimulacijom polja. Da bi se ustanovilo spazmolitičko djelovanje, test kombinacije agensa ovog izuma otopljene su u fiziološkoj otopini i dodavane u sve većim količinama u kupelj organa u intervalima od 5 min da bi se dobila kumulativna krivulja koncentracija-učinak.

U gornjem test modelu, kombinacije terapijskih agensa ovog izuma općenito inhibiraju kontrakcije pripravka dušnika zamorca izazvane poljem u koncentracijama u području od 0,001 do 0,1 μM.

Ozonom pobuđeni model bronhijalne hiperreaktivnosti - Sposobnost kombinacije terapijskih agensa ovog izuma da spriječe povećani odziv dišnih putova na štetne podražaje, također poznat kao bronhijalna hiperreaktivnost, pokazana je određivanjem učinka ovih agensa na aktivnost odziva pluća u zamoraca. Odrasli zamorci (300-600 g) prethodno se tretiraju i pripremaju prema metodi Yeadon i suradnika, 1992, Pulm. Pharmacology, 5, 101-112. Odgovor dišnih putova na različite podražaje prati se u bazalnom stanju i nakon različitih posredovanja koja rezultiraju promjenama plućne mehanike. Test artikli se primjenjuju i.t. ili putem aerosola u različitim vremenima prije ispitivanja. Prethodno tretiranje ozonom u kontrolnih životinja rezultiralo je 3-100× povećanim odzivom pluća koji se blokira povezano s dozom kombinacije terapijskih agensa ovog izuma.

U gornjem test modelu kombinacije terapijskih agensa ovog izuma općenito pokazuju protuupalno djelovanje pri dozama u području od 0,001 do 0,3 mg/kg i.t.

Opuštanje humanih bronhija - Uzorci humanih pluća secirani za vrijeme operacija raka pribavljeni su unutar 3 dana nakon uklanjanja. Male bronhije (unutarnji promjer ≈ 2 do 5 mm) se izrežu, sijeku u odsječke i stave u 2 ml ampule tekućeg dušika za pohranu sa fetalnim serumom teleta (FCS) koji sadrži 1,8M dimetilsulfoksid (DMSO) i 0,1M saharozu kao agense za zaštitu pri zamrzavanju. Ampule se stave u kutiju od polistirola (11 × 11 × 22 cm) i polako se zamrznu uz srednju brzinu zamrzavanja od oko 0,6°C/min u zamrzivaču koji se podesi na -70°C. Nakon 3-15 h ampule se prenesu u tekući dušik (-196°C) gdje su pohranjene do uporabe. Prije uporabe tkiva se izlažu 30-60 min na -70°C prije otapanja tijekom 2,5 min stavljanjem ampula u vodenu kupelj na 37°C. Nakon toga odsječci bronhija se isperu stavljanjem u posudu s Krebs-Henseleit-ovom otopinom (μM: NaCl 118; KCl 4,7; MgSO4 1,2; CaCl2 1,2; KH2PO4 1,2; NaHCO3 25; glukoza 11; EDTA 0,03) na 37°C, sijeku se u prstene i suspendiraju u 10 ml kupelji s organom za mjerenje izometričke napetosti pod prethodnim opterećenjem od oko 1g. Daljnji porasti napetosti induciraju se kroz primjenu stimulacije poljem, za koje je poznato da izaziva aktivaciju živaca u uzorku dišnog puta i stvara napetost kroz oslobađanje acetilkolina i ostalih neuralnih medijatora. Krivulje koncentracija-odgovor načinjene su kumulativnim dodacima, svaka koncentracija je dodana nakon što je maksimalni učinak proizvela prethodna dodana koncentracija. Papaverin (300 μM) je dodan na kraju krivulje koncentracija-odgovor da bi izazvao potpuno opuštanje prstena bronhija. Ovaj učinak se uzima kao 100% opuštanje.

U gornjem test modelu kombinacije terapijskih agensa ovog izuma općenito uzrokuju koncentracijski ovisno opuštanje pripravaka humanih bronhijalnih prstena pri koncentracijama u području od 0,001 do 0,1 μM u pogodnijim izvedbama djelovanje se ostvaruje pri koncentracijama u području od 0,5 nM do 500 nM.

Prigušivanje kapsaicinom pobuđene bronhokonstrikcije - Mužjaci Dunkin-Hartley zamoraca (400-800 g) koji su prije pokusa imali slobodan pristup hrani i vodi, anestetizirani su s natrijevim fenobarbitalom (100 mg/kg i.p. [intraperitonealno]). Životinje, održavane na 37°C na ugrijanoj podlozi, temperatura se provjerava rektalnim termometrom, ventilirane su preko kanile u dušniku (oko 8ml/kg, 1 Hz) sa smjesom zraka i kisika (45 : 55 v/v). Ventilacija se prati na dušniku pomoću pneumotahografa povezanog na pretvornik razlike u tlaku koji je spojen s pumpom za disanje. Promjene tlaka unutar prsnog koša prate se direktno preko intratorakalne kanile, pomoću pretvornika diferencijalnog tlaka tako da se razlika tlakova između dušnika i prsnog koša može mjeriti i prikazati. Iz ovih mjerenja strujanja zraka i tlaka unutar pluća, izračunani su otpor dišnog puta (R1 cmH2O/l/s) i propusnost (Cddyn) pomoću digitalnog elektroničkog analizatora disanja za svaki respiratorni ciklus. Krvni tlak i brzina otkucaja srca bilježeni su na karotidnoj arteriji pomoću pretvornika tlaka.

Kada su vrijednosti bazalnog otpora i propusnosti stabilne, izazvana je akutna epizoda bronhokonstrikcije putem intravenoznog bolusa kapsaicina. Kapsaicin se otopi u 100% etanolu i razrijedi s fosfatom puferiranom fiziološkom otopinom. Test kombinacije terapijskih agensa ovog izuma primijenjene su kada je odgovor na kapsaicin stabilan, što je izračunano da je nakon 2-3 takve primjene u intervalima od 10 min. Popuštanje bronhokonstrikcije procjenjuje se tijekom 1-8 h bilo nakon intratrahealne ili intraduodenalne instilacije bilo nakon intravenozne bolus injekcije. Bronhospazmolitička aktivnost izražava se kao % inhibicije početnog maksimalnog otpora (RD) nakon infuzije kapsaicina. ED50 vrijednosti predstavljaju dozu koja uzrokuje 50% smanjenje porasta otpora induciranog kapsaicinom. Trajanje djelovanja definira se kao vrijeme u minutama kada je bronhokonstrikcija smanjena za 50% ili više. Učinke na krvni tlak (BP) i brzinu otkucaja srca (HR) karakteriziraju ED20 vrijednosti; tj. doze koje smanjuju BP ili HR za 20% mjereno 5 min nakon primjene.

U gornjem test modelu kombinacije terapijskih agensa ovog izuma općenito pokazuju bronhodilatatorsko djelovanje pri dozama u području od 0,001 do 0,1 mg/kg i.t. [intratrahealno]. Nadalje, kombinacija primijenjena i.t. pokazuje tek aditivni inhibitorni učinak na bronhospazam, gdje svaka komponenta sama može inhibirati više od 50% opaženog kontrolnog odgovora.

LPS-om pobuđena plućna neutrofilija - Mobilizacija neutrofila prema plućima i njihova aktivacija u plućima smatra se značajnom patološkom osobinom kod COPD-a i jake astme. Dakle, inhibicija bilo kojeg od ovih krajnjih točaka u životinja daje dokaz koji podržava korisnost ovog izuma.

Mužjaci Wistar-albino štakora (150-250 g) ili mužjaci Dunkin-Haartley zamoraca (400-600 g) prethodno se tretiraju samo s test artiklima ili u kombinaciji s ihnaliranjem ili intratrahealnom (i.t.) instilacijom pod kratkom općom anestezijom. Nakon 1-24 h poslije primjene spoja, životinje se iskušavaju inhaliranjem aerosola bakterijskog lipopolisaharida (LPS) dovoljnog da izazove izraženu plućnu neutrofiliju tijekom slijedećih 1-24 h. Procjena neutrofilije vrši se brojanjem stanica u bronhijalnoj ispirnoj tekućini ili određivanjem neutrofilnih produkata u plućnoj ispirnoj tekućini ili tkivu. U ovom test sustavu, terapijski agensi ovog izuma općenito pokazuju protu-upalno djelovanje pri dozama u području od 0,0001 do 0,1 mg/kg i.t. Neočekivano, kombinacija primijenjena i.t. daje u najmanju ruku aditivni učinak na upalu, unatoč činjenici da jedna od komponenti sama za sebe ne daje značajan protu-upalni učinak. Nadalje, ekvivalentni protu-upalni učinci visokih doza jedne od komponenata mogu se uočiti u nižim dozama kada se rabe u kombinaciji kao što je slučaj u ovom izumu, na taj način smanjujući sustavne neželjene učinke.

Alergijski test na zamorcima - U ovom testu za procjenu terapijskog utjecaja kombinacija terapijskih agensa ovog izuma na simptom dispneje i bronhospazma, tj. otežanog ili usiljenog disanja i povećanog otpora u plućima, i na simptom upale, tj. plućne neutrofilije i eozinofilije, rabe se Dunkin-Hartley zamorci (400-600 g tjelesne težine).

Albumin iz jaja (EA), V čistoće, kristaliziran i liofiliziran, aluminijev hidroksid, i mepiramin maleat koji se rabe u ovom testu komercijalno su dostupni. Iskušavanje i naknadna očitavanja provode se u čistoj plastičnoj kutiji unutarnjih dimenzija 10×6×4 inča. Odjeljci glave i tijela kutije mogu se odvojiti. Tijekom uporabe ova dva dijela drže se čvrsto zajedno pomoću stezaljki, a pomoću mekih gumenih brtvi održava se zračna nepropusnost između komora. Kroz sredinu odjeljka glave umetnut je ʺnebulizatorʺ pomoću brtve koja ne dozvoljava prolaz zraka i svaki kraj kutije također ima odušak. Na jedan kraj kutije je umetnut pneumotahograf i povezan s pretvornikom volumetrijskog tlaka koji je zatim povezan s dinografom kroz prikladne uređaje za povezivanje. Za vrijeme prevođenja antigena u stanje aerosola, odušci su otvoreni i pneumotahograf je odvojen od komore. Odušci se zatim zatvore i pneumotahograf i komora su povezani za vrijeme očitavanja respiratorne pravilnosti. Za iskušavanje, 2 ml 3% otopine antigena u fiziološkoj otopini stavlja se u ʺnebulizatorʺ i aerosol se stvara s zrakom pomoću male membranske pumpe koja radi pod 10 psi i s protokom od 8 l/min.

Zamorci se senzitiziraju supkutanim i i.p. injektiranjem 1 ml suspenzije koja sadrži 1 mg EA i 200 mg aluminijevog hidroksida u fiziološkoj otopini. Oni se rabe između 12 i 24 dana nakon senzitizacije. Da bi se uklonila histaminska komponenta odgovora, zamorci se prethodno i.p. tretiraju s 2 mg/kg mepiarminom 30 min prije iskušavanja aerosolom. Zamorci se tada izlažu aerosolu 3% EA u fiziološkoj otopini kroz točno 1 min, zatim se očitavaju respiratorni profili tijekom slijedećih 30 min. Nakon toga, upala pluća odredi se post mortem u periodu od 1-48 h. Trajanje neprekidne dispneje mjeri se iz respiratornih očitavanja.

Test kombinacije terapijskih agensa ovog izuma općenito se primjenjuju i.t. ili putem aerosola 0,5-4 h prije iskušavanja. Kombinacije spojeva su ili otopljene u fiziološkoj otopini ili u biološki podnošljivim otapalima. Aktivnost spojeva određena je na temelju njihove sposobnosti da smanje jakost i trajanje simptoma dispneje i bronhospazma i/ili jačinu upale pluća u usporedbi s kontrolnom skupinom tretirane nosačem. Testovi kombinacija terapijskih agensa ovog izuma procijenjeni su za serije doza i iz toga je određen ED50 koji je definiran kao doza (mg/kg) koja će inhibirati trajanje simptoma za 50%.

Protu-upalno djelovanje - Protu-upalno djelovanje kombinacija terapijskih agensa ovog izuma prikazano je inhibicijom aktivacije eozinofila ili neutrofila. U ovom testu uzimaju se uzorci krvi (50 ml) od neatopičnih dragovoljaca kod kojih se broj eozinofila kreće između 0,06 i 0,47 × 109 L-1. Venska krv sakuplja se u epruvete za centrifugu koje sadrže 5 ml trinatrijevog citrata (3,8%; pH 7,4).

Krv zaštićena od zgrušavanja se razrijedi (1:1, v:v) s fiziološkom otopinom puferiranom s fosfatom (PBS, koji ne sadrži niti kalcij niti magnezij) i nanese u sloju na 15 ml izotoničnog Percoll-a (gustoća 1,082-1,085 g/ml; pH 7,4), u 50 ml epruvetu za centrifugiranje. Nakon centrifugiranja (30 minuta, 1000×g, 20°C), mononuklearne stanice na granici faza plazma/Percoll pažljivo se aspiriraju i odbace.

Talog neutrofila/eozinofila/eritrocita (volumena oko 5 ml) se oprezno resuspendira u 35 ml izotonične otopine amonijevog klorida (NH4Cl, 155 mM; KHCO3, 10 mM; EDTA, 0,1 mM; 0-4°C). Nakon 15 min, stanice se dva puta isperu (10 min, 400×g, 4°C) u PBS-u koji sadrži fetalni serum teleta (2%, FCS).

Magnetski sustav za razdvajanje stanica rabi se da bi se odvojili eozinofili i neutrofili. Ovaj sustav ima mogućnost odvajanja stanica u suspenziji prema površinskim markerima, i sastoji se od stalnog magneta, u koji je smještena kolona koja uključuje čelični matriks koje se može magnetizirati. Prije uporabe, kolona se uravnoteži s PBS/FCS kroz 1 sat i zatim se ispere retrogradno s ledom ohlađenim PBS/FCS putem 20 ml šprice. Hipodermička igla 21G pričvrsti se na bazu kolone i pusti se da 1-2 ml ledom ohlađenog pufera isteče kroz iglu.

Nakon centrifugiranja granulocita, supernatant se aspirira i stanice se oprezno resuspendiraju sa 100 μl magnetnih čestica (anti-CD16 monoklonalno protutijelo, konjugirano sa superparamagnetnim česticama). Smjesa eozinofili/neutrofili/anti-CD16 magnetne čestice inkubira se na ledu kroz 40 minuta, a zatim se razrijedi do 5 ml s ledom ohlađenim PBS/FCS. Suspenzija stanica polako se nanese na vrh kolone i otvori se slavina da bi se omogućilo polagano kretanje stanica u čelični matriks. Kolona se zatim ispere s PBS/FCS (35 ml) koji se oprezno doda na vrh kolone tako da se ne poremete magnetski označeni neutrofili koji se već uhvaćeni u čeličnom matriksu. Neoznačeni eozinofili se sakupe u 50 ml epruvete za centrifugu i isperu (10 minuta, 400×g, 4°C). Tako dobiveni talog resuspendira se u 5 ml otopine Hanks-ove uravnotežene soli (HBSS) tako da se mogu procijeniti broj stanica i čistoća prije uporabe. Kolona za odvajanje se ukloni iz magneta i eluira se frakcija koja sadrži neutrofile. Kolona se zatim ispere s PBS (50 ml) i etanolom (apsolutni) i pohrani na 4°C.

Ukupne stanice se broje pomoću brojača mikro stanica. Doda se jedna kap lizogene otopine u uzorak, koji se nakon 30 s ponovno broji da bi se procijenila kontaminacija s eritrocitima. Razmazi citospina se priprave na uređaju Shandon Cytospin 2 (100 μl uzorci, 3 minute, 500 rpm). Ovi preparati se oboje i diferencijalno brojanje stanica se određuje svjetlosnim mikroskopom, pregledavanjem najmanje 500 stanica. Životnost stanica procjenjuje se iz sposobnosti nepropuštanja tripan plavog.

Eozinofili ili neutrofili se razrijede u HBSS i pipetiraju u mikrotitar pločice sa 96 jamica (MTP) uz 1-10 × 103 stanica/jamica. Svaka jamica sadrži 200 μl uzorka koji se sastoji od: 100 μl suspenzije stanica; 50 μl HBSS; 10 μl lucigenina; 20 μl stimulansa aktivacije; i 20 μl test spoja.

Uzorci se inkubiraju s test spojem ili nosačem kroz 10 min prije dodatka stimulansa aktivacije fMLP (1-10 μM) ili C5a (1-100 nM) otopljenog u dimetilsulfoksidu i nakon toga razrijeđenom u puferu, tako da je najviša rabljena koncentracija otapala 1% (uz 100 μM test spoja). MTPs se tresu da bi se olakšalo miješanje stanica i medija, i MTP se stavi u luminometar. Ukupna kemiluminiscencija i vremenski profil svake jamice mjere se istovremeno kroz 20 min i rezultati se izraze u arbitrarnim jedinicama, ili kao postotak fMLP-om inducirane kemiluminiscencije u odsutnosti test spoja. Rezultati se prilagode Hill-ovoj jednadžbi i IC50 vrijednosti se računaju automatski.

Kombinacije terapijskih agensa ovog izuma općenito su aktivne u gornjem test postupku pri koncentracijama u području od 0,0001 μM do 0,5 μM, u pogodnijim izvedbama pri koncentracijama u području od 0,1 nM do 100 nM.

Protu-upalno djelovanje kombinacija terapijskih agensa ovog izuma dodatno je prikazano inhibicijom ekstravazacije plazme u dišnim putovima štakora. Za ovaj test uzima se tkivo dušnika i određuje se razmjer istjecanja plazme. Ovaj test se jednako odnosi i na druge kronične upalne bolesti dišnih putova uključujući COPD ali ne ograničavajući se na COPD i sukladno tome neće biti ponavljan u ovom odjeljku.

Wistar albino štakori (150-200 g) ili Dunkin-Hartley zamorci (450-600 g) anestetiziraju se pomoću natrijevog pentobarbitona i ugrade im se venske i arterijske kanile. Da bi se vezali proteini plazme daje se i.v. Evans plavo boja (30 mg/kg). Nakon 10 minuta daju se i.t. test agensi, a 10 minuta kasnije primijeni se i.v. kapsaicin (3 μg/kg). Nakon 30 minuta, ukloni se tkivo dušnika, ekstrahira preko noći u formamidu i očita se apsorbancija kod 620 nm. U nekim pokusima redoslijed doziranja je obrnut tako da se spojevi daju prije Evans plavog i upalnog stimulansa.

U gornjem test modelu kombinacije terapijskih agensa ovog izuma općenito pokazuju protu-upalno djelovanje pri dozama u području od 0,001 do 0,1 mg/kg i.t.

Iz gore navedenog može se uočiti da su kombinacije terapijskih agensa ovog izuma korisne u liječenju upalnih ili opstruktivnih bolesti dišnih putova ili ostalih stanja koja uključuju opstrukciju dišnih putova. Posebice su korisne u liječenju bronhijalne astme.

Imajući u vidu njihovo protu-upalno djelovanje i njihov utjecaj na hiperreaktivnost dišnih putova, kombinacije terapijskih agensa ovog izuma korisne su u liječenju, osobito u profilaktičkoj primjeni, opstruktivnih ili upalnih bolesti dišnih putova. Stoga, neprekidnom i pravilnom primjenom tijekom duljeg vremenskog perioda kombinacije spojeva ovog izuma korisne su u pružanju prethodne zaštite protiv ponovne pojave bronhokonstrikcije ili ostalih simptomatičnih napada kao posljedica opstruktivnih ili upalnih bolesti dišnih putova. Kombinacije spojeva ovog izuma također su korisne u kontroli, poboljšanju ili oporavku bazalnog statusa ovakvih bolesti.

Uzevši u obzir bronhodilatatorsko djelovanje kombinacije terapijskih agensa ovog izuma korisni su kao bronhodilatatori, npr. u liječenju kronične ili akutne bronhokonstrikcije, i za simptomatično liječenje opstruktivnih ili upalnih bolesti dišnih putova.

Opstruktivne ili upalne bolesti dišnih putova na koje se odnosi ovaj izum uključuju astmu; pneumokoniozu; kroničnu eozinofilnu upalu pluća; kroničnu opstruktivnu bolest pluća ili dišnih putova (COPD ili COAD); i sindrom respiratornog stresa u odraslih osoba (ARDS), kao i povišenu hiperreaktivnost dišnih putova koja se javlja kao posljedica terapije drugim lijekovima, npr. aspirinom ili terapije β-agonistima.

Selektivni PDE4 inhibitori i agonisti adrenergičkog β2 receptora ovog izuma se mogu se primijeniti odvojeno ili u kombinaciji ali će se općenito primjenjivati u primjesi s farmaceutski pogodnim ekscipijensom, diluensom ili nosačem.

Selektivni PDE4 inhibitori i agonisti adrenergičkog β2 receptora ovog izuma primjenjuju se pogodnije inhalacijom i uobičajeno se isporučuju u obliku suhog praška (bilo sami ili kao smjesa, na primjer kao smjesa s laktozom) iz inhalatora suhog praška ili raspršivača aerosola iz spremnika pod tlakom, pumpe, raspršivača, atomizatora (pogodnije iz atomizatora uz primjenu elektrohidrodinamike da bi nastala fina maglica) ili ʺnebulizatoraʺ, sa ili bez uporabe pogodnog potisnog sredstva, npr. diklorodifluorometana, triklorofluorometana, diklorotetrafluoroetana, hidrofluoroalkana kao što su 1,1,1,2-tetrafluoroetan (HFA 134A [zaštićeno ime]) ili 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropan (HFA 227EA [zaštićeno ime]), ugljični dioksid, zatim perfluoronirani ugljikovodik kao što je Perflubron (zaštićeno ime) ili drugi pogodni plinovi. U slučaju aerosola pod tlakom, jedinica doziranja se može odrediti tako da se opremi ventilom za oslobađanje odmjerene količine. Spremnik pod tlakom, pumpa, raspršivač, atomizator ili ʺnebulizatorʺ mogu sadržavati otopinu ili suspenziju aktivnog spoja, npr. uporabom smjese etanola (prema izboru, etanola koji sadrži vodu) ili pogodnog agensa za raspršivanje, otapanje ili poboljšano oslobađanje te potisnog sredstva kao otapala, koje dodatno može sadržavati lubrikant, npr. sorbitan trioleat. Kapsule, blisteri i spremnici (napravljeni, na primjer, od želatine ili HPMC-a) za uporabu u inhalatorima ili insuflatorima mogu biti formulirani tako da sadrže praškastu smjesu spoja ovog izuma, pogodni osnovni prah kao što su laktoza ili škrob i modifikator djelovanja kao što su 1-leucin, manitol ili magnezijev stearat.

Prije uporabe u formulacijama suhih prašaka ili formulacijama suspenzija za inhalaciju, spoj izuma bit će razbijen u vrlo fine čestice, veličine pogodne za primjenu inhalacijom (tipično se smatra da su to čestice manje od 5 mikrona). Razbijanje na vrlo fine čestice može se postići nizom postupaka, na primjer mljevenjem u ahatnom mlinu, mljevenjem u ahatnom mlinu s fluidnim dnom ili uporabom superkritične kristalizacije fluida.

Pogodna formulacija otopine za uporabu u atomizatoru uz primjenu elektrohidrodinamike čime se stvara fina maglica može sadržavati djelatnu količinu spoja ovog izuma od 1 μg do 10 mg, a djelatni volumen može varirati od 1 do 100 μl. Tipična formulacija može sadržavati spoj ovog izuma, propilen glikol, sterilnu vodu, etanol i natrijev klorid. Umjesto propilen glikola mogu se rabiti alternativna otapala, na primjer glicerol ili polietilen glikol.

Formulacije aerosola ili suhog praška pogodnije se podešavaju tako da svaka odmjerena doza ili ʺudisajʺ sadrži od 1 do 4000 μg spoja ovog izuma koji uzima pacijent. Ukupna dnevna doza s aerosolom bit će u području od 1 μg do 20 mg koja se može primijeniti kao jedna doza ili, kako je češće slučaj, u odvojenim dozama kroz cijeli dan.

Pogodniji težinski (w/w) omjer selektivnog PDE4 inhibitora : agonista adrenergičkog β2 receptora koji se rabi bit će ovisan o određenim ispitanim kombinacijama. Razlog tome su razlike u jakosti pojedinačnih spojeva. U bilo kojem slučaju liječnik će odrediti pravu dozu svakog spoja koji će biti najpogodniji za svakog pojedinog pacijenta i to će varirati s dobi, težinom i odgovorom za određenog pacijenta.

Treba uvažiti da sve reference koje se ovdje odnose na liječenje uključuju kurativne, palijativne i profilaktičke tretmane.

Test podaci - Inhibicija oslobađanja elastaze iz izoliranih humanih neutrofila

Venska krv (90 ml) zdravih ljudi dragovoljaca obaju spolova sakuplja se u 10 ml 3,8% (w/v) natrijev citrat, i alikvoti od 8 ml se razdijele u 15 ml polipropilenske epruvete za centrifugu od kojih svaka sadržava 4 ml 6% dekstrana (prosječne molekulske težine 148000) u otopini Hanks-ove uravnotežene soli (HBSS). Dekstran/krv se oprezno miješa okretanjem epruvete i zatim se ostavi stajati ne sobnoj temperaturi kroz 45 minuta da bi se omogućilo taloženje eritrocita. Na alikvote od 16 ml iz leukocitima bogatog supernatanta polože se 10 ml Ficoll-Hypaque jastučići u 50 ml polipropilenskim epruvetama za centrifugu, epruvete se zatim centrifugiraju na 400g kroz 35 minuta na 21°C. Plazma, sloj mononuklearnih stanica i Ficoll se uklone ostavljajući granulocitima bogat talog. Talog se najprije resuspendira u 10 ml ledom ohlađene destilirane vode kroz 45 sekundi da bi se razorile crvene krvne stanice koje zagađuju talog, nakon čega slijedi dodavanje 10 ml ledom ohlađene dvostruko koncentrirane fosfatom puferirane fiziološke otopine (PBS) u svaku epruvetu da bi se ponovno uspostavila osmolarnost. Suspenzije se ponovno centrifugiraju na 200g kroz 10 minuta pri 4°C da bi se dobio talog neutrofila. Supernatant se ukloni a talog se oprezno resuspendira u ukupnom volumenu od 10 ml ledom ohlađenog HBSS-a uporabom Pasteur-ove pipete. Diferencijalno brojanje bijelih krvnih stanica obavlja se na ishodnoj suspenziji neutrofila pomoću Beckman Coulter Ac. T5 hematološkog analizatora i stanice se pohrane na ledu do testiranja. Neposredno prije ispitivanja, alikvoti suspenzije neutrofila se uklone i razrijede na broj od 4×106 neutrofila/ml u ledom ohlađenoom HBSS-u koji sadrži 2U/ml adenozin deaminaze.

Inhibicija fMLP-om induciranog oslobađanja elastaze provedena je uporabom 160 μl test volumena u polistirenskim mikrotitar pločicama s 96 jamica. Oslobađanje elastaze se ispituje mjerenjem brzine cijepanja sintetičkog supstrata MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA. Za mjerenje oslobađanja elastaze, jamice za ispitivanje sadržavaju 8μl 100μg/ml citokalazina B (u 10% DMSO/90% HBSS), 8μl test spoja (razrijeđenog u HBSS), 40μl suspenzije neutrofila i 96μl 156μM MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA (u HBSS). Test pločice se inkubiraju na 37°C kroz 10 minuta prije dodatka 8μl 2μM fMLP (u HBSS) a mjerenje brzine cijepanja supstrata mjeri se pri λ=405 nm kroz 3 minute pri 37°C. Bazalno oslobađanje elastaze određuje se dodatkom 8μl HBSS umjesto fMLP-a. Podaci izneseni ispod u Tablici 1 su IC50 vrijednosti, tj. koncentracija (u nM) aktivnog agensa potrebna da bi se postigla 50% inhibicija fMLP-om induciranog oslobađanja elastaze. U slučaju pokusa s kombinacijama, 1000 nM 9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(2-tienil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin (C) se dodaje u test i krivulja koncentracija-odgovor se konstruira za formoterol (F) ili za salmeterol (S).

Tablica 1 - Inhibicija oslobađanja elastaze (IC50 vrijednosti u nM)

[image]

Pokazano je da kombinirana primjena β2 agonista (formoterol ili salmeterol) s PDE4 inhibitorom (9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(2-tienil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin) uzrokuje sinergističku inhibiciju pred upalnih funkcija neutrofila. Slaba (μM) inhibicija fMLP-om induciranog oslobađanja elastaze iz izoliranih humanih neutrofila postiže se pojedinačnim tretmanom s ovim farmakološkim agensima, i ona se dramatično povećava do vrlo jake (nM) inhibicije njihovom kombiniranom primjenom.

Claims (17)

1. Kombinacija za inhaliranje koja se sastoji od (a) selektivnog PDE4 inhibitora formule (I) [image] ili njegove farmaceutski prihvatljiva soli ili solvata, naznačeni time da: R1 predstavlja H, (C1-C6) alkil, (C1-C6) alkoksi, (C2-C4) alkenil, fenil, -N(CH3)2, (C3-C6) cikloalkil, (C3-C6) cikloalkil(C1-C3) alkil ili (C1-C6) acil, gdje alkil, fenil ili alkenil skupine mogu biti supstituirane s do dvije -OH, (C1-C3) alkil, ili -CF3 skupine ili s do tri halogena; R2 i R3 su svaki neovisno odabrani iz skupine koja se sastoji od H, (C1-C14) alkil, (C1-C7) alkoksi(C1-C7) alkil, (C2-C14) alkenil, (C3-C7) cikloalkil, (C3-C7)cikloalkil(C1-C2) alkil, zasićene ili nezasićene (C4-C7) heterocikličke (CH2)n skupine gdje je n 0, 1 ili 2, koje sadrže kao heteroatom jednu ili dvije skupine koje se sastoje od kisika, sumpora, sulfonila, dušika i NR4 gdje R4 predstavlja H ili (C1-C4) alkil; ili skupina Formule (II): [image] gdje je a cijeli broj od 1 do 5; b i c su 0 ili 1; R5 predstavlja H, -OH, (C1-C5) alkil, (C2-C5) alkenil, (C1-C5) alkoksi, (C3-C6) cikloalkoksi, halogen, -CF3, -CO2R6, -CONR6R7, -NR6R7, -NO2, ili -SO2NR6R7 gdje R6 i R7 predstavljaju svaki neovisno H, ili (C1-C4) alkil; Z je -O-, -S-, -SO2-, -CO- ili -N(R8)- gdje R8 predstavlja H ili (C1-C4) alkil; i Y je (C1-C5) alkilen ili (C2-C6) alkenilen prema izboru supstituiran s do dvije (C1-C7) alkil ili (C3-C7) cikloalkil skupine; gdje svaka alkil, alkenil, cikloalkil, alkoksialkil ili heterociklička skupina može biti supstituirana s 1 do 14, najpogodnije 1 do 5, (C1-C2) alkil, CF3, ili halo skupinama; i R9 i R10 su neovisno odabrani iz skupine koja se sastoji od H, (C1-C6) alkil, (C1-C6) alkoksi, (C6-C10) aril i (C6-C10) ariloksi; i (b) agonista adrenergičkog β2 receptora.

2. Kombinacija prema zahtjevu 1 naznačena time da je R1 metil, etil ili izopropil.

3. Kombinacija prema zahtjevima 1 ili 2 naznačena time da je R3 (C1-C6) alkil, (C2-C6) alkenil, (C3-C7) cikloalkil, (C3-C7)cikloalkil(C1-C6) alkil ili fenil prema izboru supstituiran s 1 ili 2 skupine koje se sastoje od H, -OH, (C1-C5) alkil, (C2-C5) alkenil, (C1-C5) alkoksi, halogena, trifluorometila, -CO2R6, -CONR6R', -NR6R7, -NO2 ili -SO2NR6R7 gdje R6 i R7 predstavljaju svaki neovisno H, ili (C1-C4) alkil.

4. Kombinacija prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva naznačena time da je selektivni PDE4 inhibitor formule (I) odabran između: 9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-fenil-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin; 9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(furan-2-il)-9H-pirazolo[3, 4-c]-1,2, 4-triazolo[4,3-α]piridin; 9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(2-piridil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin; 9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(4-piridil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin; 9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(3-tienil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin; 3-benzil-9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin; 9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-propil-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin; 3,9-diciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin; 9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(1-metilcikloheks-1-il)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin; 3-(terc-butil)-9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin; 9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(2-metilfenil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin; 9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(2-metoksifenil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin; 9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(tien-2-il)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin; 3-(2-klorofenil)-9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin; 9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(2-jodofenil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo [4,3-α]piridin; 9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(2-trifluorometilfenil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin; i 5,6-dihidro-7-etil-9-(4-fluorofenil)-3-(1-metilcikloheks-1-il)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin; i njihove farmaceutski prihvatljive soli i solvati.

5. Kombinacija prema zahtjevu 4 naznačena time da je selektivni PDE4 inhibitor formule (I) odabran između 9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(2-tienil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridina i 9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(terc-butil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridina i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli i solvate.

6. Kombinacija prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva naznačena time da je agonist adrenergičkog β2 receptora odabran između salmeterola, formoterola i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli ili solvata.

7. Kombinacija prema zahtjevu 1 naznačena time da: selektivni PDE4 inhibitor formule (I) je 9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(2-tienil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin, ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol ili solvat, a agonist adrenergičkog β2 receptora je salmeterol, ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol ili solvat; selektivni PDE4 inhibitor formule (I) je 9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(2-tienil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin, ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol ili solvat, a agonist adrenergičkog β2 receptora je formoterol, ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol ili solvat; selektivni PDE4 inhibitor formule (I) je 9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(terc-butil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin, ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol ili solvat, a agonist adrenergičkog β2 receptora je salmeterol, ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol ili solvat; ili selektivni PDE4 inhibitor formule (I) je 9-ciklopentil-5,6-dihidro-7-etil-3-(terc-butil)-9H-pirazolo[3,4-c]-1,2,4-triazolo[4,3-α]piridin, ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol ili solvat, a agonist adrenergičkog β2 receptora je formoterol, ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol ili solvat.

8. Kombinacija prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva naznačena time da se rabi kao lijek.

9. Kombinacija prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 7 naznačena time da se primjenjuje istovremeno, uzastopno ili odvojeno u liječenju opstruktivnih dišnih putova ili drugih upalnih bolesti.

10. Farmaceutski pripravak naznačen time da sadrži selektivni PDE4 inhibitor formule (I), kako je definirano u zahtjevu 1, agonist adrenergičkog β2 receptora i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, diluens ili nosač, za primjenu putem inhalacije u liječenju opstruktivnih dišnih putova ili drugih upalnih bolesti.

11. Farmaceutski pripravak kako je definirao u zahtjevu 10 naznačen time da su selektivni PDE4 inhibitor formule (I) i agonist adrenergičkog β2 receptora defninrani u bilo kojem od zahtjeva 2 do 7.

12. Uporaba selektivnog PDE4 inhibitora formule (I), kako je definirano u zahtjevu 1, ili agonista adrenergičkog receptora β2, naznačena time, da se koristi u proizodnji lijeka za istovremenu, uzastopnu ili odvojenu primjenu obaju agenasa putem inhalacije u liječenju opstruktivnih dišnih putova ili drugih upalnih bolesti.

13. Uporaba zahtjeva 12 naznačena time da su selektivni PDE4 inhibitor formule (I) i agonist adrenergičkog β2 receptora definirani bilo kojim od zahtjeva 2 do 7.

14. Postupak liječenja opstruktivnih dišnih putova ili drugih upalnih bolesti, naznačena time, da se sastoji od primjene koja može biti istovremena, uzastopna ili odvojena, putem inhalacije, u sisavaca kojima je takvo liječenje potrebno, učinkovite količine selektivnog PDE4 inhibitora formule (I), kako je definiranu u zahtjevu 1, i agonista adrenergičkog β2 receptora.

15. Postupak prema zahtjevu 14 naznačen time da su selektivni PDE4 inhibitor formule (I) i agonist adrenergičkog β2 receptora definirani u bilo kojem od zahtjeva 2 do 7.

16. Inhalacijska oprema za istovremenu, uzastopnu ili odvojenu primjenu selektivnog PDE4 inhibitora formule (I), kako je definirano u zahtjevu 1, i agonista adrenergičkog β2 receptora, naznačena time, da se koristi u liječenju opstruktivnih dišnih putova ili drugih upalnih bolesti.

17. Inhalacijska oprema prema zahtjevu 16 naznačena time da su selektivni PDE4 inhibitor formule (I) i agonist adrenergičkog β2 receptora definirani u bilo kojem od zahtjeva 2 do 7.