MXPA04004930A - Combinacion farmaceutica. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a una combinacion de un inhibidor selectivo de PDE4 como se define en la presente memoria y u agonista del receptor (2-adrenergico, para la administracion simultanea, secuencial o por separado por via inhalada en el tratamiento de una enfermedad obstructiva de las vias respiratorias u otra enfermedad inflamatoria.

Description

Combinación farmacéutica La presente invención se refiere a una combinación inhalada de un inhibidor selectivo de PDE4 y un agonista del receptor P2-adrenérgico, a composiciones farmacéuticas, incluyendo los dispositivos para la administración, y a los usos de dicha combinación. Una combinación de un inhibidor selectivo de PDE4 y un agonista del receptor p2-adrenérgico es útil en el tratamiento de enfermedades obstructivas de las vías respiratorias y otras enfermedades inflamatorias, en particular, de enfermedades obstructivas de las vías respiratorias, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) y otras enfermedades obstructivas de las vías respiratorias exacerbadas por reflejos bronquiales incrementados, inflamación, hiperreactividad bronquial y broncoespasmos . La combinación -es especialmente útil en el tratamiento de COPD. Ejemplos de enfermedades particulares que se pueden tratar con la presente invención incluyen las enfermedades respiratorias, asma, síndrome de dificultad respiratoria aguda, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, bronquitis, bronquitis crónica, enfermedad pulmonar (vías respiratorias) obstructiva crónica y silicosis y enfermedades del sistema inmune tales como rinitis alérgica y sinusitis crónica.

Las fosfodiesterasas de los nucleótidos 3 ', 5 ' -cíclicos (PDE) comprenden una amplia clase de enzimas divididas en al menos ' once familias diferentes que son estructural, bioquímica y farmacológicamente diferentes entre sí. Las enzimas de cada familia se denominan normalmente isoenzimas o isozimas. En esta clase se incluyen un total de más de quince productos génicos y se produce una diversidad adicional por corte y empalme diferencial y procesado postraducción de dichos productos génicos. La presente invención se refiere principalmente a los cuatro productos génicos de la cuarta familia de PDE, es decir, PDE4A, PDE4B, PDE4C y PDE4D . Estas enzimas se denominan conjuntamente isoformas o subtipos de la familia de isoenzimas PDE (PDE4) . Las PDE4 se caracterizan por una degradación selectiva, hidrolítica de alta afinidad del nucleótido cíclico como segundo mensajero, el nucleótido cíclico 3' , 5' -monofosfato de adenosina (AMPc) y por la sensibilidad a la inhibición por rolipram. En los últimos años se han descubierto una serie de inhibidores selectivos de PDE4 y se han demostrado en una diversidad de modelos de enfermedad los efectos beneficiosos y farmacológicos resultantes de dicha inhibición: véase, por ejemplo, Torphy et al. Environ. Health Perspect., 102 Suppl. 10, 79-84, 1994; Duplantier et al., J. Med. Chem. 39 120-125, 1996; Schneider et al., Pharmacol . Biúchem. Behav. 50 211-217, 1995; Banner and Page, Br. J. Pharmacol. 114 93-98, 1995; Barnette et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 273 674-679, 1995; Wright et al. "Differential in vivo and in vitro bronchorelaxant activities of CP-80633, a selective phosphodiesterase 4 inhibitor," Can. J. Physiol. Pharmacol. 75 1001-1008, 1997; Manabe et al. "Anti-inflammatory and bronchodilator properties of KF19514, a phosphodiesterase 4 and 1 inhibitor", Eur. J. Pharmacol. 332 97-107, 1997; y Ukita et al. "Novel, potent, and selective phosphodiesterase-4 inhibitors as antiasthmatic agents: synthesis and biológica! activities of a series of 1-pyridylnaphthalene derivatives", J. Med. Chem. 42 1088-1088, 1999. Los receptores ß-adrenérgicos están presentes en el sistema nervioso simpático. Existen al menos dos tipos. Los receptores ß?-adrenérgicos se encuentran en el corazón y desempeñan una- función importante en la regulación de la frecuencia cardiaca mediante la acción de los agonistas epinefrina y norepinefrina . Los receptores 2-adrenérgicos están presentes en una serie de tipos de células en el pulmón (por ejemplo, células del músculo liso de las vías respiratorias, células epiteliales y una diversidad de células inflamatorias) y los agonistas del receptor ß2-adrenérgico son eficaces broncodilatadores, provocando la relajación del músculo liso de las vías respiratorias. Las aminas simpaticomiméticas tienen una larga historia de uso en el tratamiento de enfermedades crónicas de las vías respiratorias caracterizadas por un estrechamiento parcialmente reversible de las vías respiratorias tales como COPD y asma y se usaron inicialmente como broncodilatadores en forma de epinef ina intravenosa. Posteriormente, se usaron agentes ß-adrenérgicos inhalados tales como isoprenalina que eran relativamente no selectivos por los receptores ß2 sobre los ß? y por ello provocaban taquicardia en dosis broncodilatadoras eficaces. Más recientemente, se han usado agentes ß-adrenérgicos inhalados como salbutamol que tienen más selectividad por el receptor ß2 pero con una acción corta. Los agentes ß-adrenérgicos inhalados formoterol, N- [ 2-hidroxi-5- ( 1-hidroxi-2- ( (2- (4-metoxifenil ) -1-metiletil) amino) -etil) -fenil] formamida y salmeterol son ambos selectivos por el receptor ß2 y de acción prolongada. Se ha descubierto ahora de forma sorprendente que una combinación de inhibidores selectivos de PDE4 particulares y agonistas del receptor ß2-adrenérgico ofrecen beneficios significativos en el tratamiento de enfermedades obstructivas de las vías respiratorias y otras enfermedades inflamatorias con respecto al tratamiento con el agente solo o con respecto a otras combinaciones conocidas. La ventaja de la combinación es proporcionar un control óptimo del calibre de las vías respiratorias mediante el mecanismo más apropiado a la patología de la enfermedad, a saber, agonismo del receptor 2-adrenérgico, junto con lá supresión efectiva de la inflamación inapropiada. De este modo, se controlan los síntomas de la enfermedad corrigiendo los reflejos neurales de las vías respiratorias inapropiados que conducen a tos, producción de mocos y disnea. Administrando una combinación de un agonista del receptor p2-adrenérgico y un inhibidor selectivo de PDE4 por vía inhalada' se consiguen los beneficios de cada clase sin los efectos periféricos indeseados. Además, las combinaciones particulares de la presente invención tienen como resultado una sinergia inesperada, produciendo una mayor eficacia que las dosis toleradas máximas de cualquiera de las clases de agentes usados solos. La invención proporciona por tanto una combinación inhalada de (a) un inhibidor selectivo de PDE4 de fórmula: ( o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables, en la que R1 es H, alquilo Ci-C6, alcoxi Ci-C6, alquenilo C2-C4, fenilo, -N(CH3)2, cicloalquilo C3-C6, (cicloalquil C3-C6> (alquilo C1-C3) o acilo Ci-C6, pudiendo estar los grupos alquilo, fenilo o alquenilo sustituidos con hasta dos grupos -OH, alquilo C1-C3 o -CF3 o con hasta tres halógenos; cada uno de R2 y R3 se selecciona independientemente del grupo formado por H, alquilo Ci-Cn, (alcoxi Ci-C7) (alquilo C1-C7) , alquenilo C2-C14, cicloalquilo C3-C7, (cicloalquil C3-CT) (alquilo C1-C2) , un grupo (heterociclico C4-C7) (CH2)n saturado o insaturado en el que n es 0, 1 ó 2, que contiene como heteroátomo uno o más del grupo formado por oxigeno, azufre, sulfonilo, nitrógeno y NR4, siendo R4 H o alquilo Ci-C4 o un grupo de Fórmula (II) : (II) en la que a es un número entero de 1 a 5; b y c son 0 ó 1; R5 es H, -OH, alquilo Ci-C5, alquenilo C2-Cs, alcoxi Ci~ C5, cicloalcoxi C3-C6, halógeno, -CF3, -C02R6, -CONR6R7, -NR6R7, -NO2 o -S02NR6R7, siendo cada uno de R6 y R7 independientemente H o alquilo C1-C4; Z es -O-, -S-, -S02-, -CO- o -N(R8) -, siendo R8 H o alquilo Ci-C4; e Y es alquileno C1-C5 o alquenileno C2-C6 opcionalmente sustituido con hasta dos grupos alquilo C1-C7 o cicloalquilo C3-C7; pudiendo estar cada uno de los grupos alquilo, alquenilo, cicloalquilo, alcoxialquilo o heterociclico sustituidos con 1 a 14 , preferiblemente 1 a 5 grupos alquilo Ci-C2 , CF3 o halo; y cada uno dé R9 y R10 se selecciona independientemente del grupo formado por H, alquilo Ci-C6, alcoxi Ci-C6 / arilo C6-C10 y ariloxi C6-Ci0 ; y (b) un agonista del receptor p2-adrenérgico . Además, la invención proporciona una combinación inhalada de un inhibidor selectivo de PDE4 de fórmula (I), como la definida antes, y un agonista del receptor ß2-adrenérgico, para usar como medicamento. Además, la invención proporciona una combinación inhalada de un inhibidor selectivo de PDE4 de fórmula (I), como la definida antes, y un agonista del receptor ß2-adrenérgico, para la administración simultánea, secuencial o por separado en el tratamiento de una enfermedad obstructiva de las vías respiratorias u otra enfermedad inflamatoria . Además, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un inhibidor selectivo de PDE4 de fórmula (I), como la definida antes,, un agonista del receptor 2-adrenérgico y un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable, para la administración por via inhalada en el tratamiento de una enfermedad obstructiva de las vías respiratorias u otra enfermedad inflamatoria. Además, la invención proporciona el uso de un inhibidor selectivo de PDE4 de fórmula (I), como la definida antes, o un agonista del receptor p2-adrenérgico, en la fabricación de un medicamento para la administración simultánea, secuencial o por separado de ambos agentes por vía inhalada en el tratamiento de una enfermedad obstructiva de las vías respiratorias u otra enfermedad inflamatoria. Además, la invención proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad obstructiva de las vías respiratorias u otra enfermedad inflamatoria que comprende administrar, de forma simultánea, secuencial o por separado, por vía inhalada, a un mamífero que necesite dicho tratamiento, una cantidad eficaz de un inhibidor selectivo de PDE4 de fórmula (I), como la definida antes, y un agonista del receptor 2-adrenérgico . Además, la invención proporciona un dispositivo de inhalación para la administración simultánea, secuencial o por separado, de un inhibidor selectivo de PDE4 de fórmula (I), como la definida antes, y un agonista del receptor ß2-adrenérgico, en el tratamiento de una enfermedad obstructiva de las vías respiratorias u otra enfermedad inflamatoria . Un -inhibidor selectivo de PDE4 es aquel que posee una afinidad mayor por la isoenzima PDE4 que por el resto de isoenzimas PDE conocidas. Con preferencia, la afinidad de un inhibidor selectivo de PDE4 conforme a la invención es al menos 100 veces mayor por la isoenzima PDE4 cuando se compara con su afinidad por las otras isoenzimas PDE. Los compuestos preferidos de fórmula (I) incluyen aquellos en los que R1 es metilo, etilo o isopropilo y aquellos en los que R3 es alquilo Ci-Ce, alquenilo C2-C6, cicloalquilo C3-C7, (cicloalquil C3-C7) (alquilo Ci-Cs) o fenilo opcionalmente sustituidos con 1 ó 2 del grupo formado por H, -OH, alquilo C1-C5, alquenilo C2-C5, alcoxi C1-C5, halógeno, trifluorometilo, -C02R6, -CONR6R7, -NR6R7, -N02 o -S02NR6R7, siendo cada uno de R6 y R7 independientemente H o alquilo C1-C4. Los compuestos preferidos individuales de fórmula (I) incluyen : 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3-fenil-9H-pi azólo [3, -c]-l, 2, 4-triazolo[4, 3-a] piridina; 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- ( furan-2-il ) -9H-pirazólo [3,4-c]-l,2,4-triazolo[4, 3-a] piridina; 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- (2-piridil ) -9H-pirazólo [3,4-c]-l,2,4-triazolo[4, 3-a] piridina; 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- (4-piridil) -9H-pira olo [3,4-c]-l,2,4-triazolo[4, 3-a] piridina; 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- (3-tienil) -9H-pirazolo [3, 4-c] -1, 2, 4-triazolo [4, 3-a] piridina; 3-Bencil-9-ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-9.fi-pirazolo [3, -c] -1, 2, 4-triazolo [4, 3-a] piridina; 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3-propil-9H-pirazolo [3,4-c]-l,2,4-triazolo[4, 3-a] piridina; 3, 9-Diciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-9H-pirazolo [3, 4-c]-l,2,4-triazolo[4, 3-a] piridina; 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- (1-metilciclohex-l-il) -9Ji-pirazolo [3, 4-c] -1, 2, 4-triazolo [ , 3-a] piridina; 3- ( Terc-butil) -9-ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-9if-pirazólo [3,4-c]-l,2, -triazolo ( 4 , 3-a] piridina; 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- (2-metilfenil) -9H-pirazólo [3, 4-c] -1, 2, 4-triazolo [4, 3-a] piridina; 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- ( 2-metoxifenil) -9H-pirazolo[3,4-c]-l,2,4-triazolo[4,3-a] piridina; 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- (tien-2-il) -9H-pirazolo [3, 4-c] -1, 2, -triazolo [4, 3-a] piridina; 3- (2-Clorofenil) -9-ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-9H-pirazolo [3, -c] -1, 2, -triazolo [4, 3-a] piridina; 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- (2-yodofenil) -9H-pirazolo [3,4-c]-l,2,4-triazolo[4, 3-a] pi idina ; 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- (2-trifluorometilfenil) -9fi-pirazolo [3,4-c]-l,2,4-triazolo[4,3-a]piridina; y 5, 6-Dihidro-7-etil-9- (4-fluorofenil) -3- (1-metilciclohex-l-il ) -9#-pirazólo [3,4-c]-l,2,4-triazolo[4,3-ajpiridina; y sus sales y solvatos farmacéuticamente aceptables. Los compuestos particularmente preferidos de fórmula (I) incluyen 9-ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- (2-tienil) -9#-pirazolo [3, -c] -1, 2, -triazolo [4, 3-a]piridina y 9-ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- ( terc-butil ) -9H-pirazolo [3, 4-c] -1, 2, 4-triazolo [4, 3-ot]piridina y sus sales y solvatos farmacéuticamente aceptables. La síntesis de los compuestos de fórmula (I) se describe en el documento WO-A-96/39408. Con preferencia, un agonista del receptor ß2-adrenérgico usado en una combinación conforme a la invención es un agonista del receptor p2-adrenérgico selectivo, es decir, tiene una mayor afinidad por el receptor 32-adrenérgico que por los otros receptores ß-adrenérgicos conocidos. Con preferencia, la afinidad de dichos agonistas del receptor 2-adrenérgico selectivos es al menos 100 veces mayor por el receptor P2-adrenérgico cuando se compara con su afinidad por los otros receptores ß adrenérgicos . Los agonistas preferidos del receptor 32-adrenérgico para usar en la invención incluyen salmeterol , formoterol y Sus sales y solvatos farmacéuticamente aceptables. Combinaciones particularmente preferidas incluyen: 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- (2-tienil ) -9H-pirazolo [3, 4-c] -1, 2, 4-triazolo [4, 3-a] piridina, o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables y salmeterol, o una de. sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables ; 9-Ciclópentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- (2-tienil) -9H-pirazolo [3, -c] -1, 2, -triazolo [4, 3-a] piridina, o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables y formoterol, o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables; 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- ( terc-butil ) -9H-pirazolo [3, 4-c] -1, 2, -triazolo [4, 3-a] piridina, o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables y salmeterol, o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables; y 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-étil-3- ( terc-butil) -9H-pirazolo [3, 4-c] -1, 2, 4-triazolo [4, 3-a] piridina, o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables y formoterol, o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables. Opcionalmente, se puede utilizar. un inhibidor selectivo de PDE4 o un agonista del receptor 2-adrenérgico usado conforme a la invención en forma de una sal o solvato farmacéuticamente aceptable. Dicha sal puede ser una sal de adición de ácidos o de bases. Las sales de adición de ácidos adecuadas se forman de ácidos que forman sales no tóxicas y ejemplos de los cuales son las sales hidrocloruro, hidrobromuro, hidroyoduro, sulfato, bisulfato, nitrato, fosfato, fosfato ácido, acetato, maleato, fumarato, lactato, tartrato, citrato, gluconato, succinato, sacarato, benzoato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato y pamoato . Las sales de bases adecuadas se forman de bases que forman sales no tóxicas y son ejemplos las sales de sodio, potasio, aluminio, calcio, magnesio, cinc y dietanolamina .

Puede encontrarse una revisión de sales adecuadas en Berge et al., J. Pharm. Sci., 66, 1-19, 1977. Los solvatos farmacéuticamente aceptables de los inhibidores selectivos de PDE4 y los agonistas del receptor 2-adrenérgico usados conforme a la invención, o sus sales, incluyen sus hidratos. Los inhibidores selectivos de PDE4 y los agonistas del receptor 2-adrenérgico de la invención pueden existir en una o más formas polimórficas . Los inhibidores selectivos de PDE4 y los agonistas del receptor 2-adrenérgico de la invención (en lo sucesivo "compuestos de la Invención") pueden contener uno o más átomos de carbono asimétricos y, por tanto, existir en dos o más formas estereoisoméricas (por ejemplo, una realización preferida es R, R' -formoterol ) . Cuando tales agonistas contengan un grupo alquenilo o alquenileno, puede presentarse también isomería cis/trans (o Z/E) . La presente invención incluye estos estereoisómeros individuales de los compuestos de la invención y, cuando sea apropiado, las formas tautómeras individuales de los mismos, junto con sus mezclas . La separación de diastereoisómeros o isómeros cis y trans puede conseguirse por técnicas convencionales, por ejemplo, por cristalización fraccionada, cromatografía o HPLC de una mezcla de estereoisómeros de un compuesto de la invención o de una de sus sales o derivados adecuados. También se puede preparar un enantiómero individual de un compuesto de la invención a partir del intermedio ópticamente puro correspondiente o por resolución, tal como por HPLC del racemato correspondiente usando un soporte quiral adecuado o por cristalización fraccionada de las sales diastereoisoméricas formadas por reacción del racemato correspondiente con un ácido o base ópticamente activo adecuado, según sea lo más apropiado. La presente invención también incluye todas las variaciones isotópicas adecuadas de un compuesto de la invención o de una de sus sales farmacéuticamente aceptables. Se define una variación isotópica de un compuesto de la invención o de una de sus sales farmacéuticamente aceptables como aquella en la que al menos un átomo está reemplazado por un átomo que tiene el mismo número atómico pero una masa atómica diferente de la masa atómica encontrada normalmente en la naturaleza. Ejemplos de isótopos que pueden incorporarse en compuestos de la invención y en sus sales farmacéuticamente aceptables incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxigeno, fósforo, azufre, flúor y cloro tales como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 170, 180, 31P, 32P, 35S, 18F y 36C1, respectivamente. Ciertas variaciones isotópicas de los compuestos de la invención y de sus sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, aquellas en las que se incorpora un isótopo radiactivo tal como 3H o 14C, son útiles en estudios de distribución en los tejidos de fármacos y/o sustratos. Los isótopos tritio, es decir, 3H, y carbono 14, es decir, 1C, son particularmente preferidos por su facilidad de preparación y de detección. Además, la sustitución con isótopos como el deuterio, es decir, 2H, puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas originadas por la mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, una mayor semivida in vivo o menores requerimientos de dosificación y, por tanto, pueden ser preferidos en algunas circunstancias.

Los tipos de enfermedades que se pueden tratar usando las combinaciones de la presente invención incluyen, aunque no quedan limitadas a las mismas, asma, broncoconstricción crónica o aguda, bronquitis crónica, obstrucción de las vías respiratorias menores, enfisema, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , COPD con bronquitis crónica, enfisema pulmonar o disnea asociada con el mismo y COPD que se caracterice por obstrucción irreversible y progresiva de las vías respiratorias.

Asma Una de las enfermedades respiratorias más importantes que puede tratarse con las combinaciones de agentes terapéuticos de la presente invención es asma, un trastorno crónico, cada vez más común, presente en todo el mundo y caracterizado por obstrucción reversible intermitente de las vías respiratorias, hipersensibilidad de las vías respiratorias e inflamación. La causa del asma no se ha determinado todavía, pero la expresión patológica más común del asma es la inflamación de las vías respiratorias, la cual puede ser significativa, incluso en las vías respiratorias de pacientes con asma leve. Esta inflamación conduce a sucesos reflejos en las vías respiratorias que producen la extravasación de proteínas plasmáticas, disnea y broncoconstricción. Tomando como base1 estudios de biopsias y lavados bronquiales se ha demostrado inequívocamente que el asma implica la infiltración por células cebadas, eosinófilos y linfocitos T en las vías respiratorias del paciente. El lavado broncoalveolar (BAL) en asmáticos atópicos muestra la activación de interleuquina (IL)-3, IL-4, IL-5 y el factor estimulador de colonias de granulocitos/macróf gos (GM-CSF) que sugiere la presencia de una población de linfocitos T como los linfocitos T auxiliares 2 (Th-2) . Las combinaciones de agentes terapéuticos de la presente invención son útiles en el tratamiento de asma atópica y no atópica. El término "atopía" se refiere a la predisposición genética hacia el desarrollo de reacciones de hipersensibilidad tipo I (inmediatas) contra los antígenos del entorno comunes. La manifestación clínica más corriente es rinitis alérgica, aunque se producen con menos frecuencia asma bronquial, dermatitis atópica y alergia a alimentos. Por consiguiente, la expresión "asma atópica" tal y como se usa en la presente memoria, se pretende que sea sinónimo de "asma alérgica", es decir, asma bronquial que " es una manifestación alérgica en una persona sensibilizada. La expresión "asma no atópica" tal y como se usa en la presente memoria se pretende que se refiera al resto de asmas, especialmente asma esencial o "verdadera", que está provocada por una diversidad de factores, incluyendo ejercicio intenso, partículas irritantes, estrés psicológico y factores similares.

Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (COPD) Las combinaciones de agentes terapéuticos de la presente invención son además útiles en el tratamiento de COPD o COAD, incluyendo bronquitis crónica, enfisema pulmonar o disnea asociada con los mismos. La COPD se caracteriza por una obstrucción poco reversible y progresiva de las vías respiratorias. La bronquitis crónica se asocia con hiperplasia e hipertrofia de las glándulas que segregan moco de la submucosa en las vías respiratorias cartilaginosas grandes. La hiperplasia de células de Goblet, infiltración de células inflamatorias en la mucosa y submucosa, edema, fibrosis, tapones de moco y músculo liso agrandado se encuentran todas en los bronquiolos terminales y respiratorios. Se sabe que las pequeñas vías respiratorias son el principal sitio de obstrucción de las vías respiratorias. El enfisema se caracteriza por destrucción de la pared alveolar y pérdida de elasticidad del pulmón. También se han identificado una serie de factores de riesgo asociados con la incidencia de COPD. Está bien establecida la asociación entre tabaco y COPD. Otros factores de riesgo incluyen exposición a polvo de carbón y diversos factores genéticos. Véase Sandford et al . , "Genetic risk factors for chronic obstructive pulmonary disease", Eur. Respir. J. , 10 1380-1391, 1997. La incidencia de COPD va en aumento y representa una carga económica significativa en las poblaciones de países industrializados. La COPD también se presenta en sí misma clínicamente con un amplio margen de variación desde la bronquitis crónica simple sin incapacidad hasta pacientes en un estado gravemente incapacitado con insuficiencia respiratoria crónica. La COPD se caracteriza por inflamación de las vías respiratorias, como es el caso del asma, pero las células inflamatorias que se han encontrado en el líquido de lavados broncoalveolares y en esputos de pacientes son neutrófilos y macrófagos en lugar de eosinófilos. También se han encontrado elevados niveles de mediadores inflamatorios en pacientes con COPD, incluyendo IL-8,,. LTB4 y TNF-oc, y se ha encontrado que el epitelio y el subepitelio superficial de los bronquios de tales pacientes tienen infiltraciones de linfocitos T y macrófagos. El alivio sintomático para pacientes con COPD puede proporcionarse usando broncodilatadores de agonistas ß y broncodilatadores anticolinérgicos, pero el progreso de la enfermedad permanece inalterado. Se ha tratado COPD usando teofilina, pero sin demasiado éxito, debido en parte a su propensión a producir efectos indeseados. También han fallado los esteroides en mantenerse como agentes prometedores para el tratamiento satisfactorio en COPD ya que son relativamente ineficaces como agentes antiinflamatorios. Por consiguiente, el uso de combinaciones de agentes terapéuticos de la presente invención para tratar COPD y sus enfermedades de las vías respiratorias obstruidas relacionadas e incluidas representa un avance significativo en la técnica. La presente invención no está limitada a ningún modo de acción particular o a ninguna hipótesis en cuanto a la forma en que se han obtenido los objetivos terapéuticos deseados utilizando las combinaciones de agentes terapéuticos de la presente invención.

Bronquitis y bronquiectasias Conforme a las actividades inhibidoras particulares y diversas descritas antes que poseen las combinaciones de agentes terapéuticos de la présente invención, éstas son útiles en el tratamiento de bronquitis de cualquier tipo, etiología o patogénesis, incluyendo, por ejemplo, bronquitis aguda que tiene un curso corto pero severo y está causada por exposición al frío, respirar sustancias irritantes o por una infección aguda; bronquitis catarral que es una forma de bronquitis aguda con una descarga mucopurulenta profusa; bronquitis crónica que es una forma continuada a largo plazo de bronquitis con una tenencia más o menos acentuada a re.currencia después de etapas de inactividad, debida a ataques repetidos de bronquitis aguda o enfermedades generales crónicas, caracterizada por ataques de tos, por expectoración ya sea ligera o profusa y por cambios secundarios en el tejido pulmonar; bronquitis seca que está caracterizada por secreción ligera de esputos con tos; bronquitis asmática infecciosa que es un síndrome marcado por el desarrollo de síntomas de broncoespasmo seguido de infecciones del tracto respiratorio en personas con asma; bronquitis productiva que es bronquitis asociada con una tos productiva. El uso de combinaciones de agentes terapéuticos de la presente invención para tratar asma atópica o asma no atópica, COPD u otra enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias se puede demostrar por el uso de una serie de modelos diferentes conocidos en la técnica que incluyen los modelos descritos a continuación^ Actividad broncodilatadora - El AMPc no solo está implicado en la relajación del músculo liso, sino también ejerce una influencia inhibidora general sobre la proliferación del músculo liso de las vías respiratorias, los cuales se pueden producir ambos por la elevación del AMPc por el componente de PDE4 de la invención. La hipertrofia e hiperplasia del músculo liso de las vías respiratorias se pueden modular por el AMPc y estos estados son características morfológicas comunes del asma crónica.

Actividad broncoespasmolitica in vitro - En el siguiente procedimiento de ensayo se demuestra la capacidad de las combinaciones de agentes terapéuticos de la presente invención para provocar la relajación del músculo liso de la tráquea de cobayos. Se sacrifican cobayos (350 a 500 g) con pentotal sódico (100 mg/kg i.p.). Se disecciona la tráquea y se separa una sección de 2 a 3 cm de longitud. Se corta transversalmente la tráquea en el plano transversal en placas de cartílago alternadas para proporcionar anillos-de tejido de 3 a 5 mm de profundidad. Se descartan los anillos distal y proximal . Los anillos individuales se montan verticalmente en soportes de acero inoxidable, uno de los cuales se fija en la base de un baño de órganos, mientras que el otro se fija a un transductor isométrico. Los anillos se introducen en solución de Krebs (composición uM: NaHC03 25; NaCl 113; KC1 4,7; MgS04-7H20 1,2; KH2P04 1,2; CaCl2 2,5; glucosa 11,7) a 37°C y se gasifican con O2/CO2 (95:5 v/v) . Los anillos preparados de esta forma se contraen por estimulación de campo. Para determinar la actividad espasmolítica, se disuelven combinaciones de ensayo de agentes terapéuticos de la presente invención en solución salina fisiológica y se añaden en cantidades crecientes al baño de órganos en intervalos de 5 minutos para proporcionar una curva concentración - efecto acumulativa . En el modelo de ensayo anterior, las combinaciones de agentes terapéuticos de la presente invención inhiben por lo general la contracción estimulada por campo de las preparaciones de anillos de tráquea de cobayos en concentraciones en el intervalo de 0,001 a 1,0 µ?.

Modelo de hiperreactividad bronquial inducido por ozono - Se demuestra la capacidad de combinaciones de agentes terapéuticos de la presente invención para prevenir la mayor sensibilidad de las vías respiratorias a estímulos nocivos, también conocida como hiperreactividad bronquial, determinando los efectos dé estos agentes sobre la actividad de la sensibilidad pulmonar en cobayos. Se tratan con anticipación cobayos adultos (300 a 600 g) y se preparan conforme al procedimiento de Yeadon et al . , 1992, Pulm. Pharmacology, 5, 101-112. Se controla la sensibilidad de las vías respiratorias a una serie de estímulos en estado basal y después de diversas intervenciones que producen cambios en los mecanismos pulmonares. Los artículos de ensayo se administraron i.t. o por aerosol en diversos tiempos antes de la estimulación provocada. El tratamiento previo con ozono en animales control produjo un aumento de 3 a 100 veces en la sensibilidad pulmonar, el cual fue bloqueado de forma relacionada a la dosis por las combinaciones de agentes terapéuticos de la invención. En el modelo de ensayo anterior, las combinaciones de agentes terapéuticos de la presente invención mostraron por lo general actividad antiinflamatoria en dosis en el intervalo de 0,001 a 0,3 mg/kg i.t.

Relajación de bronquios humanos - Se obtienen muestras de pulmones humanos diseccionadas durante cirugía para el cáncer dentro de los tres días siguientes a su extirpación. Se separan los bronquios pequeños (diámetro interno aproximadamente 2 a 5 mm) , se cortan en segmentos y sé colocan en ampollas de almacenamiento de nitrógeno líquido de 2 mi llenas con suero bovino fetal (FCS) que contiene dimetil sulfóxido 1,8M (DMSO) y sacarosa 0,1M como agentes crioprotectores . Las ampollas se colocan en una caja de poliestireno (11 x 11 x 12 cm) y se congelan lentamente a una velocidad media de enfriamiento de aproximadamente 0,6°C/minuto en un congelador mantenido a -70°C. Después de 3 a 15 horas, se transfieren las ampollas a nitrógeno líquido (-196°C) en el que se almacenan hasta su uso. Antes de usar, se exponen los tejidos durante 30 a 60 minutos a -70°C antes de descongelarse en 2,5 minutos colocando las ampollas en un baño de agua a 37°C. A continuación, se aclaran los segmentos bronquiales colocándolos en una placa que contenia solución de Krebs-Henseleit (uM: NaCl 118; KC1 4,7; MgS04 1,2; CaCl2 1,2; KH2P04 1,2, NaHC03 25, glucosa 11, EDTA 0,03) a 37°C, se cortan en anillos y se suspenden en baños de órganos de 10 mi para el registro de la tensión isométrica bajo una carga predeterminada de aproximadamente 1 g. Se inducen aumentos posteriores de tensión mediante la aplicación de estimulación de campo, que se conoce por inducir la activación de nervios en la muestra de las vías respiratorias y generar tensión mediante la liberación de acetilcolina y otros mediadores neuralmente derivados. Las curvas de concentración-respuesta se producen mediante adiciones acumuladas, añadiéndose cada concentración cuando se ha producido el máximo efecto por la concentración previa. Se añade papaverina (300 µ?) al finalizar la curva de concentración-respuesta para inducir la relajación completa de los anillos bronquiales. Este efecto se toma como relajación del 100%. En el modelo de ensayo anterior, las combinaciones de agentes terapéuticos de la presente invención producen por lo general la relajación relacionada con la concentración de preparaciones de anillos de bronquios humanos en concentraciones en el intervalo de 0,001 a 1,0 µ?, siendo las realizaciones preferidas activas en concentraciones en el intervalo de 5,0 nM a 500 nM.

Supresión de la broncoconstricción inducida por capsaicina Se anestesian con fenobarbital sódico (100 mg/kg intraperitonealmente) cobayos macho Dunkin-Hartley (400 a 800 g) con acceso libre a comida y agua antes del experimento. Los animales, mantenidos a 37°C con un lecho calefactado, controlado por un termómetro rectal, se ventilan mediante una cánula en la tráquea (aproximadamente 8 ml/kg, 1Hz) con una mezcla de aire y oxígeno (45:55 v/v) . La ventilación se controla en la tráquea por un neumotacógrafo conectado a un transductor de presión diferencial en línea con la bomba respiratoria. Los cambios de presión en el tórax se controlan directamente a través de una cánula intratorácica, usando un transductor de presión diferencial de modo que se puede medir y registrar la diferencia de presión entre la tráquea y el tórax. A partir de estas medidas de flujo de aire y presión transpulmonar, se calculan la resistencia de las vías respiratorias (Ri cm H20/l/s) y la compliancia (Cddyn) con un analizador respiratorio electrónico digital para cada ciclo respiratorio. Se registran la tensión arterial y la frecuencia cardíaca de la arteria carótida usando un transductor de presión. Cuando los valores básales para la resistencia y la compliancia son estables, se induce un episodio agudo de broncoconstricción mediante una inyección intravenosa de gran tamaño de capsaicina. La capsaicina se disuelve en etanol al 100% y se diluye con solución salina tamponada con fosfato. Las combinaciones de ensayo de los agentes terapéuticos de la presente invención se administran cuando la respuesta a la capsaicina es estable, lo que se calcula después de 2 a 3 de tales administraciones a intervalos de 10 minutos. La reversión de la broncoconstricción se valora durante 1 a 8 horas después de la instilación intratraqueal o intraduodenal o la inyección intravenosa de gran tamaño. La actividad broncoespasmolitica se expresa como el % de inhibición de la resistencia máxima inicial (RD) después de la infusión de capsaicina. Los valores de ED50 representan la dosis que causa una reducción del 50% del aumento en la resistencia inducida por capsaicina. La duración de la acción se define como el tiempo en minutos en el que se reduce la broncoconstricción en un 50% o más. Los efectos sobre la tensión arterial (BP) y frecuencia cardiaca (HR) se caracterizan por los valores de ED2o, es decir, las dosis que reducen la BP o HR en un 20%, medidas 5 minutos después de la administración. En el modelo de ensayo anterior, las combinaciones de agentes terapéuticos de la presente invención presentan por lo general actividad broncodilatadora en dosis en el intervalo de 0,001 a 0,1 mg/kg i.t. [intratraquealmente] . Además, la combinación administrada i.t. presenta al menos un efecto inhibidor aditivo sobre los broncoespasmos, siendo capaz cada componente solo de inhibir más del 50% de la respuesta de control observada.

Neutrofilia pulmonar inducida por LPS - El reclutamiento y activación de neutrófilos en los pulmones se considera una característica patológica importante en la COPD y en el asma severa. Por consiguiente, la inhibición de cualquiera de estas dos consecuencias o ambas en animales proporciona una evidencia que apoya la utilidad de la presente invención. Se tratan con antelación con los artículos de ensayo solos o combinados por inhalación o instilación intratraqueal (i.t.) bajo anestesia general ratas macho Wistar-Albino (150 a 250 g) o cobayos macho Dunkin-Hartley (400 a 600 g) . Después de 1 a 24 horas tras la administración del compuesto, los animales se estimulan de forma provocada con un aerosol por inhalación de liopolisacárido bacteriano (LPS ) suficiente para inducir durante las siguientes 1 a 24 horas una pronunciada neutrofilia pulmonar. La neutrofilia se valora por recuento celular en lavados bronquiales o por determinación de productos neutrófilos en lavados pulmonares o en tejido. En este sistema de ensayo, los agentes terapéuticos de la presente invención presentan por lo. general una actividad antiinflamatoria en dosis que varían de 0,0001 a 0,1 mg/kg i.t. De forma inesperada, la combinación administrada i.t. ejerce al menos un efecto aditivo sobre la inflamación, a pesar del hecho de que uno de los componentes no ejerce por si mismo un efecto antiinflamatorio significativo. Además, se pueden observar efectos antiinflamatorios equivalentes de una dosis elevada de uno de los componentes con dosis menores cuando se usan en combinación como en esta invención, minimizando así los efectos sistémicos indeseados .

Ensayo en cobayos alérgicos - Un ensayo para evaluar el impacto terapéutico de las combinaciones de agentes terapéuticos de la presente invención sobre el síntoma de disnea y broncoespasmos, es decir, respiración costosa o dificultad respiratoria y mayor resistencia pulmonar y sobre el síntoma de inflamación, es decir: neutrofilia y eosinofilia pulmonar, utiliza cobayos Dunkin-Hartley (400 a 600 g de peso corporal) . . La albúmina de huevo (EA) , calidad V, cristalizada y liofilizada, hidróxido de aluminio y maleato de mepiramina usados en este ensayo están disponibles de forma comercial. La estimulación provocada y posteriores ¦ lecturas respiratorias se llevan a cabo en una caja de plástico transparente con unas dimensiones internas de 25,4 x'15,24 x 10,16 cm. Las secciones de cabeza y cuerpo de la caja pueden separarse. En uso, las dos se sujetan firmemente mediante pinzas y se mantiene un cierre hermético al aire entre las cámaras por medio de una junta blanda de caucho. Por el centro del extremo de la cabeza de la cámara se inserta un nebulizador a través de un cierre hermético al aire y cada extremo de la caja tiene también una salida. Se inserta un neumotacógrafo en un extremo de la caja y se acopla a un transductor de presión volumétrica que se conecta a su vez a un dinógrafo mediante los adaptadores apropiados. Mientras el antigeno se aplica en forma de aerosol, las salidas están abiertas y el neumotacógrafo está aislado de la cámara. Las salidas se cierran entonces y se conectan el neumotacógrafo y la cámara durante el registro de los patrones respiratorios. Para la estimulación provocada, se colocan 2 mi de una solución al 3% de antigeno en solución salina en cada nebulizador y se genera el aerosol con aire desde una pequeña bomba de diafragma que funciona a 68,96 kPa y un caudal de 8 1/min.

Los cobayos se sensibilizan inyectando por vía subcutánea e intraperitoneal 1 mi de una suspensión que contiene 1 mg de EA y 200 mg de hidróxido de aluminio en solución salina. Se usan entre los días 12 y 24 después de la sensibilización. Con el fin de eliminar el componente histaminico de la respuesta, se tratan previamente los cobayos intraperitonealmente, 30 minutos antes de la estimulación provocada con aerosol, con 2 mg/g de mepiarmina. Los cobayos se exponen entonces a un aerosol de EA al 3% en solución salina exactamente durante 1 minuto y luego se registran los perfiles respiratorios durante otros 30 minutos. A continuación, se determina la inflamación pulmonar después de la muerte durante un período de 1 a 48 horas. La duración de la disnea continua se mide a partir de las medidas respiratorias. Las combinaciones de ensayo de agentes terapéuticos de la presente invención se administran por lo general i.t. o por aerosol de 0,5 a 4 horas antes de la estimulación provocada. Las combinaciones de compuestos están disueltas en solución salina o en disolventes biocompatibles . La actividad de los compuestos se determina en base a su capacidad para reducir la magnitud y duración de los síntomas de disnea y broncoespasmos y/o la magnitud de la inflamación pulmonar en comparación con un grupo control tratado con vehículo. Los ensayos de las combinaciones de agentes terapéuticos de la presente invención se evalúan sobre una serie de dosis y se obtiene una ED50 que se define como la dosis (mg/kg) que inhibirá la duración de los síntomas en un 50%.

Actividad antiinflamatoria - La actividad antiinflamatoria de las combinaciones de agentes terapéuticos de la presente invención se demuestra por la inhibición de la activación de eosinófilos y neutrófilos. En este ensayo se obtienen muestras de sangre (50 mi) de voluntarios no atópicos con números de eosinófilos que varían de 0,06 a 0, 47 x 109 l'1. Se recoge la sangre venosa en tubos de centrífuga que contienen 5 mi de citrato trisódico (3,8%, pH 7,4). La sangre anticoagulada se diluye (1:1, v:v) con solución salina tamponada con fosfato (PBS, que no contiene calcio ni magnesio) y se estratifica sobre 15 mi de Percoll isotónico (densidad 1,082 - 1,085 g/ml, pH 7,4) en un tubo de centrífuga de 50 mi. Después de centrifugar (30 minutos, 1000 x g, 20°C) se aspiran cuidadosamente y se descartan las células mononucleares en la interfase plasma/Percoll. El sedimento de neutrófilos/eosinófilos/eritrocitos (aproximadamente 5 mi en volumen) se resuspende suavemente en 35 mi de solución de cloruro amónico isotónico (NH4C1, 155 mM; KHC03, 10 mM; EDTA, 0,1 mM; 0-4°C) . Después de 15 minutos, se lavan las células dos veces (10 min, 400 x g, 4°C) en PBS que contenía suero bovino fetal (2%, FCS) . Para separar los eosinófilos y neutrófilos se usa un sistema de separación magnético. Este sistema puede separar las células en suspensión conforme a marcadores de superficie y comprende un imán permanente en el que se coloca una columna que incluye una matriz de acero agnetizable. Antes de usar, se equilibra la columna con PBS/FCS durante 1 hora y luego se infunde con PBS/FCS enfriada en hielo de una forma progresiva mediante una jeringa de 20 mi. Se fija una aguja hipodérmica 21G a la base de la columna y se deja que 1 a' 2 mi de tampón enfriado en hielo salgan a través de la aguja. Después de centrifugar los granulocitos, se aspira el líquido sobrenadante y se resuspenden suavemente las células con 100 µ? de partículas magnéticas (anticuerpos monoclonales anti-DC16, conjugados con partículas superparamagnéticas ) . La mezcla de eosinófilos/neutrófilos/partículas magnéticas anti-CD16 sé incuba en hielo durante 40 minutos y luego se diluye hasta 5 mi con PBS/FCS enfriado en hielo. La suspensión celular se introduce lentamente en la parte superior de la columna y se abre la tapa permitiendo que las células se muevan lentamente en la matriz de acero. La columna se lava entonces con PBS/FCS (35 mi) que se añade cuidadosamente en la parte superior de la columna para no alterar los neutrófilos marcados magnéticamente todavía atrapados en la matriz de acero. Los eosinófilos no marcados se recogen en un tubo de centrífuga de 50 mi y se lavan (10 minutos, 400 x g, 4°C) . El sedimento resultante se resuspende en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) , de modo que se puedan valorar los- números y pureza de las células antes de usar. La columna de separación se retira del imán y se eluye la fracción de neutrófilos. La columna se lava entonces con PBS (50 mi) y etanol (absoluto) y se almacena a 4°C. Se realiza el recuento de células totales con un contador microcelular . Se añade una gota de solución lisógena a la muestra, que después de 30 segundos se vuelve a contar para valorar la contaminación con eritrocitos. Se preparan muestras de citospina en un aparato Shandon Cytospin 2 Cytospinner (muestras de 100 µ?, 3 minutos, 500 rpm) . Estas preparaciones se tiñen y se determinan los recuentos celulares diferenciales por microscopía visible, examinando al menos 500 células. La viabilidad celular se valora por exclusión en azul de tripano. Los eosinófilos y neutrófilos se diluyen en HBSS y se extraen con pipetas en placas de microvaloración de 96 pocilios (MTP) a 1 - 10 x 103 células/pocilio. Cada pocilio contiene una muestra de 200 µ? que comprende: suspensión celular, 100 µ?; HBSS, 50 µ?; lucigenina, 10 µ?; estímulo de activación, 20 µ?; y compuesto de ensayo, 20 µ? . Las muestras se incuban con el compuesto de ensayo o vehículo durante 10 minutos antes de añadir un estímulo de activación fMLP (1-10 µ?) o C5a (1-100 nM) disuelto en dimetil sulfóxido y se diluye seguidamente en tampón, tal que la máxima concentración de disolvente usada sea 1% (a 100 µ de compuesto de ensayo) . Se agitan las MTP para facilitar la mezcla de las células y el medio y se colocan las MTP en un luminómetro. Se mide la quimioluminiscencia total y el perfil temporal de cada pocilio simultáneamente durante 20 minutos y los resultados se expresan como unidades arbitrarias, o como un porcentaje de ' la quimioluminiscencia inducida por fMLP en ausencia de compuesto de ensayo. Los resultados se ajustan a la ecuación de Hill y se calculan los valores de ICS0 automáticamente . Por lo geneal, las combinaciones de los agentes terapéuticos de la presente invención son activas en el procedimiento de ensayo anterior en concentraciones en el intervalo de 0,0001 µ? a 0,5 µ?, siendo las realizaciones preferidas activas en concentraciones en el intervalo de 0,1 nM a 100 nM. La actividad antiinflamatoria de las combinaciones de agentes terapéuticos de la presente invención se demuestra además por la inhibición de la extravasación de plasma en las vías respiratorias de ratas. En este ensayo se toma tejido traqueal y se determina el grado de pérdida de plasma. Este ensayo se refiere igualmente a otras enfermedades inflamatorias crónicas de las vías respiratorias que incluyen COPD, pero sin estar limitadas a la misma, y por consiguiente no se recapitula en esta sección . Se anestesian con pentobarbitona sódica ratas albinas Wistar (150 a 200 g) o cobayos Dunkin-Hartley (450-600 g) y se instalan cánulas venosas y arteriales. Se administra i.v. (30 mg/kg) colorante azul de Evans para ligar las proteínas plasmáticas. Después de 10 minutos, se administran los agentes de ensayo i.t. y 10 minutos después se administra capsaicina i.v. (30 ug/kg) . 30 minutos después se extirpa tejido traqueal, se extrae durante la noche en formamida y se lee la absorbancia a 620 nm. En algunos experimentos se invierte el orden de dosificación tal que los compuestos se administraron antes del azul de Evans y el estimulo inflamatorio. En el modelo de ensayo anterior, las combinaciones de agentes terapéuticos de la presente invención presentan por lo general actividad antiinflamatoria en dosis en el intervalo de 0,001 a 0, 1 mg/kg i.t. A partir de lo anterior puede observarse que las combinaciones de agentes terapéuticos de la presente invención son útiles para el tratamiento de enfermedades inflamatorias u obstructivas de las vías respiratorias u otros estados que impliquen obstrucción de las vías respiratorias. En particular, son útiles para el tratamiento de asma bronquial. A la vista de su actividad antiinflamatoria y de su influencia sobre la hiperreactividad de las vías respiratorias, las combinaciones de agentes terapéuticos de la presente invención son útiles para el tratamiento, en particular el tratamiento profiláctico, de enfermedades obstructivas o inflamatorias de las vías respiratorias. Así, mediante una administración continuada y regular durante períodos prolongados de tiempo, las combinaciones de compuestos de la presente invención son útiles para proporcionar protección por anticipado contra la recurrencia de broncoconstricción u otros ataques sintomáticos consecuencia de enfermedades obstructivas o inflamatorias de las vías respiratorias. Las combinaciones de compuestos de la presente invención son también útiles para el control, alivio o reversión de estados básales de tales enfermedades. Haciendo referencia a su actividad broncodilatadora, las combinaciones de agentes terapéuticos de la presente invención son útiles como broncodilatadores, por ejemplo, en el tratamiento de broncoconstricción crónica o aguda y para el tratamiento sintomático de enfermedades obstructivas o inflamatorias de las vías respiratorias. Las enfermedades obstructivas o inflamatorias a las que se aplica la presente invención incluyen: asma; neumoconiosis ; neumonía eosinofílica crónica; enfermedad pulmonar o de las vías respiratorias obstructiva crónica (COAD o COPD) ; y síndrome de dificultad respiratoria en el adulto (ARDS) , así como la exacerbación de hiperreactividad de las vías respiratorias consecuencia de una terapia f rmacológica, por ejemplo, terapia con aspirina o con agonistas ß. Los inhibidores selectivos de PDE4 y los agonistas del receptor P2-adrenérgico de la presente invención se pueden administrar solos o combinados, aunque por lo general se administrarán mezclados con un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Los inhibidores selectivos de PDE4 y los agonistas del receptor P2-adrenérgico de la presente invención se administran preferiblemente por inhalación y se liberan convenientemente en forma de un polvo seco (solo o mezclado, por ejemplo, una mezcla con lactosa) desde una presentación de inhalador de polvo seco o un pulverizador de aerosol desde un recipiente a presión, bomba, pulverizador, atomizador (preferiblemente un atomizador que use la electrohidrodinámica para producir una niebla fina) o nebulizador con o sin el uso de un propulsor adecuado, po.r ejemplo, diclorodifluormetano, triclorofluormetano, diclorotetrafluoretano, un hidrofluoralcano tal como 1, 1, 1, 2-tetrafluoretano (HFA 134A™) o 1,1,1,2,3,3,3-heptafluorpropano (HFA 227EA*") , dióxido de carbono, otro hidrocarburo perfluorado tal como Perflubron™ u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol a presión, la dosis unitaria puede determinarse disponiendo una válvula para que libere una cantidad medida. El recipiente a presión, bomba, pulverizador, atomizador o nebulizador puede contener una solución o suspensión de compuesto activo, por ejemplo, usando una mezcla de etanol (opcionalmente, etanol acuoso) o un agente adecuado para liberar por dispersión, solubilización o dilución y el propulsor como disolvente, que puede contener además un lubricante, por ejemplo, trioleato de sorbitán. Se pueden formular cápsulas, blisters y cartuchos (realizados, por ejemplo, en gelatina o HP C) para usar en un inhalador o insuflador que contengan una mezcla de polvo del compuesto de la invención, una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón y un modificador del comportamiento tal como 1-leucina, manitol o estearato de magnesio. Antes de usar en una formulación de polvo seco o en una formulación de suspensión para inhalación, el compuesto de la invención se micronizará hasta un tamaño adecuado para liberar por inhalación (de forma típica considerado menos de 5 micrómetros) . La micronización se conseguirá por una serie de procedimientos, por ejemplo, molino de chorro en espiral, molino de chorro en lecho fluido o usando cristalización en fluido supercrítico . Una formulación en solución adecuada para usar en un atomizador que usa la electrohidrodinámica para producir una niebla fina puede contener de 1 µg a 10 mg de un compuesto de la invención por actuación y el volumen de cada actuación puede variar de 1 a 100 µ? . Una formulación típica puede comprender un compuesto de la invención, propilenglicol , agua estéril, etanol y cloruro sódico. Se pueden usar disolventes alternativos en lugar de propilenglicol, por ejemplo, glicerol o polietilenglicol . Las formulaciones de aerosol o polvo seco se disponen preferiblemente de modo que cada dosis medida o "aplicación" contenga de 1 a 4000 µg de un compuesto de la invención para administrar al paciente. La dosis diaria total con un aerosol variará en el intervalo de desde 1 g a 20 mg, que se pueden administrar en una única dosis o, más normalmente, en dosis divididas durante todo el día. La relación preferida, en peso (p/p) de inhibidor selectivo de PDE4 : agonista del receptor 2-adrenérgico usada dependerá de la combinación particular que se examine. Esto se debe a las diferencias en la potencia farmacológica de los compuestos individuales. En cualquier caso, el médico determinará la dosis real de cada compuesto que será la más adecuada para un paciente particular y ésta variará con la edad, peso y respuesta del paciente particular. Se apreciará que todas las referencias en la presente memoria al tratamiento incluyen el tratamiento curativo, paliativo y profiláctico.

Datos de ensayo - Inhibición de la liberación de elastasa de neutrófilos humanos aislados Se recogió sangre venosa (90 mi) de voluntarios humanos sanos de ambos sexos en 10 mi de citrato sódico al 3, 8% (v/v) y se dispensaron alícuotas de 8 mi en tubos de centrífuga de polipropileno de 15 mi que contenía cada uno 4 mi de dextrano al 6% (Peso Molecular medio 148.000) en Solución Salina Equilibrada de Hanks (HBSS) . La mezcla dextrano/sangre se homogeneizó suavemente por inversión y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 45 minutos para permitir la sedimentación de los eritrocitos. Se depositaron alícuotas de 16 mi del líquido sobrenadante rico en leucocitos sobre 10 mi de almohadillas Ficoll-Hypaque en tubos de centrífuga de polipropileno de 50 mi y los tubos se centrifugaron a 400g durante 35 minutos a 21°C. El plasma, la capa de células mononucleares y el Ficoll se retiraron dejando el sedimento rico en granulocitos . Los sedimentos se resuspendieron inicialmente en 10 mi de agua destilada enfriada en hielo durante 45 segundos para lisar los glóbulos rojos contamienntes, seguido por la adición a cada tubo de 10 mi de solución salina tamponada con fosfato (PBS) doblemente concentrada enfriada en hielo para restaurar la osmolaridad. Se volvieron a centrifugar las suspensiones a 200g durante 10 minutos a 4°C para generar sedimentos de neutrófilos. Se retiraron los líquidos sobrenadantes y los sedimentos se resuspendieron suavemente en un volumen total de 10 mi de HBSS enfriada en hielo usando una pipeta Pasteur. Se llevó a cabo un recuento leucocitario diferencial sobre la suspensión de neutrófilos resultante usando un analizador hematológico Beckman Coulter A. T5 y las células se almacenaron en hielo hasta el ensayo. Inmediatamente antes del ensayo, se extrajeron alícuotas de la suspensión de neutrófilos y se diluyeron hasta un recuento de 4 x 10s neutrófilos/ml de HBSS enfriada en hielo que contenía 2 U/ml de adenosina desaminasa. La inhibición de la liberación de elastasa inducida por fMLP se llevó a cabousando un volumen de ensayo de 160 µ? en placas de microvaloración de poliestireno de 96 pocilios. La liberación de elastasa se ensayó midiendo la velocidad de ruptura del sustrato sintético MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA. Para la medida de la liberación de elastasa, los pocilios de ensayo contenían 8 µ? de citocalasina B 100 µg/ml· (en DMSO al 10%/HBSS al 90%), 8 µ? de compuesto de ensayo (diluido en HBSS), 40 µ? de suspensión de neutrófilos y 96 µ? de MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA 156 µ? (en HBSS) . Las placas de ensayo se incubaron a 37°C durante 10 minutos antes de la adición de 8 µ? de fMLP 2 µ? (en HBSS) y se midió el valor de la velocidad de ruptura del sustrato a una ?=405 nm durante 3 minutos a 37 °C. Se determinó la liberación de elastasa basal mediante la adición de 8 µ? de HBSS en lugar de fMLP. Los datos reproducidos en la Tabla 1 siguiente son valores de IC5o, es decir, la concentración (en mM) de agente activo requerida para conseguir una inhibición del 50% de la liberación de elastasa inducida por fMLP. En el caso de los experimentos de combinación, se añadieron al ensayo 1000 nM de 9-ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- (2-tienil) -9H-pirazolo [3, 4-c] -1, 2, 4-triazolo [4, 3-a]piridina (C) y se generó entonces una curva de concentración - respuesta para formoterol (F) y salmeterol (S) .

Tabla 1 - Inhibición de la liberación de elastasa (valores de IC5o en nM) Se demuestra que la aplicación combinada de un agonista ß2 (formoterol o salmeterol) con un inhibidor de PDE4 (9-ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- ( 2-tienil ) -9H- pirazolo [3, 4-c] -1, 2, 4-triazolo [4, 3-a] piridina) produce una inhibición sinérgica de la función proinflamatoria de neutrófilos . Se consiguió una inhibición débil (orden µ?) de la liberación de elastasa inducida por fMLP en neutrófilos humanos aislados mediante el tratamiento individual con estos agentes farmacológicos y se mejoró notablemente esto hasta una inhibición potente (orden nM) mediante su aplicación combinada.

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES ?. Una combinación inhalada de (a) un inhibidor selectivo de PDE4 de fórmula: (l) o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables, en la que R1 es H, alquilo Ci-C3, alcoxi Ci-C6, alquenilo C2-C4, fenilo, -N(CH3)2, cicloalquilo C3-C6, (cicloalquil C3-C6) (alquilo C1-C3) o acilo Ci-C6, pudiendo estar los grupos alquilo, fenilo o alquenilo sustituidos con hasta dos grupos -OH, alquilo C1-C3 o -CF3 o con hasta tres halógenos; cada uno de R2 y R3 se selecciona independientemente del grupo formado por H, alquilo Ci-Cn, (alcoxi Ci~ C7) (alquilo C1-C7) , alquenilo C2-Ci4, cicloalquilo C3-C7, (cicloalquil C3-C7) (alquilo C1-C2) / un grupo (heterociclico C4-C7) (CH2)n saturado o insaturado en el que n es 0, 1 ó 2, que contiene como heteroátomo uno o más del grupo formado por oxigeno, azufre, sulfonilo, nitrógeno y NR4, siendo R4 H o alquilo Ci-C4; o un grupo de Fórmula (II) : en la que a es un número entero de 1 a 5; b y c son 0 ó 1; R5 es H, -OH, alquilo C-Cs, alquenilo C2-C5, alcoxi Ci~ C5, cicloalcoxi C3-C6, halógeno, -CF3; -C02R6, -CONR6R7, -NR6R7, -NO2 o -S02NR6R7, siendo cada uno de R6 y R7 independientemente H o alquilo C1-C4; Z es -O-, -S-, -S02-, -C0- o -N(R8)-, siendo R8 H o alquilo Ci-C4; e Y es alquileno C1-C5 o alquenileno C2-C6 opcionalmente sustituido con hasta dos grupos alquilo C1-C7 o cicloalquilo C3-C7; pudiendo estar cada uno de los grupos alquilo, alquenilo, cicloalquilo, alcoxialquilo o heterocíclico sustituidos con 1 a 14, preferiblemente 1 a 5 grupos alquilo Ci-C2, CF3 o halo; y cada uno de R9 y R10 se selecciona independientemente del grupo formado por H, alquilo Ci-C6, alcoxi Ci-C6, arilo C6-C10 Y ariloxi C6-Ci0; y (b) un agonista del receptor P2-adrenérgico .
2. 2. Una combinación según la reivindicación 1, en la que R1 es metilo, etilo o isopropilo.
3. 3. Una combinación según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que R3 es alquilo Ci-Cg, alquenilo C2-C6/ cicloalquilo C3-C7, (cicloalquil C3-C7) (alquilo Ci-C6) o fenilo opcionalmente sustituido con 1 ó 2 del grupo formado por H, -OH, alquilo Ci-C5 alquenilo C2-C5, alcoxi C1-C5, halógeno, trifluorometilo, -C02R6, -CONR6R7, -NR6R7 , -NO2 o -S02NR6R7, siendo cada uno de R6 y R7 independientemente H o alquilo C1-C4.
4. 4. Una combinación según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el inhibidor selectivo de PDE4 de fórmula (I) se selecciona de: 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3-fenil-9H-pi azolo[3,4-c]-l, 2, 4-triazolo [4, 3-a] piridina; 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- (furan-2-il) -9H-pirazolo [3,4-c]-l,2,4-triazolo[4, 3-a] piridina; 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- (2-piridil) -9H-pirazolo [3, -c] -1,2, 4-triazolo [4, 3-a] piridina; 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- ( 4-piridil ) -9H-pirazolo [3,4-c]-l,2, -triazolo [4, 3-a] piridina; 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- (3-tienil) -9H-pirazolo [ 3, -c] -1 , 2, 4-triazolo [4, 3-a] i idina; 3-Bencil-9-ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-9H-pirazolo [3,4-c]-l,2, 4-triazolo [ 4 , 3-a] piridina; 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3-propil-9H-pirazolo [3, 4-c] -1, 2, 4-triazolo [4, 3-a] piridina; 3, 9-Diciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-9fí-pirazolo [3, 4- c] -1,2, 4-triazolo [4, 3-a] piridina; 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- ( 1-metilciclohex-l-il) -9#-pirazolo [3, -c]-l, 2, 4-triazolo [4, 3-a] piridina; 3- (Terc-butil) -9-ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-9ff-pirazolo[3,4-c]-l,2,4-triazolo[4, 3- ] piridina; 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- (2-metilfenil ) -9H-pi azolo[3,4-c]-l,2,4-triazolo[4, 3-a] piridina; 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- (2-metoxifenil) -9H-pirazolo [3, 4-c] -1, 2, 4-triazolo [4, 3-oc] piridina; ^ 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- (tien-2-il) -9H-pirazolo [3,4-c]-l,2, 4-triazolo [4, 3-a] piridina; 3- (2-Clorofenil) -9-ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-9tf-pirazolo [3,4-c]-l,2, -triazolo [4, 3-a] piridina; 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- ( 2-yodofenil ) -9H-pirazolo[3,4-c]-l,2,4-triazolo[4, 3-a] piridina ; 9-Ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- (2-trifluorometilfenil) -9H-pirazolo [3, 4-c] -1,2, 4-triazolo [4, 3-a] piridina; y 5, 6-Dihidro-7-etil-9- (4-fluorofenil) -3- (1-metilciclohex-l-il) -9H-pirazolo [3, 4-c] -1,2, 4-triazolo [ 4 , 3-a] piridina; y sus sales y solvatos farmacéuticamente aceptables.
5. 5. Una combinación según la reivindicación 4, en la que el inhibidor selectivo de PDE4 de fórmula (I) se selecciona de 9-ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- (2- tienil) -9H-pirazolo [3, 4-c] -1, 2, 4-triazolo [ 4 , 3-a] piridina y 9-ciclopentil-5, 6-dihídro-7-etil-3- ( terc-butil ) -9H-pirazolo [3, 4-c] -1, 2, 4-triazolo [4, 3-a] piridina y sus sales y solvatos farmacéuticamente aceptables.
6. 6. Una combinación según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el agonista del receptor 2-adrenérgico se selecciona de salmeterol, formoterol y sus sales y solvatos farmacéuticamente aceptables .
7. 7. Una combinación según la reivindicación 1, en la que : el inhibidor selectivo de PDE4 de formula (I) es 9-ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- (2-tienil) -9H-pirazolo [3, 4-c] -1, 2, 4-triazolo [4, 3-o] piridina " o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables y el agonista del receptor P2-adrenérgico es salmeterol o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables; o el inhibidor selectivo de PDE4 de formula (I) es 9-ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- (2-tienil) -9H-pirazolo [3, 4-c] -1, 2, 4-triazolo [4, 3-a]piridina o una- de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables y el agonista del receptor p2-adrenérgico es formoterol o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables; el inhibidor selectivo de PDE4 de formula (I) es 9- ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- ( terc-butil) -9H- pirazolo [3, 4-c] -1, 2, -triazolo [4, 3-a]piridina o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables y el f -50- agonista del receptor p2-adrenérgico es salmeterol o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables; el inhibidor selectivo de PDE4 de formula (I) es 9- ciclopentil-5, 6-dihidro-7-etil-3- ( terc-butil) -9H- pirazolo [3, 4-c] -1, 2, 4-triazolo [4, 3-cc]piridina o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables y el agonista del receptor P2-adrenérgico es formoterol o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables.
8. 8. Una combinación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para usar como medicamento.
9. 9. Una combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la administración simultánea, secuencial o por separado en el tratamiento de una enfermedad obstructiva de las vías respiratorias u otra enfermedad inflamatoria.
10. 10. Una composición farmacéutica que comprende un inhibidor selectivo de PDE4 de fórmula (I), según se define en la reivindicación 1, un agonista del receptor ß2- adrenérgico y un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable, para administración por vía inhalada en el tratamiento de una enfermedad obstructiva de las vías respiratorias u otra enfermedad inflamatoria.
11. 11. Una composición farmacéutica según la reivindicación 10, en la que el inhibidor selectivo de PDE4 de fórmula (I) y el agonista del receptor 2-adrenérgico son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7.
12. 12. Uso de un inhibidor selectivo de PDE4 de fórmula (I), como se define en la reivindicación 1, o de un agonista del receptor P2-adrenérgico, en la fabricación de un medicamento para la administración simultánea, secuencial o por separado de ambos agentes por vía inhalada en el tratamiento de una enfermedad obstructiva de las vías respiratorias u otra enfermedad inflamatoria.
13. 13. Uso según la reivindicación 12, en el que el inhibidor selectivo de PDE4 de fórmula (I) y el agonista del receptor p2-adrenérgico son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7.
14. 14. Un procedimiento para tratar una enfermedad obstructiva de las vías respiratorias u otra enfermedad inflamatoria, que comprende administrar de forma simultánea, secuencial o por separado, por vía inhalada, a un mamífero que necesita dicho tratamiento, una cantidad eficaz de un inhibidor selectivo de PDE4 de fórmula (I) , como se define en la reivindicación 1, y un agonista del receptor P2-adrenérgico .
15. 15. Un procedimiento según la. reivindicación 14, en el que el inhibidor selectivo de PDE4 de fórmula (I) y el agonista del receptor 2-adrenérgico son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7.
16. 16. Un dispositivo de inhalación para la administración simultánea, secuencial o por separado de un inhibidor selectivo de PDE4 de fórmula (I), como se define en la reivindicación 1, y un agonista del receptor ß2-adrenérgico, en el tratamiento de una enfermedad obstructiva de las vías respiratorias u otra enfermedad inflamatoria .
17. 17. Un dispositivo de inhalación según la reivindicación 16, en el que el inhibidor selectivo de PDE4 de fórmula (I) y el agonista del receptor 2-adrenérgico son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7.