HRP20020721A2 - Novel method for down-regulation of amyloid - Google Patents

Novel method for down-regulation of amyloid Download PDF

Info

Publication number
HRP20020721A2
HRP20020721A2 HR20020721A HRP20020721A HRP20020721A2 HR P20020721 A2 HRP20020721 A2 HR P20020721A2 HR 20020721 A HR20020721 A HR 20020721A HR P20020721 A HRP20020721 A HR P20020721A HR P20020721 A2 HRP20020721 A2 HR P20020721A2
Authority
HR
Croatia
Prior art keywords
cell
epitope
analog
polypeptide
app
Prior art date
Application number
HR20020721A
Other languages
English (en)
Inventor
Martin
Birk Peter
Gregorius Nielsen Klaus
Original Assignee
Pharmexa A/S
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/DK2001/000113 external-priority patent/WO2001062284A2/en
Application filed by Pharmexa A/S filed Critical Pharmexa A/S
Publication of HRP20020721A2 publication Critical patent/HRP20020721A2/hr
Publication of HRP20020721B1 publication Critical patent/HRP20020721B1/hr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)

Description

Područje izuma
Ovaj izum odnosi se na poboljšanje terapije i prevenciju stanja Alzheimerove bolesti (AD) i ostalih bolest karakteriziranih depozicijom amiloida, tj. karakteriziranih depozicijom amiloida u centralnom nervnom sustavu (CNS). Određenije, ovaj izum prikazuje metode smanjivanja (neželjene) depozicije amiloida omogućivanjem produkcije antitijela na važni protein ili njegovu komponentu, a kod osoba koje pate ili su u opasnosti da će patiti od bolesti koje imaju patologiju obuhvaćenu depozicijom amiloida. Izum također prikazuje metode produkcije polipeptida korisnih u ovoj metodi, kao i modificiranih polipeptida samih za sebe. Također su ovim izumom obuhvaćeni fragmenti nukleinske kiseline koje kodiraju modificirane polipeptide kao i vektori koji ugrađuju ove fragmente nukleinskih kiselina, te njima transformirane stanice domaćina i stanične linije. Izum također prikazuje metode identifikacije polipeptida koji se deponiraju, a koji su korisni u metodi iz izuma kao i pripravke koji sadrže modificirane polipeptide ili sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju analoge modificiranih polipeptida.
Dosadašnje spoznaje
Amiloidoza je vanstanično deponiranje netopljivih proteinskih fibrila što vodi oštećenju tikva i bolesti (Pepys, 1996; Tan et al., 1995, Kelly, 1996). Normalno topljivi fibrili tvore proteine i peptide koji se sami povezuju na abnormalan način (Kelly, 1997).
Amiloid je povezan s ozbiljnim bolestima uključujući sistemsku amiloidozu, AD, starački dijabetes, Parkinsonovu bolest, Huntingtonovu bolest, frontalno-temporalnu demenciju i s prionima povezane prenosive spongioformne encefalitise (kuru i Creutzzfeldt-Jacobova bolest kod ljudi i slinavku i BSE kod ovaca i teladi) i s tvorbom amiloidnog plaka, koji izgleda da je primjerice kod Alzheimerove bolesti povezan s progresijom humane bolesti. Kod životinjskih modela prekomjerna ekspresija ili ekspresija modificiranih oblika proteina nađena je u depozitima kao što je β-amiloidni protein, za koji je pokazano da inducira različite simptome bolesti, npr. simptome poput Alzheimerove bolesti. Ne postoji specifičan tretman depozicije amiloida i te bolesti su obično fatalne.
Podjedinice amiloidnih fibrila mogu biti divljeg tipa, varijante ili skraćeni proteini, a slični fibrili se mogu stvoriti in vitro iz oligopeptida i denaturiranih proteina (Bradbury et al., 1960; Filshie et al., 1964; Burke & Rougvie, 1972). Priroda polipeptidne komponente fibrila definira karakter amiloidoze. Usprkos velikoj razlici u veličini, prirodi i funkciji amiloidnih proteina, svi amiloidni fibrili su neodređene duljine, nerazgranati, primjer 70 do 120 Å i pokazuju karakterističnu ukrštenu-β strukturu (Pauling & Corey, 1951) u kojem je polipeptidni lanac organiziran u β-nabranu ploču. Mada amiloidni proteini imaju vrlo različite strukture prekursora, kod svih dolazi da strukturne promjene, možda sličnim putem u krivo strukturi-rani oblik koji je građevna jedinica β-ploče i heliksa protofilamenta.
Određeni oblik vlakna je uzrok što se amiloidoza naziva β-fibriloza (Glenner, 1980a,b) i β-fibrilni protein od AD je nazvan β-protein, a prije poznavanja sekundarne strukture (Glenner & Wong, 1984). Karakteristični oblik unakrsne difrakcije, vlaknasti izgled i bojom su sada prihvaćen za dijagnosticiranje amiloida, i ukazuju da unatoč stvaranju od različitih proteinskih prekursora, dijele stupanj strukturne sličnosti i sadrže strukturnu superobitelji, bez obzira na prirodu njihovog prekursorskog proteina (Sunde M, Sepell LC, Bartlam M, Fraser PE, Pepys MS, Blake CCFJ MOl Biol 1997 listopad 31; 273(3): 729-739).
Jedna od najraširenijih dobro poznatih bolesti za koju je ukazano da centralnu ulogu u razvitku bolesti igra depozicija amiloida u centralnom nervnom sustavu je AD.
AD
Alzheimerova bolest (AD) je ireverzibilni, progresivni poremećaj mozga do kojeg dolazi postupno i rezultira gubitkom pamćenja, promjenama ponašanja i osobnosti, te smanjivanju mentalnih sposobnosti. Ti gubici su povezani sa smrću stanica mozga i razbijanjem veza među njima. Uzrok tih bolesti se mijenja od osobe do osobe, kao i brzina gubitaka. Prosječno, pacijenti s AD žive 8 do 10 godina nakon dijagnoze, mada bolest može trajati do 20 godina.
AD napreduje u stupnjevima, od rane blage zaboravljvosti do ozbiljnog gubitak mentalne funkcije. Taj gubitak je poznat kao demencija. Kod većine ljudi s AD se simptomi prvi put pojavljuju u dobi preko 60 godina, ali ranije nastupanje bolesti nije rijetko. Najraniji simptomi Često uključuju gubitak nedavne memorije, sposobnost procjene, te promjenu osobnosti. Često ljudi u početnim stupnjevima AD misle manje jasno i zaboravljaju imena poznatih osoba i uobičajenih predmeta. Kasnije u bolesti mogu zaboraviti izvršiti čak i jednostavne zadatke. Konačno, ljudi s AD gube svu sposobnost rasuđivanja i postaju ovisni o ljudima koji svakodnevno skrbe o njima. Konačno, bolest toliko onemoćuje da pacijenti ostaju u krevetu u postoji vjerojatnost razvitka ostalih bolesti i infekcija. Ljudi s AD najčešće umiru od upale pluća.
Mada je rizik od razvijanja AD povećava s dobi, AD i simptomi demencije nisu dio normalnog starenja. AD i ostale demencijski poremećaji su uzrokovani bolešću koja djeluje na mozak. Pri normalnom starenju nervne stanice u mozgu se ne gube u velikoj mjeri. Nasuprot tome AD uništava tri ključna procesa: komunikaciju nervnih stanica, metabolizam i obnovu. To uništavanje Konačno uzrokuje prestanak funkcioniranja nervnih stanica, gubitak veze s drugim nervnim stanicama i smrt.
AD prvo uništava neurone u dijelovima mozga koji kontroliraju memoriju, posebice u strukturama povezanim s hipokampusom. Nervne stanice hipokampusa prestanu ispravno funkcionirati, kratkoročna memorija slabi i često sposobnost osobe da izvede uobičajene zadatke počinje slabiti. AD također napada cerebralni korteks, posebice dijelove odgovorne za jezik i rasuđivanje. Konačno su obuhvaćeni mnogi drugi dijelovi mozga i ti dijelovi mozga atrofiraju (smanjuju se), te pacijent s AD padne u krevet, ima inkontinenciju, potpuno je bespomoćan i ne komunicira sa vanjskim svijetom (izvor: National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer Disease, 1999).
Utjecaj AD
AD najčešće uzrokuje demenciju među ljudima dobi 65 i starijim. Ona predstavlja glavni zdravstveni problem zbog njenog velikog utjecaja na pojedince, obitelji, zdravstveni sustav i društvo u cjelini. Znanstvenici procjenjuju da do 4 miliona ljudi trenutačno pati od bolesti, i da se pojavljivanje udvostručuje svakih 5 godina iznad dobi od 65. Također se procjenjuje da će doći do približno 360000 novih slučajeva (pojavljivanja) svake godine, tako da će taj broj rasti kako stari populacija (Brookmeyer et al., 1998).
AD je veliki ekonomski problem za društvo. Nedavna istraživanja u Sjedinjenim Državama procjenjuju da briga o jednom pacijentu s blagom AD godišnje košta 18408 $, 30096$ o pacijentu sa srednjim AD i 36132 $ za pacijenta s ozbiljnom AD. Godišnji trošak za brigu o pacijentima s AD u US se procjenjuje da je nešto preko 50 milijardi $ (Leon et al., 1998).
Približno je 4 miliona Amerikanaca koji su stariji od 85 godina i u većini industrijskih država je ta skupina jedna od najviše rastućih segmenata populacije. Procjenjuje se da će broj te skupine godine 2030 biti 8.5 miliona u US; neki eksperti koji istražuju populacijske trendove ukazuju da taj broj može biti čak veći. Kako više i više ljudi živi dulje, broj ljudi pogođenih bolesti starenja, uključujući AD će dalje rasti. Primjerice, neka istraživanja pokazuju da skoro pola od svih ljudi dobi od 85 i starijih imaju neki oblik demencije. (National Institute of Aging Progress Report in Alzheimer Disease, 1999).
Glavne karakteristike AD
Dvije abnormalne strukture u mozgu su oznaka AD: amiloidni plakovi i neurofibrilna klupka (NFT). Plakovi su gusti, uglavnom netopljivi depoziti proteina i staničnog materijala izvan i oko neurona mozga. Klupka su netopljiva izvijena vlakna koji se grade unutar neurona.
Postoje dva tipa AD: familijarni AD (FAD) koji slijedi neke urođene obrasce i sporadični AD kada nema očitih urođenih obrazaca. Zbog razlike u dobi nastupanja, AD se nadalje opisuje kao rano-nastupajuća (pojavljuje se ljudi mlađih od 65) i kasno-nastupajuća (pojavljuje se ljudi starijih od 65). Rano-nastupajuća AD je rijetka (oko 10 posto slučajeva) i općenito pogađa ljude u dobi od 30 do 60. Neki oblici rano-nastupajuće AD su urođeni i događaju se unutar obitelji. Rano-nastupajuća AD često napreduje brže od učestalijeg kasno-nastupajućeg oblika.
Svi do sada poznati FAD rano nastupaju i do čak 50 posto slučajeva FAD se zna da su uzrokovani defektom triju gena smještenih u trima različitim kromosomima. To su mutacje u APP genu u kromosomu 32; mutacije u genu na kromosomu 14 koji se zove presenilin 1; te mutacije u genu na kromosomu 1 koji se zove presenilin 2. Još međutim ne postoji dokaz da bilo koja od ovih mutacija ima važnu ulogu u uobičajenom, sporadičnom ili nefamilijarnom obliku kasno-nastupaljuće AD (National Institute of Aging Progress Report in Alzheimer Disease, 1999).
Amiloidni plakovi
U AD se prvo razvijaju amiloidni plakovi u dijelovima mozga za memoriju i druge mislene funkcije. Oni se sastoje od uglavnom netopljivih depozita beta amiloida (nadalje obilježen kao Aβ) - koji je proteinski fragment većeg proteina koji se zove proteinski amiloidni prekursor (APP, čiju sekvenciju aminokiselina predstavlja SEQ ID NO: 2) - pomiješanog s dijelovima neurona i sa stanicama koje nisu nervne, kao što su miklroglia i astrociti. Nije poznato da li su amiloidni plakovi sami glavni uzrok AD ili su oni nusprodukt AD procesa. Sigurno je da promjene proteinskog APP mogu uzrokovati AD, kao što je pokazano u urođenom obliku AD uzrokovano mutacijom APP gena, te je tvorba Aβ plaka blisko povezana s razvitkom humane bolesti (Lippa C. F. et al., 1998).
APP
APP je jedan od mnogih proteina koji je povezan sa staničnom membranom. Nakon što je APP stvoren postaje ugrađen u nervne stanične membrane, djelomice unutar i djelomice izvan stanice. Nedavna istraživanja upotrebom transgeničnih miševa su pokazala da APP vjerojatno ima važnu ulogu u rastu i preživljavanju neurona. Primjerice, neki oblici i količine APP mogu zaštititi neurone protiv kratkoročnih i dugoročnih oštećenja i omogućavati oštećenim neuronima brzu samoobnovu i pomažu rast dijelova neurona nakon ozljede mozga.
Dok je APP ugrađen u staničnu membranu, proteaza djeluje na određenim mjestima APP, cijepajući ga u proteinske fragmente. Jedna proteaza pomaže cijepanje APP da bi se dobio Aβ, a druga proteaza cijepa APP u sredini amiloidnog fragmenta tako da se Aβ ne može stvoriti. Stvoreni Aβ ima dvije različite duljine, kraći Aβ od 40 (ili 41) aminokiselina koji je relativno topljiv i polako stvara agregate, i nešto dulji, "ljepljivi" Aβ od 42 aminokiseline koji brzo tvori netopljive nakupine. Za vrijeme stvaranja nije potpuno poznato kako se Aβ kreće kroz i oko nervne stanice. U Konačnim stupnjevima tog procesa "ljepljivi" Aβ stvaraju agregate i duge filamente izvan stanice, te skupa s fragmentima mrtvih i umirućih neurona i mikroglia i astorcita tvore plakove koji su karakteistika tkiva mozga AD.
Postoji neki dokaz da je mutacijom APP raste vjerojatnost da će Aβ biti izrezan iz APP prekursora, te stoga uzrokovati više ukupnog Aβ ili relativno više "ljepljivog" oblika. Također izgleda da ta mutacija u Aβ presenilinskim genima može doprinijeti degeneraciji neurona na barem dva načina: modifikacijom produkcije Aβ ili izravnijim poticanjem smrti stanica. Ostali istraživači ukazuju da mutirani presenilini 1 i 2 mogu biti obuhvaćeni u povećanju brzine apoptoze.
Također se očekuje da se stvara više i više plaka kako bolest napreduje, puneći više i više mozga. Istraživanja pokazauju da možda dolazi do istovremenog stvaranja i raspada agregata Aβ u kratkoj dinamičkoj ravnoteži. To povećava nadu da može biti moguće da se razbije plak čak nakon stvaranja. (National Institute of Aging Progress Report in Alzheimer Disease, 1999).
Vjeruje se da je Aβ toksičan za neurone. U Istraživanjima stanične kulture istraživači su opazili da povećanje smrti hipokampalnih stanica neurona koje su inženjerstvom dovedene da prekomjerno eksprimiraju mutirane oblike humanog APP, a u usporedbi s neuronima koje prekomjerno eksprimiraju normalnu humani APP (Luo et al., 1999).
Nadalje, prekomjerna ekspresija ili ekspresija modificiranih oblika Aβ proteina je kod životinjskih modela pokazala indukciju simptoma poput Alzheimerove bolesti. (Hsiao K. et al. 1998).
Kako povećano generiranje Aβ, njegova agregacija u plakove, te dobivena neurotoksičnost može voditi prema AD, od terapijskog interesa je ispitivati uvjete pod kojima agregacija Aβ u plakove može biti usporema ili čak zaustavljena.
Presenilini
Mutacije presinilina 1 (S-180) se pojavljuju u skoro 50% svih slučajeva rano-nastupajuće familijarne AD (FAD). Identificirano je oko 30 mutacija koje povećavaju AD. Nastupanje AD varira s mutacijom. Mutacije u presinilin-2 čine mnogo manji dio slučajeva FAD, ali je to još uvijek značajan faktor. Nije poznato da li su presinilini obuhvaćeni u sporadičnim ne-familiranim AD. Funkcija presinilina nije poznata, ali izgleda da su obuhvaćeni u procesuiranju APP i nastajanju Aβ-42 (dulji ljepljiviji oblik peptida, SEQ ID NO: 2, ostaci 673-714), jer je pacijentima s AD mutacijom presinilina povećana razina tog peptida. Nije jasno da li presinilini također imaju ulogu u uzrokovanju stvaranja NFT. Neki predlažu da presinilini također mogu imati više izravnih uloga u degeneraciji neurona i smrti neurona. Presinilin-1 je smješten u kromosomu 14, dok je presinilin-2 povezan na kromosom 1. Ako osoba ima mutirane verzije samo jednog od ovih gena, on ili ona se skoro sigurno razviti rano-nastupajuću AD.
Postoje neke neodređenosti je li presinilin-1 identičan hipotetskoj gama-sekretazi obuhvaćene u procesuiranju APP (Naruse et al., 1998).
Apolipoproteina E
Apolipoprotein A je obično povezan s kolesterolom, ali je također nađen u plakovima u klupku mozga s AD. Dok izgleda da alele 1-3 nisu obuhvaćene u AD, postoji značajna korelacija između prisutnosti APOE-e4 alele i razvitka kasno-nastupajuće AD (Strittmatter et al., 1993). Međutim, radi se o faktoru rizika, a ne izravnom uzrokovanju, kao što je slučaj s mutacijama presenilina i APP, te nije ograničeno na familijarni AD.
Način na koji ApoE e4 protein povećava vjerojatnost razvitka AD nije sa sigurnošću poznat, ali jedna moguća teorija je da olakšava gradnju Aβ, što doprinosi smanjivanju dobi nastupanja AD, ili prisutnost odnosno odsutnost određene APOE alele može djelovati na način kojim neuron odgovara na ozljedu (Buttini et al., 1999).
Za Apo A1 je također pokazano da je amiloidogen. Nedirnuti apo A1 može sam tvoriti fibrile poput amiloida in vitro koji daju pozitivni test s Conga crveni (Am J Patol 147 (2): 238-244 (kolovoz 1995), Wisniewski T, Golabek AA, Kida E, Wisniewski KE, Frangione B).
Izgleda da postoje neki kontradiktorni rezultati koji pokazuju da nema pozitivnog efekta APOE-e4 alela na smanjivanje simptoma mentalnog gubitka, a u usporedbi s alelama (stern, Brandt, 1997, Annals of Neurolgy 41).
Neurofibrilna klupka
Ta prepoznatljiva karakteristika AD su abnormalne nakupine izmotanih vlakana unutar nervne stanice. Glavna komponenta klupka je jedan oblik proteina navzvan tau (t). U centralnom nervnom sustavu tau proteini su najbolje poznati po njihovoj sposobnosti vezanja i pomoći pri stabilizacije mukrotubula, koji su sastavni dio stanične unutarnje podupirajuće strukture ili skeleta. Međutim, Ad tau se mijenja kemijski i taj promjenjeni tau ne može više stabilizirati mikrotubile pa se one raspadaju. Taj raspad transportnog sustava može prvo rezultirati nefunkcioniranjem komunikacije između nervnih stanica i može kasnije voditi smrti neurona.
Pri AD se kemijski promjenjen tau isplete u sparene helikoidalne filamente - dva lanca tau se omotaju jedan oko drugog. Ti filamenti su glavna tvar nađena u neurofibrilnim klupcima. U jednom nedavnom Istraživanju su istraživači našli neurofibrilne promjene u manje od 6 posto zdravih mozgova, a više od 43 posto tih neurona kod ljudi koji su umrli od blagog oblika AD, te 71 posto tih neurona kod ljudi koji su umrli od ozbiljne AD. Kada je ispitivan gubitak neurona, nađena je slična progresija. Dokaz tog tipa podupire ideju da tvorba klupka i gubitak neurona napreduju tijekom AD. (National Institute of Aging Progress Report in Alzheimer Disease, 1999).
Tautopatije i klupka
Nekoliko neurodegenerativnih bolesti koje nisu AD je karakterizirano agregacijom tau u netopljive filamente u neuronima glia, što vodi nefunkcioniranju i smrti. Nedavno je nekoliko skupina istraživača, a koji su ispitivali obitelji s različitim nasljednim demencijama koja nisu AD, našlo prvu mutaciju tau gena na kromosomu 17 (Clark et al., 1998; Hutton et al., 1998; Poorkaj et al., 1998; Spillantini et al., 1998). Kod tih obitelji su mutacije tau gena uzrokovale smrt neuronskih stanica i demenciju. Ti poremećaji koji imaju neke zajedničke karakteristike s AD, ali se razlikuju u nekoliko važnih karakteristika, su kolektivno zvani "frontalno-temporalna demencija i parkinsonizam povezan s kromosomom 17" (FTDP-17). To su bolesti kao što je Parkinsonova bolest, neki oblici amiotrofne lateralne skleroze (ALS), krtikobazalne degeneracije, progresivne supranuklearni paralize i Pickove bolesti, te su karakterizirani abnormalnom agregacijom tau proteina.
Ostale neuroloških bolest poput AD
Postoji važna paralela između AD i ostalih neuroloških bolesti uključujući prionske bolesti (kao što je kuru, Creutzfeld-Jacobova bolest i goveđi spongiformni encefalitis), Parkinsonova bolest, Huntingtonova bolest, frontalno-temporalna demencija. Sve obuhvaćaju depoziciju abnormalnih proteina u mozgu. AD i prionska bolest uzrokuju demenciju i smrt, i obje su povezane s tvorbom netopljivih amiloidnih fibrila, ali iz membranskih proteina koji su različiti jedan od drugog.
Znanstvenici su ispitivajući Parkinsonovu bolest, a koja je druga po učestalosti neurodegenerativnih poremećaja nakon AD, otkrili da je prvi gen povezan s tom bolesti. Taj gen kodira protein zvan sinuklein koji je, intrignatno, također nađen u amiloidnim plakovima u mozgu pacijenata s AD (Lavedan c, 1998, Genome Res. 8(9): 871-80). Istraživači su također otkrili da genetski defekt pri Huntingtonovoj bolesti, koja je još jedan progresivni neurodegenerativni poremećaj koji uzrokuje demenciju, uzrokuje Huntingtonov protein koji tvori netopljive fibrile vrlo slične fibrilima Aβ kod AD i proteinskim fibrilima pri prionovoj bolesti (Scherzinger E, et al., 1999, PNAS U.S.A. 96(8): 4604-9).
Znanstvenici su također otkrili nove gene koji su kad mutiraju odgovorni za familiarnu Britnasku demenciju (FBD), rijetku urođenu bolest koja uzrokuje ozbiljne poremećaje i progesivnu demenciju sličnu onoj u AD. U biokemiskoj analizi amiloidnih fibrila je nađenih u FBD, u plaku je nađen jedinstveni peptid nazvan ABri (Vidal et al., 1999). Mutacija na određenom mjestu u tom genu uzrokuje produkciju Bri proteina koji su dulji od normlanih. ABri peptidi, koji su izdvojeni iz mutiranog kraja Bri proteina je deponiran u obliku amiloidnih fibrila. Za te plakove se smatra da vode disfunkciji neurona i demenciji koja karakterizira FBD.
Imunizacija s Aβ
Imuni sustav će normalno sudjelovati u uklanjanju stranog proteina i čestica poput proteina u organizmu, ali depoziti povezani s gore spomenutim bolestima se uglavnom sastoje od vlastitih proteina pa je stoga uloga imunog sustava u kontroli tih bolesti manje očita. Nadalje, depoziti su smješteni u dijelu (CNS) koji je normalno odvojen od imunog sustava, te obje činjenice ukazuju da će bilo koja vakcina ili imunoterapijski pristup biti neuspješan.
Ipak, znanstvenici su nedavno pokušali imunizirati miševe s vakcinom sastavljenom od heterolognog humanog aβ i tvari poznate da pobuđuje imuni sustav (Schenk et al., 1999 i WO 99/27944). Vakcina je testirana na modelu parcijalno transgeničnog miša s AD, a koji imaju humani mutirani genom za APP insetriranim u DNA miša. Miš je producirao modificirani APP protein i razvijao amiloidni plak starenjem. Taj mišji model je korišten za testiranje da li vakcinacija na modificirani transgenični humani APP ima učinak na izgradnju plaka. U prvom eksperimentu je jednoj skupini transgeničnih miševa dana mjesečna injekcija vakcine počevši od starosti sa 6 tjedana u završivši sa 11 mjeseci. Druga skupina transgeničnih miševa nije primila injekcije i služila je kao kontrolna skupina. Do starosti od 13 mjeseci kontrolnoj skupini miševa je plak prekrivao 2 do 6 posto njihovog mozga. Nasuprot tome, imunizirani miševi nisu imali plak.
U drugom eksperimentu, istraživači su počeli davanje injekcija mjeseca 11, a kada je neki plak već postojao. U periodu od 7 mjeseci kontrolni transgenični miševi su imali 17 puta povećanu količinu plaka u njihovom mozgu, dok su oni koji su primili vakcinu imali 99 posto smanjivanje u usporedbi s 18-mjesečnim kontrolnim transgeničnim miševima. Kod neki miševa je prethodno postojeći deponirani plak uklonjen tretmanom. Također je nađeno da su se ostali poremećaji povezani s plakom, kao što je upala i abnormalni procesi, smanjili kao rezultat imunizacije.
Gore je stoga prikazano preliminarno Istraživanje na miševima, a znanstvenici primjerice trebaju naći da li vakcinirani miševi ostaju zdravi prema drugim kriterijima, te da li memorija tih vakciniranih miševa ostaje normalna. Nadalje, kako mišji model nije kompletno predstavljanje AD (životinje ne razvijanu neurofibrilna klupka, niti mnogi od njihovih neurona umire), dodatna Istraživanja će biti neophodna da se odredi da li ljudi imaju sličnu ili različitu reakciju kao miševi. Drugi problem koji treba razmotriti je li metoda možda samo "liječi" depoziciju amiloida, ali ne zaustavlja demenciju.
Tehnički problemi predstavljaju također veliki izazov. Primjerice nije vjerojatno da je čak moguće, a korištenjem te tehnologije, stvoriti vakcinu koja omogućuje kod ljudi povećanje antitijela na vlastite proteine. Veliki broj problema sigurnosti i učinkovitosti treba biti razrijeđeno prije bilo kojeg testiranja na ljudima.
Rad Schenk et al. stoga pokazuju da ako je moguće generirati jaki imuni odgovor prema vlastitim proteinima u depozitima u centralnom nervnom sustavu, kao što su plakovi stvoreni u AD, moguće je i spriječiti tvorbu depozita a moguće i ukloniti već stvorene plakove.
Cilj izuma
Cilj ovog izuma je prikaz novih terapija stanja karakteriziranih depozicijom amiloida, kao što je AD. Daljnji cilj je razvitak autovakcine protiv amiloida, a da se dobije novi tretman AD i ostalih patoloških poremećaje koji obuhvaćaju depozicijom amiloida.
Sažetak izuma
Ovdje opisana upotreba tehnilogije autovakcinacije za generiranje jakih imunih odgovora protiv inače neimunogenih vlastitih proteina uključene u depoziciju amiloida povezane s patologijom. Stoga se generira jaki imuni odgovor na jednu ili više komponenata uključenih u depoziciju ili protiv jednog ili više proteina odgovornih za tvorbu amiloida. Također je opisana priprava takvih vakcina za prevenciju, moguće liječenje ili poboljšanje simptoma takvih bolesti povezanih s depozicijom amiloida.
Stoga u najširem i najopćenitijem obujmu, ovaj izum se odnosi na in vivo metodu smanjivanja amilopida u životinji, uključujući čovjeka, a metoda sadrži djelovanje na ispoljavanje životinjskog imunog sustava s učinkovitom količinom:
- najmanje jednog amiloidogenog polipeptida ili njegove podsekvencije koji je formuliran tako da imunizacija životinje s amiloidogenim polipeptidom ili njegovom podsekvnecijom inducira produkciju antitijela na amiloidogeni polipeptid, i/ili
- najmanje jednog amiloidnog analoga u koji je uvedena modifikacija amiloidogenog polipeptida što rezultira time da imunizacija životinje s analogom inducira produkciju antitijela na amiloidogeni polipeptid.
Stoga je ovim izumom obuhvaćena upotreba 1) prirodnih antigena i njihovih fragmenata formuliranih da potaknu imuni odgovor kao i 2) analoga takvih prirodnih antigena, a analozi mogu biti uvedeni unakrsno reaktivnim imunom odgovorom.
Izum se također odnosi na analoge amiloidogenih polipeptida kao i na fragmente nukleinskih kiselina koje kodiraju njihovu subsekvneciju. Dio izuma su također pripravci analoga ili fragmenata nukleinskih kiselina.
Izum se također odnosi na metode identifikacije imunogeno učinkovitih analoga amiloidogenih polipeptida kao i na metode priprave pripravaka koji sadrže analoge.
Opis slika
Slika 1: Shematski prikaz Autovac varijanata izvedenih iz amiloidnog prekursora proteina sa svrhom generiranja odgovora antitijela na Aβ protein Aβ-43 (ili C-100). APP je prikazan sistematski na vrhu slike, a ostali shematski konstrukti pokazuju da su modelni epitopi P2 i P30 supstituirani ili insertirani u različite skraćene APP. Na slici crni uzorak pokazuje signalnu sekvenciju APP, dvosmjerno ukršteno koso šrafiranje je vanstanični dio APP, tamno vertikalno šrafirannje je transmembranska domena APP, svjetlo vertikalno šrafiranje je intracelularna domena APP, intenzivno koso šrafiranje pokazuje epitop P30, a fino koso šrafiranje pokazuje epitop P2. Prostor omeđen punom linijom pokazuje Aβ-42/43, a prostor omeđen punom i točkastom linijom zajedno pokazuju C-100. "Abeta" označuje Aβ.
Detaljan opis izuma
Definicije
U sljedećem dijelu bit će definirani i u detalje objašnjeni brojni termini korišteni u ovoj specifikaciji i zahtjevima, a da se raščiste otkrića i područja izuma.
Termin "amiloid" ili "amiloidni protein" koji se ovdje koristi naizmjenično označuje klasu proteinski nerazgranatih fibrila neodređene duljine. Amiloidni fibrili pokazuju karakteristično bojanje s Congo Red i imaju ukrštenu-β strukturu u kojoj je polipeptidni lanac organiziran u β-nabranu ploču. Amiloid se općenito izvodi iz amilogenoidnih proteina koji imaju prekursore vrlo različite strukture, ali svi mogu biti strukturno promjenjeni u krivo strukturiran oblik koji su građevne jedinice β-nabrane ploče i heliksa protofilamenta. Normalno se promjer amiloidnih fibrila kreće od oko 70 do oko 120 Å.
Namjera je da termin "amiloidni protein" označuje polipeptid koji je obuhvaćen u tvorbi amiloidnih depozita kao dio depozita ili kao dio biosintetskog puta koji vodi tvorbi depozita. Stoga su primjeri amiloidnih proteina APP i Aβ, ali također proteini obuhvaćeni i metabolizmu ovih mogu biti amiloidogeni proteini. Brojni amiloidogeni polipeptidi su ovdje diskutirani detaljno.
Namjera je da "amiloidni polipeptid" ovdje označuje polipeptide koji imaju aminokiselinsku sekvneciju gore diskutiranih amiloidogenih proteina izvedenih iz ljudi ili ostalih sisavaca (ili skraćene tako da dijele znatnu količinu epitopa B-stanica s netaknutim amiloidogenim proteinom) - amiloidogeni polipeptid može stoga npr. sadržavati glavni dio prekursora amiloidogeniog polipeptida (u slučaju Aβ, ili moguću amiloidni polipeptid može biti deriviran iz APP). Također u okvir termina mogu biti uključeni neglikoilizirani oblici amiloidogenih polipeptida koji se pripravljaju u prokaritoskim sustavima, kao što su oblici koji imaju različite obrasce glikolizacije zbog upotrebe ekspresijskog sustava npr. gljivica ili ostalih eukariota koji nisu sisavci. Valja, međutim, naglasiti da kad se upotrebi termina "amiloidogeni polipeptid" namjera je da je razmatrani polipeptid normalno neimunogen kad se ispoljava u tretiranim životinjama. Drugim riječima, amiloidogeni polipeptid je vlastiti protein ili je analog takvog vlastitog proteina koji neće normalno povećavati imuni odgovor na amiloidogene u razmatranoj životinji.
"Analog amiloidogenog polipeptida" je amiloidogeni polipeptid čija je primarna struktura podvrgnuta promjenama. Takva promjena može npr. biti u obliku vezanja amiloidnog polipeptida na pogodni fuzijski partner (tj. promjena primarne strukture obuhvaća samo C, i/ili N-terminalnu adiciju aminokisleinskih ostataka) i/ili može biti u obliku insercije i/ili delecije i/ili supstitucije u polipeptidnoj aminokiselinskoj sekvenciji. Terminom su također obuhvaćeni derivatizirane molekule amiloidogenih polipeptida. U slučaju amiloidogenog, polipeptid je amiloid ili njegov prekursor, a analog može biti konstruiran da može manje ili čak da ne može izazvati antitijela na normali prekursor(e) proteina amiloida, stoga izbjegavati neželjene interferencije s (fiziološki normalnim) negaregiranim oblikom polipeptida koji je prekursor amiloidnog proteina.
Valja naznačiti da se može zamisiti kod ljudi ili kesno-analoga (npr. psećim ili svinjskim analogom) upotreba vakcine humanog amiloidnog polipeptida za koji da producira željeni imunitet na amiloidni polipeptid. Takva upotreba kseno-analoga za imunizaciju se također smatra dijelom izuma.
Termin "polipeptid" u ovom kontekstu označuje kratke peptide od 2 do 10 aminokiselinskih ostataka, oliopeptide od 11 do 100 aminokiselinskih ostataka, te polipeptide od više od 100 aminokiselinskih ostataka. Nadalje, namjera je također da termin uključuje proteine, tj. funkcionalne biomolekule koje sadrže najmanje jedan polipeptid, a kad sadrže najmanje dva polipeptida oni mogu biti u obliku kompleksa, kovalentno vezani ili mogu biti nekovalentno vezani. Polipeptid(i) u proteinu može biti glikoliziran i/ili lipidiran i/ili može sadržavati prostetične skupine.
Termin “T-limfocit” i T-stanica” će se koristiti alternativno za limfocite porijeklom iz timusa koji su odgovorni za različite stanice koje su posredovane imunim odgovorima kao i za aktivnost pomoćnih stanica u humoralnom imunom odgovoru. Slično, termin “B-limfocit” i B-stanica” će se koristiti limfocite koji produciraju antitijela.
Termin "subsekvencija" označuje duljinu od najmanje 3 aminokiseline ili, kada je to važno, najmanje 3 nukleotida izravno izvedenih od prirodne aminokiselinske sekvencije ili sekvencije nukleinske kiseline.
Termin “životinja” u ovom kontekstu općenito označuje životinjske vrste (preferirano sisavce) kao što su Homo sapiens, Canis domesticus, itd. a ne samo jednu životinju. Međutim, termin također označuje populaciju takvih životinjskih vrsta jer je važno da jedinke imunizirane prema metodi iz izuma sve sadrže uglavnom isti amiloidogeni polipeptid koji dopušta da imunizaciju životinja s istim imunogenom (imunogenima). Ako primjerice genetske varijante amiloidogenog polipeptida postoje u različitim humanim populacijama, može biti neophodno da se koriste različiti imunogeni u tim različitim populacijama, može biti neophodna upotreba različitih imunogena u različitim populacijama da bi se mogla razbiti autotolerancija prema amiloidogenom polipeptidu u svakoj populaciji na najbolji način. Bit će jasno stručnjaku da životinja u ovom kontekstu je živo biće koje ima imuni sustav. Preferirano je da je životinja kralježnjak, kao što je sisavac.
Terminom "in vivo smanjivanje amiloida" ovdje označuje smanjivanje u živom organizmu ukupne količine deponiranog amiloida važnog tipa. Smanjivanje se može dobiti putem nekoliko mehanizama od kojih je jednostavna interferencija amiloida i antitijela koji ga veže i tako sprječava krivu agregaciju najjednostavnija. Međutim, također je unutar obujma ovog izuma da vezivanje antitijela uzrokuje uklanjanje amiloida sa stanicama "čistačima" (kao što su makrofagi i ostale fagocitne stanice) tako da antitijela interferiraju s ostalim amiloidnim polipeptidima koji vode tvorbi amilopida.
Namjera je da izraz "djeluje na ispoljavanje...na imuni sustav" označuje da je životinjski imuni sustav podvrgnut imunogenom izazovu na kontrolirani način. Bit će jasno iz donjeg prikaza da se takav izazov imunog sustava može izvesti na brojne načine od kojih je najvažnija vakcinacija s polipeptidom koju sadrži "farmacina" (tj. vakcina koja je dana da poboljša odvijajuću bolest) ili nukleinskom kiselinom koju sadrži "farmacina". Važan rezultat koji treba postići je da su imuno kompetentne stanice u životinji kontrolirane antigenom na imunološki učinkovit način, dok je točan način postizanja to rezultata manje važan od inventivne ideje prikazane u ovom izumu.
Termin “imunogenski učinkovita količina” ima svoje uobičajeno značenje, tj. količina imunogena koja može inducirati imuni odgovor koji značajno zadržava patogena sredstva koja dijele imunološke karakteristike s imunogenom.
Kada se koristi izraz da je amiloidogeni polipeptid “modificiran” ovdje označuje kemijsku modifikaciju polipeptida koji čini skelet tog amiloidogenog polipeptida. Takva modifikacija može npr. biti prevođenje u derivat (npr. alkiliranje) na nekim aminokiselinskim ostacima u sekvenciji amiloidogenog polipeptida, ali će, kao što će biti razumljivo iz donjeg prikaza, preferirana modifikacija sadržavati promjene primarne strukture animokiselinske sekvencije.
Kada se diskutira “autotolerancija prema amiloidogenom polipeptidu”, a zato što je amiloidogeni polipeptid vlastiti protein u populaciji koju treba vakcinirati, podrazumijeva se da normalni pojedinci u populaciji neće povećavati imuni odgovor prema amiloidogenom polipeptidu; ne može se isključiti da će ponekad pojedinci u životinjskoj populaciji moći tvoriti antitijela na prirodni amiloidogeni polipeptid, npr. kao dio autoimunog poremećaja. Pri bilo kojoj brzini, životinja će normalno biti autotolerantna prema svom vlastitom amiloidogenom polipeptidu, ali se ne može isključiti da će analozi izvedeni iz ostalih životinjskih vrsta ili iz populacije koja ima različit fenotip također biti tolerirani u rečenim životinjama.
"Strani epitop za T-stanice” (ili "stani epitop za T-limfocit") je peptid koji je u stanju vezati se na molekulu MHC i koji stimulira T-stanice u životinjama. Preferirani strani epitop za T-stanice u ovom izumu su epitopi relaksirane specifičnosti, tj. epitopi koji se veću na veliki udio klase MHC molekula u životinjskim vrstama u populaciji. Poznat je samo vrlo mali broj takvih epitopa za T-stanice relaksirajuće specifičnosti, i ti će dolje biti detaljno prikazani. Valja napomenuti da bi imunogeni koji se koriste u ovom izumu bili učinkoviti u velikom dijelu životinjske populacije, za što može biti neophodno da se 1) insertira nekoliko stranih epitopa za T-stanice u isti analog ili da se 2) pripravi nekoliko analoga u kojima svaki analog ima insetrirani različiti epitop relaksirane specifičnosti. Valja naznačiti da je koncenpt stranih epitopa za T-stanica također obuhvaća upotrebu kriptičnih epitopa za T-stanice, tj. epitopa koji se izvode iz vlastitih proteina i koji pokazuju imunogeno ponašanje samo kad postoje u izoliranom obliku bez početnog dijela vlastitih proteina.
“Strani epitop za T pomoćne limfocite” (strani etitop za TH) je strani epitop za T-stanice koji se vezuje na MHC klasu II molekula i može biti prisutan na površini stanice koja ispoljava antigen (APC) vezanom na MHC klasu II molekulu.
“Funkcionalni dio” (bio)molekule u ovom kontekstu označuje dio molekule koja je odgovorna za najmanje jedan biokemijski ili fiziološki efekt pod utjecajem molekule. Dobro je poznato u struci da mnogi enzimi ili ostale molekule imaju aktivno mjesto koje je odgovorno za efekte koje se ispoljuju zbog tih molekula. Ostali dijelovi molekule mogu služiti u svrhu stabilizacije ili mogu povećavati topljivost i mogu stoga biti izostavljeni ako ove svrhe nisu važne u kontekstu nekih cjelina ovo izuma. Primjerice, moguće je da se koriste neki citokini kao modificirani ostaci u amiloidogenog polipeptida (vidi detaljnu diskusiju dolje) i u takvom slučaju pitanje stabilnosti može biti nevažno jer vezanje za analog dovodi do željene stabilnosti.
Termin “adjuvans” ima svoje uobičajeno značenje u tehnologiji vakcina, tj. tvar ili pripravak koji 1) za sebe nije u mogućnosti izazvati specifičan imuni odgovor vakcine, ali koji je 2) ipak u stanju povećati imuni odgovor na imunogen. Drugim riječima vakcinacija adjuvansom ne dovodi do imunog odgovora na imunogen, vakcinacija s imunogenom može ili ne mora povećavati imuni odgovor na imunogenu, ali kombinirana vakcinacija s imunogenom i adjuvansom izaziva imuni odgovor na imunogen koji je jači od onog induciranog samim imunogenom.
“Usmjeravanje” molekule u kontekstu ovo izuma označuje situaciju u kojoj će nakon uvođenja molekule u životinju preferirati neko tkivo(a) ili će preferirano biti povezana s nekim tipom stanice ili stanicama. Efekt može biti dobiven na brojne načine, ukjučujući formulaciju molekule u pripravku koja olakšava usmjeravanje uvođenjem u molekulu skupina koje olakšavaju usmjeravanje. Ova tkiva će biti dolje detaljno diskutirana.
“Stimulacija imunog sustava” znači da tvar ili pripravak općenito pokazuje nespecifičan imunostimulirajući učinak. Brojni adjuvansi i oni za koje se pretpostavlja da su adjuvansi (kao neki citokini) dijele sposobnost stimuacije imunog sustava. Rezultat korištenja imunostimulacijskog sredstva je povećanje “pripravnosti” imunog sustava znači da istovremena ili kasnija imunizacija s imunogenom inducira značajno učinkovitiji imuni odgovor u usporedbi kad se koristi samo imunogen.
Preferirane cjeline
Preferirano je da je amiloidogeni polipeptid koji se koristi kao imunogen u metodi iz izuma modificirana molekula pri čemu postoji najmanje jedna promjena u aminokiselinskoj sekvenciji amiloidogenog polipeptida, jer je vjerojatnost za dobivanje važne autotolerancije prema amiloidogenom polipeptidu općenito olakšana na taj način - to je vidljivo npr. iz rezultata predstavljenih ovdje u Primjeru 2, u kojem je imunizacija s divljim tipom Aβ uspoređena s imunozacijom s varijantom Aβ molekule. Valja naznačiti da to ne isključuje mogućnost upotrebe takvog modificirano amiloidogenog polipeptida u formulacijama koje dalje olakšavaju razbijanje autotolerancije na amiloidogenog polipeptida, npr. formulacije koje sadrže određeni adjuvans.
Pokazano je (u Dalum I et al., 1996, J. Immunol. 157: 4796-4804) da su potencijalni samoreaktivni B-limfociti koji prepoznaju vlastite proteine fiziološki prisutni u normalnim pojedincima. Međutim, da bi se ovi B-limfociti inducirali da stvarno proizvode antitijela reaktivna s važnim vlastitim proteinima, pomoć je potrebna od citokina koji produciraju T pomoćne limfocite (TH-stanice ili TH-limfociti). Ta pomoć normalno nije osigurana jer T limfociti općenito ne prepoznaju epitope za T-stanice izvedene iz vlastitih proteina, a kada su ispoljeni stanicama koje ispoljavaju antigene (APC). Međutim, dovođenjem elementa "stranosti" u vlastiti protein (tj. uvođenjem imunološki značajne modifikacije), T-stanice koje prepoznaju strani element su aktivirane prepoznavanjem stranog epitopa za APC (kao što je, početno, mononuklerna stanica). Poliklonalni B limfociti (koji su također APC) mogu prepoznati vlastite epitope na modificiranim vlastitim proteinima također uvlače antigen i zatim ispoljavaju odgovarajući strani epitop(e) za T satnice, te aktiviraju T limfocite pa time omogućuju pomoć citokina tim samoreaktivnim poliklonalnim B-limfocitima. Kako su antitijela nastala tim poliklonalnim B-limfocitima reaktivna s različitim epitopima na modificiranom polipeptidu, uključujući one koji su također prisutni u prirodnom polipeptidu, meureaktivnost antitijela s nemodificiranim vlastitim proteinima je inducirana. U zaključku, T-limfociti mogu biti vođeni da djeluju kao da populacija poliklonalnih B-limfocita prepoznaje cijeli strani antigen, dok je u stvari samo insertirani epitop(i) stran domaćinu. Na taj način, induciraju se antitijela sposobna meurakciji s nemodificiranim vlastitim antigenima.
U struci je poznato nekoliko načina modificiranja peptidnog vlastitog antigena, a da se dobije razbijanje autotolerancije. Stoga, prema izumu, modifikacija može uključivati
- uvođenje barem jednnog epitopa za T-stanicu, i/ili
- uvođenje najmanje jednog prvog segmenta koji djeluje usmjeravanjem modificirane molekule na stanicu koja ispoljava antigen (APC), i/ili
- uvođenje barem jednog drugog segmenta koji stimulira imuni sustav, i/ili
- uvođenje barem jednog trećeg segmenta koji optimizira ispoljavanje modificranog amiloidogenog polipeptida na imuni sustav.
Međutim, sve ove modifikacije se trebaju izvesti dok se održava znatni dio originalnog epitopa za B-limfocit u amiloidogenom polipeptidu, jer prepoznavanje B-limfocita od prirodne molekule je time povećano.
U jednoj preferiranoj cjelini su bočne skupine (u obliku stranih epitopa za T-stanice ili gore spomenutog prvog, drugog i trećeg segmenta) kovalentno ili nekovalentno uvedene. Namjera je da ovo znači da su lanci aminokiselinskih ostataka izvedenih iz amiloidogenog polipeptida prevedeni u derivate bez mijenjanja primarne aminokiselinske sekvencije, ili barem bez uvođenja promjena u peptidne veze između pojedinih aminokiselina i lancu.
Alternativna i preferirana cjelina koristi aminokiselinsku supstituciju i/ili križanje i/ili umetanje i/ili adiciju (koja se može dobiti rekombinantno ili peptidnom sintezom; modifikacija koja obuhvaća dulje lance aminokiselina povećava vezivanje u polipeptide). Posebno preferirana verzija ove cjeline je tehnika opisana u WO 95/05849, koja prikazuje metodu smanjivanja aktivnosti vlastitih proteina imunizacijom s analozima vlastitih proteina u kojima je broj aminokiselinske sekvencije(a) supstituiran s odgovarajućom sekvencijom(ama) aminokiselina od kojih svaka sadrži početni imunodominantni epitop za T-stanice, dok je u isto vrijeme održavana cjelokupna tercijarna struktura vlastitog proteina u analogu. Za svrhe ovog izuma dozvoljeno je, međutim, da se modifikacijom (koja može biti insercijom, adicijom, delecijom ili supstitucijom) poveća strani epitop za T-stanice, a pri čemu se istovremeno zadržava najveći dio epitopa za B-stanice u amiloidogenom polipeptidu. Međutim, da bi se dobila maksimalna učinkovitost induciranog imunog odgovora, preferirano je da se ukupna tercijarna struktura amiloidogenog polipeptida održava u modificranoj molekuli.
Sljedeća formula opisuje građevne jedinice molekulskih konstrukta koji su općenito pokriveni izumom:
(MOD1)s1(amiloide1)n1(MOD2)s2(amiloide2)n2...(MODx)sx(amiloidex)(I)
- u kojoj amiloide1-amiloidex jesu epitopi x za B-stanice u kojima slijedi amiloidogenog polipeptida koji je neovisno identičan ili nije identičan i koji može sadržavati druge bočne skupine, x je cijeli broj ≥3, n1-nx jesu x cijeli brojevi ≥0 (najmanje jedna je ≥1), MOD1-MODx su x modifikacija uvedenih između sačuvanih epitopa za B-stanice, s1-sx jesu x cijeli brojevi ≥0 (najmanje jedna je ≥1 ako nije uvedena ni jedna bočna skupina u amiloidex sekvencijama). Stoga prema općem funkcionalnom ograničenju na imunogenost građevnih dijelova, izum dozvoljava za sve vrste permutacija originalne sekvencije amiloidogenog polipeptida, te sve vrste modifikacija u njoj. Stoga, u izum su uključeni modificirani amiloidogeni polipeptidi dobiveni ispuštanjem dijelova sekvencije amiloidogenog polipeptida koju su normalno intracelularni i stoga mogu povećavati neželjene imunološke reakcije.
Jedna preferirana verzija gore navedenih konstrukata, a kada je primjenjljiva, je ona u kojima je epitop za B-stanice, a koji sadrži podsekvenciju amiloidnog proteina, izvan stanice izložen prekursoru polipeptida iz kojeg je amiloid izveden. Takvim izborom amiloidnig epitopa se osigurava da nisu generirana antitijela koja bi reagirala sa stanicama koje produciraju amiloidni prokursor, te stoga imuni odgovor koji se stvara postaje ograničen na imuni odgovor na neželjene amiloidne depozite. Sličan se izbor može, kad je primjenjljiv, učiniti za ostale amiloidogene polipeptide uz amiloid. U tim slučajevima bit će npr. moguće inducirati imunost na epitope amiloidogenog polipeptida koji je izložen samo u vanstaničnoj fazi kada nije povezan sa stanicama koje su ga producirale.
Održavanje velikog dijela epitopa za B-stanice, ili čak cijele tercijarne strukture proteina koji je podvrgnut modifikaciji kao što je opisano ovdje, može se postići na nekoliko načina. Jedan način je jednostavna priprava poliklonalnog antiseruma na amiloidogeni polipeptid (npr. antiserum pripravljen u zecu) i zatim korištenje tog antiseruma kao reagensa za testiranje (npr. u kompetitivnom ELISA) na modificirane proteine koji se proizvode. Modificirane verzije (analozi) koji reagiraju do iste mjere s antiserumom kao doza amiloidogenog polipeptida se moraju smatrati da imaju istu ukupnu tercijarnu strukturu amiloidogenog polipeptida, pri čemu se analozi koji pokazuju ograničenu (ali još uvijek značajnu i specifičnu) reaktivnost s takvim antiserumom smatraju da imaju održanu značajni dio originalnih epitopa za B-stanice.
Alternativno se za testiranjem mogu pripraviti i koristiti monoklonalna antitijela koji su reaktivna s određenim epitopima na amiloidogenog polipeptida. Ovaj pristup je povoljan jer dozvoljava: 1) mapiranje epitopa za amiloidogeni polipeptid, te 2) mapiranje epitopa koji su za održavanje u pripravljenim analozima.
Naravno, treći pristup bi bio da se riječi trodimenzijska struktura amiloidogenog polipeptida ili biološki aktivnog fragmenta (vidi gore) i usporedi ta struktura s riješenom trodimenzijskom strukturom pripravljenih analoga. Trodimenzijska struktura se može riječiti difrakcijom X-zraka i NMR spektroskopijom. Daljnje informacije koje se odnose na tercijarnu strukturu se do neke mjere mogu dobiti cirkularnim dikroizmom čija je prednost da samo zahtjeva polipeptid u čistom obliku (dok difrakcija X-zraka zahtjeva kristalizirani polipeptid a NMR zahtjeva izotopno obilježene polipeptide), za dobivanje korisne informacije o tercijarnoj strukturi molekule. Međutim, Konačno su difrakcija X-zraka i/ili NMR neophodni da se dobiju konkluzivni podaci jer cirkularni dikroizam može dati samo indirektni dokaz o ispravnoj trodimenzijskoj strukturi, a informacijom o sekundarnoj strukturi elemenata.
Jedna preferirana cjelina izuma koristi višestruko ispoljavanje epitopa za B-limfocite amiloidogenog polipeptida (t.j. formula I u kojoj je najmanje jedan epitop za B-stanicu prisutan u dva poloćaja). Taj efekt se može postići na različite načine, npr. pripravom fuzioniranih polipeptida koji sadrže strukturu (amiloidogeni polipeptid)m, gdje m jeste cijeli broj ≥2, a zatim uvođenjem ovdje diskutirane modifikacije u najmanje jednu amiloidnu sekvenciju. Preferirano je da uvedena modifikacija ukjučuje najmanje jednu duplikaciju epitopa B-imfocita i/ili uvođenje haptena. Ove cjeline, uključujući višestruka ispoljavanja odabranih epitopa, su posebno preferirane za stimulaciju kad su samo mali dijelovi amiloidogenog polipeptida korisni kao sastojci vakcine.
Kako što je gore spomenuto, uvođenje stranog epitopa za T-stanicu se može izvesti insrecijom, delecijom ili supstitucijom najmanje jedne aminokiseline. Naravno, normalna situacija bi bila uvođenje više od jedne promjene u aminokiselinsku sekvenciju (npr. insercija ili supstitucija komplenog epitopa za T-stanicu) ali je važno postići da se analogom pri procesiranju, koje ispoljavaju antigen u stanici (APC), poveća strani imunodominantni epitop za T-stanicu koji je prisutan u MCH klasi II molekule na površini APC. Zato, ako aminokiselinska sekvencija amiloidogenog polipeptida u odovarajućem položaju sadrži broj aminokiselinskih ostataka koji se također mogu naći u stranim TH epitopima, tada se uvođenje stranog TH epitopa može završiti time da se ostale amino-kiseline insertiraju u strani epitop, adiraju, deletiraju ili supstituiraju. Drugim riječima, nije neophodno da se uvede kompletan TH epitop insercijom ili supstitucijom, a da bi se zadovoljila svrha ovo izuma.
Preferirano je da je broj aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija ili adicija najmanje 2, kao što je 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 i 25 insercija, adicija, supstitucija ili delecija. Nadalje je preferirano da je broj aminokiselinskih insercija, adicija, supstitucija ili delecija nije veći od 150, tako da je uglavnom 100, uglavnom 90, uglavnom 80 i uglavnom 70. Posebno je preferirano ako je broj aminokiselinskih insercija, adicija, supstitucija ili delecija ne prelazi 60, a određenije da ne prelazi 50 ili čak 40. Najpreferiraniji broj nije veći od 30. Što se tiče adicije aminokiselina valja napomenuti da je ona, a kada je nastala struktura u obliku fuzioniranog polipeptida, često znatno veća od 150.
Preferirane cjeline izuma uključuju modifikacije uvođenjem najmanje jednog stranog imunodominantog TH epitopa. Podrazmjevat će se da pitanje dominacije TH epitopa ovisi u vrsti životinje. Po tome kako se ovdje koristi, termin “imunodominacija” odnosi se na epitope koji u vakciniranom pojedincu/populaciji značajno povećavaju imuni odgovor, ali je dobro poznata činjenica da TH epitop koji je imunodominantan u pojedincu/populaciji nije sigurno dominantan u drugom pojedincu iste vrste, mada može biti sposoban vezati se na MHC-II molekule u potonjima. Stoga, za svrhe ovog izuma, imunodominantni epitop za T-stanicu je epitop za T stanicu koji će biti učinkovit u pomoći T-stanica, a kada je prisutan u antigenu. Tipično, imunodomonantni epitop T-stanice ima ugrađeno svojstvo da će uvijek biti ispoljen kad je vezan na MHC Klasu II molekule, neovisno o polipeptidu koji se pojavljuje.
Sljedeća važna točka je pitanje restrikcije MHC TH epitopa. Općenito prirodni TH epitopi su ograničeni na MHC, tj. neki peptidi koji sadrže TH epitop će se vezati učinkovito na podskupinu MHC klase II molekula. To s druge strane ima učinak da će upotreba jednog specifičnog TH epitopa u komponenti vakcine rezultirati time da je ona učinkovita samo u dijelu populacije, a ovisno o veličini tog udjela, može biti neophodno da se uključi više TH epitopa u istu molekulu, ili da se alternativno pripravi višekomponentna vakcina u kojoj su komponente varijante amiloidogenog polipeptida koje se mogu razlikovati jedna od druge uvođenjem prirodnog TH epitopa.
Ako je restrikcija korištenih T-stanica potpuno nepoznata (primjerice u situaciji u kojoj vakcinirana životinja ima slabo definirani sastav MHC), udio populacije koja je pokrivena specifičnim sastavom vakcine se može odrediti sljede_om formulom
fpopulacija=[image] (II)
- u kojoj pi jeste frekvencija onih koji daju odgovor u populaciji na i epitopa za T-stanice prisutnih u pripravku vakcine, a n je ukupni broj stranih epitopa za T-stanice prisutnih u sastavu vakcine. Stoga, pripravak vakcine koji sadrži 3 strana epitopa za T-stanice i ima frekvenciju odgovora u populaciji od 0.8, 0.7 i 0.6, dat će
1 - 0.2 x 0.3 x 0.4 = 0.976
tj. 97.6 posto populacije će statistički povećavati odgovor na vakcinu posredovan MHC-II.
Gornja formula se ne odnosi na situaciju u kojoj je poznat više ili manje precizni restrikcijski obrazac korištenih peptida. Ako se, primjerice, neki peptidi vežu samo na humane MHC-II molekule kodirane od HLA-DR aleli DR1, DR2, DR3, DR5 i DR7, tada je korištenje tih peptida skupa s drugim peptidom koji se veže na preostale MHC-II molekule kodirane s HLA-DR alelom će upotpuniti 100% pokrivenosti populacije koja je u pitanju. Slično, ako se drugi peptid veće samo DR3 i DR5, dodatni peptid uopće neće povećati pokrivenost. Ako se račun zasniva na populacijskom odgovoru samo na MHC restrikciju epitopa za T-stanice u vakcini, udio pokrivene populacije specifičnim pripravkom vakcine se može odrediti pomoću sljedeće formule:
fpopulacija = [image] (III)
u kojoj Φjje suma frekvencija u populaciji aleičnog haplotipa koji kodiraju MHC molekule koje vežu bilo koji epitop za T-stanicu u vakcini i koji pripradaju j-tom od 3 poznata mjesta HLA (DP, DR i DQ); u praksi je prvo određeno koje će MHC molekule prepoznavati svaki epitop za T-stanicu u vakcini koje su zatim navedene po tipu (DP, DR i DQ) - a zatim su pojedine frekvencije različitih navedenih aleičnih haplotipa zbrojene za svaki tip pri čemu su dobiveni Φ1, Φ2 i Φ3.
Može se desiti da vrijednost pi u formuli II prelazi odgovarajući teorijsku vrijednost pi:
[image] (IV)
- u kojoj je vjsuma frekvencija u populaciji kojom alelični haplotip kodira MHC molekule koje se vežu na i-ti epitop za T-stanicu u vakcini i koja pripada j-tom od 3 poznata mjesta HLA (DP, DR i DQ). To znači da je 1-πi-tom dijelu populacije frekvencija odgovora fostatak_i=(pi--πi)/(1-πi). Stoga se formula III može podesiti dako da se dobije formule V
fpopulacija = [image] = (V)
- u kojoj termin 1-fostatak_i je određen kao 0 ako je negativan. Valja napomenuti da formula V zahtjeva da svi epitopi imaju haplotip mapiran na identičan set haplotipa.
Zato, kada se biraju epitopi za T-stanicu koji će se uvesti u analog, važno je da se uključe sva znanja o epitopima koji su na raspolaganju: 1) frekvencija onih koji daju odgovor u populaciji na svaki epitop, 2) podaci o restrikciji MHC i 3) frekvencija relevantnih haplotipa u populaciji.
Postoje brojni prirodni epitopi za T-stanice "relaksirane specifičnosti" koji su aktivni u velikom udjelu pojedinaca životinjskih vrsta ili životinjske populacije i oni se preferirano uvode u vakcinu, što smanjuje potrebu za vrlo velikim brojem različitih analoga u istoj vakcini.
Epitop relaksirane specifičnosti može prema ovom izumu biti prirodni epitop za T-stanice kao što su epitopi iz toksoidnog tetanusa (npr. P2 i P30 epitopi), toksoid difterije, virus influencije hemagluttinin (HA), i antigen P. falciparun CS.
Tijekom godina su identificirani brojni epitopi za T-stanicu relaksirane specifičnosti. Posebno peptidi sposobni za da veću na veliki dio HLA-DR molekula kodiranih od različitim HLA-DR alelima su identificirani i svi oni su potencijalni epitopi za T-stanice koji se mogu uvesti u analoge koji će se koristiti u ovom izumu. Cf. također epitope diskutirane u sljedećim referencijama koji su svi ovdje ugrađeni citatom: WO 98/23635 (Frazer IH et al., University od Queensland); Southwood S et al. 1998, J. Immunol. 160: 3363-3373; Sinigaglia F et al. 1988, Nature 336: 778-780; Chicz RM et al. 1993, J. Exp. Med. 178: 27-47; Hammer J et al. 1993, Cell 74: 197-203; te Falk K et al. 1994, Immunogenetics 39: 230-242. Zadnja referencija se također odnosi na HLA-DQ i -DP ligande. Svi prikazani epitopi u referenciji 5 su važni kandidati prirodnih epitopa za korištenje u ovom izumu, kao i epitopi koji dijele zajednički motiv s ovima.
Alternativno se epitop može biti sintetski epitop za T-stanicu koji se može vezati na veliki dio MHC klase II molekula. U tom kontekstu pan DR epitop peptida ("PADRE") opisan u WO 95/07707 i u odgovarajućem radu Alexander J et al. 1994, Innunity 1: 751-671 (oba ovdje ugrađena citatom) su prema ovom izumu interesantni kandidati za korištenje kao epitopa. Valja napomenuti da najučinkovitiji PADRE peptidi opisani u ovim radovima nose D-aminokiseline na C- i N-terminalnom kraju., a da se poboljša stabilnost pri davanju. Međutim, ideja ovog izuma je prvenstveno u ugrađivanju važnih epitopa kao dijela modificiranog amiloidogenog poplipeptida koji treba zatim biti enzimatski pocijepan unutar lizosomalnog dijela APC, a da se dozvoli ispoljavanje u sadržaju MHC-II molekule, pa stoga nije pogodno da se ugradi D-aminokiselina u epitope korištenih u ovom izumu.
Jedan posebno preferirani PADRE peptid ima aminokiselinsku sekvenciju AKFVAAWTLKAA ili odgovarajuću imunološki učinkovitu subsekvenciju. Ti i ostali epitopi koji nemaju MHC restrikciju su preferirani epitopi za T-stanicu koje treba koristiti u analozima po ovoj metodi. Takvi epitopi vrlo relaksirane specifičnosti će činiti najjednostavniju cjelinu izuma u kojem je samo jedan modificirani amilogenoidni polipeptid prisutan u vakciniranom životinjskom imunom sustavu.
Kao što je gore spomenuto, modifikacija amiloidogenog poplipeptida može također uključivati uvođenje prvog segmenta koji usmjeravaju modificirani amiloidogeni poplipeptid u APC ili B-limfocit. Primjerice, prvi segment može biti specifično vezujući partner za specifični površinski antigen B-limfocita ili specifični površinski antigen APC. Poznati su mnogi takvi specifični površinski antigeni. Primjerice, segment može biti ugljikohidrat za koji postoji receptor na B-limfocitu ili APC (npr. manan ili manoza). Alternativno, drugi segment može biti hapten. Također kao fragment antitijela koji specifično prepoznaju površinu molekule APC ili limfocitima se mogu koristiti kao prvi segment (površinska molekule može npr. biti FCγ receptor makrofaga ili monocita, kao što je FCγRI ili alternativno bilo koji druga specifična oznaka površine kao što je CD40 ili CTLA-4). Valja napomenuti da se svi ti primjeri usmjeravanja molekule mogu koristiti kao dio adjuvansa, vidi dolje.
Kao alternativa ili suplement usmjeravanju modificiranog amiloidogenog poplipeptida u neke tipove stanica da bi se postigao povećani imuni odgovor, je moguće povećanje razine odgovora imunog sustava uključivanjem gore spomenutog segmenta koji stimulira imuni sustav. Tipični primjeri takvih drugih segmenata su citokini i proteini podvrgnuti toplinskom šoku ili molelukski šaperoni kao i njihovi učinkoviti dijelovi.
Pogodni citokini koji se mogu koristiti u ovom izumu su oni koji će normalno djelovati kao adjuvansi u pripravku vakcine tj. primjerice interferon γ (IFN-γ), interleukin 1 (IL-1), interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4), interleukin 6 (IL-6), interleukin 12 (IL-12), interleukin 13 (IL-13), interleukin 15 (IL-15), te stimulirajući faktor kolonije granulacitnog makrofaga (GM-CSF); alternativno funkcionalni dio molekule citokinona može biti pogodan kao drugi segment, vidi diskusiju dolje.
Prema izumu, pogodni proteini podvrgnuti toplinskom šoku ili molekulski šaperoni koji se koriste za drugi segment mogu biti HSP70, HSP90, HSC70, GPR94 (također poznat kao gp96, vidi Wearsch PA et al. 1998, Biochemistry 37: 5709-19) i CRT (kalretikulin).
Alternativno drugi segment može biti toksin kao što je listeiolicin (LOO), lipid A i termolabilan enterotoksin. Također su interesantne mogućnosti brojni mikrobakterijski derivati kao što je MDP (muramil dipeptid), CFA (kompletni Freudov adjuvans) i dister tetraloze TDM i TDE.
Također je važna cjelina uvođenje trećeg segmenta koji ubrzava ispoljavanje modificiranog amiloidogenog poplipeptida na imuni sustav. U struci je poznato nekoliko primjera tog principa. Primjerice, poznato je da se sidrenje lipidacije pamitoila u Borrelia burgdorferi proteinu OspA može koristiti tako da se dobije polipeptidi koji je autoadjuvans (cf. npr. WO 96/40718) izgleda da lipidirani proteini tvore strukture poput micela čija srž sadrži dijelove za sidrenje lipidacije polipeptida i ostali dijelovi molekule koje se pružaju od njih, rezultirajući višestrukom prezentacijom antigenske determinante. Zato, korištenje ovog i sličnih pristupa koristeći različita sidrišta lipidacije (npr. miristilna skupina farnezilna skupina i N-aciln digliceridna skupina) su preferirane cjeline iz izuma, posebice jer je ograničenje takve lipidacije u rekombinatno nastalom proteinu jednostavno i samo zahtjeva korištenje npr. prirodnih signalnih sekvencija kao partnere za modificiranog amiloidogenog poplipeptida. Daljnja mogućnost je korištenje C3d fragmenta komplementarnog faktroa C3 ili samo C3 (vidi Dempsey et al. 1996, Science 271, 348-350 i Lou & Kohler, 1998, Nature Biotechnology 16, 458-462).
Alternativna cjelina izuma koja također rezultira preferiranim ispoljavanjem višestrukih (npr. barem 2) kopija važnih epitopalnih regija amiloidogenog poplipeptida u imunom sustavu je kovalentno vezivanje amiloidogenog poplipeptida, podsekvenciji ili njegovim varijantama s određenim molekulama. Primjerice, mogu se koristiti polimeri npr. ugljikohidrati kao što je dektran, vidi Lees A et al. 1995, Vaccine 12: 1160-1166; Lees A et al. 1990, J. Immunol. 145: 3594-3600, ali također manoza i mana su korisne alternative. Integralni membranski proteini iz nor, e. coli i ostalih bakterija su također korisni konjigacijski partneri. Tradicionalni nosač molekula kao što je hemocianin (KLH), toksoidtetanusa, toksoid difeteria i goveđi serum albumin (BSA) su također preferirani i korisni partneri za konjugaciju.
Preferirane cjeline kovalentno vezanih amiloidogenih poplipeptida na polihidroksipolimere, kao što su ugljikohidrati, uključuju upotrebu najmanje jednog amiloidogenog poplipeptida i najmanje jednog stranog epitopa za T-pomoćnu stanicu koji je zasebno povezan na polihidroksipolimer (tj. epitop strane T-stanice i amiloidogeni poplipeptid nisu povezani jedan na drugog nego su vezani na polihdroksipolimer koji zatim služi kao kostur nosača). Ponovo, takva cjelina je najpreferiranija kada pogodni epitop za B-stanicu koji nosi regije amiloidogenog poplipeptida je sastavljen od kratkih peptida - to je zato jer je taj pristup vrlo pogodan način postizanja višestrukog ispoljavanja odabranih epitopa u rezultirajućem amunogenom sredstvu.
Posebno je preferirano da je vezanje stranog epitopa za T-pomoćne stanice i amiloidogenog (popli)peptida postignuto amidnom vezom koja se može cijepati peptidazom. Ta strategija ima efekt da će APC biti sposoban prihvatiti konjugat a zatim ispoljiti epitop strane T-stanice u kontekstu MHC Klase II.
Jedan način postizanja vezanja peptida (amiloidogenog poplipeptida i stranog epitopa) je aktiviranje podobnog polihidroksipolimera tresilnom skupinom; npr. moguće je pripraviti tersilirane polisaharide kao što je opisano u WO 00/05316 i US 5,874,469 (oba ovdje ugrađena citatom), a dva ova amiloidogena peptida i epitopi T-stanice pripravljeni su uobičajenim tehnikama sinteze u čvrstoj ili tekućoj fazi. Nastali produkt sadrži polihidroksipolimerni skelet (npr. skelet dektrana) na koji su preko N-terminalnog kraja ili preko drugih ostataka koji sadrže dušikom spojeni amiloidogeni polipeptidi i epitopi za stanu T-stanicu. Kad je poželjno moguće je sintetizirati amiloidogene polipeptide tako da se zaštite sve rapoložive amino-skupine osim onih na N-terminalnom kraju, a zatim da se povežu nastali zaštićeni peptide i tresilirani dekstanski dio, te Konačno da se ukloni zaštita da bi se dobio konjugat. Specifični primjer tog pristupa je opisan u donjem primjeru.
Umjesto korištenja u vodi topljivih polisaharidnih molekula kao što je prikazano u WO 00/05316 i US 5,874,469, moguće je koristi unakrsno povezane molekule polisaharida, pa stoga dobiti određeni konjugat polipeptida i polisaharida - vjeruje se da to vodi poboljšanom ispoljavanju imunog sustava polipeptida jer su postignuta dva cilja, da se dobije lokalni efekt depozicije kada se injektira konjugat i da se dobiju čestice koje su atraktivan cilj za APC. Taj pristup korištenja takvih određenih sustava je također prikazan detaljno u primjerima.
Razmatranja koja izdavaju odabrane dijelove za uvođenje modifikacija u amiloidogene polipeptide su: a) sačuvanje poznatih i predviđenih epitopa za B-stanice, b) sačuvanje tercijarne strukture, c) izbjegavanje prisutnosti B-stanice na "stanici koja producira" itd. Pri bilo kojoj brzini, kao što je gore diskutirano, prilično je lako da se proberu modificirane amiloidogene molekule koje su podvrgnute uvođenju epitopa za T-stanicu u različit položaj.
Kako najpreferiranije cjeline ovog izuma obuhvaćaju smanjivanje humanog Aβ, zato je preferirano da je gore diskutirani amiloidni polipeptid humani Aβ polipeptid. U toj cjelini je posebno preferirano da je humani amiloidni polipeptid modificiran supstitucijom najmanje jedne aminokiselinske sekvencije SEQ ID NO: 2 s najmanje jednom aminokiselinskom sekvencijom iste ili različite duljine koja sadrži strani TH epitop. Preferirani primjeri modificiranog amiloidogenog APP i Aβ su sustavno prikazani na Slici 1 upotrebom epitopa P2 i P30 kao primjera. Objašnjenje ovih kontrukata je diskutirano detaljno u primjeru.
Specifičnije, TH koji sadrži (ili kompletira) aminokiselinsku sekvenciju koja je uvedena u SEQ ID NO: 2 može biti uvedena kod bilo koje aminokiseline u SEQ ID NO: 2. Uvođenje je moguće nakon bilo koje aminokiseline od 1-770, ali preferirano nakon bilo koje od sljedećih aminokiselina: 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, V09, 710, 711, 712, 713, te 714 u SEQ ID NO: 2. To se može kombinirati s delecijom bilo koje ili svih aminokiselina od 1- 671, ili bilo koje od aminokiselina 715-770. Nadalje, kada se koristi tehnika supstitucije, bilo koja od aminokiselina 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, .687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, V03, 704, 705, 706, 707, 708, 709,710, 711, 712, 713, te 714 u SEQ ID NO: 2 može biti deletirana u kombinaciji s uvođenjem.
Formulacije amiloidogenog polipeptida i modificiranih amiloidogenih polipeptida
Utjecanje na ispoljavanje polipeptidnog amiloidogenog polipeptida ili modificiranog amiloidogenog polipeptida na životinjski imuni sustav davanjem životinjama formulacije polipeptida je u skladu s općim znanjem struke.
Priprava vakcina koje sadrže peptidne sekvencije kao aktivne komponente je općenito dobro poznata, kao što je prikazano u U. S. Patentima 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; te 4,578,770, svi ovdje ugrađeni citatom. Tipično se takve vakcine pripravljaju kao tekuće otopine ili suspenzije koje se mogu injektirati; kruti oblici pogodni za otopine ili suspenzije , te tekućina koja se također može pripraviti prije injektiranja. Pripravak također može biti emulgiran. Aktivni imunogenčni sastojak se često miješa s ekcipijentom koji je farmaceutski prihvatljiv i kompatibilan s aktivnim sastojkom. Pogodni ekscipijensi su primjerice voda, fiziološka otopina, dektroza, glicerol, etanol ili slično te njihova kombinacija. Nadalje, po želji vakcina može sadržavati malu količinu dodatnih tvari kao što su klizna sredstva ili emugatori, sredstva za puferiranje pH, adjuvansi koji povećavaju učinkovitost vakcine; niže vidi detaljnu diskusiju o adjuvansima.
Vakcine se uobičajeno daju parenteralnom injekcijom, primjerice subkutalno, intrakutalno, intradermano, subder-malno ili intramuskuarno. Nadalje, formulacije koje su pogodne za ostale načine davanja ukjučuju supozitorije, te u nekim slučajevima oralne, bukalne, sublingvalne, intraperitonalne, intravaginalne, analne, epiduralne, spinalne i intrakrainalne formulacije. Za supozitorije tradicionalna veziva i nosači mogu uključivati primjerice polialkalen, glikole ili trigliceride; takvi supozitoriji mogu se tvoriti od smjese koja sadrži aktivni sastojak u rasponu od 0.5% do 10%, preferirano 1-2%. Oralne formulacije uključuju normalno korištene ekcipijente kao što je primjerice manitol farmacetuskog stupnja čistoće, laktoza, škrob, magnezijev strearat, natrijev saharin, ceuloza, magnezijev karbonat i slično. Ti pripravci mogu tvoriti otopine, suspenzije, talbete, pilule, kapsule, formulacije s odgođenim djelovanjem ili praške koji sadrže 10-95% aktivnog sastojka, preferira-no 25-70%. Za oralne formulacije je toksin kolere interesantni formulacijski partner (a također i konjugacijski partner).
Polipeptidi se mogu formuilrati u vakcine u neutralnom obliku ili obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju soli nastale adicijom (nastale sa slobodnom aminoskupinom peptida) anorganskih kiselina kao što je primjerice klorovodična kiselina ili fosforna kiselina, ili s takvih organskih kiselina kao što je octena, oksalna, vinska, bademova i slične. Soli nastale sa slobodnim karboksilnoim skupinama mogu također biti izvedene iz anorganskih baza kao što je primjerice natrijev, kalijev, amonijev, kalcijev ili željezni(III) hidroksid, te iz takvih organskih baza kao što je izopropilamin, trimetilamin, 2-etilaminoetanol, histidin, prokain i slično.
Vakcine se daju na način koji je kompatibilan s formulacijom doze, i u takvoj količini koja će biti terapijski učinkovita i imunogena. Količina za davanje ovisi o osobi koja je pod tretmanom, uključujući npr. kapacitet imunog sustava pojedinca da podigne imuni odgovor i željenog stupnja zaštite. Pogodni rasponi doze kreću se do razlike nekoliko stotina mikrorama aktivnog sastojka po vakcini s preferiranim rasponom od oko 0.1 μg do 2000 μg (čak su razmatrane i veće količine u rasponu od 1-10 mg) kao što je raspon od oko 0.5 μg do 1000 μg, preferirano u rasponu od 1 μg do 500 μg, a posebno preferirano u rasponu od oko 10 μg do 100 μg. Pogodni režim za početak davanja i ponovljena imunizacija su također primjenjljivi ali su tipizirani početnim davanjem koje slijedi inokulaciju ili druga davanja.
Način primjene može široko varirati. može se primjeniti bilo koja konvencionalna metoda davanja vakcine. To uključuje oralnu primjenu na krutoj fiziološki prihvatljivoj osnovi ili fiziološki prihvatljivu disperziju, parenteralno davanje injekcijom ili slično. Doza vakcine će ovisiti o načinu davanja i prilagoditi će se starosti osobe koja će biti vakciniranai i vrsti formulacije antigena.
Neki polipeptidi vakcine su dovoljno imunogeni u vakcini, ali će za neke druge imune odgovore biti bolje ako vakcina daljnje sadrži adjuvanse.
Poznate su različite metode postizanja učinka adjuvansa za vakcine. Opći principi i metode su opisane detaljno u “The Theory and Practical Application of Adjuvants”, 1995, Duncan E. S. Stewart-Tull (izd.), John Wiley & Sins Ltd, ISBN 0-471-95170-6, i također u “Vaccines: New Generation Immunologica Adjuvants”, 1995, reoriadis . et al. (izd.) Plenum Press, New York, ISBN 0-306-4583-9, a oba su ovdje ugrađeni citatom.
Posebno je preferirano korištenje adjuvansa koji mogu olakšati uništavanje autotolerancije na autoantigene, a to je suštinski važno u slučaju kad se koristi nemodificirani amiloidogeni polipeptid kao aktivni sastojak u autovakcini. Neograničavajući primjeri pogodnih adjuvansa su odabrani iz skupine koja se sastoji od imunousmjeravajućih adjuvansa, imunomoduirajućih adjuvansa kao što je toksin, citokin i mikobakterijski derivati, formulacije ulja, polimera, adjuvansa koji tvore micele, saponina, matricu imunostimulirajućeg kompleksa (ISCOM matrica) čestica, DDA, aluminijskog adjuvansa, DNA adjuvansa, γ-inulina i adjuvansa koji se može kapsulirati. Općenito, bit će naznačeno da se gornji prikaz odnosi na sredstva korisna kao prvi, drugi i treći segment u analozima se također odnose mutatis mutandis na njihovo korištenje kao adjuvansa vakcine iz izuma.
Primjena adjuvansa uključuje upotrebu sredstva kao što je aluminijev hidroksid ili fosfat (alum), koji se obično koristi kao 0.05 do 01 postotna otopina u puferiranoj fiziološkoj otopini u smjesi sa sintetskim šećernim polimerima (npr. Carbopol®) korišten kao 0.25 postotna otopina, agregacija proteina u vakcini djelovanjem toplinom u rasponu tepmerature između 70 °C do 101 °C u periodu od 30 sekundi do 2 minute, a također je moguće postići agregaciju pomoću sredstva za umrežavanje. Mogu se također koristiti agregacija reaktiviranjem s antitijelima koji su tretirani pepsinom (Fab fragmenti) u albumin, smjesa bakterijskih stanica kao što je C. pravum ili endotoksini ili lipopoli-saharidne komponente ili gram-negativnih bakterija, emulzija u fiziološki prihvatljivom uljnom vehikulu kao što je manidni monooleat (Aracel A) ili emulzija s 20 postotnom otopinom perfluorugljika (Fluosol-DA) korištena kao blok supstitut. Također je preferirano je miješanje s uljem kao što je skvalen i IFA.
Prema izumu DDA (dimetildioktadecilamonijev bromid) je interesantan kandidat da adjuvans kao i DNA i γ-inulin, ali također su Freudov kompletan i nekompletan adjuvans kao i quillaja saponons kao što su i QuilA i QS21 interesantni kao RIBI. daljnje mogućnosti su monofosforil-lipidi a (MPL), gore spomenuti C3, C3d i muramil dipeptidi (MDP).
Formulacije liposoma također prenose učinak adjuvansa, pa su stoga liposomski adjuvansi preferirani u ovom izumu.
Također je adjuvans tipa imunostimulirajuće matrice (ISCOM® matrica) preferiran izbor prema izumu, posebice jer je pokazano da takav tip adjuvansa može povećati ekspresiju MHC klase II pomoću APC. ISCOM® matrica se sastoji od (može biti frakcionirana) saponina (tritepenoidi) iz Quillaja saponaria, kolesterola i fosfolipida. Kada se miješa s imunogenim proteinom, nastale formulacija je ono što je poznato kao ISKOM čestica u kojoj saponin čini 60-70% w/w, kolesterol i fosfolipid 10-15% w/w, a protein 1-15% w/w. Detalji koji se odnose na sastav i korištenje imunostimulirajućih kompleksa mogu npr. biti nađeni u gore spomenutim udžbenicima koji prikazuju adjuvanse, ali također u i Morein B et al. 1995 Clin, Immunother. 3: 461-475 kao i Barr IG i Mitchell GF, 1996, Immunol. and Cell Biol. 74: 8-25 (oba ovdje ugrađena citatom) prikazuju korisne upute za pripravu kompletnih imunostimulrajućih kompleksa.
Još jedna interesantne (pa stoga preferirana) mogućnost postizanja učinka adjuvansa je uporaba tehnike opisane od Gosselin et al., 1992 (koji je ovdje ugrađen citatom). Ukratko, ispoljavanje relevantnih antigena kao što je antigen u ovom izumu se može povećati konjugiranjem antigena s antitijelima (ili fragmentima antitijela koja vežu antigen) na Fcγ receptore na monocitima/makro-fagima. Posebno su konjugati između antigena i anti-FcγRI pokazali da povećavaju imunogeničnost za svrhe vakciniranja.
Ostale mogućnosti korištenja su gore spomenutih usmjeravajućih i imunomodulirajućih tvari (i.a. citokini) kao kandidata za prvi i drugi segment u modificiranoj verziji amiloidogenog polipeptida. S tim u vezi mogući su i citokini koji sintetski induciraju citokine kao što je poli I:C.
Pogodni bakterijski derivati su odabrani od skupine koja se sastoji od muramilnog dipeptida, kompleta Freudovog adjuvansa, RIBI i diestera trehaloze kao što je TDM i TDE.
Pogodni imunousmjeravajući adjuvansi su odabrani od skupine koja se sastoji od CD40 liganda i CD40 antitijela ili njihovih specifično vezanih fragmenata (vidi gornju diskusiju), manoze, Fab fragmenta i CTLA-4.
Pogodni polimerni adjuvansi su odabrani od skupine koja se sastoji od ugljikohidrata kao što je dekstran, PEG, škrob, manan i manoza; plastičnih polimera kao što je lateks u obliku lateksnih zrna.
Sljedeći interesantan način moduliranja imunog odgovora je uključivanje imunogena (može zajedno s adjuvoansom i farmaceutski prihvatljivim nosačima i vehikulima) u "virtualni limfni čvor" (VLN) (odgovarajuća medicinska naprava razvijena je od ImmunoTherapy, Inc. 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501). VLN (tanka tubularna naprava) imitira strukturu i funkciju limfnog čvora. Umetanje VLN ispod koće stvara mjesto sterilne upale s porastom citokina i kemokina. T- i B-stanice kao i APC brzo odgovaraju na signal opasnosti koji je na mjestu upale i akumuliraju se unutar porozne matrice VLN. Pokazano je da je neophodna doza antigena potrebna za postizanje imunog odgovora na antigen smanjena kada se koristi VLN i da imuna zaštita pri vakcinaciji koja koristi VLN prelazi konvencionalnu imunizaciju koristeći Ribi kao adjuvans. Tehnologija je i.a. opisana ukratko u Gelber C et al. 1998 "Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts od Inmmunegens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node" u "From the Laboratory to the Clinic, Book od Abstracts, October 12th - 15th 1998, Seascape Resort, Aptos, California".
Pokazano je da formulacije vakcine s mikročesticama povećavaju imunogenost antigena proteina i stoga su još jedna preferirana cjelina izuma. Mikročestice se prirpalvjaju kao koformulacije antigena s polimerom, lipidom, ugljikohidratom ili ostalim molekulama pogodnim za prirpavu čestica, ili mikročestice mogu biti homogene čestice koje se sastoje od samog antigena.
Primjeri mikročestica zasnovanih na polimerima su na PLGA i PVP zasnovane čestice (Gupra, R. K. et al. 1998) pri čemu su polimer i antigen kondenzirani u čvrste čestice. Na lipidu zasnovane čestice (također yvane liposomi) ugrađuju anigen unutar micela (Pietrobon, P. J. 1995). Na ugljikohidratina zasnovane čestice su tipično pripravljene od ugljikohidrata koji se mogu dagradirati kao što je kukuruzni škrob ili kitosan. Ugljikohidrat i antigen se miješaju i kondenziraju u čestice u postupku sličnom onom korištenom za polimerne čestice (Kas, H. S. et al. 1997).
Čestice koje se sastoje samo od antigena su načinjene različitim tehnikama raspršivanja i liofilizacije. Posebno pogodna za svrhe ovog izuma je tehnologija superkritične tekućine koja se koristi da bi se dobile jednolične čestice kontrolirane veličine (York, P. 1999 & Shekunov, B. et al. 1999).
Očekuje se da bi vakcina dana 1-6 puta godišnje, kao što je najmanje 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 puta godišnje osobi koja za tim ima potrebu. Prethodno je pokazano da pamćenje inducirane imunosti korištenjem preferiranih autovakcina prema izumu nije stalno, pa zato imuni sustav ima potrebu za periodičnim izazovom amiloidogenim polipeptidom ili modificiranim amiloidogenim polipeptidima.
Zbog genetskih varijacija, različiti pojedinci mogu reagirati na isti polipeptid s imunim odgovorom različite jakosti. Zato vakcina prema ovom izumu može sadržavati nekoliko različitih polipeptida da bi se povećao imuni odgovor, cf. također gornju diskusiju koja se tiče izbora uvođenja stranog epitopa za T-stanicu. Vakcine mogu sadržavati dva ili više polipeptida, pri čemu su svi polipeptidi kao što su gore definirani.
Vakcine mogu sadržavati 3-20 različitih modificiranih ili nemodificiranih polipeptida, kao što je 3-10 različitih polipeptida.
Vakcinacija nukleinskom kiselinom
Kao alternativa klasičnom davanju vakcine zasnovane na peptidu, tekhnologija vakcinacije nukleinskom kiselinom (također poznata kao "imunizacija nukleinskom kiselinom", "genetska imunizacija" i "imunizacija genom") nudi brojne atraktivne karakteristike.
Prvo, nasuprot tradicionalnom pristupu vakcini, vakcinacija nukleinskom kiselinom ne zahtjeva produkciju konzumiranog resursa u velikim količinama imunogenog sredstva (npr. fermentacije mikroorganizama koji produciraju modificirane amiloidogene polipeptide na industrijskoj skali). Nadalje, nema potrebe za napravom za pročišćavanje i restruktuiranje shema imunogena. Konačno, kako se vakcinacija nukleinske kiseline oslanja na biokemiju vakciniranog pojedinca, a da se producira produkt ekspresije uvedene nukleinske kiseline, očekuje se da dođe do optimuma post-translacijskog procesiranja produkta ekspresije; to je posebice važno u slučaju autovakcinacije jer, kao što je gore spomenuto, značajni dio originalnih epitopa za B-stanicu se može sačuvati u modificiranoj molekuli i kako se epitopi za B-stanicu u načelu mogu sastojati od dijelova bilo koje (bio)molekule (npr. ugljikohidrat, lipid, protein itd.). Zato prirodni način glikozilacije i lipidacije imunogena može biti vrlo značajan dio ukupne imunogenosti, a što se najbolje osigurava domaćinom koji proizvodi imunogen.
Stoga preferirana cjelina sadrži učinkovito ispoljavanje modificiranog amiloidogenog polipeptida u imunom sustavu uvođenjem nukleinske kiselina (kiselina) koja kodira modificirani amiloidogeni polipeptid u životinjskim stanicama i iz toga se dobiva in vivo ekspresija u stanicama u koje je uvedena nukleinska kiselina (kiseline).
O ovoj cjelini, uvedena nukleinska kiselina je preferirano DNA koja može biti u obliku same DNA, DNA formulirane s nabijenim ili nenabijenim lipidima, DNA formulirane u liposomima, DNA uključene u virusni vektor, DNA formulirane s proteinom ili polipeptidom koji olakšava transfekciju, DNA vezane na inertnu molekulu koja je nosač, DNA kapsulirane u hitin ili hitosan, te DNA formulirane s adjuvansom. U ovom kontekstu primjećeno je da su gotovo sve tradicionalne fromulacije vakcine koriste za formulaciju DNA vakcine. Zato sve prikazano ovdje koje se odnosi na korištenje adjuvansa u kontekstu vakcina baziranih na polipeptidima se primjenjuju mutatis mutandis na njihovu upotrebu u tehnologiji vakcijancije nukleinskom kiselinom.
Načini davanja i sheme davanja vakcina baziranih na polipeptidima koji su gore detaljno prikazani, mogu se primjeniti za vakcine nukleinske kiseline iz izuma i sve gornje diskusije koje se odnose na načine davanja i sheme davanja polipeptida primjenjuju se mutatis mutandis na nukleinske kiseline. Tome treba dodati da vakcine nukleinske kiseline mogu biti pogodne za intravenozno davanje. Nadalje, dobro je poznato u struci da se vakcine nukleinske kiseline mogu davati korištenje tzv. genskog pištolja, te zato taj i ekvivalentan način davanja je dio ovog izuma. Konačno, također je prikazano da upotreba VLN pri davanju nukleinskih kiselina daje dobre rezultate i stoga je taj određeni način davanja posebno preferiran.
Nadalje, nukleinska kiselina (kiseline) korištena kao sredstvo za imunizaciju može sadržavati regije koje kodiraju prvi, drugi i/ili treći segment, npr. u obliku imunomodulirajućih tvari koje su opisane gore, kao što je citokin koji je diskutiran kao adjuvans. Preferirana verzija ove cjeline obuhvaća postojanje regije kodiranja za analog i regije kodiranja za imunomodulator u različitim čitajućim okvirima ili su barem kontrolirani različitim promotorima. Tako je izbjegnuto da se analog epitopa stvara kao partner za fuziju imunomodulatora. Alternativno se mogu koristiti dva različita nukleotidna fragmenta, ali je to manje preferirano jer je prednost osiguravanja koekspresije kada su uključene obje regije kodiranja u istu molekulu.
Prema tome, izum se također odnosi na pripravke za izazivanje produkcije antitijela na amiloidogeni polipeptid, a pripravak sadrži
- fragment nukleinske kiseline ili vektor iz izuma (cf. donju diskusiju o vektorima), te
- farmaceutski i imunološki prihvatljiv vehikul i/ili nosač i/ili adjuvans, kao što je gore diskutirano.
Pod normalnim uvjetima, varijanta koja kodira nukleinsku kiselinu je uvedena u obliku vektora pri čemu je ekspresija pod kontrolom virusnog promotora. Za detaljniju diskusiju vektora prema ovom izumu, vidi donju diskusiju. Također postoji detaljni prikaz koji se odnosi na formulacije i korištenje nukleinske kiseline za vakcine, vidi Donnelly JJ et al. 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648 i Donnelly JJ et al. 1997, Life Sciences 60: 163-172. Oba su ovdje ugrađena citatom.
Žive vakcine
Treća mogućnost za učinkovito ispoljavanje modificiranog amiloidogenog polipeptida na imuni sustav je korištenje tehnologije žive vakcine. Živom vakcinacijom je djelovano na imuni sustav davanjem životinji nepatogenih mikroorganizama koji su transformirani fragmentom nukleinske kiseline koja kodira modificirani amiloidogeni polipeptid ili s vektora koji sadrži takav fragment nukeinske kiseline. Pogodan nepatogeni mikroorganziam može biti bilo koja pogodna oslabljena bakterijska vrsta (oslabljena pasažom ili uklanjanjem patogenog produkta ekspresije tehnologijom rekombinantne DNA) npr. Mycobacterium bovis BCG., nepatogen Streptococcus spp., E. coli, Samonella spp., Vibrio Cholerae, Shigea itd. Pregledni radovi koji obrauju prirpavu živih vakcina prema dosadašnjim spoznajama mogu biti nađeni u Saliou P, 11995 Rev. Prat. 45: 1492-1496 i Waker PD, 1992, Vaccine 10: 977-990, ova ovdje ugrađena citatom. Za detalje o fragmentima nukleinskih kiselina i ovdje korištenih vektora u takvim živim vakcinama vidi donju diskusiju.
Kako alternativa živim bakterijskim vakcinama, fragmenti nukleinske kiseline mogu biti ugrađeni u neživu vakcinu s virusnim vektorom kao što je vrsta vakcine od bilo kojeg pogodnog pox virusa.
Normalno se nepatogeni mikroorganizam ili virus daje samo jedanput životinji, ali u nekim slučajevima može biti neophodno da se miokroorganizam da više od jedanput u životu, a da se održi zaštitna imunost. Čak je razmatrano da će imunizacijske sheme koje su detaljno prikazane gore za vakcinaciju polipeptidom biti korisne kad se koristi živa ili virusna vakcina.
Alternativno je živa ili virusna vakcinacija kombinirana s prethodnom ili sljedećom vakcinacijom polipeptidom i/ili nukleinskom kiselinom. Primjerice, moguće je da se izazove primarna imunizacija sa živom ili virusnom vakcinom koju slijedi ponovljena imunizacija korištenjem polipeptida ili nukleinske kiseline.
Mikroorganziam ili virus se može transformirati nukleinskom kiselinom (kiselinama) koja sadrži regiju koja kodira prvi, drugi i/ili treći segment, npr. u obliku imunomodulirajućih tvari koje su opisane gore, kao što je citokin koji je diskutiran kao koristan adjuvans. Preferirana verziji ove cjeline obuhvaća postojanje regije kodiranja za nalog i regiju kodiranja za imunomodulator u različitim otvorenim čitajućim okvirima ili barem da su kontrolirani različitim promotorima. Tako je izbjegnuto da se analog epitopa stvara kao partner za fuziju imunomodulatora. Alternativno se mogu koristiti dva različita nukleotidna fragmenta kao sredstva za transformiranja. Naravno, postojanje drugog i/ili trećeg segmenta u istim čitajućim okvirima može omogućiti ekpresiju produkta, analoga iz izuma i takva cjelina je posebno preferirana prema ovom izumu.
Korištenje metode iz izuma u tretmanu bolesti
Bit će razumljivo iz gornje diskusije da uvjeti metode iz izuma dozvoljavaju kontrolu bolesti karakteriziru depozicijom amiloida. U tom kontekstu AD je ključni cilj za inventivnu metodu, ali su također ostale bolesti karakterizirane depozicijom amiloida mogući ciljevi. Zato važna cjelina metode iz izuma za smanjivanje aktivnosti amiloida sadrži tretman i/ili prevenciju i/ili poboljšanje AD ili ostalih bolesti karakteriziranih depozicijom amiloida, a metoda sadrži smanjivanje amiloida prema metodi iz izuma do one mjere da je količina amiloida značajno smanjena.
Posebno je preferirano da smanjivanje amiloida ima kao rezultat inverziju balansa između tvorbe amiloida i degradacije/uklanjanja amiloida, tj. da je brzina degradacije/uklanjanja amiloida postala veća od brzine stvaranja. Pažljivom kontrolom broja imunološkog utjecaja imunizacije kod pojedinca koji za tim ima potrebu, bit će moguuće dobiti balans u vremenu čiji je rezultat ukupno smanjivanje depozita amiloida bez jakih nepoželjnih pojava.
Alternativno ako pojedina metoda iz izuma ne može smanjiti postojeće speozite amiloida, metoda iz izuma se može koristiti za dobivanje klinički značajnog smanjivanja tvorbe novog amiloida, i stog značajno produljivanje vremena u kojem bolesti onesposobljava. Trebalo bi biti moguće da se prati brzina depozicije amiloida bilo mjerenjem koncentracije amilopida u serumu (za što se vjeruje da je u ravnoteži s deponiranim materijalom), bilo korištenjem pozitron emisijske tomografije (PERT), cf. Small GW et al. 1996, Ann N Y Acad Sci 802: 80-78.
Ostale bolesti u stanja u kojem se ovaj način i ove metode mogu koristiti za tretman ili poboljšanje na analogan način su gore spomenut u "Dosadašnjim spoznajama" (sistemske smiloidoze, frontoalno-temporalna demencija s prionom povezan prijenosi spongiformni encefalitis) ili su dolje navedene u tijeku koje počinje s "ostale amiloidne bolesti i proteini s njima povezani".
Peptidi, polipeptidi i pripravci od njih u ovom izumu
Bit će očito iz gore izloženog da je ovaj izum zasnovan na konceptu imunizacije pojedinaca amilopgenoidnim antigenom da bi se indirektno dobila smanjena količina deponiranog amiloida povezanog s patologijom. Preferirani način dobivanja takve imunizacije je korištenje modificiranih verzija amilogenoidnog polipeptida, dakle molekula koje nisu bile prethodno poznate.
Vjeruje se da su modificirane molekule ovdje diskutirana nove sama po sebi, pa je stoga važan dio izuma koji se tiče analoga koji je izveden iz životinjskog amilogenoidnog polipeptida u koji je uvedena modifikacija koja ima rezultat imunizacije životinje s analogom koji izaziva stvaranje antitijela koji specifično reagiraju s nemodificiranim amilogenoidnim polipeptidom. Preferirano, priroda gore opisanih modifikacija odgovara tipu modifikacija opisanih gore kad su diskutirane razne cjeline metode iz izuma, a kada se koristi modificirani amilogenoidni polipeptid. Stoga je ovdje uključen bilo koji prikaz koji se tiče analoga amilogenoidnog polipeptida iz izuma i bilo koji prikazi koji se odnosi na mutatis mutandis opis tih analoga.
Valja napomenuti da preferirane modificirane amiloidogene molekule sadrže modifikacije koje kao rezultat imaju polipeptdid koji ima identičnost sekvencije od najmanje 70% s amilogenoidnim polipeptidom ili s njegovom podsekvencijom najmanju duljinu od 10 aminokiselina. Preferirane su veće identične sekvencije, npr. najmanje 75% ili najmanje 80, 85, 90 ili 95%. Identičnost sekvencija proteina i nukleinskih kiselina se može izračunati kao (Nref-Nraz)•100Nref, pri čemu je Nraz ukupni broj neidentičnih ostataka u dvjema uspoređenim sekvencijama, a Nref je broj aminokiselinskih ostataka u jednoj od sekvencija. Tako će DNA sekvencija AGTCAGTC imati identičnost od 75% sekvenciji AATCAATC (Nraz=2 i Nref=8).
Izum se također tiče pripravaka korisnih u primjeni metode iz izuma. Zato se izum također odnosi na imunogeni pripravak koji sadrži imunogeno učinkovitu količinu amilogenoidnog polipeptida koji je vlastiti protein u životinji, a rečeni amilogenoidnog polipeptida je formuliran skupa s imunološki prihvatljivim adjuvansom, tako da se razbije autotolerancija životinje prema amilogenoidnom polipeptidu, a pripravak nadalje sadrži farmaceutski i imunološki prihvatljivi razrjeđivač i/ili vehikul i/ili nosač i/ili ekcipijent. Drugim riječima, ovaj dio izuma odnosi se na formulacije prirodnih amilogenoidnih polipeptida koji su opisani u vezi s cjelinom koja je metoda po izumu.
Izum se također odnosi na imunogeni pripravak koji sadrži imunogeno učinkovitu količinu gore definiranog analoga, a rečeni pripravak nadalje sadrži farmaceutski i imunološki prihvatljivi razrjeđivač i/ili vehikul i/ili nosač i/ili ekscipijent i/ili adjuvans. Drugim riječima, ovaj dio izuma tiče se formulacija s modificiranog amiloidogenog polipeptida, u suštini kao što je ovdje opisano. Izbor adjuvansa, nosača i vehikula je prema ovom na liniji koja je gore diskutirana kada se pozivalo na formulaciju modificiranog i nemodificiranog amiloidogenog polipeptida za upotrebu u metodi izuma za smanjivanje amiloida.
Polipeptidi se pripravljaju prema metodama koje su dobro poznate u struci. Dulji polipeptidi se normalno pripravljaju tehnologijom rekombinanacije gena uključujući uvođenje sekvencije nukleinske kiseline koja kodira analog u pogodnom vektoru, transformacijom pogodne stanice domaćina s vektorom, ekspresijom sekvencije nukleinske kiseline, izolacijom produkta ekspresije iz stanice domaćina ili iz supernatanta njene kulture, te potom čišćenjem i mogućom daljnjom modifikacijom, npr. restruktuiranjem ili prevođenjem u derivate.
Kraći peptidi se preferirano pripravljaju prema dobro poznatim tehnikama sinteze peptida na krutoj ili tekućoj fazi. Međutim, nedavni napredak u toj tehnologiji vraća mogućnost priprave polipeptida pune duljine i proteina tim načinom, pa je stoga također unutar obujma ovog izuma u pripravi dugih građevnih jedinica sintetskom metodom.
Fragmenti nukleinske kiseline i vektori iz izuma
Bit će razumljivo iz gornjeg prikaza da se modificirani amiloidogeni polipeptidi mogu pripraviti tehnologijom rekombinantnog gena, ali također i kemijskom sintezom ili semisintezom; zadnje dvije mogućnosti su posebno važne kada se modifikacija sastoji od vezivanja na protein nosača (kao što je KHL, toksoid difterije, toksoid tetanusa i BSA) i neproteinske molekule kao što su polimeri ugljikovodika i naravno također kada modifikacija sadrži adiciju bočnog lanca ili bočne skupine na iz polipeptida derivirani peptidni lanac.
Za svrhe tehnologije rekombinantnog gena, i naravno također za svrhe imunizacije nukleinskom kiselinom, fragmenti nukleinske kiseline koji kodiraju modificirani amiloidogeni polipeptid su važni kemijski produkti. Zato se važan dio izuma odnosi na fragment nukleinske kiseline koja kodira analog amiloidogenog polipeptida, tj. polipeptid izveden od amiloidogenog polipeptida koji sadrži neutralnu sekvenciju kojoj je dodan i insertiran partner za fuziju, ili preferirano sadrži polipeptid izveden od amiloidogenog polipeptida u koji je uveden strani epitop za T-stanicu načinom insercije i/ili adicije, preferirano metodom supstitucije i/ili delecije. Fragmenti nukleinske kiseline iz izuma su DNA ili RNA fragmenti.
Fragmenti nukleinskih kiselina iz izuma će normalno biti insertirani u pogodne vektore za tvorbu vektora za kloniranje ili ekspresiju koji nose fragmente nukleinske kiseline iz izuma; takvi novi vektori su također dio izuma. Detalji koji se tiču konstrukcije tih vektora iz izuma će biti diskutirani dolje u kontekstu transformiranih stanica i mikroorganizmama. Vektor može, ovisno o svrsi i tipu aplikacije biti u obliku plazmida, faga, kosmida, mini-kromosoma ili virusa, ali također sama DNA koja je sam eksprimirana provremeno u nekim stanicama je važan vektor. Preferirano su vektori za kloniranje i ekspresiju iz izuma sposobni za autonomnu replikaciju, zato omogućuju veliki broj kopija za svrhe velike razine ekspresije ili velike razine replikacije za sljedeće kloniranje.
Općenito vektor iz izuma ima sljedeće karakteristike u 5'-3' smjeru i djelatnom mjestu vezivanja: promotor ekspresije fragmenta nukleinske kiseline iz izuma, koji može biti sekvencija nukleinske kiseline koja kodira vodeći peptid omogućava izlučivanje (u ekstracelularnu fazu ili gdje je primjenjljivo u periplazmu) ili integraciju u membranu polipeptidnog fragmenta, u fragment nukleinske kiseline iz izuma, te može i u nukleinsku kiselinu koja može kodirati terminator. Kada se operira s ekpresijskim vektorima u produkciji vrsta ili staničnih linija to je za svrhu genetske stabilnosti transfomianih stanica preferirano je da je vektor pri uvođenju u stanicu domaćina interiran u genom stanice. Nasuprot tome, kada se radi s vektroima koji će se koristiti za djelovanje in vivo ekspresije u životinji (tj. kada se koristi vektor DNA vakcine), zbog razloga siurnosti preferirano je da vektor ne može biti integriran u genom domaćina; tipično se koristi sama DNA ili neintegrirani virusni vektori, a izbor je dobro poznat stručnjacima.
Vektori iz izuma se koriste da transformiraju stanicu domaćina da se producira modificirani amiloidogeni polipeptida iz izuma. Takve transformirane stanice, koje su također dio izuma mogu biti kultivirane ili stanične linije korištene za propagaciju fragmenata nukeinskih kiselina i vektora iz izuma, ili se koriste za rekombinantnu produkciju modificiranih amiloidogenih polipeptida iz izuma. Alternativno, transformirane stanice mogu biti pogodne za žive vakcine u kojima je fragment nukleinske kiseline (jedna ili više kopija) insertirana tako da utječe na sekreciju ili interakciju u bakterijsku membranu ili stanični zid modificiranog amiloidogenog polipeptida.
Preferirane transformirane stanice iz izuma su mikroorganizmi kao bakterije (kao što su vrste Escherichia [npr. E. coli], Bacillus [npr. Bacius subtilis], Samonella ili Mycobacterium [preferirano nepatogene npr. M. bovis BC]), gljivice (kao što je Saccharomyces cerevisiae) i protozonas. Alternativno, transformirane stanice se izvode iz višestaničnih organizama kao što je kvasac, stanice insekta, stanice biljke ili stanice sisavca. Najpreferiranije su stanice dobivene od ljudi, cf. donju diskusiju o staničnim linijama i vektorima. Nedavni rezultati s pokazali veliku mogućnost upotrebe komercijalno pristupačne Drosophila melanogaster stanične linije (Schneider 2 (S2)stanična linija i vektorski sustav od Invitrogen) za rekombinantnu produkciju polipeptida u laboratoriju prijavitelja i stoga je taj ekspresijski sustav posebno preferiran.
Za svrhe kloniranja i/ili optimiziranja ekspresije preferirano je da su transformirane stanice sposobne za replikaciju fragmenta nukleinske kiseline iz izuma. Stanice koje eksprimiraju fragmente nukleinske kiseline su preferirana cjelina u ovom izumu i one mogu biti korištene za produkciju na malo i veliko modificiranog amiloidogenog polipeptida ili u slučaju nepatogenih bakterija, kao sastavni dio žive vakcine.
Kada se pripravljaju modificirane molekule iz izuma transformiranjem stanica, pogodno je, mada nije suštinski, da je ekspresijski produkt eksportiran u medij kulture ili je nađen na površini transformirane stanice.
Kada je identificirana stanica koja je učinkovit proizvođač, preferirano je da se na toj osnovi utvrdi stanična linija koja nosi vektor iz izuma i koja eksprimira fragment nukleinske kiseline koja kodira modificirani amiloidogeni polipeptid. Preferirano, ta stabilna stanična linija izlučuje ili nosi analog iz izuma, pa stoga olakšava njegovo pročišćavanje.
Općenito, vektori plazmida koji sadrže replikon i kontrolnu sekvenciju koji se izvodi iz vrsta kompatibilnim sa stanicama domaćina se koriste u vezi s domaćinima. Vektor obično sadrži mjesto replikacije kao i markirajuću sekvenciju koja je sposobna omogućiti fenotipsku selekciju u transformiranim stanicama. Primjerice, E. coli je tipično transformirana korištenjem pBR322 plazmida izvedenog iz vrste E. coli (vidi npr. Bolivar et al. 1977). Plazmid pBR322 sadrži gene za rezistenciju na ampicilin i tetraciklin i stoga je moguće lako identificiranje ransformiranih stanica. Plazmid pBR ili drugi plazmid ili fag mikroorganizma mora također sadržati ili biti modificiran da sadrži promotore koji se mogu koristiti prokariotski mikroorganizami za ekspresiju.
Ti promortori se najuobičajenije koriste pri konstrukciji rekombinantne DNA koja sadrži B-laktamazu (penicilinaza) i promotorni sustav laktoze (Chang et al., 1978, Itakura et al. 1977; Goeddel et al 1979) i sustav promotora triptofana (trp) (Goeddel et al. 1979; EP-A-0 036 776). Dok se navedeni najviše koriste, pronađeni su i korišteni drugi promotori iz mikroorganizama, a detalji koji se tiču njihovih nukleotidnih sekvencija su pubicirani, omogućujući stručnjacima da izvedu funkcionalnu ligaciju s plazmidnim vektorom (Siebwenlist et al. 1980). Neki geni prokariota se mogu eksprimirati učinkovito u E. coli iz njihove vlastite promotorske skevencije, a time otklanjaju potrebu za dodatnim ili drugim promotorom dobivenim na umjetni način.
Uz prokariote se također mogu koristiti eukatiotski mikroorgnanizmi, kao što su kulture kvasca, a tamo promotor mora imati sposobnost izvođenja ekspresije. Sacchatomyces cerevisiase ili obični pekarski kvasac se najčešće koriste među eukariotskom mikroorganizmima, mada stoje na raspolaganju brojne ostale vrste. Za ekspresiju Sacchatomyces se primjerice obično koristi plazmid YRp7 (Stinchcomb et al. 1979; Kingsman et al. 1979; Tschemper et al. 1980). Taj plazmid već sadrži trp1 gen koji omogućuje odabir markera za mutantnu vrstu kvasca kojoj nedostaje mogućnost rasta triptofana primjerice ATCC br 44076 ili PEP4-1 (Jones, 1977). Prisutnost trp1 lezije, kao karakteristike stanice domaćina kvasnog genoma, omogućuje zatim učinkovit okoliš za detekciju transformacije pri rastu u nedostatku triptofana.
Pogodne sekvencije za promociju u vektorima kvasca uključuju promotore za 3-fosfoglicerat kinaze (Hitzman et al. 19080) ili ostale glikolitičke enzime (Hess et al. 1968; Holland et al. 1978) kao što je enolaza, gliceraldhid-2-fosfat dehidrogenaza, heksokinaza, piruvat dekarboksilaza, fosfo-fruktokinaza, gukoza-6-fosfat izomeraza, 3-fosfoglicerat mutaza, piruvat kinaza, triozafosfat izomeraza, fosfoglukoza izomeraza i glukokinaza. U konstrukciji pogodnih ekspresijskih plazmida, terminacijska sekvencija povezana s tim genima je također podvrgnuta ligaciji u ekspresijski vektor 3’ sekvencije koja se želi eksprimirati, a da se dobije poliadenilacija mRNA i terminacija.
Ostali promotori koji imaju dodatnu prednost da su transkripcijski kontrolirani uvjetima rasta jesu regija koja promovira alkohol dehidrogenazu 2, izocitokrom C kiselu fosfatazu, degradativnie enzime povezane s metabolizmom dušika, te prije spomenutu gliceraldehid-3-fosfat dehidro-genazu i enzime odgovorne za upotrebu maltoze i galaktoze. Pogodan je bilo koji plazmidni vektor koji sadrži promotor koji je kompatibilan s kvascem, a koji potječe od replikacijskih i terminacijskih sekvencija.
Uz mikroorganizme, kulture stanica izvedene od višestaničnih organizama mogu također biti domaćini. U načelu, bilo koja takva stanična kultura se može koristiti, bilo iz kultura vertebrata ili evertebrata. Međutim, najveći je interes pokazan prema stanicama vertabrata, a progagacija vertebrata u kulturi (kultura tkiva) postala je rutinski postupak zadnjih godina (Tissue Culture 1973). Primjeri takvih korisnih staničnih linija domaćina su VERO i HeLa stanice, stanične linije ovarija kineskog zamorca (CHO), te W138, BHK, COS-7 293, Spodoptera frugiperda (SF) stanice (komercijalno pristupačne kao ekspresijski sustav od i.a. Protein Science, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, USA i iz Invitrogen), te MDCK stanične linije. U ovom izumu, posebne su preferirane stanične linije S2 od Invitrogen, PO Box 2312, 9704 CH Hroninen, Nizozemska.
Ekspresijski vektori za takve stanice obično uključuju (ako je potrebno) porijeklo replikacije, promotor smješten u prednjem dijelu gena koji će biti eksprimiran, skupa s bilo kojim neophodnim mjestom vezivanja ribosoma, RNA na mjestu izrezivanja introna, polidentilacijsko mjesto i sekvenciju transkripcijskog terminatora.
Za upotrebu u stanicama sisavaca, kontrolna funkcija ekspresijskih vektora često potječe od virusnog materijala. Primjerice, obično korišteni promotori se izvode od polioma, Adenovirusa 2, a najčešće Simian Virusa 40 (SC40). Rani i kasni promotori SV40 virusa su izuzetno korisni jer se oba dobivaju lako iz virusa kao fragment koji također sadrži replikaciju SV40 virusnog porijekla (Fiers et al. 1978). Manji ili veći SV40 fragmenti se također mogu koristiti s tim da je uključeno pribižno 250 bp sekvencija koja se proteže od HindIII mjesta prema BglI mjestu smještenom u replikatoru virusnog porijekla. Nadalje, također je moguće, a često je poželjno, koristiti promotor ili kontrolnu sekvenciju koja je normalno povezana s željenom genonskom sekvencijom, s tim da je takva kontrolna sekvencija kompatibilina sa sustavima stanice domaćina.
Do replikacije može doći zbog konstrukcijskog vektora koji je egzogenog porijekla, a takav se može izvesti iz SV40 ili ostalih virusa (npr. Polyoma, Adeno, VSV, BPV) ili može nastati replikacijskim mehanzimom kromosomske stanice. Ako je vektor ugrađen u kromosom stanice domaćina, potonji je često dovoljan.
Identifikacija korisnih analoga
Bit će jasno stručnjaku da nemaju sve moguće varijante ili modifikacije prirodnih amiloidogenih polipeptida sposobnost izdvojiti antitijela u životinjama koji su reaktivni s prirodnim oblikom. Međutim, nije teško postaviti učinkovit standard za pronalaženje modificiranih molekula koje zadovoljavaju minimalne zahtjeve za imunološku reaktivnost koja je ovdje diskutirana. Zato se još jedan dio izuma tiče metode za idnetifikaciju modiificiranog amiloidogenog polipeptida koji je sposoban inducirati antitijela na nemodificirani amiloidogeni polipeptid u životinjskim vrstama u kojima je nemodificirani amiloidogeni polipeptida (neimunogeni) vlastiti protein, a metoda sadrži:
- pripravu načinom peptidne sinteze ili tehnikom genetskog inženjerstva, skupine višestruko različitih modificiranih amiloidogenih polipeptida u kojima aminokiseline koje su uvedene adicijom, insercijom, uklonjene delecijom ili uvedene supstitucijom u aminokiselinsku sekvenciju amiloidogenog polipeptida životinjskih vrsta, čime raste sekvencija aminokiselina u skupini koja sadrži epitope T-stanice, koji su strani životinjskoj vrsti, ili pripravu skupine nukleinskih fragmenata koji kodiraju skupinu višestruko različitih modificiranih amiloidogenih polipeptida.
- testiranje članova skupine na njihovu sposobnost indukcije produkcije antitijela u životinjskim vrstama na nemodificirani amiloidogeni polipeptid, te
- identifikacija i moguća izolacija člana (Članova) iz skupine modificiranih amiloidogenog polipeptida koji značajno produkciju antitijela na nemodificirani amiloidogeni polipeptid u vrstama, ili identifikacija i moguća izolacija polipeptidnih ekspresijskih produkata koji kodiraju članove skupine fragmenata nukleinske kiseline što značajno inducira produkciju antitijela na nemodificirani amiloidogeni polipeptid u životinjskim vrstama.
U tom kontesktu, "skupina višestruko modificiranih amiloidogenih polipeptida" je skupina koja je npr. odabrana na osnovi gore diskutiranih kriterija (npr. u kombinaciji sa rezultatima cirkularnog dikroizma, NMR spektara i/ili difrakcije X-zraka). Skupina se može sastojati od samo nekoliko Članova, ali se razmatra da skupina može sadržavati nekoliko stotina članova.
Testirani članovi skupine se na kraju mogu ispoljiti u in vitro testovima primjenom koja sužuje broj modificiranih molekula koje mogu služiti za svrhu izuma.
Kako je cilj uvođenje stranih epitopa za T-stanicu da pojačaju odgovor B-stanice pomoću T-stanice, uvjet je da je proliferacija inducirana modificiranim amiloidogenim polipeptidom. Proliferacija T-stanice se može testirati standardiziranim in vitro testom proliferacije. Ukratko, uzorak obogaćen T-stanicama je dobiven od osoba i održavan je u kulturi. Kultivirane T-stanice su zaražene APC od osobe kojoj je prethodno modificirana molekula i procesuirana da ispolji njegove epitope za T-stanicu. Proliferacija T-stanica je praćena i uspoređena s pogodnom kontrolom (npr. T-stanice u kulturi zaražene APC koje su procesuirale nedirnuti prirodni amiloidogeni polipeptid). Alternativno, proliferacija se može mjeriti određivanjem koncentracije važnih citokina koji se oslobađaju iz T-stanica kao odgovor na njihovo prepoznavanje stalnih T-stanica.
Čini se vrlo vjerojatno da je najmanje jedan modificirani amiloidogeni polipeptid svakog tipa u stanju inducirati proizvodnju antitijela na amiloidogeni polipeptid, pa je moguće pripraviti imunogeni pripravak koji sadrži najmanje jedan modificirani amiloidogeni polipeptid koji je sposoban inducirati proizvodnju antitijela na nemodificiran amiloidogenog polipeptid u životinjskoj vrsti u kojemu je modificirani amiloidogeni polipeptid vlastiti protein, a metoda sadrži miješanje člana (članova) skupine koja značajno inducira produkciju antitijela u životinjskim vrstama koje su reaktvine s amiloidogenim polipeptidom s farmaceutski i imunološki prihvatljivim nosačem i/ili vehikulom i/ili razrjeđivačem i/ili ekcipijentom, a može u kombinaciji s najmanje jednim farmaceutski i imunološki prihvatljivim adjuvansom.
Gornji aspekti izuma tiču se testiranja skupina polipeptida koji se uobičajeno izvode pripremom brojnih višestruko različitih sekvencija nukleinskih kiselina ili vektora iz izuma, transformiranjem pogodnih stanica domaćina vektorima i ekspresijom sekvencija nukleinskih kiseline iz izuma. Ti koraci se mogu pratiti izolacijom ekspresijskig produkata. Preferirano je da se sekvencije nukleinske kiseline i/ili vektori, priprave metodama koje sadrže provođenje tehnike molekulske amplifikacije kao što je PCR ili sintezom nukleinskih kiselina.
Specifični ciljevi amiloidogena
Uz proteine APP, ApoE4 i Tau koji su najčešće povezivani s Alzheimerovom bolesti, postoji dugi popis ostalih proteina koji su na neki način povezani na AD, ili izravnom prisutnosti u plaku ili klupku AD mozga ili njihovom opaženom genetskom vezom s povećanim rizikom razvijanja AD. Većina, ako ne svi ti antigeni su zajedno s gore diskutiranim Aβ, APP, presenilinom i ApoE4 prihvaćeni ciljevi proteina u ovom izumu.
Alfa1-antikimotripsin (ACT) je glavna komponenta SP i ukazano je da ima važnu ulogu u patogenezi lezija u AD i cerebrovaskularnoj amiloidozi (CA) (Acta neuropatol, 1998, 96: 628-36). On stupa u interkaciju s Aβ in vitro i stimulira tvorbu i uklanjanje Aβ-42 fibrila (JBC, 1998, 273: 28360-4).
Alfa2-makroglobulin je nađen imunobojanjem u osnovi plaka u mozgu s AD, Transmembranski fragment iz beta podjedinice je nađen u osnovi plaka, dok je topljivi alfa fragment nađen vanstanično u plaku. Acta neuropatol, 1998, 96: 628-36 i Brain Res., 1997, 777: 223-227.
ABAD (Aβ-peptid vezan na alkohol dehidrogenazu) vezuje se s Aβ unutar stanice. Prisutan je neuronski enzim u normalnim stanicama, ali je prekomjerno eksprimiran u neuronima na koje djelije AD. Aβ je toksičniji prema stanicama koje prekomjerno eksprimiraju ABAD. ADAB je povezan na X-kromosom. Yan, 1997, Nature 389.
APLP-1 i -2 (amiloidni prekurson sličan proteinu 1 i 2): oba proteina pripadaju superobutilji proteina homologa APP. ali im nedostaje regija Aβ oeotida. Ipak, postoji značajno bojanje APLP u neuritičnom plaku. Acta Nueropatol, 1997, 94: 519-524.
AMY117 je novo otkriveni protein u lezija poput plaka u mozgovima ljudi s AD koji su jako zastupljeni, široko prošireni i "visoko specifični" u bolesti. Sumnja se da protein AMY117 može imati ključu ulogu u razvitku i napredovanju AD, a tvorbom tih plakova. Interesantno je da plakovi koji sadrže AMY117 nisu lokalizirani na istom mjestu s onima koji sadrže Aβ, čime definiraju novu karakterističnu manifestaciju Ad uz dobro poznate plakove koji sadrže Aβ i Tau klupka. AMY117 pozitivni plakovi su u velikom obujmu nađeni u mozgovima sporadičnih slučajeva AD i u mozgovima ljudi s Downovim sindromom, ali "rijetko ili ih nema" u mozgovima kontrole i ostalim neurodegenerativnim bolestima (Am. J. Patol 1997; 151:69, 80).
Bax: Momoklonalna antitijela su detektirala Bax kao komponentu senilnih plakova u mozgu s AD. On je također eksprimiran u distrofičnim neuritima. Acta Neuropatpl. 1998, 95: 407-412.
Uloga Bcl-2 nije jasna. Prekomjerno je ekprimiran u glialnim stanicama koje okružuju plakove. Acta Neuropatpl. 1998, 95: 407-412.
Bleomicin hidrolaza je vjerojatno beta sekretaza. Imunoraktivnost anti belomicin hidrolaze je nađena u SP u AD (Brain Res. 1999, 830: 200-202). Neki genotipovi bleomicin hidrolaze su povezani s povećanim rizikom razvitka AD u nekim slučajevima, dok u ostalim nije nađena korelacija (Ann Neurol, 1998, 44:808-811 i Ann Neurol, 1999, 46:136-137).
BRI/ABRI: ABRI je fragment pretpostavljenog transmembran-skog proteina od 4 kD, kodiran s BRI genom na kromosomu 13, nađen u amiloidnom plaku ljudi s familiarnom britanskom femencijom (FBD). Ti pacijenti imaju mutaciju u stop kodonu BRI gena koji stvara dulji otvoreni čitajući okvir. Oslobađanje 34 karboksi terminalnih aminokiselina promjenjenih proteina generira ABRI amiloisnu podjedinicu. Antitijela na ABRI prepoznaju oba parenhimalne i vaskularne leziju u mozgu pacijenata s FBD. ABri peptid je deponiran u obliku amiloidnih fibrila i za nastale plakove se smatra da vode disfunkciji neurona i demenciji karakterizirane s FBD (Vidal, R et al., 1999, Nature 339).
Kromogranin A je nađen u nekim difuznim amiloidnim depozitima i distrofičnim neuritima koji ih okružuju (Brain Res, 1991, 539: 143-50).
Clusterin/apoJ: Ovaj gen je često izoliran difericnjalnim probiranjem u laboratorijima iz različitih dijelova molekulske biologije, jer je prekomjerno ekprimiran u brojnim slučajevima degenerativnih bolesti kao što je AD i slinavka (Biochem J 1997 studeni 15;328():45-50 Michel D, Chaletain G, North S, Brum G).
Protein koji se vezuje na CRF (faktor koji oslobaa koritkotropin) se vezuje na CFR peptid od 41 aminokiseline koji je važan regulacijski faktor u odgovoru na stres u mozgu. Većina CRF je vezana CFR vezujućim proteinom, te uklanjanje CFR vezujućeg proteina (imunoterapijom) može voditi povećanju razine slobodnog CFR, a za koji se vjeruje da ima pozitivni efekt na AD. Behan, 1997, J. Neurochemistry, 68: 2053-2060.
EDTF (toksični faktor izveden od endotela): protein produciran od mikrokapilara kod pacijenata s AD. Posebno je toksičan prema neuronskim stanicama. WO 99/24468.
Proteiglikani hepran sulfata su prikazani dolje da se nalaze skupa s Aβ u SP. Istraživanja na štakorima pokazuju da je hepran sulfat glikosaminoglikan potreban za tvorbu amilodnih vlakana (Neuron, 1994, 12:219-234 i Acta neuropatol, 1998, 96:628-36).
Protein 2, mediator odgovora humanog kolapsina je protein od 65 kDa koji prepoznaje neurofibrilna klupka monoklonalnim antitijelima. Ugradnja u klupka može ukloniti topljive proteine i voditi abnormalnim neuritskom rastu i stoga ubrzavanju degeneracije neurona. JBC, 1998, 273: 9761-8.
Huntingtin (protein Huntingtonove bolesti): u HD, protein Huntingtonove bolesti je također nađen u NFT mozgovima s AD i Pivkovom bolesti (Exp. Neurol, 1998, 150:213-222).
ICAM-I je akumuliran u SP. Acta neuropatol, 1998, 96: 628-36 i Am. J. Patol. 1994, 144:104-16.
IL-6 je povezan s neurofibrilnim promjenana i nađen je u centru plaka. Predočeno je da potiče pojavu AD. Jako je pojačan astrocitima od aktivnih peptida 25-35 Aβ. Brain Res., 1997, 777: 223-227 i Behav Brain Res, 1996, 78:37-41.
Antigen CD68 povezan s liposomom je prepoznat od antitijela KP-1 u NFT i SP. Stoga liposomi mogu igrati ulogu u tvorbi klupka i plakova. Dement Geratr Cogn Disord, 1998, 9: 13-19.
P21 ras je obuhvaćen kao primarni korak u povećanju faktora rasta i metigena viđenih u ranim stupnjevima razvitka AD. Neuroecience, 1999, 91:1-5.
PLC-delta 1 (fosfolipaza C izoenzim delta 1) je abnormlano akumuliran u NFT i neuritima koji okružuju središte plaka. On je ekstraceleularan. Alzheimer Dis Assoc Disord, 1995, 9: 15-22.
Serum amiloidne P komponente (SAP) je normalni sastojak u plazmi koja je prisutna u svim tipovima amiloidnih depozita, uključujući one kod AD (JBC, 1995, 270: 26041-4). Opažen je u SP i NFT. U nekim Istraživanjima je pokazano da promovira agregaciju Aβ i sprječava proteolizu fibrila (Biochem Biophys Res Commun, 1995, 211: 349v-53 i PNAS, 1995, 92: 4299-4303) dok druga istraživanja pokazuju da SAP inhibira stvaranje Aβ fibrila (JBC, 1995, 270: 26041-4).
Sinpatofisin je detektiran u nekim difuznim amiloidnim depozitima i u distrofičnim neuritima koji ih okružuju (Brain Res, 1991, 539: 143-50).
Sinuklein (alfa-sinuklein ili NACP): Ne-A beta komponenta AD amiloida (NAC) je nađena biokemijski kao druga glavna komponenta amiloida, pročišćenog iz tkiva mozga pacijenata s AD. NAC, izveden od njegovog 140 aminokiselina dugog prekursora, NACP i je dug barem 35 aminokiselina (NAC35) mada njegova terminalna amino skupina nije Konačno određena. NAC monoklonalna antitijela imunološki boje SP u mozgovima s AD, ali ne reagiraju s NACP (Biochemistry 34 (32): 10139-10145 (kolovoz 15 1995) Iwai A, Yoshimoto M, Masliah E, Saitoh T). NAC stvaraju vlastite oligomere u prisutnosti Aβ. Novi dokazi ukazuju na moguću ulogu te molekule u simpatičkom oštećenju i neurotoksičnosti preko tvorbe fibrila poput amiloida i nefunkcioniranjem mitohodnrija. Brain Patol 1999 listopad; 9(4): 707-20. FEBS Lett, 1998, 421:73-76. Dio NACP ima visoki stupanj homologije s C-terminalnim amiloidnim fragmentom APP te u regiji proteinskog priona slinavke (PrPSC). Sinuklein je glavni faktor koji uzrokuje Parkinsonovu bolest (Chem Biol, 1995, 2: 163-9).
TGF-b1 (transformirajući faktor rasta b1): Prekomjer-na ekspresija TGF-b1 koja mutira APP u TG miševima ubrzava depoziciju Aβ. Stoga se za TGF-1 vjeruje da je obuhvaćen u inicijaciji i promociji tvorbe amiloidnog plaka (Wyss-Coraz, 1997, Nature 389).
Druge amiloidne bolesti i s njima povezani proteini
Uz gore spomenute proteine koji mogu biti obuhvaćeni u AD i bolestima poput AD (Hungtintonova, Parkinsonova bolesti, FBD i ostali oblici demencije) postoji relativno veliki broj bolesti koje nisu AD u kojima je tvorba amiloida obuhvaćena u pokretanju bolesti ili uzrokuje simptome bolesti. Mada proteini obuhvaćeni u tim bolestima variraju po načinu kojim dijele iste karakteristike koje definira amiloid, cf. gore. Sljedeća tablica nabraja brojne amiloidne poremećaje i proteina koji ih uzrokuju.
[image]
Ti proteini, kao i proteini obuhvaćeni u AD su potencijalni ciljevi za ovdje predloženu strategiju imunizacije.
Smatra se da većina metoda za imunizaciju na amiloidogene polipeptide treba biti ograničena na imunizaciju koja povećava antitijela koja su unakrsno reaktivna s prirodnim amiloidogenom polipeptidom. Ipak, u nekim slučajevima će biti od interesa inducirati staničnu imunost u obliku CTL odgovora na stanice koje ispoljuju MHC klasu I epitopa iz amiloidogenih polieptida - to može biti pogodno u slučajevima u kojima smanjivanje broja stanica koje produciraju amiloidogene polipeptide nema ozbiljni nepovoljni učinak. U takvim slučajevima u kojima su CTL odgovori poželjni, preferirano je korištenje prikaza aplikanata PCT/DK99/00525 (koji odgovara USSN 09/413, 186). Prikaz ti dvaju dokumenata je ovdje ugrađen citatom.
Sljedećim neograničavajući primjeri u usredotočeni na razvitak autovakcine protiv AD zasnovane na Aβ. Međutim, ovdje postavljen princip se odnosi na bilo koji amiloidni protein.
PRIMJER 1
Autovakcinacijski pristup za imunizaciju na AD
Činjenica da Aβ protein "knock out" miševa ne pokazuje abnormalnost ili nepogodni nuzefekt ukazuje da će uklanjanje ili smanjivanje količine Aβ biti sigurno, Zheng H, (1996).
Objavljeni eksperimenti, u kojima su transgenične životinje imunizirane na transgenični humani Aβ protein, pokazuju da ako je bilo moguće razbiti samotoleraciju, se može dobiti smanjivanje Aβ autorektivnim antitijelima. Ti eksperimenti nadalje ukazuju da bi tkvino smanjivanje Aβ potencijalno moglo spriječiti stvaranja plakova, te čak očistiti već stvorene Aβ plakove iz mozga, cf, Schenk et al. (1999). Ali, tradicionalno nije moguće povećati antitijela na vlastite proteine.
Publicirani rezultati ne pokazuju način razbijanja prave vlastite tolerancije prema vlastitim proteinima. Podaci ne prikazuju informacije kako osigurati da je imuna reakcija upućena samo ili uglavnom prema Aβ depozitima a ne prema prekursoru Aβ (APP) koji je vezan na stanični zid, a ako je to potrebno. Pretpostavlja se da će generirani imuni odgovor koji koristi postojeću tehnologiju generirati imuni odgovor na vlastite proteine na neregulirani način i značajna autoreaktivnosti prema dijelovima Aβ proteina može biti stvorena. Stoga će korištenjem strategija imunizacije biti najvjerojatnije onemogućeno generirati jake imune odgovore prema vlastitim proteinima i bit će nadalje nesigurno zbog moguće jake ukrštene reaktivnosti prema membranski vezanom APP koji je prisutan u velikom broju stanica CNS.
Ovaj izum prikazuje načine učinkovitog generiranja jakih reguliranih imunih odgovora prema pravom vlastitom proteinu koji može tvoriti plakove i uzrokovati ozbiljne bolesti u CNS ili ostalim dijelovima tijela. Sigurnost i učinkovitost terapijske vakcine humanog Aβ protein će se razviti korištenjem te tehnologije za tretman AD.
U svjetlu ovoga, moguće je pretpostaviti da AD, bolest za koju je predviđeno da će oštećivati zdravstveni sustav u sljedećem stoljeću, može biti liječena, ili barem da takve opisane vakcine mogu barem imati učinkovit terapijski pristup za tretman simptoma i progresiju bolesti.
Ta tehnika predstavlja potpuno novi imunološki pristup blokiranju amiloidnog depozita u AD kao i ostalim neurološkim bolestima.
U sljedećoj tablici pokazana su 35 razmatrana konstrukta. Svi položaju dani u tablici su relativno prema početnom metioninu u APP (prva aminokiseilna u SEQ ID NO: 2) i uključuje početnu i zadnju aminokiselinu, npr. 672-714 fragment uključuje obje aminokiseline 672 i 714. Početni i završni položaju za P2 i P30 pokazuju da je epitop supstituira dio APP fragmenta na navedenom položajima (oba položaja uključuju supstituciju) - u većini konstrukata uvedeni epitopi supstituiraju fragmente duljine epitopa. Zvjezdice u tablici imaju sljedeća značenja:
*) Samo jedan položaj P2 i P30 pokazuje da je epitop insertiran u derivat APP na pokazanim položajima (epitop počinje pokraj danog položaja C-terminalne aminokiseline)
*) Samo jedan položaj P2 i P30 pokazuje da je epitop insertiran u derivat APP na pokazanim položajima (epitop počinje pokraj danog položaja C-terminalne aminokiseline)
**) Konstrukcija 34 sadrži devet identičnih APP fragmenata odijeljenih naizmjenično s P30 i P2 epitopima.
***) Konstrukcija 35 sadrži devet identičnih APP fragmenata odijeljenih naizmjenično s P30 i P2 epitopima.
[image]
Dio APP na koji je najinteresantnije generirati odgovor je središnji peptidni Aβ od 43 aminokiseline (Aβ-43, odgovara SEQ ID NO:2, ostaci 672-714) koji je glavni sastojak amiloidnih plakova u mozgu s AD. Taj APP fragment je dio svih gore pokazanih konstrukata.
Varijante 1 i 2 sadrže dio APP uzvodno od Aβ-43 u kojem su smješteni modelni epitopi P2 i P30. Varijante 1 i 3-8 svi sadrže C-1000 fragment za koji je pokazano da je neurotoksičan - C-1000 fragment odgovara aminokiselinskim ostacima 714-770 u SEQ I NO: 2. U varijantama 3-5 epitopi supstituiraju dio fragmenta C-1000 dok su u varijantama 6-8 insertirani u C-100.
Varijante 9-35 sadrže središte Aβ-43 proteina. U varijantama 9-13, P2 i P30 su fuzionirani na bilo koji kraj Aβ-43; u 14-21 P2 i P30 supstituiraju dio Aβ-43; u 22-33 P2 i P30 su insertirani u Aβ-43; 34 sadrži tri identična Aβ-43 fragmenta razdvojena s P30 i P2; 35 sadrži 9 ponovljena Aβ-43 razdvojena naizmjenično s epitopima P2 i P30.
Za detalje vidi Sliku 1 i gornju tablicu.
Jedan daljnji tip konstrukata je posebno preferiran. Kako je jedan cilj ovog izuma izbjegavanje destrukcije stanica koje produciraju APP dok je uklanjanje Aβ poželjno, izgleda moguće pripraviti autovakcinski konstrukt koji sadrži samo dijelove Aβ koji nisu izloženi vanstaničnoj fazi, a kada su prisutni u APP. Stoga bi za takve konstrukte bilo potrebno da sadrže najmanje epitop B-stanice izveden iz aminokiselinskog fragmenta definiranog aminokiselinama 700-714 i SEQ ID NO:2.
Kako je za takve polipeptidne fragmente predviđene da budu slano imunogeni, preferirano je da takvni autovakcinski kronstrukti sadrže nekoliko kopija epitopa B-stanica, npr. u obliku konstrukata koji imaju strukturu pokazanu u Formuli I u detaljnom prikazu ovog izuma, cf. gore. U takvoj verziji Formule I, terminalni amiloide1-amiloidex su x epitopa B-stanice koji sadrži aminokiseline sekvencije izvedene iz aminokiselina 700-714 SEQ ID NO: 2. Preferirana alternativa je gore detaljno prikazana mogućnost vezanja amiloidogenog (poli)peptida i odabranog stranog epitopa T-pomoćne stanice preko amidne veze na polisaharidnu molekulu koja je nosač - na taj način višestruko ispoljavanje "slabog" epitopa načinjenog od aminokisleina 700-714 u SEQ ID NO; 2 postaje moguće, ali također postaje moguće odabrati optimalni omjer između epitopa B-stanica i T-stanica.
PRIMJER 2
Imunizacija transgeničnih miševa s Aβ i modificiranim proteinima prema izumu
Konstrukcija hAB43+-45 koja kodira DNA. hAB43+-45 gen je konstruiran u nekoliko koraka. Prvo, PCR fragment je generiran klicama ME#801 (SEQ ID NO: 10) i ME#802 (SEQ ID NO: 11) upotrebom klice ME#800 (SEQ ID NO: 9) kao templata. ME#800 kodira humani abeta-43 fragment s E.coli optimiziranim kodonima. ME#801 i 802 doprinosi odgovarajućim restrikcijskim mjestima fragmenta.
PCR fragmenti su pročišćeni, razgrađeni s NcoI i HindIII, pročišćeni ponovo i klonirani u NcoI-HindIII razgrađen i pročišćen pET28b+ E. coli ekspresijski vektor. Rezultirajući plazmid kodira divlji tip humanog Aβ-43 nazvan pAB1.
U sljedećm stupnju epitop pomoćne T-stanice je dodan na C-terminalni kraj molekule. Klica ME#806 (SEQ ID NO: 12) sadrži sekvenciju koja kodira epitop P2 i stoga generiraj fuziju P2 i Abeta-32 PCR reakcijom.
Kloniranje je izvedeno pripravom PCr fragmenata s klicama ME#178 (SEQ ID NO: 8) i ME#806 korištenjem pAB1 kao templata. Fragmenti su pročišćeni ponovo i klonirani u NcoI-HindIII razgrađenom i pročišćenom pET28b+ vektoru. Nastali plazmid se zove pAB2.
Na analogan način je pripravljen drugi plazmid koji sadrži Aβ-43 kodirajuću sekvenciju s drugim epitopom T-pomoćne stanice, P30, dodan na N-terminalni kraj. Na taj način je pripravljen PCR fragment s klicama ME#105 (SEQ ID NO: 7) i ME#807 (SEQ ID NO: 13) upotrebom pAB1 kao templata.
Fragment je pročišćen, razgraen s NcoI i HindIII, pročišćen ponovo i kloniran u NcoI-HindIII razgrađenim i pročišćenim pET28b+ vektorom. Nastali plazmid se zove pAB3.
U trećem koraku se drugi ponovljeni Aβ-43 dodano C-terminalnom epitopu P2 plazmida pAB2 klicom ME#809 (SEQ ID NO: 14). ME#809 istovremeno stvara BamHI mjesto odmah nakon ponovljeno Aβ-43. Fragment PCR je načinjen od klica ME#178 i ME#809 korištenjem pAB2 kao templata. Fragment je razgrađen s NcoI i HindIII, pročišćen i kloniran u NcoI-HindIII razgrađenim i pročišćenim pET28b+ vektorom. Nastali plazmid se zove pAB4.
Konačno, epitop P30 - Aβ-43 ponavljana sekvencija iz pAB3 je klonirana u pAB4 plazmid. To je izvedeno pripravom PCR fagmenata s klicama ME#811 (SEQ ID NO: 16) i ME#105 upotrebom pAB3 kao templata. Fragment je pročišćen i korišten kao klica u sljedećem PCR s ME#810 (SEQ ID NO: 15) upotrebom pAB3 kao templata. Nastali fragment je pročišćen, razgrađen s BamHI i HindIII i kloniran je u BamHI-HindIII razgraen i pročišćen pAB45 plazmid. Nastali plazmid, pAB5 kodira hAB43+-34 molekulu.
Svi PCR postupci kloniranja su izvedeni u osnovi kao što je opisano u Sambrook J,m Fritsch, E. F. & Maniatis, T. 1989 "Molecular cloning: a laboratory manual". 2 izd. Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.
Za sve postupke kloniranja su korištena E. coli K-12 stanice, vrsta Top-10 F' (Stratagene, USA). Vektor pET28b+ je kupljen od Novagen USA. Sve klice su sintetizirane na DNA Technology, Danska.
Ekspresija i pročišćavanje hAB43+-34. Protein hAB43+-34 koji kodira pAB5 je eksprimiran u BL21-Gold (Novagen) stanice E. coli kao što je opisano od dobavljača pET28b+ sustava (Novagen).
Eksprimirani protein hAB43+-34 je pročišćen na više od 85% čistoće pranjem inkluziskih tijela, a nakon kromatografije kationskom izmjenom korištenjem BioCard radne stanice za pročišćavanje (PerSeptive Biosystems, USA) u prisutnosti 6M uree. Urea je zatim uklonjena postupnom dijalizom u otopini koja sadrži smanjivajuću količinu uree. Konačni pufer je 10 mM Tris, pH 8.5.
Istraživanja imunizacije. Za Istraživanja su korišteni transgenični miševi za humani APP (proteinski Alzheimerov prekursor). Ti miševi, zvani TgRND8+, eksprimiraju mutirani oblik APP što rezultira visokom koncentracijom Aβ-40 i Aβ-42 u mišjem mozgu (Janus, C. et al.)
Miševi (8-10 miševa po skupini) su imunizirani s Abera-32 (SEQ ID NO: 2, ostaci 673-714, sintetizirani standardnom Fmoc strategijom) ili hAB32+-34 varijanta (konstrukt 34 u tablici u Primjeru 1, pripravljen rekombinatno) Četiri puta u intervalima od dva tjedna. Doze su 100 mg za Aβ ili 50 mg za hAM43+-34. miševima je uzeta krv dana 43 (nakon tri injekcije) i nakon dana 52 (nakon četiri injekcije) i serumi su korišteni za određivanje razine specifičnih titara na anti-Aβ-42, a upotrebom izravne ELISA.
Sljedeća tablica pokazuje srednju vrijednost anti Abeta-32 titara
[image]
Kao što će biti jasno, titar antitijela dobiven nakon imunizacije s hAB43+-34 varijantom približno je 4 i 7.5 puta veći nakon 3 i 4 imunizacija nego titrevi dobiveni kada se koristio nepromjenjeni divlji tip Aβ-42 kao imunogen. Ta činjenica se može sagledati sa strane, a kad se razmatra činjenica da je količina varijante korištena za imunizaciju samo 50% količine sekvencije divljeg tipa korištenog za imunizaciju.
PRIMJER 3
Sinteza kopolimerske vakcine Aβ peptida korištenjem aktiviranog poli-hidroksipolimera kao sredstva za umre_avanje.
Uvod. Tradicionalni konjugat vakcine sadrži (poli)peptid vezan kovalentno na proteinski nosač. Peptid sadrži eitop(e) B-stanice i proteinski nosač koji ima epitope T-pomoćnih stanica. Međutim, većina proteinskog nosača će normalno biti nevažna kao izvor epitopa T-pomoćnih stanica. Takvi epitopi mogu biti definirani i sintetizirani kao peptidi, npr. od 12-15 aminokiselina. Ako su ti peptidi povezani kovalentno na peptide koji sadrže epitope B-stanica, npr. preko viševalento aktiviranih poligidroksipolimeta, može se molekula vakcine koja sadrži samo važne dijelove. Dalje je moguće dobiti konjugat vakcine koji sadrži optimizirani omjer između epitopa B-stanica i T-stanica.
Sinteza aktiviranog poli-hidroksipolimera. Poli-hidroksipolimeri kao što je dektran, kukuruzni škrob, agaroza itd. se mogu aktivirati s 2,2,2-trifluoretan-sulfonilnim kloridom (tresilni klorid), homogenom sintezom (dektran), otopljeno u N-metilpirolidinonu (NMP) ili heterogenom sintezom (kukuruzni škrob, agaroza, umreženi dektran) u npr. acetonu.
225 mL bezvodnog N-metil-pirolidinona (NMP) je dodano u bezvodnim uvjetima u vodi topljivi dekstran dobiven liofilizacijom (4,5 g, 83 mmol, klinička čistoća, prosječne Mr 78000) u tikvici od 500 mL s okruglim dnom snabdjevene magnetom za miješanje. Tikvica je smještena u uljnu kupelj od 60 °C s magnetskim miješanjem. Temperatura je povišena na 92 °C u periodu od 20 minuta. Kada je dekstran otopljen, tikvica je odmah uklonjena iz uljne kupelji i temperatura kupelji je spuštena na 40 °C. Tikvica je smještena ponovo u uljnu kupelj uz magnetsko miješanjem te je dokapavan tresil-klorid (2.764 mL, 25 mmol). Tikvica je uklonjena iz uljne kupelji i miješana 1 sat pri sobnoj temperaturi. Produkt (Tresil Aktivirani Dekstran, TAD) je taložen u 1200 mL hladnog etanola (99.9%). Supernatant je dekantiran i talog je sakuljen u 50 mL polipropilenskim epruvetama centrifugiranjem pri 2000 rpi. Talog je otopljen u 50 mL 0.5% octenoj kiselini, dijaliziran 2 puta s 5000 mL 0.5% octenom kiselinom, te je liofiliziran. TAD se može čuvati kao liofilizirani prašak pri -20 °C.
Netopljivi polihidroksipolimer, kao što je agaroza ili umreženi dekstran može biti aktiviran tresilom pripravom suspenzije poli-hidroksipolimera u npr. acetonu i izvođenjem sinteze kao što je sinteza na čvrstoj fazi. Aktivirani poli-hidroksipolimer se može sakupiti filtracijom. Pogodne metode su prikazane u npr. Nilsson K i Mosbach K (1987), Methods in Enzymology 135, str. 67 u Hermasson GT et al. (1992) u "Immobilized Affinity Ligans Techniques", Accademic Press, Inc., str. 87.
Sinteza kopolimernih vakcina s A beta peptidom. TAD (10 mg) je otopljen u 100 μL H2O i 1000 μL karbonatnog pufera pH 9.6 koji sadrži 5 mg Aβ-42 (SEQ ID NO: 2, ostaci 673-714), 2.5 mg P2 (SEQ ID NO: 4) te je dodano 2.5 mg P30 (SEQ ID NO: 6). Pepptidi Aβ-42, P2 i P30 sadrže zaštićene lizinske skupine: oni su u obliku 1-(4,4-dimetil-2,6-dioskociklohek-1-iliden)etilnih (Dde) zaštićenih lizinskih skupina. Peptidi su pripravljeni standardnom Fmoc strategijom, u kojoj je konvencionalni Fmoc-Lys(Boc)-OH supstituiran s Fmoc-Lys(Dde)-OH (dobiven od Novabiochem, kat br. 04-12-1121) tj. �-amino skupina u lizinu je zaštićena s Dde umjesto Boc.
Vrijednost pH je mjerena i podešena na 9.6 korištenjem 1 M HCl. Nakon 2.5 sata pri sobnoj temperaturi, dodano je toliko 80% hidrazin da Konačna koncetracija hirazina bude 8% i otopina je inkubirana još 30 minuta. Liofilizirani produkt je otopljen u H2O i dijaliziran intenzivno s H2O prije Konačne liofilizacije.
Omjer između epitopa B-stanice (Aβ) i epitopa T-pomoćnih stanica (P2 i P30) u Konačnom produktu se može mijenjati korištenjem različitih koncentracija tih peptida u koraku sinteze. Nadalje, Konačni produkt se može obilježiti s npr., manozom (tako da cilja konjugat na APC) dodatkom aminirane manoze u karbonatnom puferu u koraku sinteze.
Ako se koristi netopljivi aktivirani poli-hidroksipolimer za spajanje peptida koji sadrži epitop B-stanice i epitopi T-pomoćnih stanica, vezanje na polimer se može izvesti kao sinteza na čvrstoj fazi, a končani produkt je sakupljen čišćen pranjem i filtracijom.
POPIS REFERENCIJA
Brookmeyer, R.; Gray, S.; Kawas, C. (1998). Projections of Alzheirrer's Disease in the United States and the Public Health Impact of Delaying Disease Onset. American Journal of Public Health, 88 (9), 1337-1342.
Buttini, M.; Orth, M.; Bellosta, S.; Akeefe, H.; Pitas, R.E.; Wyss.-Coray, T. ; Mucke, L.; Mahley, R.W. (1999). Expression of Human Apolipoprotein E3 or E4 in the Brains of Apoe-/- Mice: Isoform-Specific Effects on Neurodegeneration. Journal of Neuroscience, 19, 4867-4880.
Clark, L.N.; Poorkaj, P.; Wszolek, Z.; Geschwind, D.H.; Nasreddine, Z.S.; Miiler, B.; Li, D.; Payami, fl.; Awert, F.; Markopoulou, K.; Andreadis, A.; D'Souza, I.; Lee, V.M.; Reed, L.; Trojanowski, J.Q.; Zhukareva, V.; Bird, T.; Schelienberg, G.; Wilhelmsenf K.C. (1998). Pathogenic Implications of Mutations in the Tau Gene in Pallido-Ponto-Nigral Degeneration and Related Neurodegenerative Disorders Linked to Chromosome 17. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 95(22), 13103-13107.
Gupta, R. K. et. al. (1998), Dev Biol Stand. 92: 63-78.
Hsiao K. et al. (1998) Transgenic mice expressing Alzheimer ainyloid precursor proteins", Exp. Gerontol. 33 (7-8), 883-889
Hutton, M.; Lendon, C.L.; Rizzu, P.; Baker, M.; Froelich, S.7 Houlden, H.; Pickering-Brown, S.; Chakraverty, S.; Isaacs, A.; Grover, A.; Hackett, J.; Adamson, J.; Lincoln, S.; Dickson, D.; Davies, P.; Petersen, R.C.; Stevens, M.; de Graaff, E.; Wauters, E.; van Baren, J.; Hillebrand, M.; Joosse, M.; Kwon, J.M.; Nowotny, P.; Che, L.K.; Norton, J.; Morris, J.C.; Reed, L.E.; Trojanowski, J.; Basun, H.; Lannfelt, L.; Neystat, M.; Fahn, S.; Dark, F.; Tannenberg, T.; Dodd, P.; Hayward, N.; Kwok, J.B.J.; Schofield, P.R.; Andreadis, A.; Snowden, J.; Craufurd, D.; Neary, D.; Owen, F.; Oostra, B.A.; Hardy, J.; Goate, A.; van Swieten, J.; Mann, D.; Lynch, T.; Heutink, P. (1998). Association of Missense and 5'- Splice-Site Mutations in Tau with the Inherited Dementia FTDP-17. Nature, 393, 702-705.
Janus, C. et. al. (2000), Nature 408: 979 - 982.
Kas, H.S. (1997) J Microencapsul 14: 689-711.
Leon, J.; Cheng, C.K.; Neumann, P.J. (1998). Alzheimer's Disease Care: Costs and Potential Savings. Health Affairs, 17(6), 206-216.
Lippa C. F. et al. (1998) Ab-42 deposition precedes other changes in PS-1 Alzheimer's disease. Lancet 352, 1117-1118.
Luo, J.-J.; Wallace, W.; Riccioni, T.; Ingram, D.K.; Roth, G.S.; Kusiak, J.W. (1999). Death of PC12 Cells and Hippocampal Neurons Induced by Adenoviral-Mediated FAD Human Amyloid Precursor Protein Gene Expression. Journal of Neuroscience Research, 55(5), 629-642.
Naruse, S.; Thinakaran, G.; Luo, J.-J.; Kusiak, J.W.; Tomita, T.; lwatsubo, T.; Qian, X.; Ginty, D.D.; Price, D.L.; Borchelt, D.R.; Wong, P.C.; Sisodia, S.S. (1998). Effects of PS1 Deficiency on Mernbrane Protein Trafficking in Neurons. Neuron, 21(5), 1213-1231.
National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999, NIH Publication No. 99- 4664.
Pietrobon, P.J. (1995), Pharm Biotechnol. 6: 347-61. Poorkaj, P.; Bird, T.D.; Wijsman, E.; Nemens, E.; Garruto, R.M.; Anderson, L.; Andreadis, A.; Wiederhold, W.C.; Raskind, M.; Schellenberg, G.D. (1998). Tau is a Candidate Gene for Chromosome 17 Frontotemporal Dementia. Annals of Neurology, 43, 815-825.
Schenk, D.; Barbour, R.; Dunn, W.; Gordon, G.; Grajeda, H.; Guido, T.; Hu, K.; Huang, J.; Johnson-Wood, K.; Khan, K.; Kholodenko, D.; Lee, M.; Liao, Z.; Lieberburg, I.; Motter, R.; Mutter, L.; Soriano, F.; Shopp, G.; Vasquez, N.; Vandevert, C.; Walker, S.; Wogulis, M.; Yednock, T.; Games, D.; Seubert, P. (1999). Immunization with A-beta Attenuates Alzheimer's Disease-Like Pathology in the PDAPP Mouse. Nature, 400(6740), 173-177.
Shekunov, B. et. al. (1999), J. Crystal Growth 198/199: 1345 - 1351.
Spillantini, M.G.; Murrell, J.R.; Goedert, M.; Farlow, M.R.; Klug, A.; Ghetti, B. (1998). Mutation in the Tau Gene in Familial Multiple System Tauopathy with Presenile Dementia. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 95(13), 7737-7741.
Strittmatter, W.J.; Saunders, A.M.; Schmechel, D.; Pericak-Vance, M.; Enghild, J.; Salvesen, G-S.; Roses, A.D. (1993). Apolipoprotein E: High-Avidity Binding to Aβ and Increased Frequency of Type 4 Allele in Late-Onset Familial Alzheimer Disease. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 90,1977-1981.
Vidal, R.; Frangione, B.; Rostagno, A.; Mead, S.; Revesz, T.; Plant, G.; Ghiso, J. (1999). A Stop-Codon Mutation in the BRI Gene Associated with Familial British Dementia. Nature, 399: 776-781.
Zheng H. (1996) "Mice deficient for the amyloid precursor protein gene. Ann. N Y Acad. Sci., 777, 421-426.
York, P. (1999), PSTT 11: 430-440.

Claims (45)

1. Metoda in vivo smanjivanja aktivnosti proteinskog autolognog beta amiloida (Aβ) ili proteinskog amiloidnog prekursora (APP) kod životinja, uključujući ljude, a metoda sadrži djelovanje na ispoljavanje životinjskog imunog sustava s imunološki učinkovitom količinom barem jednog analoga životinjskih analoga Aβ ili APP, naznačeno time da je uveden barem jedan izolirani epitop za T pomoćnu stanicu (TH epitop) pomoću insercije, adicije, delecije ili supstitucije, ili zasebnim povezivanjem TH epitopa i peptidne sekvencije izvedene od peptidnog Aβ ili APP na nosač s polihidroksipolimernim skeletom, a tako da imunizacija životinje s analogom inducira produkciju antitijela na autologni Aβ ili autologni APP u životinji, pri čemu je strani TH epitop uveden u Aβ ili APP kao što je shematski prikazano za epitope P2 i P30 na Slici 1, ili pri čemu je TH epitop povezan na nosač s polihidroksipolimernim skeletom, a koji također nosi peptidnu sekvenciju izvedenu od Aβ ili APP.
2. Metoda prema patentnom zahtjevu 1, naznačeno time da uvođenjem zadržan epitop B-stanice od Aβ ili APP, te da je - uveden najmanje jednan prvi segment koji djeluje usmjeravanjem modificirane molekule na stanicu koja ispoljava antigen (APC), i/ili - uveden barem jednan drugi segment koji stimulira imuni sustav, i/ili - uveden barem jedan treći segmenta koji optimizira ispoljavanje modificranog amiloidogenog polipeptida na imuni sustav.
3. Metoda prema patentnom zahtjevu 2, naznačeno time da je analog modificiran uvođenjem bočne skupine, a kovalentnim ili nekovalentnim vezivanjem pogodne kemijske skupine u Aβ, APP ili njegovu podsekvenciju, prvog i/ili drugog i/ili trećeg segmenta.
4. Metoda prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahtjeva, naznačeno time da uvođenje aminokiselinske supstitucije i/ili delecije i/ili insercije i/ili adicije ima za rezultat uveliko zadržavanja ukupne tercijarne strukture amiloidogenog polipeptida.
5. Metoda prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahtjeva, naznačeno time da analog uključuje udvostručenje najmanje jednog epitopa za B-stanicu amiloidogenog polieptida i/ili uvođenje haptena.
6. Metoda prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahtjeva, naznačeno time da je strani epitop za T-stanicu imunodominantan u životinji.
7. Metoda prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahtjeva, naznačeno time da je epitop za T-stanicu relaksirane specifičnosti, kao što je strani epitop za T-stanicu odabran od prirodnog epitopa za T-stanicu relaksirane specifičnosti ili od sintetske peptidne sekvencije koja se vezuje na MHC-II.
8. Metoda prema patentnom zahtjevu 7, naznačeno time da je prirodni epitop za T-stanicu odabran od sljedećih: epitop toksoida tetanusa kao što je P2 ili P30, epitop toksoida difterije, hemaglutininski epitop virusa influencije, te CS epitop P. faciparum.
9. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 2-8, naznačeno time da je prvi segment specifičan partner za vezivanje na antigen B-limfocita specifične površine ili antigen APC specifične površine kao što je hapten ili ugljikohidrat za koji postoji receptor na B-limfocitu ili na APC.
10. Metoda prema patentnim zahtjevima 2-9, naznačeno time da je drugi segment odabran od citokina kao što je interferon γ (IFN-γ) ili njegovog učinkovitog dijela, Flt3L ili njegovog učinkovitog dijela, interleukina 1 (IL-1) ili njegovog učinkovitog dijela, interleukina 2 (IL-2) ili njegovog učinkovitog dijela, interleukina 4 (IL-4) ili njegovog učinkovitog dijela, interleukina 6 (IL-6) ili njegovog učinkovitog dijela, interleukina 12 (IL-12) ili njegovog učinkovitog dijela, interleukina 13 (IL-13) ili njegovog učinkovitog dijela, interleukina 15 (IL-15) ili njegovog učinkovitog dijela, te stimulirajućeg faktora kolonije granulacitnog makrofaga (GM-CSF) ili njegovog učinkovitog dijela; hormona; te proteina podvrgnutog toplinskom šoku kao što je HSP70 ili njegovog učinkovitog dijela, HSP90 ili njegovog učinkovitog dijela, HSC70 ili njegovog učinkovitog dijela, GRP94 ili njegovog učinkovitog dijela, te kalretikulina (CRT) ili njegovog učinkovitog dijela.
11. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 2-10, naznačeno time da je treći segment lipidne prirode, kao što je palmitoilna skupina, miristilna skupina, farnezilna skupina, geranil-geraniolna skupina, GPI-sidro, te N-acil-digliceridna skupina, ili dsa je treći segment polihidroksipolimer kao što je polisaharid.
12. Metoda prema patentnom zahtjevu 11, naznačeno time da da polisaharid služi kao skelet nosača na koji su odvojeno vezani peptid izveden od Aβ ili APP i epitop za stranu T-stanicu.
13. Metoda prema patentnom zahtjevu 11, naznačeno time da su peptid izveden od Aβ ili APP i epitop za stranu T-stanicu vezani amidnom vezom na polisaharid.
14. Metoda prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahtjeva, naznačeno time da je autologni Aβ ili APP modificiran tako da se sačuvaju epitop B-stanice koji nisu izloženi vanstaničnoj fazi, a kada su prisutni u obliku autolognog APP koji se vezuje na stanicu.
15. Metoda prema patentnom zahtjevu 14, naznačeno time da amiloidogeni polipeptid modificiran tako da mu nedostaje najmanje jedan epitop B-stanice koji je izložen vanstaničnoj fazi, a kada su prisutan u obliku autolognog APP koji se vezuje na stanicu.
16. Metoda prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahtjeva, naznačeno time da sadrži barem jednu supstituciju najmanje jedne aminokiselinske sekvencije unutar autolognog Aβ ili APP s aminokiselinskom sekvencijuom jednake ili različite duljine kojom se povećava strani TH epitop u analogu.
17. Metoda prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahtjeva, naznačeno time da analog sadrži aminokiselinsku sekveniju koja odgovara aminokiselinama 672-714 u SEQ ID NO: 2, pri čemu je insertirana aminokiselinska sekvencija čime se povećava strani TH epitop u analogu, ili pri čemu analog sadrži aminokiselinsku sekveniju koja odgovara aminokiseli-nama 672-714 u SEQ ID NO: 2, pri čemu je sekvencija supstituirana aminokiselinskom sekvencijom iste ili različite duljine tako da se povećava strani TH epitop u analogu.
18. Metoda prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahtjeva, naznačeno time da je ispoljavanje na imuni sustav postignuto postojanjem barem dvije kopije polipeptidnog analoga kovalentno ili nekovalnetno vezanih na molekulu nosača koja je sposobna utjecati na ispoljavanje višestukih kopija antigenskih determinanata.
19. Upotreba prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahtjeva, naznačeno time da je analog formuliran s adjuvansom koji olakšava razbijanje autotolerancije na autoantigene.
20. Metoda prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahtjeva, naznačeno time da je učinkovita količina polipeptidnog analoga dana životinji na način koji je odabran od sljedećih: parenteralanim putem, kao što je intradermalno, subdermalno, intrakutalno, subkutalno, intramuskuarnim putem; peritonalnim putem; oralnim putem; buklalnim putem; sublingvalnim putem; epiduralnim putem; spinalnim putem; analnim putem;te intrakranialnim putem.
21. Metoda prema patentnom zahtjevu 20, naznačeno time da učinkovita količina iznosi između 0.5 μg i 2000 μg analoga.
22. Metoda prema patentnom zahtjevu 20 ili 21, naznačeno time da je analog sadržan u napravi koja je virtualni limfni čvor (VLN).
23. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 1-17, naznačeno time da na ispoljavanje modificiranog amiloidnog polipepitda ili modificiranog amiloidnog polipeptida na imuni sustav utječe uvođenje nukleinske kiseline (kiselina) koja kodira analog u životinjskim stanicama i čime je dobivena in vivo ekspresija u stanicama u koje je uvedena nukleinska kiselina (kiseline).
24. Metoda prema patentnom zahtjevu 23, naznačeno time da je/jesu uvedena nukleinska kiselina (kiseline) odabrana od sljedećih: sama DNA, DNA formulirana s nabijenim ili nenabijenim lipidima, DNA formulirana u liposomima, DNA uključena u virusni vektor, DNA formulirana s proteinom ili polipeptidom koji olakšavju transfekciju, DNA formulirana s cijnim proteinom ili polipeptidom, DNA formulirana sa sredstvom koje taloži kalcij, DNA formuirana sa sredstvom za taloženje kalcija, DNA vezana na inertrnu molekulu koja je nosač, DNA kapsuliranu hitinu ili hitosanu, te DNA formuliranu s adjuvansom.
25. Metoda prema patentnom zahtjevu 24, naznačeno time da je/jesu nukleinska kiselina sadržana u VLN napravi.
26. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 20-25, naznačeno time da uključuje najmanje jedno davanje/ uvođenje analoga godišnje, kao što je najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, te najmanje 12 davanja/uvođenja godišnje.
27. Metoda tretmana i/ili prevencije i/ili poboljšanja Alzheimerove bolesti ili ostalih bolesti i stanja karakteriziranih depozicijom Aβ, naznačeno time da metoda sadrži smanjivanje Aβ ili APP prema metodi iz bio kojeg patentnog zahtjeva od 1-26 do te mjere da je ukupna količina amiloida smanjena ili da je brzina tvorbe amiloida smanjena toliko da je klinički signifikantno.
28. Analog amiloidnog polipeptida koji je izveden iz životinjskog Aβ ili APP, naznačeno time da uveden barem jedn izolirani strani TH epitop kao što je shematski prikazano na P2 i P30 na Slici 1, ili pri čemu je barem jedan stani TH epitop povezan na polihidroksipolimenrni skelet koji također nosi peptidnu sekvenciju izvedenu od Aβ ili APP, tako da imunozacija životinje s analogom inducira produkciju antitijela na amiloidogeni polipepitd.
29. Analog prema patentnom zahtjevu 28, naznačeno time da je modifikacija ista kao što je definirano u bio kojem patentnom zahtjevu 2-17.
30. Imunogeni pripravak, naznačeno time da sadrži imunogeno učinkovitu količinu analoga prema patentnom zahtjevu 28 ili 29, a pripravak nadalje sadrži farmaceutski i imunološki prihvatlj nosač i/ili vehikul, a može i adjuvans.
31. Fragment nukleinske kiseline, naznačeno time da kodira analog prema patetnom zahtjevu 28 ili 29.
32. Vektor, naznačeno time da nosi fragment nukleinske kiseline prema patetnom zahtjevu 31, kao što je vektor koji je sposoban za autonomnu replikaciju.
33. Vektor prema patentnom zahtjevu 32, naznačeno time da je odabran iz sljedeće skupine: pazmid, fag, kosmid, mini-kromosom, te virus.
34. Vektor prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 32 ili 33, naznačeno time da u 5'�3' smjeru i u djelatnom mjestu vezivanja sadrži promotor za upravljanje ekspresijom fragmenta nukleinske kiseline prema patentnom zahtjevu 31, može sadržavati sekvenciju nukleinske kiseline koja kodira vodeći peptid omogućujući izlučivanje ili integraciju u membranu polipetidnog fragmenta, fragment nukleinske kiseline prema zahtjevu 38, a može sadržavati i terminator.
35. Vektor prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 32-34, naznačeno time da je pri uvođenju u stanicu domaćina sposoban ili nije sposoban biti integriran u genom stanice domaćina.
36. Vektor prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 34 ili 35, naznačeno time da promotor upravlja ekspresijom u stanici eukariota i/ili u stanici prokariota.
37. Transformirana stanica, naznačeno time da nosi vektor iz bilo kojeg od zahtjeva 32-36, kao što je tranformirana stanica koja je sposobna replicirati fragement nukleinske kiseline prema zahtjevu 31.
38. Transformirana stanica prema patentnom zahtjevu 37, naznačeno time da je mikroorganizam odabran od sljedećih: bakterija, kvasna gljivica, protozoa ili stanica izvedena iz višestaničnog organizma koji je odabran od sljedećih: gljivice, stanica insekta kao što je S2 ili SF stanica, stanica biljke i stanica sisavca.
39. Transformirana stanica prema patentnom zahtjevu 37 ili 38, naznačeno time da eksprimira fragment nukleinske kiseline prema patentnom zahtjevu 31, kao što je transformirana stanica koja na svojoj površini izlučuje ili nosi analog prema patentnom zahtjevu 28 ili 29.
40. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 1-17, naznačeno time da se na ispoljavanje imunog sustava utječe davanjem nepatogenih miroorganizama ili virusa koji nose fargment nukleinske kiseline koja kodira i eksprimira analog.
41. Pripravak za indukciju produkcije antitijela na Aβ ili APP, naznačeno time da pripravak sadrži: - fragment nukleinske kiseline prema zahtjevu 31 ili vektor prema bilo kojem od zahtjeva od 32-36, te - farmaceutski i imunološki prihvatljiv nosač i/ili vehikul i/ili adjuvans.
42. Stabilna stanična linija koja nosi vektor prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 32-36, naznačeno time da eksprimira fragemnt nukleinske kiseline prema zahtjevu 31, te koja može lučiti ili nositi na površini analog prema patentnom zahtjevu 33 ili 34.
43. Metoda za pripravu stanica prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 37-39, naznačeno time da metoda sadrži transformirnje stanice domaćina s fragmentom nukleinske kiseline prema patentnom zahtjevu 31 ili s vektrom prema bio kojem od patentnih zahtjeva 32-36.
44. Korištenje analoga prema patentnom zahtjevu 28 ili 29, naznačeno time da je za pripravu imunogenog pripravka, koji može sadržavati adjuvans za smanjivanje amiloida u životinji.
45. Korištenje analoga prema patentnom zahtjevu 28 ili 29, naznačeno time da je za pripravu imunogenog pripravka, koji može salzheimerove bolesti ili ostalih stanja karakteriziranih depozicijom amiloida.
HR20020721A 2000-02-21 2002-09-03 Metoda smanjivanja aktivnosti amiloida HRP20020721B1 (hr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200000265 2000-02-21
US18629500P 2000-03-01 2000-03-01
PCT/DK2001/000113 WO2001062284A2 (en) 2000-02-21 2001-02-19 Novel method for down-regulation of amyloid

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HRP20020721A2 true HRP20020721A2 (en) 2005-04-30
HRP20020721B1 HRP20020721B1 (hr) 2012-04-30

Family

ID=26068772

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HR20020721A HRP20020721B1 (hr) 2000-02-21 2002-09-03 Metoda smanjivanja aktivnosti amiloida

Country Status (7)

Country Link
US (2) US7135181B2 (hr)
KR (2) KR100879810B1 (hr)
AU (1) AU783144B2 (hr)
CA (1) CA2400838C (hr)
CZ (1) CZ20022748A3 (hr)
HR (1) HRP20020721B1 (hr)
MX (1) MXPA02007796A (hr)

Families Citing this family (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6750324B1 (en) 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
US7790856B2 (en) 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US20080050367A1 (en) 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6905686B1 (en) 1997-12-02 2005-06-14 Neuralab Limited Active immunization for treatment of alzheimer's disease
US6761888B1 (en) 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US6787523B1 (en) 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US6913745B1 (en) 1997-12-02 2005-07-05 Neuralab Limited Passive immunization of Alzheimer's disease
US7799535B1 (en) 1997-12-09 2010-09-21 Arch Development Corporation Methods for identifying factors that control the folding of amyloid proteins of diverse origin
US20030147882A1 (en) 1998-05-21 2003-08-07 Alan Solomon Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
US6787637B1 (en) 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
US6689753B1 (en) * 1999-11-05 2004-02-10 Axonyx, Inc. β sheet breaker peptide analogs that inhibit β pleated sheet formation in amyloid β-peptide
KR100879810B1 (ko) * 2000-02-21 2009-01-22 하. 룬드벡 아크티에셀스카브 아밀로이드의 하향-조절을 위한 신규한 방법
WO2001062284A2 (en) * 2000-02-21 2001-08-30 Pharmexa A/S Novel method for down-regulation of amyloid
EP1322959A1 (en) * 2000-08-21 2003-07-02 The General Hospital Corporation Methods for diagnosing a neurodegenerative condition
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
US7264810B2 (en) * 2001-01-19 2007-09-04 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
US7045290B2 (en) 2001-02-15 2006-05-16 The University Of Chicago Yeast screens for treatment of human disease
MY144532A (en) * 2001-08-20 2011-09-30 Lundbeck & Co As H Novel method for down-regulation of amyloid
EP1820806A1 (en) * 2006-02-16 2007-08-22 Crossbeta Biosciences B.V. Affinity regions
MY139983A (en) 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US20070003552A1 (en) * 2002-07-09 2007-01-04 Gebbink Martijn F B Cross-beta structure comprising amyloid binding proteins and methods for detection of the cross-beta structure, for modulating cross-beta structures fibril formation and for modulating cross-beta structure-mediated toxicity and method for interfering with blood coagulation
EP1380290A1 (en) * 2002-07-09 2004-01-14 Universitair Medisch Centrum Utrecht Cross-beta structure pathway and its therapeutic relevance
WO2010011999A2 (en) * 2008-07-25 2010-01-28 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for eliciting an amyloid-selective immune response
US9034337B2 (en) * 2003-10-31 2015-05-19 Prothena Biosciences Limited Treatment and delay of outset of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US20080014194A1 (en) * 2003-10-31 2008-01-17 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease
US8697082B2 (en) * 2002-11-01 2014-04-15 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
TW200509968A (en) * 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
US8506959B2 (en) * 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
WO2004093790A2 (en) * 2003-04-16 2004-11-04 Whitehead Institute For Biomedical Research Yeast ectopically expressing abnormally processed proteins and uses therefor
US7358331B2 (en) * 2003-05-19 2008-04-15 Elan Pharmaceuticals, Inc. Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease
US8685718B2 (en) * 2003-05-20 2014-04-01 New York University Mucosal immunization to prevent prion infection
WO2005019412A2 (en) * 2003-05-20 2005-03-03 New York University Mucosal immunization to prevent prion infection
TWI306458B (en) 2003-05-30 2009-02-21 Elan Pharma Int Ltd Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7674599B2 (en) * 2003-11-08 2010-03-09 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of using antibodies to detect alpha-synuclein in fluid samples
EP1761276B1 (en) * 2004-06-25 2013-07-24 ID Biomedical Corporation of Quebec Compositions and methods for treating neurological disorders
CA2590337C (en) 2004-12-15 2017-07-11 Neuralab Limited Humanized amyloid beta antibodies for use in improving cognition
US20090202980A1 (en) * 2005-03-21 2009-08-13 Crossbeta Biosciences B.V. Cross-Beta Structure Comprising Amyloid Binding Proteins and Methods for Detection of the Cross-Beta Structure, for Modulating Cross-Beta Structures Fibril Formation and for Modulating Cross-Beta Structure-Mediated Toxicity and Method for Interfering With Blood Coagulation
CA2615028A1 (en) * 2005-07-13 2007-01-18 Crossbeta Biosciences B.V. Cross-.beta. structure binding compounds
US8114832B2 (en) * 2005-07-13 2012-02-14 Crossbeta Biosciences B.V. Method for detecting and/or removing a protein comprising a cross-beta structure from a pharmaceutical composition
EP1907864A2 (en) * 2005-07-13 2008-04-09 Crossbeta Biosciences B.V. METHODS FOR DETERMINING THE EFFECT OF A TREATMENT ON THE CROSS-ß STRUCTURE CONTENT OF A PROTEIN; SELECTION OF TREATMENTS AND USES THEREOF
US20070015133A1 (en) * 2005-07-13 2007-01-18 Umc Utrecht Holding B.V. Method for detecting and/or removing protein and/or peptide comprising a cross-beta structure from an aqueous solution comprising a protein
EP1906995A2 (en) * 2005-07-13 2008-04-09 Crossbeta Biosciences B.V. Adjuvation through cross- structure
SG2014013437A (en) 2005-11-30 2014-07-30 Abbott Lab Monoclonal antibodies and uses thereof
RU2442793C2 (ru) 2005-11-30 2012-02-20 Эбботт Лэборетриз АНТИТЕЛА ПРОТИВ ГЛОБУЛОМЕРА Аβ, ИХ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ ЧАСТИ, СООТВЕТСТВУЮЩИЕ ГИБРИДОМЫ, НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, ВЕКТОРЫ, КЛЕТКИ-ХОЗЯЕВА, СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ УКАЗАННЫХ АНТИТЕЛ, КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ УКАЗАННЫЕ АНТИТЕЛА, ПРИМЕНЕНИЯ УКАЗАННЫХ АНТИТЕЛ И СПОСОБЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ УКАЗАННЫХ АНТИТЕЛ
WO2007108675A1 (en) * 2006-03-17 2007-09-27 Crossbeta Biosciences B.V. Methods of binding of cross-beta structures by chaperones
US8784810B2 (en) 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
US8188046B2 (en) 2006-10-16 2012-05-29 University Of South Florida Amyloid beta peptides and methods of use
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
PL2118300T3 (pl) * 2007-02-23 2015-11-30 Prothena Biosciences Ltd Zapobieganie i leczenie synukleinopatii i amyloidozy
US8147833B2 (en) * 2007-02-23 2012-04-03 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US20100311767A1 (en) 2007-02-27 2010-12-09 Abbott Gmbh & Co. Kg Method for the treatment of amyloidoses
US7618944B2 (en) * 2007-03-01 2009-11-17 Intezyne Technologies, Inc. Encapsulated amyloid-beta peptides
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
ES2498040T3 (es) 2007-07-27 2014-09-24 Janssen Alzheimer Immunotherapy Tratamiento de enfermedades amiloidogénicas con anticuerpos anti-beta humanizados
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
EP2058000A1 (en) * 2007-11-08 2009-05-13 Crossbeta Biosciences B.V. Immunogenic compositions capable of activating T cells
EP2058001A1 (en) * 2007-11-08 2009-05-13 Crossbeta Biosciences B.V. Enhancement of immunogenicity of antigens
AU2009257170B2 (en) * 2008-06-12 2014-06-12 Affiris Ag Compounds for treating symptoms associated with Parkinson's disease
EP2149380A1 (en) * 2008-07-29 2010-02-03 Medivet Pharma, S.L. Veterinary immunotherapy compositions for the Aged Related Cognitive Dysfunction.
US20100136584A1 (en) * 2008-09-22 2010-06-03 Icb International, Inc. Methods for using antibodies and analogs thereof
US9067981B1 (en) 2008-10-30 2015-06-30 Janssen Sciences Ireland Uc Hybrid amyloid-beta antibodies
MX360403B (es) 2010-04-15 2018-10-31 Abbvie Inc Proteinas de union a amiloide beta.
JP6147665B2 (ja) 2010-08-14 2017-06-14 アッヴィ・インコーポレイテッド アミロイドベータ結合タンパク質
US20120321694A1 (en) * 2010-10-27 2012-12-20 Daniel Larocque Compositions and uses
KR101766393B1 (ko) * 2010-11-30 2017-08-10 (주)아모레퍼시픽 블레오마이신 하이드로라제를 이용한 건조 피부 개선물질 스크리닝 방법

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4596792A (en) * 1981-09-04 1986-06-24 The Regents Of The University Of California Safe vaccine for hepatitis containing polymerized serum albumin
JPS5938877A (ja) * 1982-08-30 1984-03-02 Musashi Eng Kk 紙葉判別方法
US4599230A (en) * 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US4599231A (en) * 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US4608251A (en) * 1984-11-09 1986-08-26 Pitman-Moore, Inc. LHRH analogues useful in stimulating anti-LHRH antibodies and vaccines containing such analogues
US4601903A (en) * 1985-05-01 1986-07-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against Neisseria meningitidis Group B serotype 2 invasive disease
US5223482A (en) * 1986-11-17 1993-06-29 Scios Nova Inc. Recombinant Alzheimer's protease inhibitory amyloid protein and method of use
US5278056A (en) * 1988-02-05 1994-01-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Retroviral packaging cell lines and process of using same
US5192688A (en) 1988-08-15 1993-03-09 Switzer Iii Robert C Histological analysis method
DE4012743C1 (hr) * 1990-04-21 1992-01-09 Hans-Peter Dr. 5132 Uebach-Palenberg De Call
US5753624A (en) * 1990-04-27 1998-05-19 Milkhaus Laboratory, Inc. Materials and methods for treatment of plaquing disease
US5200339A (en) * 1990-08-17 1993-04-06 Abraham Carmela R Proteases causing abnormal degradation of amyloid β-protein precursor
US5780587A (en) * 1990-08-24 1998-07-14 President And Fellows Of Harvard College Compounds and methods for inhibiting β-protein filament formation and neurotoxicity
US5780036A (en) * 1991-08-26 1998-07-14 The Scripps Research Institute Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepattis B virus
CA2129899C (en) 1992-02-11 2011-01-04 James J. Mond Dual carrier immunogenic construct
AU4377793A (en) 1992-05-20 1993-12-13 Johns Hopkins University, The Alternative receptor therapy
US5958883A (en) * 1992-09-23 1999-09-28 Board Of Regents Of The University Of Washington Office Of Technology Animal models of human amyloidoses
US5747323A (en) * 1992-12-31 1998-05-05 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Retroviral vectors comprising a VL30-derived psi region
DK96493D0 (da) 1993-08-26 1993-08-26 Mouritsen Og Elsner Aps Fremgangsmaade til at inducere antistofresponser mod selvproteiner og autovaccine fremstillet ved fremgangsmaaden
CN1135181A (zh) * 1993-09-14 1996-11-06 Cytel有限公司 使用泛dr结合肽改变免疫应答
AUPM411994A0 (en) 1994-02-25 1994-03-24 Deakin Research Limited Epitopes
US5709995A (en) * 1994-03-17 1998-01-20 The Scripps Research Institute Hepatitis C virus-derived peptides capable of inducing cytotoxic T lymphocyte responses
US5573916A (en) * 1994-05-19 1996-11-12 Coretech, Inc. Immunogenic constructs comprising b-cell and t-cell epitopes on common carrier
IL115743A0 (en) 1994-10-28 1996-01-19 American Nat Red Cross A mammal with cells containing a transgene and its production
US5589154A (en) * 1994-11-22 1996-12-31 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods for the prevention or treatment of vascular hemorrhaging and Alzheimer's disease
ATE218583T1 (de) * 1995-03-14 2002-06-15 Praecis Pharm Inc Verbindungen mit aggregations-modulierenden wirkung auf das amyloid protein
US5874469A (en) * 1996-01-05 1999-02-23 Alcon Laboratories, Inc. Fluoroalkyl hydrocarbons for administering water insoluble or unstable drugs
AUPO390396A0 (en) 1996-11-29 1996-12-19 Csl Limited Novel promiscuous T helper cell epitopes
WO1998026747A2 (en) * 1996-12-17 1998-06-25 Terman David S Superantigen based methods and compositions for treatment of diseases
AU1388899A (en) 1997-11-11 1999-05-31 Board Of Regents Of The University Of Oklahoma, The An alzheimer-related, endothelium-derived toxic factor and methods for its use
US6787523B1 (en) * 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
TWI239847B (en) * 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US6761888B1 (en) * 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US20040062802A1 (en) * 1998-04-02 2004-04-01 Hermelin Victor M. Maximizing effectiveness of substances used to improve health and well being
AU759687B2 (en) 1998-07-21 2003-04-17 Pharmexa A/S Coating of solid surfaces with activated polyhydroxypolymers
CN1318105A (zh) * 1998-09-15 2001-10-17 M&E生物技术公司 负调节Osteoprotegerin配体活性的方法
NZ511055A (en) 1998-10-05 2003-10-31 Pharmexa As Novel methods for therapeutic vaccination
EP2322210A1 (en) * 1999-04-19 2011-05-18 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Adjuvant composition comprising saponin and an immunostimulatory oligonucleotide
US6787637B1 (en) * 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
EP1235587A2 (en) * 1999-11-29 2002-09-04 Neurochem, Inc. Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases comprising all-d peptides
EP1237930B1 (en) 1999-12-08 2006-11-08 Intellect Neurosciences, Inc. Chimeric amyloid beta peptides
WO2001062284A2 (en) * 2000-02-21 2001-08-30 Pharmexa A/S Novel method for down-regulation of amyloid
KR100879810B1 (ko) 2000-02-21 2009-01-22 하. 룬드벡 아크티에셀스카브 아밀로이드의 하향-조절을 위한 신규한 방법
GB0004530D0 (en) 2000-02-25 2000-04-19 Univ Nottingham Adjuvants
ATE286072T1 (de) * 2000-05-22 2005-01-15 Univ New York Synthetische immunogene jedoch nicht amyloidogene peptide, die homolog zu amyloid beta sind und deren verwendung zur induktion einer immunantwort gegen amyloid beta und amyloidaggregate
IT1319277B1 (it) * 2000-10-24 2003-09-26 Chiesi Farma Spa Proteine di fusione utili per il trattamento di immunizzazione dellamalattia di alzheimer.
US7097837B2 (en) * 2001-02-19 2006-08-29 Pharmexa A/S Synthetic vaccine agents
US6906169B2 (en) * 2001-05-25 2005-06-14 United Biomedical, Inc. Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide
MY144532A (en) 2001-08-20 2011-09-30 Lundbeck & Co As H Novel method for down-regulation of amyloid
US20030185845A1 (en) * 2001-11-16 2003-10-02 Steen Klysner Novel immunogenic mimetics of multimer proteins
US6841118B2 (en) * 2002-02-11 2005-01-11 Salflex Polymers Ltd. Mold assembly for blow molding plastic articles and method of use
EP1485122A2 (en) * 2002-03-11 2004-12-15 Pharmexa A/S Novel application of vaccination against tnf-alpha
US20040091945A1 (en) * 2002-07-17 2004-05-13 Cheryl Fitzer-Attas Peptides and methods of screening immunogenic peptide vaccines against Alzheimer's Disease

Also Published As

Publication number Publication date
AU783144B2 (en) 2005-09-29
CA2400838C (en) 2013-04-23
US7135181B2 (en) 2006-11-14
KR100879810B1 (ko) 2009-01-22
CA2400838A1 (en) 2001-08-30
HRP20020721B1 (hr) 2012-04-30
MXPA02007796A (es) 2003-12-08
KR20080017471A (ko) 2008-02-26
CZ20022748A3 (cs) 2004-03-17
US20090092579A1 (en) 2009-04-09
KR20030001365A (ko) 2003-01-06
US20020187157A1 (en) 2002-12-12
AU3362001A (en) 2001-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5025871B2 (ja) アミロイドの新規なダウン−レギュレート方法
HRP20020721A2 (en) Novel method for down-regulation of amyloid
EP1420815B1 (en) Beta-amyloid-analogue - t-cell epitop vaccine
AU2002325199A1 (en) Beta-amyloid-analogue-T-cell epitop vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
A1OB Publication of a patent application
ARAI Request for the grant of a patent on the basis of the submitted results of a substantive examination of a patent application
PPPP Transfer of rights

Owner name: H. LUNDBECK A/S, DK

B1PR Patent granted
ODRP Renewal fee for the maintenance of a patent

Payment date: 20130104

Year of fee payment: 13

PBON Lapse due to non-payment of renewal fee

Effective date: 20140219