HRP20040475A2

HRP20040475A2 - Cell culture process

Info

Publication number: HRP20040475A2
Application number: HR20040475A
Authority: HR
Inventors: Zeng Steffen; Bogner Franz-Markus; Kunert Renate; Mueller Dethardt; Unterluggauer Florian
Original assignee: Sandoz Gmbh
Priority date: 2001-11-28
Filing date: 2004-05-27
Publication date: 2005-06-30
Also published as: HUP0402226A2; IL161858A0; KR20040065231A; WO2003045995A3; RU2004119816A; JP2005517391A; PL368749A1; MXPA04005190A; NO20042159L; US20050069979A1; ZA200403460B; BR0214483A; EP1453948A2; WO2003045995A2; NZ533084A; CN1596302A; CA2466881A1; AU2002342922A1

Description

Područje izuma

Prezentirani izum odnosi se na postupak za ekonomski-učinkovitu proizvodnju rekombiniranog terapijskog glikoproteina kao što je humani eritropoetin (Epo) upotrebom rekombiniranih staničnih linija.

Pozadina izuma

Eritropoetin (Epo) je glavni hormon koji regulira proliferaciju i diferencijaciju eritroidnih pra stanica i održavanje fiziološkog nivoa cirkulirajućih eritrocita. U fetusu Epo se primarno proizvodi u jetri i oko 90% njezine proizvodnje razgrađuje se u bubrezima nakon rođenja. Kada nivo Epo padne zbog kronične ili akutne renalne poremećene funkcije, npr. u pacijenata s carcinomom, Epo se mora izvana aplicirati za prevenciju napredovanja anemije. Terapijski aktivan humani eritropoetin je dostupan sve od otkrića Epo gena i njegove ekspresije u stanice rodenata.

Humani Epo gen enkodira 27 amino kiselinski signal peptid i 166 amino kiselina proteina s izračunatom molekularnom masom od 18399 Daltona. Zreli protein obično ima jedan N-terminal delecije amino kiseline, i dužine je od 165 amino kiselina. Signal sekvencija usmjerava peptid na celularne komparmente uključene u vlastitu glikolizaciju, što dovodi do zrelog proteina sa tri N- i jednim mjestom O-glikolizacije. Šećerni dio, koji čini oko 40% ukupne molekularne mase, je bitan za potpuno biološko djelovanje Epo-a. Brojne studije su pokazale da broj terminalnih ostataka sialnih kiselina ima pozitivan učinak na iv vivo polu-život, isto tako i na in vitro aktivitet, tj. vezanje na receptor, koji je viši u ne ili djelomično glikolizirani oblik (Takeuchi and Kobata, 1991 (Glycobiology, 1(4): 337-346). Stupanj sialilacije je direktno proporcionalan s polu-životom, kada izooblici s manje sialičnih kiselina se mnogo brže čiste iz organizma i zbog toga pokazuju manji aktivitet.

Ekonomski-učinkovit, komercijalni proces fermentacije za proizvodnju polipeptida tako da se Epo koristi kao terapeutik ako ispunajva slijedeće kriterije:

(1) medij kulture stanica ne treba sadržavati bilo koji skupi spoj kao što je naprimjer serum ili rekombinirani proteini.

(2) zbog moguće kontaminacije prionima, medij ne treba sadržavati bilo koju komponentu animalnog porijekla.

(3) postupak treba biti scaleable i dovoditi do visoke finalne koncentracije rekombiniranog proteina od interesa.

(4) Supernatant treba sadržavati veliku količinu Epo molekula koje pokazuju visoki in vivo aktivitet, tako da je umanjen gubitak in vivo aktivnih izooblika tijekom purifikacije.

US Patent 5,441,868 opisuje u primjeru 10, stranica 28-29, postupak fermentacije koji sadržava tri ili četiri koraka. U prvom koraku stanice se zasiju u roler bocu (850 cm2) u 200 ml medija koji sadržava 50:50 smjesu DMEM/Hams F12 i sadržava 5% fetalnog telećeg seruma. Nakon razdoblja od 3-dana, kada stanice porastu do spajanja, medij se odstrani i zamijeni s medijem koji sadržava 50:50 smjesu DMEM/Hams F12 i sadržava fetalni teleći serum. Boce se vrate u inkubator kroz razdoblje od 1-3 sata a medij se opet odstrani i zamijeni s 100 mL svježeg medija bez seruma. Taj korak se koristi za reduciranje koncentracije serumskih proteina koji kontaminiraju. Roler boce se potom vrate u inkubator kroz sedmodnevno razdoblje produkcije. Nakon tog vremena, medij se sakupi i zamijeni s 100-mL medija bez seruma za sekundarni ciklus produkcije. Kao primjer iz prakse tog sustava reprezentativni uzorci sedmodnevne produkcije sadržavaju oko 3,892+/- 409 U/mL, što odgovara 30 mg/L (prosječan specifični aktivitet od 130,000 U/mg).

Taj proces, s upotrebom jeftinog medija koji sadržava serum, dovodi do finalne koncentracije od 30 ug/mL Epo u supernatantu. Unatoč činjenici da je serum strogo kontroliran, nemože se isključiti kontaminacija s infekcijskim sredstvom i scPrion-om (najvjerojatnije je odgovoran za prijenos CJD na ljude).

U US Patentu 5,688,679, Primjer 5, je opisano da generacija rekombinirane stanične linije dovodi do finalne Epo koncentracije od 40 do 80 mg/L (uz prosječan specifični aktivitet od 78,000 do 130,000 U/mg). Kod drugih komponenti porijeklom od životinja medij za kultivaciju sadržava 20% fetalnog telećeg seruma i 1% bovinog serumskog albumina. Takav medij trpi od istog priona i infekcijskih sredstava povezanih s gore navedenim problemima.

WO 96/35718 opisuje postupak za proizvodnju eritropoetina koji je slobodan od komponenti porijeklom od životinja. U tom slučaju medij sadržava jeftine funkcionalne rekombinirane proteine kao što su inzulin i transferin.

WO 99/28346 opisuje proces fermentacije za proizvodnju eritropoetina koristeći serum-reducirani (1%) ili medij bez seruma. U skladu s opisanom finalne Epo koncentracije su više od najmanje 30 do 50 mg/L. U tom slučaju medij, još sadržava jeftine funkcionalne rekombinirane proteine kao što su inzulin i transferin.

Lee et al., 1999 (J.Biotechnol. 69:85-93) opisuju postupak za razvoj kultivacije medija za CHO staničnu liniju za proizvodnju humanog eritropoetina koristeći statistički dizajn. Tim približavanjem dobije se finalna Epo koncentracija od 25 μg/mL. U tom slučaju, medij koji još sadržava skupe funkcionalne rekombinirane proteine kao što su inzulin i transferin.

U skladu s time, postoji potreba za razvojem odgovarajućeg medija za kulturu i uvjeta za proizvodnju rekombiniranih proteina u odsutnosti skupih i nepoželjnih produkata porijeklom od životinja i funkcionalno rekombiniranih proteina kao što je inzulin.

Sažetak izuma

Prezentirani izum osigurava novi protokol fermentacije tako da se koristi ekonomski prihvatljiv medij koji ne sadržava serum ili bilo koji funkcionalni {i/ili rekombinirani) protein pune dužine. Osim toga, broj parametara koji će se određivati može se koristiti za optimizaciju ekspresije proteina i u pojmovima prinosa i aktiviteta (zbog visokog stupnja sialilacije), kao što je kultivacija stanica u odsutnosti metotreksata. Upotrebom tih parametara optimizacije, moguće je postići finalnu koncentraciju sve do 600 mg/L, ili više, rekombinirani produkt (Epo) pokazuje visoki stupanj sialilacije.

U skladu s time, prezentirani izum osigurava postupak proizvodnje rekombiniranog polipeptida od interesa čija metoda obuhvaća:

(a) osiguravanje transformirane eukariotske stanice domaćina koja obuhvaća nukleotidne sekvencije koje enkodiraju rekombinirani polipeptid od interesa i koji izravno eksperesira rekombinirani polipeptid od interesa u stanicu domaćina;

(b) osigurava medij kulture bez seruma koji obuhvaća (i) vodu, pepton porijeklom od biljaka, osmotički regulator, pufer, izvor energije, amino kisleine, izvor lipida ili prekursor, izvor željeza, ione ne-željezo metala i jedan ili više vitamina i kofaktora; i (ii) da ne sadržava bilo koji polipeptid pune dužine; i

(c) kultiviranje transformirane eukariotske stanice domaćina u mediju kulture pod uvjetima tako da dozvoli ekspresiju rekombiniranog polipeptida od imteresa.

Poželjno je da medij slobodan od bilo koje komponente animalnog porijekla. U tom slučaju, preferirano ostvarenje prezentiranog izuma odnosi se na medij kulture kao što je opisano gore, koji je kompletno slobodan od komponenti animalnog porijekla.

Preferirani rekombinirani polipeptid od interesa je humani eritropoetin. Stanica domaćina može biti stanica ovarija kineskog hrčka (CHO).

U preferiranom ostvarenju, nukleotidna sekvencija enkodira rekombinirani polipeptid od interesa, koji je preferirano humani eritopoetin, integriran u genom stanice domaćina i on je operabilno vezan na nukleotidnu sekvenciju enkodirane dihidrofolat reduktaze, i stanica domaćina je kultivirana u odsutnosti metotreksata. Preferirana stanica domaćina je CHO stanica.

Jedan ili više od slijedećih parametara može se koristiti da bi se osigurao nivo proizvodnje rekombiniranog proteina:

(1) preferirani izvor energije je glukoza. U preferiranom ostvarenju, medij kulture inicijalno sadržava najmanje 5 g/ glukoze i koncentracija se održava na oko 3 g/l tijekom etape kultivacije (c).

(2) medij kulture preferirano sadržava fosfat, na primjer najmanje 0.2, 0.4 ili 0.6 g/l fosfata. U preferiranom ostvarenju prezentiranog izuma, medij kulture sadržava više od 0.3 g/L fosfata, osobito kada je izvor energije glukoza

(3) pH medija je inicijalno oko 7.1 a potom se reducira na oko 6.9 tijekom etape kultiviranja (c). Preferirano, navedena redukcija dogodi se tijekom razdoblja zadnjeg dana.

(4) medij kulture može isto obuhvaćati elemente u tragovima ili ne, dva ili više vitamina. U preferiranom ostvarenju preferira se takav medij kulture da je izvor energije glukoze. Takav medij kulture preferirano sadržava više od 0.3 g/L fosfata.

(5) medij kulture je preferirano hrana, tijekom etape kultiviranja (c), obogaćena hranjivim koncentratom koji obuhvaća jednu ili više amino kiselina, i pepton biljnog porijekla. Osim toga, najmanje jedan karbohidrat može biti prisutan. Po izboru najmanje jedan vitamin, elementi u tragovima i lipidi mogu biti uključeni. Gore navedeni parametri mogu se isto koristiti u bilo kojoj kombinaciji od dva ili više.

Metoda izuma obično dalje obuhvaća etapu (d) ponovnog dobivanja rekombiniranog polipeptida od interesa iz kulture. Kada je rekombinirani polipeptid od interesa, kao što je eritropoetin, izlučen u medij kulture, on će biti ponovo dobiven iz medija kulture. Kada je rekombinirani polipeptid od interesa, kao što je eritropoetin, izlučen u medij kulture, on će biti ponovno dobiven iz medija kulture.

Daljnje ostvarenje prezentiranog izuma odnosi se na medij kulture kao što je navedeno gore, npr. koji se koristi u metodi u skladu s prezentiranim izumom. U skladu s time, jedno ostvarenje odnosi se na medij kulture bez seruma koji obuhvaća (i) vodu, pepton biljnog porijekla, osmotički regulator, pufer, izvor energije, amino kiseline, izvor lipida ili prekurzor, izvor željeza, ne-željezo ione metala i jedan ili više vitamina i kofaktora; i (ii) da ne sadržavaju bilo koji polipeptid ukupne dužine. Preferirano, bilo koji medij kulture prezentiranog izuma je kompletno slobodan od komponenti animalnog porijekla. U preferiranom ostvarenju, u bilo kojem mediju kulture stanica prezentiranog izuma, izvor energije je glukoza. U sličnom preferiranom ostvarenju, u bilo kojem mediju stanične kulture prezentiranog izuma medij sadržava više od 0.3 g/L fosfata. U daljnjem preferiranom ostvarenju, u bilo kojem mediju stanice kultura prezentiranog izuma medij također obuhvaća elemente u tragovima i jedan ili više vitamina. Slijedeće preferirano ostvarenje medija kulture stanica prezentiranog izuma je ono kao što je opisano da se koriste u metodi u skladu s prezentiranim izumom ili kao što je opisano drugdje u dokumentu.

Prezentirani izum isto osigurava sastav koji obuhvaća rekombinirani polipeptid od interesa proizveden metodom izuma. Točnije, prezentirani izum osigurava sastav koji obuhvaća rekombinirani eritropoetin proizveden metodom izuma.

U kontekstu prezentiranog izuma, preferirana ili osobita ostvarenja kao što je ovdje opisano su sposobna za kombinaciju jednog s drugim, pritom rezultiraju s daljnjim preferiranim ostvarenjima.

Detaljni opis izuma

Osim ako nije drugačije definirano, svi tehnički i znanstveni pojmovi koji se koriste ovdje imaju isto značenje kao što se uobičajeno koriste stručnjaci (npr. u staničnoj kulturi, molekularnoj genetici, kemiji nukleinskih kiselina, tehnici hibridizacije i biokemiji). Standardne tehnike koje se koriste u molekularnim, genetičkim i biokemijskim metodama (vidi općenito, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Spier et al., Encvclopedia of Cell Technology, Vol 1 & 2, lst ed, (2000) JOhn Wiley & Sons, Inc. and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biologv (1999) 4th ED, John Wiley & Sons, Inc.- i cjelovita verzija naslovljena Current Protocols in Molecular Biology, koja je ovdje inkorporirana s referencijama) i kemijske metode.

A. Medij za kulturu

Medij za kulturu korišten u metodi prezentiranog izuma za kultivaciju stanica sisavaca ne sadržava serum. Točnije i više se preferira kompletno slobodan od komponenti porijeklom od životinja, kao što su proteini (uključujući spojeve rasta), aminokiseline, lipidi i karbohidrati. Takve komponente medija su često anorganske ili sintetičke i ali tako da se ne dobivaju direktno iz bilo kojeg animalnog izvora. Međutim, komponente ekstarhirane iz drugih izvora kao što su biljke, bakterije ili kvasci, mogu se koristiti kao što je naprimjer pepton biljnog porijekla. Nadalje, medij kulture je slobodan od bilo kojeg funkcionalno rekombiniranog proteina ili polipeptida kao što su inzulin ili transferin ili njihov funkcionalni dio.

Medij kulture obuhvaća vodu, osmotički regulator, pufer, izvor energije, amino kiseline, izvore lipida ili prekursor, izvor željeza, ione ne-željeznog metala i po izboru jedan ili više vitamina i kofaktora.

Osmotički regulator su obično soli. One koje se mogu koristiti u mediju uključuju NaCl, KC1, MgCl2. One su povoljne za održavanje osmoze u granici 200-400 mOsm/kg preferirano u granici 290-350 mOsm/Kg.

Puferi koji se koriste u mediju za održavanje pH u granici 6.5-7.5, više se prefrira oko pH 7.0. Odgovarajući puferi uključuju karbonate kao što je NaHCO3; kao i kloride, sulfate i fosfate kao što su CaCl22H2O, MgSO47H2O, NaH2PO42H2O, ili natrij piruvat, takvi puferi su općenito prisutni u količini 0.05 do 5g/L, preferira se od 0.5 do 5g/L. Na primjer oko 2.5 g/L NaHCO3 može se uključiti. Drugi puferi, kao što je N-[2-hidroksietil]piperazin-N min-[2-etanesul-fonska kiselina] drugačije poznata kao HEPES i 3-[N-morfolino]propansul-fonska kiselina poznata kao MOPS mogu se isto koristiti.

Pojam „amino kiseline" znači da svih 20 amino kiselina može biti prisutno. Preferira se da su aminokiseline sintetičnog porijekla. Količine koje su uobičajeno prisutne variraju za svaku amino kiselinu ali su općenito u granici 10-200 mg/l. Međutim, L-glutamin je općenito prisutan u mnogo većoj koncentraciji prefrirano u granici 1000-350 mg/l. Uobičajeno, izvor amino kiselina može se bazirati na temeljnom mediju kao što je Dulbecco's modificiranom eagle mediju (DMEM) i/ili Ham s F12. Dodavanjem amino kiselina u temeljni medij za dostavu za brzo konzumiranje-dobije se medij obogaćen dopunjen amino kiselinama.

Pojam"koncentrat" opisuje hranjivu otopinu koja sadržava veću količinu amino kiselina, soja peptona i karbohidrata od medija. Po izboru jedan ili više vitamina, lipida ili elemenata u tragovima može se dodati. Volumen koncentrata je obično 0.5-30% od polaznog volumena, više se preferira između 1.25-5%. Dodani su radi opskrbe s konzumiranim nutrientima.

Izvor energije u mediju je općenito prisutan u količini od 3 do 10 g/l a preferira se monosaharide kao što su manoza, fruktoza, galaktoza ili maltoza više se preferira glukoza, osobito D-glukoza. Preferira se početna koncentracija glukoze u mediju od najmanje 4 g/L.

Izvor lipida ili prekurzor može, na primjer, biti odabran od lipidnih faktora kao što su holin klorid, lipoična kiselina, oleinska, fosfatidilholin ili lineoleat i/ili spojevi uključeni u proizvodnju lipida (prekursori lipida) na primjer alkoholamini kao što je etanolamin. Preferira se da je uključen etanolamid.

Izvor željeza može biti anorganski ili organski oblik i obično je prisutan u količini 0.025 do 0.5 mg/L. Primjeri uključuju feri i fero soli kao što su feri citrat ili fero sulfat. Preferiraju se kelatirane soli kao što je feri citrat i feri amonij citrat.

Ioni ne-željeznih metala po izboru se koriste u mediju a uključuju magnezij, bakar i cink; kao i natrij, kalij i seln. Preferira se uključivanje iona selenita u medij, u obliku natrij selenita u količini oko 0.1 do 100 μg/L, više se preferira između 0.5 i 25 μg/L.

Vitamini i enzimi co-faktori vitamina (co-faktori) po izboru se koriste u mediju uključujući Vitamin B6 (piridoksin), Vitamin B12 /cijanokobalamin) i Vitamin K (biotin) u količini 0.001-1 mg/litru; Vitamin C (askorbinska kiselina) prisutan je u količini od 1-10 mg/litru, Vitamin B2 (riboflavin) prisutan je u količini 0.1-1.0 mg/litru a Vitamin BI (tiamin), niacinamid, Vitamin B5 (D kalcij pantotenat), folna kiselina, i-inozitol općenito su prisutni u količini 2-20 mg/litru.

U velikim fermentorima, stanice sisavaca su osobito osjetljive na okomitu silu koja potječe od sparging of the vessel s plinom i miješanja s impeller. Da bi se minimaliziralo javljanje oštećenja satnica preferira se medij koji sadržava sredstvo za zaštitu stanica kao što je polietilen glikol, polivinil alkoholi ili pluronski polioli. Prefreira se upotreba lutrola, obično u koncentraciji od oko 0.1%.

Isto tako se preferira dodavanje mediju digestiranog peptida, hidrolizata ili ekstrakta, kao što je ekstarkt kvasca, ili preferirano peptona biljnog porijeka. Prefrirane količine su 0.025% do 1% w/v, više se preferira 0.2% do 0.5% w/v. Biljni pepton se može proizvesti od riže, pšenice, graška, soje ali nije ograničeno na njih. Dalje se preferira dodavanje iona fosfata u medij . Obično od 10 do 1000 g/L fosfata je uključeno, tako od 50 do 150 g/l, preferira se oko 120 mg/L.

B. Stanice domaćina

Transformirane stanice domaćina kultivirane po metodi izuma su eukariotske stanice, općenito stanice sisavaca kao što su stanice rodenata ili primata. Prefrirane stanice uključuju CHO, BHK, COS i HeLa stanice. Osobito se preferiraju CHO stanice. U jednom ostvarenju, stanice domaćina su proizvedene transfekcijom (ili transformacijom) stanične linije inicijalno deficijentne za gen kao što je dhfr, koji je amplificiran u odgovoru na selekciju tlaka (vidi dolje) s nukleotidnom sekvencijom za enkodiranje navedenog gena. CHO stanice deficijentne sa dhfr su opisane od Urlaub and Chasin, 1980, PNAS 77: 4216-4220 a dostupne su u ATCC kao pohrana ATCC CRL-9096. One su pohranjene pod Budapest Treatv pod oznakom pohrane br. ATCC PTA-3672 na American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md.20852, USA, 29. kolovoza 2001.

„Transformacija" se ovdje odnosi na uvođenje genetskog materijala u stanicu domaćina tako da je genetski materijal ekspresiran u stanicu, čemu se kaže da su transformirane. Za izbjegavanje sumnje, „transformacija" se ne odnosi na održavanje stanica besmrtnim s onkogenezom ili onkogenim virusima i sličnim.

Stanice domaćina obuhvaćaju nukleotidnu sekvenciju enkodiranog rekombiniranog polipeptida od interesa (POI) koji se zahtjeva da se ekspresira u stanicu domaćina. POI je preferirano glikolizirani polipeptid, osobito glikolizirani polipeptid koji zahtjeva glikolizaciju koja se izvodi samo u stanicama sisavaca. Više se preferira, da je polipeptid sialiliran. Osobito preferirani POI je eritropoetin, preciznije humani Epo. Isto se preferira da se POI izlučuje sa stanicama u medij kulture.

Kodiranje sekvencije rekombiniranog POI koji je operabilno vezan na regulatornu kontrolnu sekvenciju tako da direktno ekspresira POI u stanicu domaćina. Preferirano, nukleotidna sekvencija enkodira POI je integrirana u genom stanice domaćina. Različite metode za uvođenje nukleotidne sekvencije enkodiranog POI-a su poznate u struci -vodi primjer Sambrook et al., supra.

U jednom ostvarenju, nukleotidne sekvencija enkodiranog POI je integrirana u genom stanice domaćina i operabilno vezana na drugu nukleotidnu sekvenciju koja kada je integrirana u genom stanice domaćina je amplificirana kada je stanica domaćina kontaktirala sa selekcijskim sredstvom koje uzrokuje amplifikaciju nukleotidne sekvencije. Eurokariorske stanice, u određenim stanicama sisavaca su sposobne emplificirati određene gene u odgovoru na selektivni tlak, obično inhibitor enzima, rezultira porastom broja kopija tog gena, koji naizmjence povisuje nivo ekspresije gena. Dodatne kopije gena mogu se održavati intrakromasomalno, ili u obliku ekstrakromasomalnog genetskog materijala kao kratke kromosome (za pregled vidi Genes VI, Lewin, 1997, Oxford Universitv Press, Oxford U.K., pp 975-978). Dobro označeni primjer je dehidrofolat reduktaza (dhfr) gen koji je amplificiran u odgovoru na metotreksat (MTX). Drugi primjeri uključuju CAD gen (enkodiran protein koji je uključen u prva tri koraka UMP sinteze) koji je amplificiran u odgovoru na inhibitore trans-karbamilaze, i glutamin sintetaze (vidi WO87/04462) koji je amplificiran u odgovoru na metionin sulfoksimin. Preferira se enkodirana sekundarna nukleotidna sekvencija dhfr.

C. Metode kultivacije

U skladu s metodama izuma, stanice domaćina su kultivirane u mediju za kulturu izuma u uvjetima koji osiguravaju ekspresiju POI. Eukariotske stanice, kao što su stanice sisavaca, mogu se kultivirati u različitom broju formata i posuda za kulture. Na primjer, stanice se mogu kultivirati tako da prijanjaju na dno plastične boce ili suda, u suspenziji uz miješanje boca/bioreaktora ili u roler bocama za kulturu. Budući da je cilj prezentiranog izuma proizvodnja POI u komercijalnim količinama, preferira se rast stanica u bioreaktoru koji je sposoban za punjenje serije i koji ima kapacitet 4 L ili više.

Stanice se obično unose u medij za kulturu u gustoći od oko 5x105 stanica/mL. Optimum može varirati za različiti tip stanica i može odrediti stručna osoba. pH je obično podešen na oko pH 7.0, temperatura na 37°C (iako neke stanične linije kao što su od insekata rastu na nižim temperaturama) i pO2 na oko 50% zasićenosti zraka.

Kada stanice domaćina obuhvaćaju integraciju u njih dhfr (ili ekvivaletn) genoma operabilno vezanog na nukleotidnu sekvenciju enkodiranog POI, prikladna količina metotreksata (ili ekvivalent) može se dodati u medij. Međutim, u preferiranom ostvarenju, metotreksat se ne dodaje u medij tijekom faze proizvodnje već smo našli da u odsutnosti metotreksata, očekivana glikolizacija je dobivena.

Stanice se kultiviraju obično oko 7 do 14 dana, ovisno o staničnoj liniji i rekombiniranom POI. Tijekom tog vremena, neophodno je dodati svježi medij za prevenciju iscrpljivanja nutrienata. Preferirano, vrijeme kultivacije je prošireno na dodavanje obogaćenog nutritivnog koncentrata koji sadržava najmanje jednu aminokiselinu, karbohidrat i pepton biljnog porijekla. Aminokiselina se doda u količini od 0.05 g/L do 50 g/L, karbohidrat u količini od 2 do 1000 g/L a pepton u količini od 2 do 1000 g/L. Više se preferira aminokiselinu dodati u količini od 0.5 do 5, karbohidrata između 25 i 75 i peptona između 25 do 75 g/L.

U preferiranom ostvarenju izuma, koncentracija izvora energije kao što je glukoza održava se u koncentraciji od najmanje 3 g/L, obično između 3 g/L i 4 g/L, za vrijeme procesa kultivacije.

U slijedećem jako preferiranom ostvarenju, umjesto održavanja pH konstantno na pH 7.0, pH je inicijalno veći od pH 7.0, kao što je pH 7.1, i reducira se na ispod pH 7.0, kao što je pH 6.9, tijekom procesa kultiviranja. Tako se koristi mijenjanje pH od gornjeg do donjeg neutralnog pH, čime se osigurava da se pH održava unutar limita tolerancije za stanice domaćina. Obično, mijenjanje pH se izvodi tijekom perioda vremena, kao što je najmanje 6 do 96 sati. Više se preferira 72 sata.

Korisno je u slučaju humanog eritropoetina, da proizvedena količina rekombiniranog POI koju proizvedu stanice je najmanje 200 mg/L, kao što je više od 300 ili 400 mg/L:

Rekombinirani protein se može ponovo dobiti iz supernatanta kulture ili peleta kultiviranih stanica kao što pristaje (iz supernatanta kulture u slučaju Epo ekspresije). Rekombinirani protein je potom obično izložen jednom ili više koraka purifikacije (vidi na primjer Broudy et aJ., 1988, Archives of Biochemistry and Biophysics 265: 329-336; Ghanem et al., 1994, Preparative Biochemistry 24(2): 127-142) kao što je afinitetna kromatografija i/ili ion-exchange kromatografijom. Dalje postupci ponovnog dobivanja eritropoetina proizvedenog metodom kulture stanica prezentiranog izuma su prikazani u dijelu primjera ovog dokumenta.

U sastavu se preferira da sadržava rekombinirani polipeptid, osobito Epo, ekspresiran u rekombinirane stanice domaćina i purificiran koristeći metodu izuma, rekombinirani polipeptid je u suštini čist, kao što je najmanje 90%, 95% ili 99% čistoće.

Biološko djelovanje purificiranog proteina može se odrediti in vitro i/ili in vivo. Prikladni in vitro test je opisan u Hammerling et al., 1996, J Pharm Biomed Anal 14 (11) :1455-69; koji uključuje testiranje proliferativne stimulacije eritroidnih staničnih linija. Prikladni in vivo test je opisan u Ghanem et al., 1994, supra, uključuje determinaciju inkorporacije 59F u eritrocite policitemičnih miševa.

U preferiranom ostvarenju, prezentirani izum se može izvesti upotrebom vektora nukleinske kiseline i stanica domaćina u kojem (a) prvi polinukleotidni vektor koji obuhvaća (i) prvu nukleotidnu sekvenciju koja enkodira rekombinirani polipeptid od interesa; i (ii) drugu nukleotidnu sekvenciju koja enkodira selektabilni marker, koji je drugu nukleotidnu sekvenciju je amplificirao kada je stanica domaćina dodirivala selekcijsko sredstvo, i (b) drugi polinukleotidni vektor ima u suštini istu nukleotidnu sekvenciju kao prvi polinukleotidni vektor osim kada je ta druga nukleotidna sekvencija zamjenjena s trećom nukleotidnom sekvencijom koja enkodira različiti selektabilni marker;

prvi polinukleotidni vektor i drugi polinukleotidni vektor se integriraju u genom stanice domaćina.

Preferirano stanica domaćin je stanica sisavca, više se preferira stanica ovarija kineskog hrčaka (CHO).

Preferirano sekundarna nukleotidna sekvencija enkodira dihidrofolat reduktazu polipeptida a selekcijsko sredstvo je metotrksat. Preferirani rekombinirani polipeptid od interesa je humani eritropoetin. Takvi sustavi su opisani u djelu primjera ovog dokumenta.

Eritropoetin se može purificirati iz stanične kulture s (a) odstranjivanjem stanica domaćina, staničnog sadržaja i krhotina iz medija kulture centrifugiranjem upotrebom disc stack separatora čemu slijedi filtracija da se dobije pročišćeni supernatant medija kulture; (b) podešena provodijivost supernatanta na 5 mS/cm ili manje, i pH između oko 7.0 i 8.0; (c) primjena supernatanta iz koraka (b) u koloni koja obuhvaća anion exchange kromatografski medij, ispiranje kolone, eluciju rhEpo iz kolone, i sakupljanje pik frakcije(a) koje sadržavaju rhEpo; (d) izlaganje spojenih pik frakcija iz koraka (c) u koraku kromatografije reverzne faze upotrebom polistirenske smole tako da može proći pod talakom medija (< 10 bara) i otporna je na visoku koncentraciju NaOH, rhEpo se eluira upotrebom linearnog gradijenta organskog otapala; (e) primjena jedne ili više frakcija u koraku (d) koji sadržava rhEpo za kolonu koja obuhvaća sefaroza anion exchange kromatografski medij, ispiranje kolone, i eluciju rhEpo upotrebom linearnog gradijenta soli; (f) odabir jedne ili više frakcija eluiranih u koraku (e) koje sadržavaju rhEpo baziran na stupnju sialilacije rhEpo; i (g) izlaganje jedne ili više frakcija eluiranih u koraku (f) koja sadržava rhEpo jednom ili više siže exclusion kromatografskih koraka upotrebom medija gel filtracije za odstranjivanje potencijalnih dimera i velikh agregata; i sakupljanje eluata koji sadržavaju rhEpo.

Pogodno je, da je korišteni anion exchange medij u koraku (c) ceramic-based ion exchange medij Q-HyperDF™, nabavljen od BioSepra. Povoljan izvor polistirenske smole korištene u koraku (d) je Source 30RPC ™(Pharmacia), dok se preferira koristiti anion exchange medij u koraku (e) Pharmacija Q Sepharose High Performance™. Medij korišten u gel filtraciji u koraku (g) je preferirano Pharmacia Superdex 75 prep grade™. Metode su opisane u djelu primjera ovog dokumenta. Prezentirani izum je opisan dalje s referencijama koje slijede primjere, koji su samo za ilustraciju a ne limitirajući. Potanko, primjeri se odnose na preferirana ostvarenja prezentiranog izuma.

Primjeri

Metode

Stanične linije domaćina

Ovarij kineskog hrčka (CHO) dihidrofolat-reduktaza deficijentan (ATCC CRL-9096). Spremljeni su pod Budapest Treaty pod oznakom br. ATCC PTA-3672 u American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md. 20852, USA, 29. kolovoza 2101.

Medij kulture stanica

Medij za kultivaciju: DMEM obogaćen s L-glutaminom, 4mM, 10% FCS, HT (hipoksantin, timidin), 1x

Medij za selekciju: DMEM obogaćen s L-glutaminom, 4mM, dializirani FCS, 10% i G418, 0.5 mg/ml

Medij za amplifikaciju: DMEM obogaćen s L-glutaminom, 4mM, dializirani FCS, 10%, G418, 0.5 mg/ml i MTX (metotreksat), 4.8x10-8M-1.54x10"6M

Medij za zamrzavanje: DMEM obogaćen s L-glutaminom, 4mM, FCS, 10% i DMSO, 10%

Medij za adaptaciju

rekombiniranih staničnih

linija bez seruma: 1:1 DMEM/Ham's F12, obogaćen s: L- glutaminom, 6 mM, Soya-pepton/UF, 0.25%, Hybridoma Supplement, 1x, Pluronic-F68, 0.1%, G-418, 0.5 mg/ml, MTX, 1.54x10-°M

Medij za proizvodnju bez

seruma: 1:1 DMEM/Ham's F12, obogaćen s: Soya-pepton/UF, 0.25% Hybridoma Supplement, 1x, Lutrol, 0.1%, MTX, 1.54x10-6M glukoza 1g/l, NaHCO3, 2.5 g/l

Medij bez seruma za

zamrzavanje rekombmiranih _

stamenih linija: PBS, PVP-10, 20%, DMSO, 5% Hibridoma suplement, 100x Etanolamin-2. 5x10-3, Ferric-Citrat-2.5x10-2 M, L-askorbinska kisleina-2.0xl0-3 M, natrij selenit-5. 0x10-6M

Konstrukcija plazmida

pEpo/neo

Taj plazmid enkodira kodiranu regiju Epo i gen rezistencije na neomicin kao dvije različite ekspresijske kazete svaku pod kontrolom sekvencije SV40 rani promoter/terminator. Detalji konstrukcije dati su u Primjeru 1.

pEpo/dhfr

Taj plazmid enkodira kodiranu regiju Epo i dhfr kao dvije različite ekspresijske kazete svaku pod kontrolom sekvencije SV40 rani promoter/terminator. Detalji konstrukcije dati su u Primjeru 2.

Metode kulture stanica

Rast CHO-dhfr-

CHO stanice deficijentne dihidrofolat reduktazom (Urlaub et al., 1980, PNAS 77 (7) : 4216-4220) (odnose se na CHO dhfr) su kultivirane u DMEM mediju za kultivaciju s omjerom dijeljenja 1:10 dvaput tjedno.

Transfekcija CHO stanica

l-5x104 stanica po cm2 se zasije u 25 cm2 T boce ili ploču s 96 bunarića dan prije izvođenja lipofektin transfekcije Odgovarajući plazmidi se pomiješaju u određenom omjeru, doda se lipofektin reagens (GIBCO/BRL) u skladu s protokolom proizvođača (0.5-1 ul/cm2). Potom se stanice prekriju s transfekcijskim koktelom kroz četiri do šesnaest sati sa DMEM bez seruma, prije nego se medij koji sadržava DNA zamjeni s medijem za kultivaciju. Nakon kultivacije od 24 do 48 sati u mediju koji sadržava serum, stanice se prebace u medij za selekciju. Pulovi transfektiranih stanica se prvo kultiviraju u mediju za selekciju radi spajanja i potom u mediju za amplifikaciju (4.8x10-8 M MTX) prije skrininga supernatanta stanične kulture ELISA-om na Epo produkciju. Utvrde se veliki proizvođači, koncentracija MTX se dvaput povisi, a najbolji proizvođači se koriste za daljnju kultivaciju.

Analitičke metode

Određivanje Epo ELISA-om u različitim matriksima

Protutijela

polikonski serum: biotinilirani anti Epo kunića (R&D Svstems;

Catalog # AB-28 6-NA) monoklonska protutijela: mišji anti Epo (Genezyme; Cat.code

AE7A5)

ELISA puferi

Pufer za oblaganje: 8.4 g/l NaHCO3, 4.2 g/l Na2CO3, pH 9.6-9.8

Pufer za ispiranje: 0.2g/l KCl, 1.15 g/l Na2HPO4x2H2O, 0.2 g/l KH2PO4, 8 g/l NaCl, 0.1% Tween 20

Pufer za razrjeđivanje: 2% PVP (Sigma Cat.No. PVP-4OT) u puferu za ispiranje

Pufer za uzorke: 0.5% alfa mono-tio-glicerola u puferu za razrjeđivanje

Pufer za bojenje: 7.3 g/l limunske kiseline x 2H2O, 11.86 g/l Na2HPO4x2H2O, pH 4.8-5.0

Otopina za bojenje: 100 ul OPD otopine/10 ml pufera za bojenje 5 ul H2O2/10 ml pufera za bojenje

OPD stock-otopina: PP: L0017

Metoda

ELISA metoda se koristi za određivanje Epo u ng/ml koncentracijama, osobito s limitom detekcije od oko 10 ng/ml, polazeći s 500 ng/ml i osam dvostrukih razrjeđenja. Jedno monoklonsko protutijelo protiv prvih 26 aminokiselina Epo djeluje kao sloj koji oblaže, vezuje Epo. U slijedećem koraku Epo je specifično vezan s protutijelom hvatačem. Detekcija je udešena preko biotiniliranog Epo koji prepoznaje antiserum kunića. Vizualizacija se izvodi bojenjem s OPD nakon steptaviidin-peroxidase spajanja na ploču.

Imunofluorescencija

Epo ekspresirane CHO stanice su inokulirane s 5x104 stanica/200 μ/l na cover slip u pločama sa 6 bunarića i inkubirane kroz 24-72 sata. Prihvaćene stanice su dvaput isprane s PBS i fiksirane kroz 5 minuta s metanolom -20°C, potom se osuše na zraku i nakon toga opet nakvase u PBS. Nespecifični proteini se zasite inkubacijom s 20 % FCS u PBS kroz 15 minuta i potom se anti-Epo inkubira kroz jedan sat. Reakcija se vizualizira s anti-mišjim IgG FICT konjugatom. Fluorescencija se detektira konfokalnom mikroskopijom na valnoj dužini ekscitacije od 488 nm i valnoj dužini emisije višoj od 515 nm.

Određivanje veličine jezgre

Materijali

Coulter Counter® Model ZM (Coulter Electronics Inc.)

Coulter Channelvzer® Model 256

Inkubacijska otopina: Limunska kiselina, 0.1M, Triton X 100, 2%

Elecrolvte Isoton II (Kat-No.884 8011; Coulter Euro Diagnostic GMbH)

Coulter Counter kvantificiranje broja i veličine čestica, koje su suspendirane u electric conductive tekućini. Tekućina se absorbira vakuumom preko kapilare koja provodi elektrode na obje strane. Promjene rezistencije induciraju impulse voltaže tako da se mogu digitalizirati s Coulter Channelizer-om. Veličina jezgre je u koleraciji sa sadržajem DNA stanica, tako da je moguće razlikovati diploid i poliploid postavljen na kromosome.

Metoda

Aproksimativno 1x106 CHO-stanica se ispere jedamput u PBS, resuspendira se u 2 ml otopine za inkubaciju i ostavi u njoj 4-5 sati. Slijedeći koraci su specifični za Coulter counter.

SDS poliakrilamid-elektroforeza i Western blotting

Materijali

SDS gelovi: Novex tris-glicin 4-20%

Pufer za uzorke: tris glicin SDS 2x(Novex LC 2676)

Running pufer: tris glicin SDS (Novex LC 2 675)

Blotting pufer: Na2B4O7xl0H2O, 50 mM, SDS, 0.1%, metanol, 20%

Blotting matriks: PVDF Immobilon P 0.45μM Millipore; K8JM8238H

Pufer za ispiranje: vidi ELISA pufer za ispiranje

Pufer za razrjeđivanje: 1% mlijeka u prahu u puferu za ispiranje

Pufer za detekciju: NaCl, 0.1 M tris-HCl 0.1 M pH9.5

Metoda

Uzorci koji sadržavaju Epo se podese na 30 ng/20μl u lx puferu za uzorke s 1% α-MTG i primjene se na SDS gelu. Na kraju putanja, proteini na blotted to PVDF immobilon membranu kroz 2 sata a potom se Epo umjetno oboji s monoklonskim protutijelom za detekciju prvih 26 amino kiselina Epo-a. Vizualizacija se izvede s anti mišjim IgG konjugatom na alkalnoj fosfatazi i NBT/BCIP boji.

Izoelektrično fokusiranje

22

Materijali

Sustav: Multiphor II, Amersham Biosciences

IPG gelovi: pH 2.5-7

Reswelling pufer: 9 g uree, 0.5 g CHAPS, 0.04 g DTE, 0.5 ml resolvtes (pH 3.5-10) 10 μl bromfenol-blue (0.1%), podešen na 25 ml s H2O

Pufer za uzorke: IPG pufer za uzorke pH 3-10, 25 ul u 625 μl H2O

Blotting pufer: 2.93 g glicina, 5.81 g tris, 20 ml metanola, 0.375 g SDS podešeno na 1000 ml s H2O

Blotting matriks: PVDF Immobilon P 0.45 uM Millipore; K8JM8238H

Pufer za ispiranje: vidi ELISA pufer za ispiranje

Pufer za razrjeđivanje: 1% mlijeko u prahu u puferu za ispiranje

Pufer za detekciju: NaCl, 0.1 M, Tris-HCl 0.1 M pH 9.5

Metoda

Uzorci koji sadržavaju Epo su podešeni na 500-1000 ng/50 μl, desalirani, razrijeđeni 1:1 u puferu za uzorke i primjenjuju se na reswollen IPG gelu. Running uvjeti su prvu minutu 300V, potom linearno rastu na 3500V i na kraju 1 sat na 3500V. Tijekom cijelog procesa fokusiranja postavljeni su limiti od 10 mA i 10 W. Nakon toga se proteini blotted na PVDF Immobilon membranu s difuzijom preko noći ili s elektroblot-om i potom se Epo specifično oboji s monoklonskim protutijelom za određivanje prvih 26 amino kiselina Epo. Vilzualizacija se izvede s konjugiranim anti mišjim IgG AP i NBT/BCIP bojenjem.

Određivanje sadržaja DNA

Sadržaj DNA rekombiniranih staničnih linija se komparira s CHO-dhfr- staničnom linijom domaćina s FACS analizom.

Materijali

Pufer za ispiranje: 0.1 M tris-HCl, pH 7.4, 2 mM MgCl2, 0.1% Triton X 100

Pufer za bojenje: 0.3 ug/ml DAPI (Hoechst) u puferu za ispiranje.

Metoda

5x105 stanica se ispere u PBS i fiksira ledeno hladnim 70% etanolom. Nakon toga stanice se isperu dvaput s puferom za ispiranje i potom inkubiraju u puferu za bojenje kroz 30 minuta na RT. Sadržaj DNA se mjeri s FACS Vantage (Becton i Dickinson) na 359 nm ekscitacije i 450 nm emisije.

In-vitro test specifičnosti

Humane eritoleukeiuijske linijske stanice TF-1 (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) rastu-neovisno od IL3 ili hGM-CSF. Ti citokini pokazuju sinergistični učinak na proliferaciju, dok Epo može održavati sposobnost za život kroz neko vrijeme. Stanice uobičajeno rastu u GM-CSF i medij za kultivaciju koji sadržava Epo.

Dodatni test

Medij za kultivaciju: RPMI 1640, obogaćen s 4mM gln, 10% FCS. 20 μg/ml transferina, 10 μM beta-

merkapto-etanola, 12 ng/ml rhGM-CSF, 3U/ml rh Epo,

Test medij: RPMI 1640, obogaćen s 4mM gln, 100 μg/ml transferina, 2mg/ml BSA

Metode

Test funkcionalnosti se izvodi kao MTT test sposobnosti preživljavanja u pločama s 96-bunarića (Hairanerling efc al., 1996, J.Pharm Biomed Anal 14 (11) :1455-69). Uzorci se razrijede 1:2 osam puta, polazeći s 100 ng Epo per ml u test mediju. 50 ul svakog uzorka se razrijedi, standardno razrjeđenje ili slijepo se transferira u ploču za testiranje s 96 bunarića. TF-1 stanice se isperu tri oputa s hladnim PBC i adaptirane na 2x105 stanica po ml u test mediju. Svaki bunarić ploče s 96 bunarića se prekrije s 50 ul suspenzije stanica i te stanice se ostave kroz 72 sata u CO2 inkubatoru. Nakn toga 10 μl MTT otopine (6 mg/ml u PBS) se doda i inkubira na 37°C kroz 4 sata. Boja se rastopi s 100 μl SDS/HCl (10% SDS u 0.1 M HCl) kroz sljedeća 4 sata u mraku a sposobnost preživljavanja koji ovisi o Epo se fotometrički odredi na 550/690 nm.

Primjer 1 - Konstrukcija plazmida Epo/neo

1. Konstrukcija p2-neo

1.1 Proizvodnja vektora fragmenta od pSV2neo koji sadržava SV40 ranog promotera

Na osnovi konstrukcije vektora plazmida kralježnice pBR322 koji je sadržan u pSV2neo. Manji EcoRI-PvuII restrikcijski fragment uključuje taj pBR322 kralježnice i susjedni PvuII i HindII fragment od SV40 bears relevantnog fragmenta SV4 0 ranog promotera.

Plazmid pSV2neo (ATCC 37149) se prereze restrikcijskim enzimom EcoRI i HindII. Dva nastala fragmenta imaju veličinu od 3092 bp i 2 637 bp. 2 637 bp fragment sadržava ScoRI-PvuII restrikcijski fragment koji uključuje pBR322 kralježnice i susjedni PvuII-HindIII fragment koji sadržava fragment SV40 rani promoter. 2637 bp je proizveden i purificiran preko gel elektroforeze.

1.2 Proizvodnja neomicin rezistentnog gena

Neo gen uzet iz transposon-a Tn5 od pSV2neo. On je amplificiran kao fragment koji sadržava isključivo kodiranu regiju gena. Kao dio startegije kloniranja, mjesto prepoznavanja za restrikciju endonukleaze se uvodi na oba kraja. Hindll mjesto izgrađeno u gornjem dijelu amplifikacijskog primera, £coRI i SpeI mjesta u donjem dijelu primera. Amplificirana regija korespondira s nukleotidama 2846 do 1938 u sekvenciji pSV2neo (Genbank Accession No. U02434). Oligonukleotide su označene kao što slijedi:

Oligo 2004-01: dužine 38mer

5'- ggg gga age ttg ttg gga age cet gca aag taa act gg -3'

SEQ:ID:No.l

5' HindIII: aaggctt-g (=pos.2846 u pSV2neo)ttgggaagccctg.............

SEQ:ID:No.2

Oligo 2004-02: dužine 42mer

5'- ggg gaa ttc act agt gag tec ege tca gaa gaa ete gtc aag -3'

SEQ.ID.No.3

5'EcoRi/SpeI:

gaa ttc actagt-g(=pos. 1938 u pSV2neo) agtcccgctcagaa.........

SEQ.ID.No.4

Produkt amplifikacije priraera 2004-01 i 2004-02 je pripremljen s PCR upotrebom Pwo polimeraze (Roche Diagnostics). Parametri procesa su: 20 ng pSV2neo, 10 pmol svakog primera, 10 mmol dNTPs, 2.5 U Pwo polimeraze u dopunjenom puferu na ukupni volumen od 50 ul; profil temperature: 5 min 95°C, 35 puta (30 sek 95°C, 20 sek 65°C, 90 sek 72°C), 3 min 72°C, hlađenje na °C sve do upotrebe.

Nastali DNA fragment od 935 bp se purificira s DNA izolacijskom kolonom (Mini, Wizard Promega GmbH), digestiran s ScoRI i 'HindIII, i purificiran preko agaroza gela i eluiran Spin Colums (Supelco).

1.3 Konstrukcija p1-neo

Amplificirani EcoRI-HindIII neo gen fragment je ligiran na EcoRI-HindIII fragment vektora od pSV2-neo upotrebom Ligation Express (Clontech) i transformiran na domaćina E.coli {E.coli SURE(Sttratagene)). Transformanti se odabiru po rastu u LB mediju oplamanjenom s 50 mg/l ampicilina.

Plazmid DNA je izoliran iz klona i provjeren restrikcijskom analizom upotrebom EcoRi plus NcoI (3 fragmenta 2527 bp, 780 bp i 251). Plazmid DNA-a pokazuje očekivane fragmente koji su dalje kontrolirani sa sekvencijski relevantnim djelom konstrukcije. Plazraid DNA sadržava verificirani SV40 rani promoter i neomicin rezistentni gen označen kao p1-neo.

1.4 Proizvodnja SV40 terminal ne regije SV40LtpolyA/IVS

PCR primeri su označeni za amplifikaciju fragmenta (nukleotide 7 51 do 1598) SV40 terminalne regije prisutne u pSV2neo. Gornji dio primera isto sadržava restrikcijsko mjesto za SpeI. Osim toga BajuHI mjesto isto tako već je uključeno na poziciju 751 pSV2-neo Eco mjesto je uvedeno u donji dio primera odvojenog s 6 nukleotida razmaknute regije od BamHI. Sekvencije dva primera su ako što slijedi:

Oligo 2004-05: dužine 40mer

5- ggg gac tag ttt gtg aag gaa cct tac ttc tgt ggt gtg a -3'

SEQ.ID.No.5

5' SpeI: actag-t(=pos. 1598 u pSV2neo) ttgtgaagga............

SEQ.ID.No.6

Oligo 2004-06: dužine 46mer

5'- ggg gga att cgg agg ggg act cag aca tga taa gat aca ttg atg a -3'

SEQ.ID.No.7

5' EcoRi/BamEI: _gaattc-g(=pos.751 u pSV2neo) gatcc agacatgataag.

Seq.ID.No.8

Produkt amplifikacije primera 2004-05+2004-06 je proizveden PCR upotrebom Pwo polimeraze (Roche Diagnostics) kao što je opisano gore. Nastali fragment DNA od 873 bp je purififciran upotrebom DNA izolacijske kolone, digestiran s EcoRI i SpeI i gel purificiran.

1.5 Proizvodnja p2-neo

P1-neo plazmid DNA je digestiran upotrebom EcoRI+SpeI. Nastali linearizirani fragment je purificiran, ligiran s amplificiranim fragmentom koji sadržava SV40LTpolyA/IVS i transformiran u domaćina E.coli. Transformanti su odabrani po rastu na LB mediju oplemenjenom s 50 mg/l ampicilina. Plazmid DNA je izoliran iz klonova i provjeren restrikcijskom analizom upotrebom EcoRI (1 fragment od 4411 bp) i NcoI (2 fragmenta veličine 3631 bp i 780 bp) i Sphl(3 fragmenta veličine 3499 bp, 840 bp i 72 bp). Plazmid DNA pokazuje očekivane fragmente koji su dalje čekirani sekvencioniranjem relevantnih dijelova konstrukta. Plazmid DNA sadržava verificirani SV40LTpolyA/IVS koji je označen s p2-neo.

2. Konstrukcija plazmida p3

2.1 Proizvodnja fragmenta SV40 ranog promoter

Plazmid pSV2neo je korišten kao izvor za fragment SV40 rani promotor. Veličina fragmenta je gotovo identična onom korištenom u konstrukciji p2 plazmida. Međutim krajevi fragmenta su modificirani za uvođenje mjesta za identifikaciju mjesta prepoznavanja za BamRI i NotI. Oligonukleotidni primeri korišteni za amplifikaciju promotera su označeni kao što slijedi:

Oligo 2004-07: Dužina: 38 mer

5'- ggg ggjj act ctg tgg aat gtg tgt cag tta ggg tgt gg -3' SEQ ID No. 9

5'- BamHI: ggatcc-t(=pos . 3435 u pSV2neo) gtggaat........... SEQ ID No. 10

Oligo 2004-08: Dužina: 46mer

5' ggg ggc. ggc cgc age ttt ttg caa aag cet agg cet cea aaa aag c-3' SEQ ID No.11

5' NotI: gcggccgc-a(=pos.3093 u pSV2neo) gcttttgcaaaag...... SEQ ID No 12

Produkt amplifikacije primera 2004-07+2004-08 je pripremljen s PCR-om upotrebom Pwo polimeraze (Roche Diagnostics), kao što je gore opisano. Nastali fragment DNA od 365 bp je purificiran upotrebom DNA izolacijske kolone, digestiran s BamHI i NotI, i gel purificiran.

2.2. Proizvodnja dijela pBluescript vektora

pBluescript II SK+DNA je sekvencijski ograničen upotrebom SaraHI i NotI. DNA je defosforilirana upotrebom alkalne fosfataze. BamHI/NotI fragment je purificiran iz malog fragmenta preko agaroza gel elektroforeze prije ligacije.

2.3 Proizvodnja i verifikacija plazmida p3

Amplificirani BamHI-NotI fragment koji sadržava SV40 rani promoter je ligiran u pripremljeni pBluescript II SK+vektor upotrebom T4 DNA Ligaše (Promega GmbH). Plazmid DNA iz E.coli SURE (Stratagene) transformant je izoliran i purificiran iz kolonija na LB mediju obogaćenom s 100 /mg/l ampicilina.

Nastale DNA su prekontrolirane restrikcijskom analizom upotrebom EcoRI plus NcoI (2 fragmenta veličine 3039 bp i 253 bp).

Dva plazmida DNA pokazuju očekivane fragmente koji su dalje prekontrolirani sekvencijom. Oba su prekinuta sa SV40 ranom promoteru pa su sekvencionirani tako da svaka pozicija može biti verificirana. Plazmid je označen kao p3.

3. Izolacija humanog Epo cDNA

3.1 Izolacija cijele RNA 3 TRIZol® reagensom

TRIZol® reagens, korišten za izolaciju Epo RNA iz tkiva humanog bubrega (dobiven od Lainzer Krankenhaus hospital) je mono-fazna otopina fenola i gvanidin izotiocianata. Za vrijeme liže stanica gvanidin izotiocianat formira vodotopivi kompleks s RNA dok su stanice disruptirane. Dodavanju kloroforma, slijedi centrifugiranje, odvajanje otopine u vodenu, RNA koja sadržava i organsku fazu. Nakon separacije vodena faza RNA je precipitirana s izopropilnim alkoholom, isprana s etanolom, osušena zrakom i resuspendirana u RNAse slobodnoj od vode.

Fragmenti tkiva humanog bubrega se usitne u male komadiće, protjeraju kroz 100 um cjedilo za stanice, centrifugiraju (179xg/10 min) a nastale pelete se isperu tri puta s PBS. Potom se pelete resuspendiraju u PBS-u, razdjele u alikvote u sterilne epruvete, zamrznu na -196°C i čuvaju na -80°C sve do upotrebe.

Smrznuto tkivo se lizira dodavanjem 1 ml TRIZol® reagensa, homogenizira i inkubira na 15-30°C kroz 5 minuta da se osigura potpuna disocijacija. Nakon dodavanja 200 ul kloroforma, protrese se epruveta i inkubira kroz 2-3 minute na 15-30°C, epruveta se centrifugira na 12000xg kroz 10 minuta. Nakon centrifugiranja, gornja vodena faza se pažljivo prenese u novu epruvetu pomiješa s 500 ul izopropilnog alkohola i inkubira na 15-30°C kroz 10 min. Precipitirana RNA se centrifugira (12000xg, 10 min), pelete se isperu s etanolom, ponovo centrifugiraju, osuše na zraku i rastope u RNAse free DEPC water. Ukupni sadržaj RNA se mjeri fotometrijski na 2 60 nm.

1 OD260nm= 40 μg RNA/ml

S evaluacijom omjera OD260nm i OD280nm (maksimalna absorbancija proteina) može se procijeniti stupanj čistoće RNA izolata. Granica treba biti između 1.6 i 1.8.

3.2 Izolacija mRNA s Dynabeads Oligo (dT)25

Dvnabeads Oligo (dT)25 mRNA DIRECT kit uključuje hibridizaciju poliadenozinskog repa RNA eukariotske mRNA na supermagnetske, polistirenske dijelove koji sadržavaju 25 nukleotidni lanac od deoksi-timidilat kovalentno dodanog na njihovu površinu. mRNA vezan na magnetsko zrno (beads) može se odvojiti upotrebom Dynal magnetik particle concentrator-a (Dynal MPC®).

Pufer za ispiranje tris-HCl 10 mM, pH 8.0; LiCl 0.15 mM; EDTA 1 mM

2 x Pufer za vezanje tris-HCl 20 inM, pH 7.5; LiCl 1 mM; EDTA 2 mM

Za 10 μg ukupne RNA, 100 μl Dynabeads oligo (dT)25 su odvojeni u Dynal MPC® i isprani dvaput s 2x puferom za ispiranje. Međutim ukupna RNA je podešena na volumen od 200 μl s lx puferom za ispiranje i denaturirana inkubacijom na 65°C kroz 4 minute. Potom se RNA pomiješa s zrnima, inkubira na sobnoj temperaturi kroz 5 minuta i separira u Dynal MPC®. Zrnca se isperu dvaput s lx puferom za ispiranje. Poliadenilirana RNA se eluira iz Dynalbeads Oligo (dT)25 inkubacijom s puferom za eluciju (2 x 10 μl) kroz 4 minute na 65°C. Dvnabeads se odvoje u Dynal MPC® a supernatant se odmah transferira u novi RNAse free epruvetu za mikrocentrifugu. Eluat se direktno koristi za reverznu transkripciju.

3.3 Reverzna transkripcija

Specifični primjer za Epo je denaturiran s inkubacijom od 4 min na 80°C, a mRNA se denaturira inkubacijom 5 min na 65°C. Dodaju se slijedeće komponente u sterilnu 1.5 ml epruvetu za mikrocentrifugu na ledu:

[image]

Inkubacija: 60 min 37°C

Inaktivacija: 5 min 100°C

3.4 Polimeraza lančana reakcija

Slijedeće komponente su dodane u 1.5 ml sterilnu epruvetu za mikrocentrifugiranje na 4°C. PCR uvjeti su pobrojani dolje.

[image]

[image] Produkti PCR amplifikacije su analizirani s agaroza gel elektroforezom.

3.5 Agaroza gel elektroforeza

6 x BX pufer bromfenol plavilo 0.25%; ksilen cianol 0.25%, glicerol 30%

TAE pufer tris baza 242 g; ledena octena kiselina 57.1 ml; EDTA (0.5 M, pH 8.0) 100 ml; podešeno do 1000 ml H2O

Lambda-Marker III 10 pμ bakteriofaga Lambda-wildtype-Dann (2.5 μl Hind III+2.5 pl Eco RI+20 μl pufera R(Fermantas) napuni se s H2O do 200 μl;

1 sat na 37 °C digestija, 20 min na 65 °C inaktivacija, obogaćen s 40 μl BX-loading pufera)

1 g agaroze i 99 g 1xTAE pufera se rastopi u mikrovalnoj pećnici, ohladi se do aproksimativno 60°C i dopuni s 3 μl etidium bromida stok otopine (10 mg/ml). Gel se stavi u 1xTAE pufer na 100-300 V kroz 30 min, ovisno o dužini DNA fragmenata koji će se odvojiti. Svaka linija sadržava 10 μl uzorka pomiješanog s 2 μl 6xBX pufera. Identifikacija DNA fragmenata se bazira na komparaciji s Lamba/Hind III digest molecular weight standard-om.

3.6 Proizvodnja PCR produkata i vektora za ligaciju

3.6.1 Restrikcija vektora DNA 1 Insertacija za lijepljenje kraja kloniranja

10u restrikcijskog enzima i odgovarajućeg restrikcijskog pufera se pomiješa s 1 μg vektora DNA i inserta u skladu s uputom proizvođača. Smjesa se inkubira na 37°C (30°C za Smal) između 30 i 60 min, ovisno o korištenom enzimu, vektoru i insertu. Potom se enzim inaktivira zagrijavanjem sve do 65°C kroz 10 min a reakcijska smjesa se analizira agaroza gel elektroforezom.

3.6.2 Ligacija

pIRESneoSV40 vektor

pIRESneo vektor (Clontech laboratories) sadržava internal ribosome entry site (IRES) virusa encefalomiokarditisa (ECMV), koji dopušta translaciju two open reading frames from one messenger RNA. Kaseta ekspresije pIRESneo sadržava humani citomegalovirus (CVM) major immediate rani promoter/izmjenjivač koji slijedi multipla mjesta kloniranja (MCS), ECMV IRES slijedi s neomicin fosfotransferaza genom i signalom poliadenilacije goveđeg hormona rasta. U tom vektoru CMV promoter je zamijenjen sa SV4 0 ranim promoterom.

Vektor i PCR produkt su vezani s T4 DNA ligazom. Za opitimalnu ligaciju aproksimativno 20 ng vektora i 200 ng inserta (ovisno o dužini) koriste se u molarnom omjeru od oko 1:10 i miješaju sa slijedećim reagensima u ukupnom volumenu od 10 μl H2O. Inkubacija je provedena preko noći na 15°C i 3 sata na RT. Potom se ligaza toplinom inaktivira inkubacijom na 65°C kroz 10 minuta.

[image]

3.6.3 Bakterija i medij za kulturu

JM109 (Promega, USA)

LB-medij pepton iz kazeina 10 g; ekstrakt kvasca 5g; NaCl 10 g, podešen na 1000 ml sa H2O i na pH 7.0 s 5M NaOH

LB agar 15 g agara u 1000 ml LB-medija

LB-Amp 100 μl ampicilina (100 mg/ml) u 1000 ml LB-medija

SOC medij bacto tripton 20 g; ekstrakt kvasca 5 g; NaCl 10 mM; KCl 3 mM; MgCl2 10 mM; glukoza 20 mM, MgSO4 10 mM

3.6.4 Transformacija sa CaCl2

Priprema bakterijske kompetentne (JM109)

10 ml LB medija se inokulira s E. coli (JM109) i raste preko noći na 37°C. 4 ml bakterijske kulture se razrijedi 1:100 u LB mediju i raste sve dok nema OD260nm od 0.8. Bakterije se centrifugiraju na 4500 rpm kroz 10 min na 4°C a pelete stanica se resuspendiraju u 10 ml 0.1 M CaCl2 (4°C)/50 ml korištene bakterijske suspenzije. Stanice se centrifugiraju, pelete se resuspendiraju u 2 ml 0.1 CaCl2 i razdijele u alikvote ukupnog volumena 100 ul, zamrznu se u tekućem dušiku i čuvaju na -80°C.

Transformacija

U prije ohlađene 17x100 mm polipropilenske epruvete sa kulturom 5-10 ng plazmida DNA doda se bakterijska komponenta JM109, nježno promiješa i stavi na led kroz 30 min. Potom se stanice zagrijavanjem šokiraju kroz 45 sekundi u vodenoj kupelji na točno 42°C bez mućkanja i odmah stave na led kroz 2 minute. Potom se doda 900 μl SOC medija u epruvetu i inkubira kroz 30 min na 37°C prije kultiviranja 100 μl bakterijske kulture u umjetnom mediju na LB-Amp ploči.

3.6.5 Skrining i uspostavljanje glicerinske kulture

Za ampicilin rezistentne kolonije proveden je skrining na insertirani DNA fragment s PCR tehnikom. Razdijeljene ampicilin rezistentne kolonije se pomiješaju s PCR reakcijskom smjesom i sa specifičnim primerima protiv kloniranog DNA fragmenta (vidi dolje). Pozitivne kolonije pokazuju pCR-amplificirani DNA lanac u agaroza gel elektroforezi. Te kolonije su umnožene u LB Amp mediju za daljnju analizu i purifikaciju plazmida. Za daljnju upotrebu i čuvanje 1 ml zahtijevane bakterijske kulture se pomiješa s 500 ul glicerina (87%) i čuva na -80°C.

3.6.6. JVizard® Plus Minipreps DNA purifikacijski sustav

Otopina za resuspendiranje tris-HCl 50 mM, pH 7.5; EDTA 10 mM,

stanica RNase A 100 ug/ml

Otopina za lizu stanica NaOH 0.2 M, SDS 1%

Otopina za neutralizaciju gvanidin hidroklorid 4.09 M, kalijev acetat 0.759 M, ledena octena kiselina 2.12, pH 4.2 Otopina za ispiranje kolone kalijev acetat 60 mM, tris-HCl 10 mM, 7.5; etanol 60%

Inokulira se 2-3 ml LB-Amp medija sa jednom kolonijom i inkubira na 37 °C preko noći. Otopina se centrifugira (12000xg, 5 min) a nastale pelete se potpuno resuspendiraju u 250 μl otopine za resuspendiranje i potom 250 μl otopine za ližu stanica, pomiješa s okretanjem epruvete 4 puta i inkubira na RT kroz 1-5 min. Nakon toga doda se 10 μl alkalne otopine proteaze (inkubirane na RT kroz 5 min) i 350 μl otopine za neutralizaciju. Epruveta se odmah miješa okretanjem 4 puta a bakterijski lizat se centrifugira na 12000xg kroz 10 min na RT. Bistri lizat se transferira u Spin Columns i centrifugira (12000xg, 5 minuta) a kolona se ispere dvaput otopinom za ispiranje (750 μl/250 μl). DNA se eluira s 100 ul nuclease-free water.

3.6.7 Sekvencioniranje plazmida

Insertirane sekvencije se sekvencionira s IBL (Gerasdorf, Austrija) i s GenXpress (Maria Worth, Austrija) sa specifičnim primerima. Dolje su pobrojani oligonukleotidni primeri za amplifikaciju Epo i SV40ranog promotera i za analizu sekvencija.

[image]

4. Konstrukcija plazmida p5

4.1 Priprema Epo fragmenta gena

Strukturni gen za Epo (humani eritropoetin) amplificiran je PCR-om upotrebom pSVGPIRNEO kao template DNA. Sekvencija Epo je dobivena iz GenBank Accession No. M 11319.1. Prepoznato mjesto za NotI i Kspl su uvedena u gornji i donji dio primera. Primeri su označeni kao što slijedi:

Oligo 2004-09: Dužina: 45mer

5'-ggg gtje ggc ege atg ggg gtg cac gaa tgt cet gcc tgg ctg tgg -3' SEQ ID No.24

5' NotI: gcggccgc a(=pos. 665 u PSVGPIRNEO) tgggggtg.... SEQ ID No. 25

Oligo 2004-10: Dužina: 44mer

5'-ggg gcc geg ejte atc tgt cee ctg tec tgc agg cet cee ctg tg -3' SEQ ID No 26

5'-Kspl; ccgcgg-t(=pos.l24 6 u PSVGPIRNEO) catctgtcccct.... SEQ ID No.27

Produkt amplifikacije primera 2004-09+2004-10 je proizveden PCR-om uz upotrebu Pwo polimeraze (Roche Diagnostics), kao što je gore opisano. Nastali fragment DNA od 604 bp je purificiran upotrebom kolone za izolaciju DNA, digestiran s Kspl i NotI, i gel purificiran. Nastali 592 bp Kspl/NotI fragment se koristi u trostrukoj ligaciji opisanoj dolje.

4.2 Priprema kraja regije SV40LTpolyA/IVS

Kraj regije SV40LTpolyA/IVS je rekloniran iz pSV2neo s PCR-om na isti način kao što je opisano gore u dijelu 1.4 za konstrukciju p2-neo osim da su primeri konstruirani s različitim restrikcijama kraja nukleaze mjesta prepoznavanja: mjesto za Kspl(=SacII) je uključeno u gornji primer a mjesto for SacI i EcoRI u donji primer.

Oligo 2004-11: dužina: 42mer

5- ggg gcc gcg gtt tgt gaa gga acc tta ctt ctg tgg tgt gac -3' SEQ ID No.28

5' Kspl: ccgcgg-1(=pos.1598 u pSV2neo)ttgtgaaggaa.... SEQ ID No.29

Oligo 2004-12: dužina: 46mer

5'- ggg gga get cga att cga tcc aga cat gat aag ata cat tga g -3' SEQ ID No.30

5' SacI/EcoRI: gagctc gaattc-g(=pos.752 u pSV2neo) atccagacatg . SEQ ID No. 31

Produkt amplifikacije primera 2004-11+2004-12 je pripremljen s PCR-om uz upotrebu Pwo polimeraze (Roche Diagnostics), kao što je opisano gore. Nastali DNA fragment 873 bp je purificiran upotrebom kolone za izolaciju DNA i digestiran s KspI i SacI. Nastali DNA fragment od 858 bp je potom gel-purificiran.

4.3 Proizvodnja dijela p3 vektora

p3 plazmid DNA je sekvencionalno digestiran upotrebom NotI i SacI. DNA se tretira alkalnom fosfatazom a fragment vektora je gel purificran.

4.4 Trostruka ligacija i izolacija plazmida p5

NotI/SacI dio vektora plazmida p3, KspI/NotI Epo gena i KspI/SacI krajnja regija SV4 0LTpolyA/IVS su povezani u reakciji vezivanja (Ligation Express, Clontech). Transformanti su selektirani u LB mediju obagačenom s 100 mg/l ampicilina.

Pozitivni transformanti koji sadržavaju oba insertirana fragmenta provjereni su kolonskom hibridizacijom upotrebom amplificiranih fragmenata 2004-09/2004-10 i 2004-11/2004-12, kao što su označene probe. Deset klonova koji daju pozitivni signal hibridizacije s obje probe su izabrani za proizvodnju plazmida u „midi" uvjetima (Qiagen).

Restrikcijska analiza je provedena upotrebom enzima BamHI (1 fragment 4723 bp), EcoRI(2 fragmenta, 2913, 1810 bp) i PvuII(4 fragmenta 2513, 1204, 903, 103 bp). Dva klona pokazuju odabrane ispravljene restrikcijske fragmente i čekirane s sekvencioniranjem. Cijela klonirana kazeta u pBluescript II SK+ sekvencionirana je i komparirana sa očekivanom nukleotidnom sekvencijom. Svaka pojedina nukleotida može se zadovoljavajuće verificirati. Plazmidi su označeni p5.

5. Konstrukcija pEpo/neo

5.1 Konstrukcija pEpo/neo 12-1

p5 plazmid DNA je digestiran s BamHI i EcoRI a nastali 1792 bp fragment predstavlja kasetu SV40promotera-Epogene-SV4 0 terminatora purificiranu u gelu. Plazmid p2-neo je isto digestiran s BamHI i EcoRI a lineariziran vektor gel purificiran. Dodatno DNA je defosforilizirana upotrebom alkalne fosfataze i purificirana s Amicon Micropure enzyme removersom.

Oba fragmenta, 4411 bp p2-neo vektor i 1792 bp kaseta od p5, su ligirani (Ligation Express, Clontech) i transformirani u E.coli SURE. Plazmid DNA je izoliran iz različitih transformanata naraslih u LB mediju obogaćenom s 70 ml/l ampicilina i analiziranom digestijom koristeći endonukleaze PvuII, EcoRI i NocI.

Klon pokazuje očekivane fragmente (EcoRI: 6191 bp, NcoI: 4085, 1326 i 780 bp, PvuII: 3273, 2130, 685 i 103 bp) koji su odabrani i označeni kao pEpo/neo-12.

Za dodatnu purifikaciju DNA je retransformirana u E.coliSURE (vidi gore) a plazmid DNA proizveden upotrebom „Midi-prep" postupka (Qiagen) iz kulture inokulirane jednom kolonijom (pEpo/neo-12-1). Restrikcijska analiza se provodi upotrebom slijedećih enzima: BamHI, HindIII, EcoRI, NcoI, NotI, PstI, SpeI, SphI, PvuII, NarI. Očekivani fragmenti i veličine mogu se odrediti, verificiranjem klona kao correct pEpo/neo klon.

5.2 Finalna konstrukcija pEpo/neo

Gornja regija Epo gena u pEpo/neo-12-1 je promijenjena na poziciji minus-3 polazeći od ATG. Dodatna nukletida A je uvedena u nastalu purinsku bazu G na poziciji -3 polazeći od ATG. Purin na toj poziciji može osigurati ekspresiju nivoa gena. U tu svrhu Epo gen je reamplificiran upotrebom adaptiranim gornjim primerom 2004-09-a:

Oligo 2004-09-a: dužina 46 mer

5'- gggggcggccgcaatgggggtgcacgaatgtcctgcctggctgtgg -3' SEQ ID No.32

Amplifikacija produkta primera 2004-09 a+2004-10 je provedena PCR-om koristeći Pwo polimarazu (Roche Diagnostics), kao što je gore opisano. Nastali DNA fragment od 605 bp purificiran je upotrebom DNA kolone za izolaciju i digestiran upotrebom KspI i NotI. Nastali DNA fragment od 593 bp potom je gel-purificiran.

pEpo/neo-12-1 plazmid DNA je digestiran s KspI i NotI, za odstranjivanje Epo gena. 5599 bp fragment je potom gel-purificiran. Obje priređene DNA su vezane jedna na drugu (Ligation Express, Clontech). Plazmid DNA od transfotmanata je izoliran i purificiran iz kolonija u LB mediju obogaćenom s 70 mg/l ampicilina. DNA su analizirane restrikcijom upotrebom NcoI u prvom skriningu.

Pozitivni klon je odabran od izolata DNA upotrebom „Midi prep" postupka (Qiagen). Propisana restrikcijska analiza izvodi se upotrebom BamHI, Hindll, EcoRI, NcoI, NotI, PstI, SpeI, Sphl, PvuII, Narl. Očekivani fragmenti i veličine mogu se odrediti, verificiranjem klona kao correct pEpo/neo. Svaka pojedina nukleotida cijele kasete (SV40rani_promoter-neo gen-SV4 OLTpolvA/IVS-SV4 Orani_promoter-Epo gen-SV4 OLTpolvA/IVS) insertiran u pBR322 dio vektora isto je potvrđena sekvencioniranjem.

Primjer 2 -Konstrukcija plazmida Epo/dhfr

1. Konstrukcija p2-dhfr-CDS

1.1 Proizvodnja dhfr gena

Gen dhfr korišten za konstrukciju vektora je uzet iz mišjeg cDNA, prisutnog u plazmidu pLTRdhfr26 (ATCC 37295). Sekvencija nukleotide mišjeg dhhfr cDNA (MUSDHFR) je dostupna u GenBank Accession No.L26316.

Dhrf se amplificira iz pLTRdhfr26 upotrebom primera određenog za proizvodnju fragmenta koji sadržava kodiranu regiju polazeći od ATG na poziciji 56 na stop codon TAA na poziciji 619. Kao i za amplifikaciju neomicin rezistentnog gena opisanoj gore, HindIII i SpeI mjesta su uvedena u gornji i donji primer amplifikacije. EcoRI mjesto je isto uvedeno u reverzni primer pored SpeI mjesta- Sekvencija oligonukleotida je kao što slijedi:

Oligo 2004-13: dužina:39 mer

5- ggg gaa gct tat ggt teg ace att gaa ctg cat cgt cgc-3' SEQ ID No.33

5-HindIII: aagctt-A(=pos.56 u MUSDHFR) TGgttcgaccattg.. SEQ ID No.34

Oligo 2004-14: dužina 42mer

5- ggg gaa ttc act agt tag tet ttc ttc teg tag act tca aac -3' SEQ ID No. 35

5' EcoRI/SpeI: gaattc actag-t (=pos. 619 u MUSDHFR) tagtctttcttctcgtagacttcaaact. SEQ ID No.36

Produkt amplifikacije primera 2004-13+2002-14 je pripravljen PCR-om uz upotrebu Pwo polimeraze (Roche Diagnostics), kao što je opisano gore. Nastali fragment DNA od 588 bp purificiran je upotrebom kolone za izolaciju DNA, digestiran s HindIII i EcoRI i gel purificiran.

1.2 Proizvodnja p1-dhfr-CDS

Amplificiran EcoRI-HindIII dhfr fragment gena povezan je na EcoRI-HindIII fragment vektora od pSV2-neo korištenjem Ligation Express (Clontech), i transformiran u E.coli domaćina. Transformanti su odabrani rastom u LB mediju obogaćenom s 50 mg/l ampicilina. Plazmid DNA od transformanta izoliran je i purificiran iz kolonija u LB mediju oplemenjenom s 50 mg/l ampicilina.

Plazmid DNA izoliran je iz klonova i provjeren s restrikcijskom analizom upotrebom £coRI plus Seal (3 fragmenta veličine 2225 bp, 514 bp i 437 bp).

Plazmid DNA pokazuje da su očekivani fragmenti dalje čekirani s sequencing relevant parts of construktors. Plazmid DNA sadržava verificirani SV4 0 rani promoter i dihidrofolat reduktaza gen koji je konstruiran kao p1-dhfr-CDS. Analiza sekvencije revealed bez devijacije unutar dhfr gena od sekvencije objavljene u MUSDHFR, specifično promjenjene od T na C poziciju 451 MUSDHFR sekvencije. Sekvencionirana sekvencija pokazuje da je ta promjena isto prisutna u izvoru plazmida. Međutim nastale promjene ne uzrokuju promjene u sekvencijama amino kiseline enkodirane sekvencije nukleotide od CTT i CTC obe enkodirane leucinom.

1.3 Proizvodnja p2-dhfr-CDS

p1-dhfr-CDS plazmid DNA je digestiran upotrebom EcoRI+SpeI. Nastali linearizirani fragment je purificiran s amplificiranim fragmentom koji sadržava SV40LTpolyA/IVS (opisan gore). Slijedi transformacija i selekcija, nastali plazmidi su analizirani restrikcijskom analizom upotrebom Accl (3 fragmenta od 2994, 855 i 216 bp). Nekoliko je odabrano i dodatno analizirano upotrebom HincII (2 fragmenta od 34 66 bp i 599 bp), AflIII (2 fragmenta 2872 bp i 1193 bp) i BglI (2 fragmenta od 2371 bp i 1694 bp).

Plazmid DNA pokazuje sve očekivane fragmente u korektnim veličinama dalje je čekiran sekvencioniranjem. Verificirani plazmid je konstruiran kao p2-dhfr-CDS.

2. Konstrukcija pEpo/dhfr

2.1. Proizvodnja pEpo/dhfr 21

p5 plazmid DNA je digestiran s BamHI i EcoRI a nastali 17 92 bp fragment predstavlja kasetu SV4 0promoter-Epogene-SV40terminator koja je gel-purificirana.

Plazmid p2-dhfr-CDS je isto digestiran s BamHI i EcoRI a linearizirani vektor je gel purificiran i eluiran sa Supelco spin kolonom. Dodatno DNA je defosforilirana upotrebom alkalne fosfataze i purificirana s Amicon Micropure enzyme removersom.

Oba fragmenta, 4053 bp p2-dhfr-CDS vektor i 1792 bp kaseta od p5, su povezani (Ligation Express, Clontech) i transformiran u E.coliSURE. Transformirane kolonije koje rastu na LB mediju obogaćenom sa 70 mg/l ampicilina su hibridizirane upotrebom Epo gena (PCR-produkt) kao probe. Plazmid DNA je izoliran iz različitih pozitivnih klonova i analiziran digestijom upotrebom restrikcijske endonukleaze NcoI.

Klon pokazuje očekivane fragmente (NcoI: 4085 bp i 1760 bp) selektiran je i označen s pEpo/dhfr-21. Za dodatnu purifikaciju DNA je retransformirana u E.coliSURE (vidi gore) a plazmid DNA pripravljen upotrebom „Midi-prep" postupka (Qiagen) iz kulture inokulirane jednom kolonijom (pEpo/dhfr-21-1).

Restrikcijska analiza je provedena upotrebom sljedećih enzima: BamEI, HindIII, EcoKI, NcoI, NotI, Pstl, SpeI, SphI, PvuII, NarI. Svi očekivani fragmenti i veličine mogu se odrediti, verificiranjem klona kao correct pEpo/dhfr-21.

2.2 finalna konstrukcija pEpo/dhfr

U istim slučajevima kao što je pEpo/neo gornja regija Epo gena u Epo/dhfr-21 promijenjena je pozicija -3 navedenog na početku ATG. Dodatna nukleotida A je uvedena na nastalu u purinskoj bazi G na poziciju -3 od početka ATG. Epo gen je reamplificiran kao što je opisano u Primjeru 1, dio 4.2. pEpo/dhfr-21 plazmid DNA je digestiran s KspI i NotI, za odstranjivanje Epo Gena. Fragment 5259 je potom gel-purificiran.

Obje preparirane DNA su povezane jedna na drugu (Ligation Express, Clontech). Plazmid DNA od transformanata je izoliran i purificiran iz kolonije u LB mediju obogaćenom s 70 mg/l ampicilina. DNA su restrikcijom analizirane upotrebom NcoI u prvom skriningu.

Pozitivni klon je selektiran na izolatu DNA upotrebom „Midi prep" postupka (Qiagen). Proširena restrikcijska analiza je provedena upotrebom BamHI, HindIII, EcoRI, NcoI, NotI, PstI, SpeI, SphI, PvuII, Narl. Očekivani fragmenti i veličine mogu se odrediti, verificiranjem klona kao correct pEpo/dhfr.

Svaka pojedina nukleotida cijele kazete (SV40rani promoter-dhfr gena -SV4 0LTpolyA/IVS-SV4Orani promoter- Epo gen SV4OLTpolyA/IVS) insertirana u pBR322 vektor-dio je isto potvrđena sekvencioniranjem.

Primjer 3- Rekombinirane CHO-stanice generirane od pEpo/neo i pEpo/dhfr

Dan prije izvođenja lipofekcijske transfekcije zasije se 1-5x104 stanica po cm2 u 25 cm2 T-plosnate boce ili ploče s 96 bunarića. Dva plazmida se pomiješaju u omjeru 50:1=Epo/neo:Epo/dhfr i ostave da se adsorbira reagens lipofektin (Gipco/BRL) u skladu s uputom proizvođača.

Ukratko, koristimo 0.25 μg DNA/cm2 i 1.5 μl lipofektin-reagensa/cm2 i podesi se taj DNA/lipid koktel na 200 μl/cm2 sloja stanica. Potom se stanice prekriju koktelom za transfekciju kroz četiri sata u serum-fre DMEM, prije medij koji sadržava DNA zamijeni se selekcijskim medijem. Nakon kultiviranja od 24 sata medij koji sadržava serum se zamijeni sa medijem za selekciju. Pulovi transfektiranih stanica se najprije kultiviraju u selekcijskom mediju za proticanje i potom u mediju za amplifikaciju (4.8x10-8M MTX) prije skrininga supernatanta s ELISA-om za Epo produkciju. Veliki proizvođači određuju se, MTX koncentraciju koja poraste dva-puta a bolji proizvođači se koriste za daljnju kultivaciju. 7 pulova rekombiniranih stanica se odaberu i kompariraju na provođenje svojstava rasta, Epo produktivnost, proteine (s western blot analizom), Epo funkcionalnost i kromosomsku stabilnost.

Transfekcija u T25-boce izvodi se s 2.5 μg pEpo/neo, 0.05 μg pEpo/dhfr i 15 μl lipofektina (09/T25/1 i 09/T25/2) po T25-boci i s 2 μg pEpo/neo, 0.4 μg pEpo/dhfr i 15 μl lipofektina (09/T25/3 i 09/T25/4) po T25-boci.

Dodatno pet ploča se transfektira s 10 μg pEpo/neo, 0.2 μg pEpo/dhfr i 60 μl lipofektina po ploči (09/96/1-09/96/5), pet ploča s 8 μg pEpo/neo, 1.6 μg pEpo/dhfr i 60 μl lipofektina po ploči (09/96/6-09/96/10). Ploče 11 i 12 su transfektirane s 6.25 ug pEpo/neo, 0.08 μg pEpo/dhfr i 37.5 μl lipofektina svaka.

Ukratko, 0.25 μg DNA/cm2 i 1.5 μl lipofektin-reagensa/cm2 se koristi a taj DNA/lipid koktel se podesi na 200 μl/cm2 sloj stanica.

Serije transfekcija su uglavnom provedene na mikrotitarskim pločama dok predhodni eksperimenti pokazuju da je broj klonova u jednoj kultivacijskoj jedinici maksimum tri do pet. To znači lakšu izolaciju monoklonskog transfektanta od izolacije od tisuću klonova iz T-boce. Tablica 1 opisuje broj klonova po ploči s 96-bunarića i ELISA titar s i bez amplifikacije tlaka. Pulovi transfektiranih stanica se najprije kultiviraju u selekcijskom mediju za okupljanje i potom amplifikacijskom mediju (4.8x10-8 M MTX) prije skrininga supernatanta stanične kulture s ELISA na Epo proizvodnju. Skrining je napravljan na rastu aproksimativno 1000 bunarića, i 50 takvih kultura je testirano na specifičnu Epo-produktivnost s porastom koncentracije MTX. Veći proizvođači su određeni, dvostrukim porastom MTX a bolji proizvođači su korišteni za daljnju kultivaciju.

Selekcija i prvi korak amplifikacije su urađeni u pločama s 96 bunarića a nakon skrininga svih kolonija, rastu u 4.8x10-8 M MTX, 7 kolonija je odabrano, označeno 09/96/1F5, 09/96/3D5, 09/96/3H5, 09/96/5D4, 09/96/5H1, 09/96/6C5 i 09/96/7E6, i komparirana su njihova svojstva rasta, Epo produktivnost, svojstva proteina u western blots, test Epo funkcionalnosti i kromosomske stabilnosti.

Vrijeme udvostručavanja stanica čini se da je isto za klonove i oni se mogu razdijeliti 1:2 do 1:5 dvaput tjedno. Povećavanje MTX koncentracije od 9.6x10-8 M na 1.9x10-7 M isto poboljšava produktivnost, dok dalje udvostručavanje MTX koncentracije ne utječe na ELISA vrijednost. Tako subkloniranje se izvodi na 3.8x10-7 M MTX. Imunoflorescencija se analizira na 1.9x10-7 M MTX gdje pojedinačne kulture ne čine signifikantnu razliku.

Morfologija stanice je komparirana svjetlosnom mikroskopijom i Coulter Counter nucleus DNA analizom. Klonovi 09/96/7E9, 09/96/6C5, 09/96/5H1, 09/96/5D4 i 09/96/3D5 obilježava distribucijama veličine jezgra kao linijske CHO-DHFR* stanice domaćina. Nasuprot tomu, stanice linije 09/96/1F5 i 09/96/3H5 imaju dužu jezgru. Poznato je iz predhodnih eksperimenata da su ti rezultati od proširenog broja kromosoma. Zato je odlučeno da se upotrebi klon 09/96/3D5 za daljnju stabilizaciju.

Test funkcionalnosti za Epo na TF-1 stanicama daje neke sadržaje supernatanata za svih sedam kultura koje su uspoređene s rekombiniranim farmaceutskim produktom. Rekombinirani protein je testiran s SDS PAGE i western blotting za svaku MTX koncentraciju i samo male promjene su nađene u svakom supernatantu rekombinirane kulture. Klonovi proizvode Epo.

Sažetak i rasprava

Opisana je selekcija rekombinanta, Epo ekspresiranih CHO-linijskih stanica iz konstrukcije eukariotske ekspresije vektora sve do transfekcije stanica sisavaca i izolacija pulova poliklonalnih Epo ekspresiranih stanica. Analitička baza je izvedena uglavnom s ELISA, imunoflorescencijom, western blotting i in vivo testom funkcionalnosti. Sve te metode su uspostavljene u granicama koncentracija tako da su sposobne za skrining niske proizvodnje pula supernatanata kulture stanica sa samo ng/ml količinom baš kao i za više stabilizirane rekombinirane stanice.

Proizveden je rekombinirani CHO-pul, u kojem broj kopija gena je amplificiran postepeno na 3.8x10-7m MTX. Te stanice mogu se razdijeliti 1:3 do 1.4 dvaput tjedno i svaki puta povišeni nivo Epo je određen ELISA-om.

Primjer 4 - daljnja selekcija rekombiniranih staničnih-linija

Pul rekombiniranih stanica 09/96/3D5 koristi se za daljnju stabilizaciju. MTX koncentracija je porasla postepeno na 0.38 μM MTX. Na tom nivou amplifikacije rekombinirane 3D5 stanice su subklonirane s 10 i 2 0 stanica po bunariću. Skrining supernatanta kulture bunarića s jednim klonom izvodi se ELISA-om. Tablica 2 pokazuje uvjete subkloniranja i učinkovitost pula rekombinirane stanice 3D5 u prisutnosti 0.38 μM MTX. Testirano je 300 supernatanata pojedinog klona. Klonovi povišenog Epo titra četiri dana nakon pasaže su selektirani s 0.77 μM MTX u pločama s 24 bunarića.

Sedam od tih klonova se konzervira u tekućem dušiku i odabire za daljnju amplifikaciju gen copy broja s povišenjem koncentracije na 1.54 μM.

Tablica 3 kompilira plating uvjete i učinkovitost druge runde stabilizacije. Ovdje su klonovi 09/96/3D5/1H9 i 09/96/3D5/18E5, su subklonirani finalno vrijeme s 1.54 uM MTX. Broj stanica po bunariću je reduciran na 4 stanice. 2 60 jednostrukih klonova je provjereno od kojih više od dvadeset klonova svake subkultivacije je transferirano u T-boce i provjereno na specifičnu produktivnost. Finalna produkcija klonova je po navedenim kriterijima kao što je specifični omjer ekspresije, uvjetima rasta i distribucije veličine stanica. Klonovi koji pokazuju tetraploidnost su isključeni zbog iskustva da takve stanice imaju tendenciju pokazivanja kompliciranog rasta u bioreaktoru. Nakon skrininga sljedećih šest subklonova (četiri 1H9 i dva 18E5 subklona) su odabrani, i oni su zamrznuti u tekućem dušiku

09/96/3D5/1H9/4C2 09/96/3D5/1H9/6C2 09/96/3D5/1H9/6D4

09/96/3D5/1H9/15B4 09/96/3D5/18E5/7A6 09/96/3D5/18E5/15C3

Primjer 5 - adaptacija na kultivaciju u mediju bez seruma

Finalno šest rekombiniranih linijskih stanica iz Primjera 4 nakon zadnjeg koraka subkloniranja je odabrano za adaptaciju na kultivaciju u uvjetima medija bez seruma.

Stanice su zasijane u 7.-12. pasaži nakon subkloniranja s aproksimativno 5x104 stanica/cm2 u T25-bocama i kultivirane su 3-4 dana do spajanja. U to vrijeme točka medija se premjesti kompletno u medij za adaptaciju bez seruma i nakon toga 80% medija se zamjeni svaki dan. Sve suspendirane stanice se vrate u kulturu. Nakon vremena adaptacije, nakon što gotovo sve stanice u suspenziji narastu, klonovi se dvaput tjedno pasiraju i kultiviraju kao suspenzija-kulture.

Klonovi su kultivirani kroz 11-13 pasaža u mediju za adaptaciju bez seruma prije krioprezerviranja. Šest ampula s 5x106 stanica svaka su zamrznute za svaku staničnu liniju u tekućem dušiku u mediju za smrzavanje bez seruma. Nakon otapanja, klonovi se kultiviraju u mediju bez seruma za proizvodnju. Analitička karakterizacije na odabir za proizvodnju klona je provedena sa supernatantom u drugoj ili trećoj pasaži nakon otapanja.

Analitički testovi uključuju:

Procjenu specifičnog rasta[p]- (u= u (X2/X1) /dani)

Specifična produktivnost [gP] - (QP=proizvod-generaci ja x 106/(broj stanica x dana))

Western blot

Izoelektrično fokusiranje

Sadržaj DNA i stabilitet

Stabilitet klona

Svih šest staničnih linija raste u mediju za rast bez seruma i podijeli se dvaput tjedno. Krioprezervacija se isto izvodi bez seruma i nakon otapanja medij za kultivaciju se zamijeni medijem za proizvodnju bez seruma. Ta formulacija je obogaćena glukozom i amino kiselinama.

Nakon 5 pasaža određuju se različiti parametri proteina i stanica, a odaberu se jedan proizvodni klon

(09/96/3D5/1H9/6C2; skraćeno 6C2) i jedan pomoćni klon

(09/96/3D5/1H9/4C2; skraćeno 4C2).

Primjer 6 - Komparacija rekombiniranih staničnih linija

Svojstva rasta šest staničnih linija iz Primjera 4 i 5 se računaju kroz nekoliko tjedana određivanjem broja stanica u kulturi isto tako kao i omjer razdjeljivanja tijekom pasaža. Epo produktivnost se testira s ELISA-om. Iz tih podataka izračunaju se specifična produktivnost i specifičan omjer rasta kao što je opisano gore.

Tablica 4 sumira podatke dobivene u uvjetima standardne kultivacije sa omjerom razdjeljivanja 1:3 nakon trodnevne kultivacije.

Prikazan je broj stanica (mjereno Couter Counter) nakon razdjeljivanja i nakon dodatna tri dana.

SDS-PAGE u reduciranim uvjetima

Supernatant šest staničnih linija se odvoji sa SDS-PAGE i komparira s razlikama u molekularnoj masi. Šest supernatanata pokazuje identičan SDS uzorka sa razmazom, obično u tako visokim glikosilat proteinima (podaci nisu prikazani).

Usporedivi komercijalno dostupni proizvodi putuju više kao određena skupina vjerojatno putujući od odvojene određene skupine tijekom procesa donjeg strujanja.

IEF-Western blot

IEF-westerb blot analiza može utjecati na potencijalnu mikroheterogenost glikoproteina. U skladu s količinom proteina koji je nanesen na gel s četrnaest traka tako da postanu vidljivi. To je jedna od karakteristika double-band vidljive na western blot aproksimativno u sredini gela; sljedeća donja traka pod tom double-band je definirana kao traka broj jedan i 9 do 10 traka je vidljivo u tom kiselom dijelu gela. Usporedni komercijalni produkt daje četiri glavne trake koje korespondiraju sa trakom broj šest do devet u heterogenom produktu.

Sadržaj DNA rekombiniranih stanica

Sadržaj DNA je proporcionalan broju kromosoma staničnih linija. Stabilitet rekombiniranih staničnih linija je u dijelu na koji djeluje kromosomski broj i identičnost DNA sadržaja je verificiran komparacijom sa staničnom linijom domaćina (CHO dhfr-).

Sažetak i rasprava

Ovdje je opisana izolacija rekombinanta i Epo ekspresiranih CHO staničnih linija. Nakon dvije runde subkloniranja šest staničnih linija komparira se na različita svojstva na osnovi označavanja jednog finalno proizvedenog klona. Analitička osnova je uglavnom ELISA, western bloting i IEF testovi a isto tako mjernje DNA s FACS analizom.

Western blot uzorak supernatanta rekombinirane kulture pokazuje nekoliko dodatnih nižih molekularnih masa traka u usporedbi s komercijalno purificiranim proteinom. Jedno objašnjenje je da te dodatne trake predstavljaju izooblike koji su odstranjeni tijekom nizvodnog procesa koji dovodi do komparacije s komercijalnim produktom. Sljedeća mogućnost tih umjetnih traka je da su zbog toga nepotpuno obhvaćene SDS-om. Izoelektrično fokusiranje daje identičnu distribuciju izooblika za sve supernatante stanične kulture, nezavisno od njegovog Qp.

Najbolji proizvedeni klon kojim se najlakše rukuje je klon 6C2 koji je izabran kao proizvodni klon. Kao pomoćni klon je izabran 4C2. Oba klona mogu se umnažati u roler bocama.

Primjer 7 - kultivacija CHO stanica u T-bocama

Rekombinirani humani eritropoetin je proizveden u linijskim stanicama ovarija kineskog hrčka (CHO) u uvjetima bez seruma u T-bocama. Kultura se nasadi s 2.67 x 106 stanica/mL. Nakon razdoblja inkubacije od tri dana postignuta je gustoća stanica je 9.35 x 10 5 stanica/mL (=>μ=0.42 dana-1).

Primjeri 1 do 6 opisuju proizvodnju brojnih CHO klonova koji ekspresiraju Epo. Od šest klonova dobivenih u Primjerima 4 i 5, klon CHO 6C2 je izabran zbog njegove visoke stanične specifičnosti produktivnosti i njegovog visoko specifičnog rasta.

Primjer 8 - Kultivacija CHO stanica u bioreaktoru

CHO stanična linija 6C2 je kultivirana u Fed-Batch (T43C6C2) modelu u 150 1 bioreaktoru. Upotreba medija za kulturu stanica koji sadržava amino kiselinama-obogaćen 50:50 DMEM/Hams F12 i sadržava 0.25% biljnog peptida, 0.1% lutrola, 1.54 μM metotreksata (MTX), 4g/L glukoze, 2.5 g/L NaHCO3, etanolamin, željezo citrat, askorbinsku kiselinu i natrij selenit. Medij ne sadržava skupocjene funkcionalne proteine (rekombinirane ili prirodnog porijekla). Prisutne su derivirane komponente životinjskog porijekla. Stanice su nasađene sa oko 5 x 105 stanica/mL u 56 L medija. pO2 počinje sa 50% zasićenim zrakom, temperaturom na 37°C i pH na 7.0 i održava konstantno tijekom trajanja fermentacije.

Koncentracija glukoze se čuva na oko 1g/L. Nakon 4 dana reaktor se puni sa 150 L svježeg medija. Nakon 9 dana serija se proširi dodavanjem 1875 mL hranjivog koncentrata koji sadržava amino kiseline, karbohidrat i peptone derivirane iz bilja. Nakon 10 dana doda se sljedećih 1875 mL hranjivog koncentrata. Dva dana kasnije (12. dan) sakupi se supernatant koji sadržava eritropoetin.

Primjer 9 - Proizvodnja eritropoetina u bioreaktoru bez metotreksata

CHO stanična linija 6C2 je kultivirana u Fed-Batch(Kamp 4 B5-1 and 2) model u 5-L bioreaktoru. Medij je kao u Primjeru 9. Prvi bioreaktor (Kamp 4B5-1) je postavljen s 1.54 um MTX u mediju, a drugi (Kamp 4 B5-2) bez MTX.

Koncentracija glukoze se održava na oko lg/L. Stanice se nasade sa oko 5 x 106 stanica/mL u 1250 mL medija. pO2 počinje sa 50% zasićenim zrakom, temperaturom na 37°C i pH na 7.0 i održava konstantno tijekom trajanja fermentacije. Nakon 2 dana reaktor se puni sa 5 L svježeg medija. Nakon 6,7,8,9, i 10 dana serija se proširi dodavanjem 50 do 122-mL hranjivog koncentrata koji sadržava amino kiseline, karbohidrat i pepton porijeklom iz bilja. 11. dana sakupi se supernatant koji sadržava eritropoetin.

Za kultivaciju bez metotreksata utvrđeno je da je superiornija zbog najbolje glikolizacije.

Uzorak 10 - proizvodnja eritropoetina u bioreaktoru s obogaćenim medijem

CHO stanice linije 6C2 su kultivirane u Fed-Batch (Kamp 11 B5-1 i 2) modelu u 5 L bioreaktoru. Bioreaktor 1 radi kao onaj u Primjeru 10 (Kamp 4 B5-2). U bioreaktoru 2 korišten je medij kulture stanica obogaćen amino kiselinom 50:50 DMEM/Hams F12 i sadržava 0.325% biljnog peptida, 0.1% lutrola, 6.4 g/L glukoze, 2.5 g/L NaHCO3, etanolamin, željezo-citrat, askorbinsku kiselinu i natrij selenit i 0.6 g/L fosfata. Stanice su zasijane na oko 5 x 105 stanica/mL u 1250 mL medija. pO2 počinje sa 50% zasićenim zrakom, temperaturom na 37°C. pH se podesi na početku na 7.1. Tijekom trajanja fermentacije razumno se reducira na 6.9.

Za vrijeme trajanja kultivacije koncentracija glukoze u bioreaktoru 2 se održava između 3 do 4 g/L. Nakon 2.5 dana reaktor se puni sa 5 L svježeg medija. Nakon 6,7,8,9 i 10 dana serija se proširi dodavanjem obogaćenog hranjivog koncentrata koji sadržava amino kiseline, karbohidrat i peptone biljnog porijekla. 11. dana sakupi se supernatant koji sadržava Epo. Kultivacija s hranjivim obogaćenim medijem (amino kiselina, glukoza, biljni pepton i fosfat) kao i pH se pomiče od 7.1 na 6.9, utvrđeno je da više od dva puta finalne Epo koncentracije u usporedbi s profilom glikolizacije.

Primjer 11 - Proizvodnja eritropoetina u bioreaktoru kojem nedostaju komponente koje potječu od životinja

CHO linija stanica 6C2 je kultivirana u Fed-Batch (Kamp 17 B5-1 i 3) modelu u 5-L bioreaktoru. Svi parametri su kao u Primjeru 10 (Kamp 4 B5-2) ukoliko nije drugačije navedeno. U bioreaktoru 2, koristi se onaj medij kulture stanica koji ne sadržava ni jednu komponentu koja potječe od životinja. Naprimjer amino kiselinu tirozin ili cistein, koji su obično animalnog porijekla (kao što su losos ili ljudska kosa) zamijenjeni su sa sintetičkim amino kiselinama).

Nakon 2.5 dana reaktor se napuni do 5 1 sa svježim medijem. Nakon 5,6,7,8 i 9 dana serija se proširi dodavanjem hranjivog koncentrata koji sadržava amino kiseline, karbohidrat i pepton biljnog porijekla. 9. do 10.dana supernatant koji sadržava eritropoetin se sakupi.

Utvrđeno je da medij koji ne sadržava bilo koju komponentu animalnog porijekla daje prinos usporediv s finalnom Epo koncentracijom. Međutim kultura raste sporije i treba dodatni koncentrirani hranjivi dodatak.

Primjer 12 - Proizvodnja eritropoetina u bioreaktoru s obogaćenim medijem (vitamini, elementi u tragovima)

CHO stanična linija 6C2 se kultivira u Fed-Batch (Kamp 12 C) modelu u 10 L bioreaktoru. Bioreaktor radi kao što je opisano u Primjeru 11 (Kamp 11 B5-2) sa sljedećim izuzecima:

Medij kulture stanica koji se koristi sadržava obogaćenu aminokiselinu nadopunjen 50:50 DMEM/Hams F12 i sadržava 0.325% biljnog peptida, 0.1 lutrola, 6.4 g/L glukoze, 2.5 g/L NaHCO3, etanolamin, željezo-citrat, vitamine, elemente u tragovima i natrij selenit i 0.6 g/L fosfata. Sadržaj u koncentratu je udvostručen i obogaćen s vitaminima.

Stanice su nanesene u koncentraciji od oko 5 x 105 stanica/mL u 4500 mL medija. pO2 počinje sa 50% zasićenim zrakom, temperaturom na 37°C. pH se podesi na početku na 7.1. Tijekom trajanja fermentacije postepeno se reducira na 6.9.

Za vrijeme trajanja kultivacije koncentracija glukoze u bioreaktoru se održava između 3 do 4 g/L. Nakon 3 dana reaktor se puni do 10 L svježeg medija. Nakon 6,7,8,9,10,11 i 12 dana serija se proširi dodavanjem obogaćenog hranjivog koncentrata. 13. dana sakupi se supernatant koji sadržava eritropoetin.

Primjer 13 - Izolacija Epo

Odvajanje stanica

Rekombinirani humani eritropoetin proizvodi se u liniji stanica ovarija kineskog hrčka (CHO) u uvjetima bez seruma s diskontinuiranom fermentacijom serija. Nakon fermentacije (4x ca. 1+2 serije modela ekspandirane u 2 različita bioreaktora) obje žetve tekuće mase s oko 200-300 mg rhEpo po litri ohladi se na 2-8°C i bez međurazdoblja čuvanja prvo pročisti centrifugiranjem preko disc stack separatora potom kasnije uranjanjem (PP Polygard 0.1 μm, Seitz Bio 10 ili Cuno A90M08, preko cea. 300 L/m2 područje filtera) i 0.2 u filtracijom (PP Polygard 0.1 μm, Sartobran P, Sartorius ili Duropore 0.22 μ, Millipore). Za izbjegavanje visoke liže stanica i kasnije velikom kontaminacijom produkta s HCPs (stanični proteini domaćina) važno je prvo žetvu provesti u optimalnoj vremenskoj točki (cca. 12 dana u glavnoj kulturi, stagniranje potrošnje kisika) i drugo upotreba specijalno dizajniranog pribora za separaciju stanica za odvajanje krhkih eukariotskih stanica npr. CSC6 (6000 m2 ECA, 15500xg, cca. 200 L/h, Westfalia) s hidrohermeticnim ulazom hrane ili BTPX250 (11000 m2 ECA, 13000 xg, 300 L/h;, Alfa Laval) s mekanim diskom na ulazu i porcupine izlazom. Komparacijom različitih separacijskih tehnika uključujući i tangencijalnu protočnu filtraciju i centrifugiranje velikih razlika u lizi stanica s pritiskom protjerivanja (mjerenje otpuštanjem intracelularnog markera enzima LDH). Centrifugiranje daje vrlo slabo odvajanje (<3U LDH/mg rhEpo) i to je preferirano.

Alternativno, samo centrifugiranje preko disk stack separatora (bez koraka duboke filtracije) kao što je opisano gore je korišteno kao korak separacije stanica. Sljedeća alternativa je korak filtracije (bez koraka centrifugiranja) kao što je gore opisano da se koristi.

Spajanje s Anion eocehange (AEX) kromatografijom

Nakon pročišćavanja sirovi supernatant razrijedi se s aproks. 3 vol. vode za postizanje finalne vodljivosti manje od ili jednake s 5 mS/cm i podešavanja pH na 7.5 s tris bazom, prije primjene na smolu AEX-spajanja.

Koristi se AEX-kolona visine mase od oko 10-20 cm je zabrtvijena s Q Cheramic HyperD F (Biosepra) s dobrim karakteristikama protoka. Ujednačena je s 20 mM tris pH 7.5 i 50 mM NaCl. Razrijeđeni supernatant stanica je potom prenesen (10-15 mg rhEpo po mL smole) na proticanju u koloni od 4-8 cm/min i kolona je isprana s 10-15 volumena kolone (CV) s puferom za ujednačavanje. Produkt je eluiran u koraku elucije provedenoj izmjenom pufera za višu vodljivost, 20 mM Tris pH 7.5 s 150 mM NaCl. Pik frakcije se puliraju da bi se dobio prinos od oko 50-60%.

Alternativno, pul frakcija se koncentrira ultrafiltracijom da se reducira volumen intermedijera i za standardizaciju precipitacijskih uvjeta koji slijede. Preferirano se koriste na 5 do 10 kDa prekinute membrane a koncentracija ciljnog produkta podesi se na oko 20 mg/ml.

Amonij sulfat precipitacija

Sakupljeni pul u predhodnoj fazi obično se dalje purificira s precipitacijom kontaminiranih staničnih proteina domaćina s 2.4 M (NH4)2SO4. Na toj AS-koncentraciji gotovo uvijek proizvod je nađen u precipitatu preostalom čistom HCP free supernatantu koji se razrjeđuje prije kasnije RPC purifikacije na <240 mM (NH4)2SO4 u RPC opterećenju.

Precipitacija se izvodi dodavanjem 1.5 volumena amonijeva sulfata-stock otopine (4M(NH4) 2SO4, 20mM Tris pH 7.5) na volumen sakupljenog pula, inkubira kroz 30 min na 10-15°C i separira precipitat uranjanjem (Seitz Bio 10 ili Cuno A90M08) i 0.2 u filtracijom (Sartobran P, Sartoruis ili Duropore 0.22 U, Millipore). U slučaju velikog volumena elucije= razrijeđeni rhEpo pul elucije (<5 mg rhEpo/ml) HCP precipitacija može se osigurati po izboru s korakom UF-koncentracije (na 10 kDA prekinuto).

Amonij sulfat precipitacija je učinkovitija od hidrofobne interakcijske kromatografije.

Da bi se reducirao sadržaj amonij sulfata iz predhodnog koraka precipitacije supernatant koji sadržava produkt će se razrijediti kao što je navedeno gore. Alternativa je korak ultrafiltracija/diafiltracija. Preferirano se koriste na 5 do 10 kD prekinute membrane a ciljana koncentracija amonij sulfata je manje od 240 mM a koncentracija produkta se podesi na oko 30 mg/ml. Pufer koji se koristi za diafiltraciju je 20 mM Tris/HCl pH 7.0

Kromatografija reverzne faze

Slijedeća faza purifikacije je kromatografija reverzne faze koja je korisna iz više razloga: a) različiti izooblici se dobro odvajaju u skladu s njihovim šećernim kosturom (visoko glikolizirani/sialilirani eluiraju se prije niže glikoliziranih/sializiranih oblika), b) rezidualni stanični proteini domaćina se odstrane s tom visokotlačnom kromatografijom i c) kromatografija je grubi korak za uklanjanje virusa kao i za inaktivaciju virusa s organskim otapalom. Izvor 30RPC (Amersham Biosciences) je polimerna smola koja se može: a) provući pod tlakom medija (<10 bar) i b) popraviti s visokom koncentarcijom NaOH. Preferirana visina kolone je između 10 i 15 cm, preporučena granica opterećenje je 8-12 mg rhEpo per ml smole.

Prije RPC-koraka produkt koji sadržava supernatant treba podesiti na finalnu koncentraciju amonij sulfata na manje od 0.24 M. Ti uvjeti mogu se provesti a) kasnijim oniine-korakom dilucije (1 vol rhEpo-supernatant + 4 vol 20 mM Tris/HCl pH 7.0+5 vol 50 vv% ACN u 20 mM Tris/HCl pH 7.0 tijekom RPC opterećenja ili za očuvanje ekspanzivnog organskog otapala preferirano opet s diaf iltracijom/koncentracijom (UF s na 10 kDa prekinuta) opet 20 mM Tris/HCl pH 7.0 prije utovarivanja. Kolone su ujednačene prije i isprane nakon utovarivanja s 2 5vv% acetoni trilom (ACN) u 20 mM Tris pH 7.0. Produkt je eluiran s linearnim gradientom od 25% do 50% ACN i sakupljen u malim frakcijama (osobito aproks. 0.2 CV, i alternativno aproks. 0.3-05 CV) prije napunjeno s 4 volumena pufera za razrjeđivanje (50 mM Tris pH 7.0) odmah za redukciju koncentracije otapala, koje može inducirati agregaciju i oslabiti AEX kromatografiju koja slijedi. Frakcije aproksimativno prve polovice pula elucije se puliraju da se dobije RCP-pul, koji se dalje procesuira. Taj pul sadržava izooblike s poželjnim višim stupnjem glikolizacije. S tim režimom frakcija, des-O-glikolizirani rhEpo produkt u kojem nedostaje O-glikan na poziciji Serl26, koji je prisutan u staničnoj kulturi na nivou sve do 20%, je odstranjen. U alternativnoj metodi, za induciranje inaktivacije virusa s izlaganjem anorganskom otapalu, frakcije su predhodno napunjene s 0.5 volumena 20 mM Tris pH 7.0 umjesto 4 volumena istog pufera kao što je opisano gore i inkubacijom kroz 20 do 40 minuta ili duže. Nakon tog koraka inkubacije drugi 3.5 volumena 20 mM Tris pH 7.0 u donosu na volumen nerazrjedene originalne frakcije se doda i tako, se zaustavi inaktivacija virusa.

Frakcije s ili bez inaktivacije virusa se puliraju za daljnju purifikaciju. Puliranje obično polazi sa 50-100% od maksimalnog OD na uzlaznoj strani i krajevima aproks. s frakcijama od oko 70-80% na silaznoj strani. Ranije eluirane frakcije mogu sadržavati stanične proteine domaćina, dok kasnije eluirane frakcije sadržavaju manje sialilirane, manje aktivne izooblike. Naknadna CZE analiza može se izvesti kao potpora puliranju za određene izooblike.

Anion Exchange kromatofrafija

Razrijeđeni RPC-pul se potom prenese u high performance AEX kolonu, koja opet pomaže selekciju specifičnih izooblika i odstranjivanju staničnih proteina domaćina. Za to vrijeme izooblici se odvoje u skladu s izoelektričnom točkom, tj. u skladu s brojem sialičnih kiselina koje su proporcionalne stupnju glikolizacije. Koristi se high performance smola, Q-Sepharose HP (Amersham Biosciences), koja pokazuje izvrstan učinak separacije. Visina sadržaja kolone je između 15 i 20 cm. Svi uvjeti, kao što su punjenje kolone, gradijenti i visina sadržaja kolone su definirani da čuvaju prilično nisku koncentraciju produkta, koja dovodi do signifikantnog post-peak-a tijekom elucije uzrokovane otapalom inducirane agregacije produkta.

RPC-pul opskrbljen s 2-4 mg Epo po mL smole na Q Sepharose HP ujednačen s 20 mM tris pH 7.0. Nakon koraka ispiranja s puferom za ujednačavanje, produkt se eluira u 10 CV linear salt gradijentu od 0 do 300 mM NaCl u puferu za ujednačavanje. Pik elucije se sakupi u 0.1 CV ili u 0.25 CV frakcijama a pul za analizu se analizira s CZE da se pronađe prava frakcija pula, koja sadržava željeni izooblik eritropoetina. AEX-pul sadržava obično drugu polovicu pika elucije, gdje su visoko glikolizirani i sializirani izooblici eluirani.

Upotrebom kapilarne zonske elektroforeze (CZE) u in-proces kontroli, moguće je proizvesti precizno definiranu smjesu izooblika eritropoetina čak i u izvorima koji sadržavaju samo nekoliko visoko sialiliranih izooblika, zbog različitih uvjeta fermantacija ili sustava domaćina.

CZE je metoda visoke rezolucije sposobna za odvajanje izooblika različitog naboja. Daje kvantitativne rezultate za svaki pojedini izooblik u svakoj frakciji. Taj podatak omogućava puliranje specifičnih frakcija koje vode do konzistentnog profila izooblika od serije do serije. Obično ranom elucijom, manje sialilirani oblici su ispušteni puliranjem samo frakcija kasnije elucije.

Siže exclusion kromatografija

U zadnjem koraku kromatografije AEX-pul je dotjeran siže exclusion, koja odstranjuje potencijalne dimere i velike agregate, a provodi je pufer za mijenjanje finalne formulacije. Superdex 75 prep grade (Pharmacia) korišten u ovom koraku ima dobru rezoluciju čak i za volumene viših punjenja sve do 15% volumena kolone. Preferirana visina sadržaja kolone je između 60 i 80 cm.

Isto tako nije moguće provođenje AEX-kromatografije prethodne etape na način da se dobije visoka koncentracija produkta u AEX-pulu, pul treba koncentrirati prije gel filtracije. To se provodi ultra-filtracijom korištenjem 10 kDa UF-membrane što daje oko 10 puta koncentriraniji UF-retentat s aproks. 10 mg eritropoetina po mL.

Oko 3-7 CV% Uf-retentata se direktno puni u Superdex 75 pg kolonu prije izjednačenu s 20 mM Na-fosfata pH 7.0, 75 mM NaCl. Nakon aproks. 1-1-5 CV produkt se poćne eluirati iz kolone a pik elucije se sakupi da se dobije SEC-pul.

Nano-filtracija

Za uklanjanje potencijalne prisutnosti virusa uključena je dodatni korak dead-end virus-filtracija. Ta filtracija se izvodi specijalnom membranom, dizajniranom za ukljanjanje čestica manjih od 15 nm, kao što je gore spomenuti Planova 15N (Asahi). Alternativno dead-end nanofiltracijske jedinice su PALL Ultipor VF Grade DV20 ili Millipore Viresolve NFP ulošci ili kapsule. Osobito za male ne-razvijene viruse, npr. parvoviruse, gotovo da nema drugog pribora za uklanjanje ili inaktivaciju virusa.

Strerilni SEC-pul je pasiran preko dead-end filtera sa odgovarajućom membranom a filtrat predstavlja finalnu bulk ljekovitu tvar. Alternativno nanofiltracija može se umetnuti između UF koncentracije i siže exclusion kromatografije.

Tablica 1: rekombinirane CHO-stanice: transfekcija s Epo/neo i Epo/dhfr

T25 transfekcija

[image]

Transfekcija u 96-bunarića

[image]

Amplifikacija različitih klonova

[image]

Tablica 2: Uvjeti subkloniranja i učinkovitost galvanizacije pula stanica 3D5 s 0.38 μM MTX

[image]

Tablica 3: Uvjeti subkloniranja i učinkovitost galvanizacije subklonova 3D5/1H9 i 3D5/18E5 s 1.54 uM MTX 3D5/1H9

[image]

3D5/18E5

[image]

Tablica 4: Specifična produktivnost i osobine rasta rekombiniranih CHO-klonova

[image]

Sve publikacije navedene gore u specifikaciji su ovdje inkorporirane referencijama. Različite modifikacije i varijacije opisanih metoda i sustava izuma će biti jasne stručnjacima bez odstupanja od cilja i duha izuma. Isto tako izum je opisan u vezi sa specifičnim preferiranim ostvarenjima, isto tako treba shvatiti da izum kao što se zahtjeva ne treba neopravdano limitirati takva specifična ostavrenja. Svakako, različite modifikacije opisanog načina za izvođenje izuma koje su jasne stručnjacima molekularne biologije ili sličnog područja su unutar cilja kasnijih zahtjeva.

Claims

1. Postupak za proizvodnju rekombiniranog polipeptida od interesa naznačen time, da metoda obuhvaća: (a) osiguravanje transformirane eukariotske stanice domaćina koja obuhvaća nukleotidne sekvencije koje enkodiraju rekombinirani polipeptid od interesa i koji izravno eksperesira rekombinirani polipeptid od interesa u stanicu domaćina; (b) osigurava medij kulture bez seruma koji obuhvaća (i) vodu, pepton porijeklom od biljaka, osmotički regulator, pufer, izvor energije, amino kiseline, izvor lipida ili prekursor, izvor željeza, ione ne-željezo metala i jedan ili više vitamina i kofaktora; i (ii) da ne sadržava bilo koji polipeptid pune dužine; i (c) kultiviranje transformirane eukariotske stanice domaćina u mediju kulture pod uvjetima tako da dozvoli ekspresiju rekombiniranog polipeptida od interesa.

2. Postupak iz zahtjeva 1, naznačen time, da medij kulture je potpuno slobodan od komponenti porijeklom od životinja.

3. Postupak iz zahtjeva 1, naznačen time, da rekombinirani polipeptid od interesa je humani eritropoetin.

4. Postupak iz zahtjeva 1, naznačen time, da nukleotidna sekvencija enkodiranog rekombiniranog polipeptida od interesa je integrirana u genom stanice domaćina i operabilno vezana na nukleotidnu sekvenciju enkodirane dihidrofolat reduktaze, a stanica domaćina je kultivirana u odsutnosti metotreksata.

5. Postupak iz zahtjeva 4, naznačen time, da je rekombinirani polipeptid od interesa humani eritropoetin.

6. Postupak iz zahtjeva 1, naznačen time, da je izvor energije glukoza.

7. Postupak iz zahtjeva 6, naznačen time, da medij kulture inicijalno sadržava najmanje 5 g/L glukoze i da koncentracija se održava iznad 3 g/l tijekom koraka kultivacije (c).

8. Postupak iz zahtjeva 1, naznačen time, da medij kulture sadržava više od 0.3 g/L fosfata.

9. Postupak iz zahtjeva 6, naznačen time, da medij kulture sadržava više od 0.3 g/L.

10. Postupak iz zahtjeva 1, naznačen time, da je inicijalni pH oko 7.1 i da se reducira na oko 6.9 tijekom koraka(c) kultivacije.

11. Postupak iz zahtjeva 10, naznačen time, da se navedena redukcija odigrava u razdoblju posljednjeg dana.

12. Postupak iz zahtjeva 1, naznačen time, da medij kulture također obuhvaća elemente u tragovima i jedan ili više vitamina.

13. Postupak iz zahtjeva 12, naznačen time, da je izvor energije glukoza.

14. Postupak iz zahtjeva 13, naznačen time, da medij kulture sadržava više od 0.3 g/L fosfata.

15. Postupak iz zahtjeva 1, naznačen time, da je medij kulture zasićen tijekom koraka kultivacije (c) s obogaćeno nutrientom koji sadržava jednu ili više amino kiselina, najmanje jednim karbohidratom i peptonom biljnog porijekla.

16. Postupak iz zahtjeva 1, naznačen time, da obuhvaća korak (d) ponovnog dobivanja rekombiniranog polipeptida od interesa iz kulture.

17. Postupak iz zahtjeva 16, naznačen time, da je rekombinirani polipeptid od interesa sakriven u mediju kulture i ponovo dobiven iz medija kulture.

18. Postupak iz zahtjeva 17, naznačen time, da rekombinirani polipeptid od interesa je eritropoetin.

19. Medij kulture bez seruma naznačen time, da obuhvaća (i) vodu, pepton biljnog porijekla, osraotički regulator, pufer, izvor energije, amino kiseline, izvor lipida ili prekursor, izvor željeza, ione ne-željeznog metala i jedan ili više metala i kofaktora; i (ii) da ne sadržava polipeptide pune dužine.

20. Medij kulture stanica iz zahtjeva 20, naznačen time, da je medij potpuno slobodan od komponenti porijeklom od životinja.

21. Medij kulture stanica iz zahtjeva 19 ili zahtjeva 20, naznačen time, da je izvor energije glukoza.

22. Medij kulture stanica svakog od zahtjeva 19 do 21, naznačen time, da medij sadržava više od 0.3 g/L fosfata.

23. Medij kulture stanica svakog od zahtjeva 19 do 22, naznačen time, da medij sadržava i elemente u tragovima i jedan ili više vitamina.