HK167295A

HK167295A - Precursors of the HIV-2 retrovirus envelope glycoprotein and related antigens

Info

Publication number: HK167295A
Application number: HK167295A
Authority: HK
Inventors: Montagnier Luc; Hovanessian Ara; Laurent Anne; Krust Bernard; Rey Marie-Anne
Original assignee: Institut Pasteur
Priority date: 1988-06-09
Filing date: 1995-10-26
Publication date: 1995-11-03
Also published as: DE68922540T2; DK284389D0; EP0354072A1; JPH02119791A; ATE122236T1; DE68922540D1; DK284389A; JP3093763B2; DK175668B1; ES2074085T3; PT90800A; CA1341488C; EP0354072B1; PT90800B

Claims

Retrovirales antigenes Glykoprotein, nämlich
- ein Glykoprotein mit der Bezeichnung gp300, mit einem Molekulargewicht (MG) von ungefähr 300 kD und bestehend aus der Kombination von zwei Einheiten eines Glykoprotein gp140-Vorläufers des Hüllglykoproteins gp125, das durch das env-Gen des Genoms eines menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 codiert wird, das LAS oder AIDS verursachen kann, oder

- ein Dimer des Vorläufers des Hüllglykoproteins eines Retrovirus, das mit Antikörpern, die gegen das Glykoprotein gp300 gerichtet sind, immunologisch kreuzreagiert.
Antigenes Glykoprotein gp300 nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:
- es liegt in den Zellen einer biologischen Probe eines Patienten vor, der mit einem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 infizier ist, insbesondere in den menschlichen T4-Lymphocyten oder in den permanenten Linien, die von diesen T4-Lymphocyten stammen,

- sein isoelektrischer Punkt (pI) liegt in einem pH-Bereich von 6,8 - 7,8,

- es ist mit Oligosaccharidketten glykosyliert, die über den Stickstoff gebunden sind,

- es ist in ionischen Detergentien stabil, insbesondere in 1 % SDS, in nicht-ionischen Detergentien, insbesondere 2 % Triton®X-100, in 4 M Harnstoff, in Salzen und in Reduktionsmitteln,

- es dissoziiert in vitro spontan in zwei Glykoproteine mit Molekulargewichten von etwa 140 kD, in einem pH-Bereich zwischen 4 und 5,

- nach Isolierung und Reinigung durch Gelelektrophorese dissoziiert es in einem Acetatpuffer in vitro in zwei Glykoproteine mit Molekulargewichten von etwa 140 kD bei pH-Werten, die 6 entsprechen oder darunter liegen,

- es zeigt nach der Reinigung an einer Immunaffinitätssäule vom Typ HIV-2 Serum-Sepharose® mit spezifischen Antikörpern, die aus Serum eines Patienten erhalten wurden, der mit einem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 infiziert ist, auf einem 7,5%igen Polyacrylamid-SDS-Gel in Gegenwart von 6 M Harnstoff eine Bande, die einem Molekulargewicht von 300 kD entspricht.
Antigenes Glykoprotein nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es bei einer elektrophoretischen Analyse eines biologischen Mediums nicht gefunden wird, das aus viralen Partikeln besteht, die in dem spezifischen Kulturmedium von Zellen vorliegen, die durch ein menschliches Retrovirus vom Typ HIV-2 infiziert sind, nach Markierung mit ³⁵S-Methionin (200 »Ci/ml, 4 x 106 Zellen/ml) während 18 Stunden und Reinigung der erhaltenen Extrakte, die infizierte Zellen und deren entsprechendes Kulturmedium enthalten, während es unter den gleichen Bedingungen in den infizierten Zellen selbst gefunden wird.
Protein p200, das von dem Glykoprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 stammt, gekennzeichnet durch ein nicht-glykosyliertes Grundgerüst, das mit dem des Glykoproteins identisch ist, mit einem Molekulargewicht von etwa 200 kD, und das sich von dem Glykoprotein durch die Abwesenheit von Glykosylierungsresten unterscheidet.
Gereinigtes Glykoprotein gp150, das in vitro in den Zellen eines Patienten nachgewiesen werden kann, der mit einem menschlichen Retrovirus des Typs HIV-2 infiziert ist, gekennzeichnet durch:
- Molekulargewicht von etwa 150 kD,

- das Peptidgerüst des Vorläufers des Hüllglykoproteins gp125, das von dem env-Gen des Genoms eines menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 codiert wird oder von einem Retrovirus, dessen Glykoprotein der äußeren Hülle von Antikörpern aus dem Serum eines Patienten erkannt wird, der mit dem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 infiziert ist, insbesondere Antikörper, die gegen gp125 gerichtet sind,

- terminale Glucosereste auf einer Oligosaccharidkette.
Antigene Zusammensetzung für die Diagnose der Gegenwart von Antikörpern in den Zellen einer biologischen Probe eines Patienten, der mit einem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 infiziert ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Protein oder ein antigenes Glykoprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfaßt.
Monoclonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er das Glykoprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 erkennt, daß er aber die reifen Hüllglykoproteine gp125 und gp36 nicht erkennt.
Monoclonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Epitop erkennt, das auf dem Glykoprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 exponiert und für den Antikörper zugänglich ist, wobei das Epitop jedoch in den reifen Proteinen gp125 und gp36 in ihrer natürlichen Konformation entweder nicht exponiert oder maskiert ist.
Antikörper nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß er außerdem neutralisierend wirkt, insbesondere indem er die Bindung eines menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 an seinen Rezeptor hemmt, insbesondere an den T4-Rezeptor menschlicher Lymphocyten, die ihn tragen.
Monoclonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er das Protein p200 nach Anspruch 4 erkennt und daß er die reifen Glykoproteine gp125 und gp36 nicht erkennt.
Monoclonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Epitop des Proteins p200 nach Anspruch 4 erkennt, wobei das Epitop jedoch entweder nicht exponiert oder maskiert auf den Proteinen gp125 und gp36 und/oder auf dem Protein gp300 in ihrer natürlichen Konformation vorliegt.
Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß er neutralisierend wirkt, insbesondere, daß er die Bindung eines menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 an seinen Rezeptor hemmt, insbesondere an den T4-Rezeptor menschlicher Lymphocyten.
Immunogene Zusammensetzung, enthaltend ein Glykoprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder das Protein p200 nach Anspruch 4, in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel geeignet für die Herstellung von Impfstoffen.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Protein und einem antigenen Glykoprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zusammengesetzt ist, so daß die Verabreichung einer Dosis von 10 bis 100 »g pro kg möglich ist.
Verfahren zur Herstellung des antigenen Glykoproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
- Lyse der Zellen, die mit einem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 infiziert sind, und Antrennung des Überstandes und des Zellextrakts,

- Inkubation des Zellextrakts und/oder des Überstandes auf einer Immunaffinitätssäule mit einem Immunabsorbens, das gereinigte Antikörper umfaßt, die vom Serum eines Patienten erhalten wurden, der mit einem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 infiziert ist, wobei diese Antikörper vorteilhafterweise an einen passenden Träger gebunden sind, in Gegenwart eines Puffers und für einen Zeitraum, der lang genug ist zur Bildung eines immunologischen Antigen-Antikörper-Komplexes,

- Waschen der Säule mit einem Puffer zur Entfernung der Moleküle, die nicht an den Träger gebunden werden,

- Auftrennung der eluierten Glykoproteine,

- Gewinnung der gesuchten antigenen Proteine.
Verfahren nach Anspruch 15 für die Herstellung des Glykoproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Auftrennung der Glykoproteine durch Elektrophorese und durch Elektroelution der Proteine erfolgt, die auf der Säule zurückgehalten werden.
Verfahren nach Anspruch 15 für die Herstellung des Glykoproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Auftrennung der Glykoproteine folgendermaßen durchgeführt wird:
- Elution der an die vorstehend erwähnte Immunaffinitätssäule gebundenen Proteine,

- Reinigung der so eluierten Produkte auf einer Chromatographiesäule, die, gebunden an das Trenngel, monoclonale Antikörper enthält, die gp300 erkennen.
Verfahren für die in vitro-Diagnose der Gegenwart von Antikörpern in den Zellen einer biologischen Probe eines Patienten, um eine eventuelle Infektion mit einem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 festzustellen, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
- Inkontaktbringen der biologischen Probe mit einem Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder einer antigenen Zusammensetzung nach Anspruch 6 unter Bedingungen, die die Bildung eines immunologischen Antigen-Antikörper-Komplexes erlauben,

- Nachweis des gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes.
Kit zum Nachweis von Antikörpern in den Zellen einer biologischen Probe eines Patienten, der mit einem menschlichen Retrovirus vom Typ HIV-2 infiziert sein kann, gekennzeichnet durch folgende Bestandteile:
- mindestens ein Protein und/oder ein antigenes Glykoprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 5,

- oder eine Zusammensetzung nach Anspruch 6,

- oder auch ein Gemisch dieser verschiedenen Bestandteile und

- Mittel, um die Reaktion zur Bildung des immunologischen Komplexes zwischen den vorstehenden Antigenen und den gegebenenfalls in der zu untersuchenden biologischen Probe vorhandenen Antikörpern zu ermöglichen, insbesondere, falls notwendig, mit einem oder mehreren Inkubationspuffern,

- eine Negativ-Kontrollprobe,

- Mittel zum Nachweis des gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes.