HK1031237B - Method for producing l-carnitine from crotonobetaine - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Carnitin aus. Crotonobetain, aus Salzen des Crotonobetains, anderen Derivaten des Crotonobetains oder dergleichen.

Es ist bekannt, daß L-Carnitin, eine ubiquitär vorkommende Verbindung, eine wichtige Rolle im Stoffwechsel - speziell beim Transport langkettiger Fettsäuren über die innere Mitochondrienmembran - spielt. Aus der Funktion des Carnitins im Stoffwechsel von Eukaryonten leiten sich zahlreiche klinische Anwendungen, z.B. in der Behandlung von Patienten mit Carnitinmangelsyndromen, in der Prophylaxe und Therapie verschiedener Herzkrankheiten sowie bei der Behandlung von Hämodialysepatienten, ab. Darüber hinaus ist L-Carnitin als Ergänzungsnährstoff von Bedeutung und fördert als Zusatz zu Fermentationsmedien auch das Wachstum von Hefen und Bakterien. Der wachsende Bedarf an diesem biologisch aktiven L-Carnitin-Enantiomer für diese und andere Anwendungen hat zu einer weltweiten Suche nach Synthesewegen für dieses Betain in einer optisch reinen Form geführt, da daß chemisch synthetisierte Racemat auf Grund der Hemmung der Carnitinacetyltransferase als auch des Carnitincarrierproteins nicht verwendet werden kann.

Zur Isolierung des L-Isomeren werden bis heute Verfahren genutzt, die auf der Racematspaltung mittels fraktionierter Kristallisation unter Anwendung optisch aktiver Säuren beruhen (z.B. US Patent 4, 254,053.1981), wobei D(+)-Carnitin als Abfallprodukt anfällt. Dieses Problem kann durch verschiedene biologische Verfahren, ausgehend von billigen achiralen Vorstufen (Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 1993, 50, 21-44) überwunden werden. Von speziellem Interesse ist die stereospezifische Hydration von trans-Crotonobetain zu L-Carnitin unter Anwendung von Stämmen der Genera Escherichia (ED 0121444.1984; DD 221 905.1987; ; EP 0320460.1989) oder Proteus (Agric. Biol. Chem., 1988, 52, 2415-2421: US Patent 5. 300. 430. 1994). Der Vorteil dieser Methode besteht darin, daß diese achirale Vorstufe auch durch chemische Dehydration des Abproduktes D-Carnitin erhalten werden kann.

CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 115, no. 1, 8. Juli 1991 Columbus, Ohio, US; abstract no. 6956, JUNG, H. ET AL: 'Production of L(-)- carnitine by biotransformation' XP002096268 & DECHEMA BIOTECHNOL. CONF. (1990), 4(PT. B, LECT. DECHEMA ANNU. MEET. BIOTECHNOL. 8TH, 1990), 1041-4 CODEN: DBCOE offenbart ein Verfahren zur Herstellung von L-Carnitin, ausgehend von Crotonobetain unter Verwendung von immobilisierten Escherichia Coli 00K74-Zellen

CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 117, no. 19, 9. November 1992 Columbus, Ohio, US; abstract no. 187989, JUNG, HEINRICH ET AL: 'L-(-)- Carnitine synthesis by stereoselective hydration of crotonobetaine' XP002096269 & PROC. - EUR. CONGR. BIOTECHNOL., 5TH (1990), VOLUME 1, 251-4. EDITOR(S): CHRISTIANSEN, CLAUS;MUNCK, LARS; VILLADSEN, JOHN. PUBLISHER: MUNKSGAARD, COPENHAGEN, DEN. CODEN: 57RVAO offenbart ein Verfahren zur Herstellung von L-Carnitin, ausgehend von Crotonobetain unter Verwendung von immobilisierten Escherichia Coli-Zellen.

Die zahlreich in der Literatur beschriebenen Verfahren mit immobilisierten Mikroorganismen in einem kontinuierlich arbeitenden Reaktorsystem haben den Vorteil, daß

• reinere Reaktionsmedien verwendet werden können und so die Extraktion sowie der Reinigungsprozeß erleichtert wird,
• durch Einsatz höherer Konzentrationen des Biokatalysators im Reaktionsmedium höhere Produktivitäten erreicht und zugleich die Möglichkeit von Kontaminationen vermindert werden,
• es zu einer Verminderung der Empfindlichkeit gegenüber Inhibitoren oder eines Nährstoffmangels kommt,
• eine höhere Stabilität des Biokatalysators erreicht wird.

Die genannten Vorteile können auch in einem kommerziell genutzten Prozeß verwendet werden.

Ein kontinuierlich arbeitender Reaktor, in dem Mikroorganismen durch Mikro- bzw. Ultrafiltrationsmembranen zurückgehalten werden, ist ein Immobilisierungsverfahren, welches neben den vorstehend genannten Vorteil auch den niedriger Kosten für die Immobilisierung besitzt und zugleich eine sehr leichte Maßstabsvergrößerung ermöglicht.

Entsprechend zielt die Erfindung auf ein Verfahren zur Produktion von L-Carnitin aus Crotonobetain, Crotonobetainsalzen oder anderen Crotonobetainderivaten in einem kontinuierlichen Reaktor mit freien oder immobilisierten Zellen, wachsenden oder ruhenden Zellen von Escherichia coli 044K74 (DSM 8828), die durch Mikro- bzw. Ultrafiltrationsmembranen in Ceramics, glasperlen oder Polymethansdreiben zurückgehalten werden.

E. coli wird in dem genannten Reaktor bei Temperaturen zwischen 20 und 40 °C, pH-Werten zwischen pH 6,0 - 8,0 und unter anaeroben Bedingungen, die für die Induktion der Carnitin-metabolisierenden Enzyme erforderlich sind, gehalten. Als Reaktionsmedien wird ein Minimal- oder Komplexmedium verwendet. In beiden Fällen wird Crotonobetain, Crotonobetainsalze oder andere Crotonobetainderivate in Konzentrationen zwischen 25 mmol und 1 M hinzugesetzt. Das Minimalmedium enthält unterschiedliche Konzentrationen von Caseinhydrolysat und Salzen (NH₄)₂SO₄, KH₂PO₄, K₂HPO₄, MgSO₄ x 7H₂O, MnSO₄ x 4H₂O, FeSO₄ x 7H₂O), während das Komplexmedium unterschiedliche Konzentrationen von pankreatischen Pepton und NaCI enthält. Zur Verbesserung des Wachstums von E. coli werden Glycerin, Glucose, Ribose, Saccharose oder Lactose hinzugesetzt. Zusätzlich werden dem Medium Inhibitoren, die die Transformation von Crotonobetain zu γ-Butyrobetain verhindern (Fumarat, Glucose oder Nitrat) und Induktoren Carnitin-metabolisierende Enzyme wie D-, L-, DL-Carnitin, ihre Salze und Derivate oder Crotonobetain, dessen Salze bzw. Derivate hinzusetzt.

Der Reaktionsablauf in dem hier verwendeten kontinuierlichen Zell-Recycle-Reaktor kann in zwei Abschnitte unterteilt werden. Der eine Abschnitt besteht aus einem Reaktortank, in welche Zellen von E. coli zusammen mit dem Reaktionsmedium den größten Teii des Crotonobetains in L-Carnitin umwandeln. Dieser Reaktortank besitzt Kontrollelemente für pH-Wert, Temperatur und Rührgeschwindigkeit sowie für die Kontrolle und Korrektur der Sauerstoffkonzentration. Die Zufuhr des Reaktionsmediums in den Reaktor erfolgt mittels einer Dosierpumpe. Wenn notwendig, muß eine Entlastung des Reaktortanks von überschüssigen Medium durchgeführt werden. Der zweite Abschnitt besteht aus einer externen Rückführungsschleife, die an den Reaktortank angeschlossen ist und über eine Pumpe den Inhalt des Reaktors durch eine Filtereinheit leitet. Während das Filtrat gesammelt wird, um L-Carnitin als Reaktionsprodukt daraus zu isolieren, wird der Rückstand aus der Filtration dem Reaktor wieder zugeführt. Zur Filtration der Zellsuspension können kommerzielle Filtersysteme unterschiedlicher Herkunft verwendet werden, solange sie eine Porengröße besitzen, die unterhalb der Zellgröße von E. coli liegt. Die Geschwindigkeit der Rückführpumpe bleibt unverändert, um best mögliche Filtrationsraten zu erreichen und um die Bildung einer Polarisationsmembran während des Filtrationsprozesses zu minimieren.

Der Ausdruck freie E. coli Zellen bezeichnet den Zustand, bei welchem ganze Zellen im Reaktionsmedium suspendiert sind, ohne daß ein Zellausfluß durch die Austrittslösung verhindert wird. Der Ausdruck immobilisierte Zellen beschreibt den Zustand, bei dem ganze Zeilen an lösliche Polymere oder unlösliche Träger gebunden sind, bzw. in Membransystemen einschlossen sind (In Methods in Enzymol. 1987. Vol. 135, 3-30).

Der Begriff Wachstumsbedingungen ist definiert als die Situation, in der ganze Zellen während ihres Lebenszyklus Substrate verbrauchen und Produkte bilden. Unter ruhenden Zellen versteht man intakte aber nicht wachsende Zellen, die unter bestimmten Bedingungen spezielle Stoffwechselleistungen zeigen (In "Biotechnology" (Kieslich, K.; Eds. Rehm, H.J. und Reed, G.) Verlag Chemie, Weinheim, Germany. 1984. Vol. 6a, 5-30).

Das Verfahren wird im Folgenden an einigen Ausführungsbeispielen erläutert:

Beispiel 1:

Escherichia coli 044 K74 wird in einem bis zum Rand gefüllten, luftdicht verschlossenen Erlenmeyerkolben bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen auf einem Rotationsschüttler (150 r.p.m.) kultiviert. Das verwendete Komplexmedium hat folgende Zusammensetzung: 50 mM Crotonobetain, 50 mM Fumarat, 5 g/l NaCI und verschiedene Konzentrationen (zwischen 0,5 und 10 g/l) pankreatisches Pepton. Der pH wird mittels KOH auf pH 7,5 eingestellt. In Tabelle 1 sind die spezifischen Wachstumsraten bei unterschiedlichen Peptonkonzentrationen zusammengefaßt. Tab. 1.

Peptone (g/l)	0.5	1.0	2.5	5.0	10.0
	0.224	0.296	0.351	0.372	0.325

Unter den genannten Bedingungen sind wachsende Zellen von E coli in der Lage, bis zur Beendigung des Versuches 20 - 30 mM L-Carnitin zu produzieren.

Konzentrationen höher als 5g/l Pepton ergeben sowohl ähnliche Wachstums- und kinetische Parameter als auch Biomassegehalte (OD 600 nm). Im Gegensatz dazu werden bei niedrigeren Peptonkonzentrationen geringere Wachstumsparameter erhalten.

Beispiel 2:

Escherichia coli 044 K74 wird in einem bis zum Rand gefüllten, luftdicht verschlossenen Erlenmeyerkolben bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen auf einem Rotationschüttler (150 r.p.m.) kultiviert. Das verwendete Komplexmedium hat folgende Zusammensetzung: 50 mM Crotonobetain, 5 g/l pankreatisches Pepton, 5 g/l NaCI sowie abgestufte Konzentrationen (zwischen 0 und 75 mM) Fumarat. Der pH wird mit KOH auf pH 7,5 eingestellt.

Tabelle 2 zeigt, daß ein Zusatz von Fumarat höhere Wachstumsraten von E. coli 044 K74 und eine OD bei 600 nm von nahezu 1,0 im steady state bedingt. Darüber hinaus bewirkt Fumarat eine L-Carnitinbildung von 20 - 30 mM bis zum Versuchsende. In Abwesenheit von Fumarat wird eine Carnitinkonzentration von nur 5 mM erhalten. Tabelle 2.

Fumarat(mM)	0	25	50	75
	0.21	0.37	0.38	0.39
Biomasse OD (600 nm)	0.980	0.910	1.00	0.950

Beispiel 3:

Die Fähigkeit von Escherichia coli 044 K74, L-Carnitin aus Crotonobetain zu bilden, wird durch Crotonobetain induziert. Die Induktionsstudien wurden mit Crotonobetain zwischen 5 und 75 mM unter Verwendung von Ruhezelien durchgeführt. Bei hohen Crotonobetainkonzentrationen werden Umwandlungsraten von über 60 % L-Carnitin erreicht (Tabelle 3). Tabelle 3.

Crotonobetain (mM)	5	25	50	75
L-Carnitin produktion (%)	55	60	62	65

Beispiel 4:

Escherichia coli 044 K74 wird in einem bis zum Rand gefüllten, luftdicht verschlossenen Erlenmeyerkolben bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen auf einem Rotationschüttler (150 r.p.m.) kultiviert. Das verwendete Komplexmedium hat folgende Zusammensetzung: 50 mM Crotonobetain, 5 g/l pankreatisches Pepton, 5 g/l NaCl und 50 mM Fumarat. Der pH wird mit KOH auf 7,5 eingestellt.

Um die Biokatalysatorkonzentation im Reaktor zu erhöhen und um eine. L-Carnitinproduktion bei Verdünnungsraten höher als die maximale spezifische Wachstumsrate zu ermöglichen, wurde ein Membranreaktor verwendet. Die Zellen wurden durch eine Polysulfon-Mikrofiltrationsmemban mit einer Ausschlußgrenze von 0,1 µm zurückkgehalten und wiederholt verwendet. Die Membranen waren in einem Plattenmodul angeordnet. In Tabelle 4 ist der Biomassegehalt und in Tabelle 5 die Carnitinproduktion, die Crotonobetainumwandlung und die Produktivität in diesem System zusammengefaßt. Tabelle 4.

	0.0	0.2	1.0	2.0
	0.5	2.1	9.4	27.0

Tabelle 5.

	0.0	0.5	1.0	1.5	2.0
L-Carnitin-Produktion (%)	0.0	38	42	42	38
Crotonobetainumwandlung (%)	0.0	24	26	26	30
	0.0	1.75	3.5	5.5	6.5

Aus den Tabellen ist ersichtlich, daß mit immobilisierten Zellen von Escherichia coli 044 K74 in einem Zell-Recycle-Reaktor eine L-Carnitinbildung aus Crotonobetain von 6,5/l/h mit einer Metabolisierungsrate von nahezu 40 % erreicht wird.

Claims (13)

1. Verfahran zur Herstellung von L-Carnitin aus Crotonobetain, dadurch gekennzeichnet, daß ein immobilisierter Mikroorganismus in einem kontinuierlich arbeitenden Zellreaktor den Ausgangsstoff Crotonobetain als solchen oder in Form seiner Salze oder Derivate zu L-Carnitin umsetzt, wobei als Trägermaterial fur den Mikroorganismus Ceramics, Glasperlen, Polyurethanscheiben verwendet werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mlkroorganismus E, coli 044 K74 (DSM 8828) ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß E. coli an Trägermaterial immobilisiert wird, das seine Lebensfähigkeit nicht beeinträchtigt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgemisch von Ceramics, welche den Mikroorganismus tragen, filtriert wird, in an sich bekannter Weise das L-Camitin abgetrennt und das Crotonobetain in den Kreislauf zurückgeführt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Crotonobetainkonzentration im Reaktionsrnedium zwischen 25 mM und 1 M beträgt.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß dem Reaktor zufließenden üblichen kommerziellen Komplexmedium oder gut definierten E coli -Minimalmedium Elektronenakzeptoren der Atmung der Inhi-bitoren wie Fumarat, Nitrat, Sauerstoff, N-Oxide oder Glucose zugesetzt werden, die die Hydrierung des Crotonobetains zu γ-Butyrobetain verhindern.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnel, daß dem Minimalmedium Induktoren Carnitin-metabolisierender Enzyme wie L-, D-, oder DL-Carnitin, -derivaten und -salzen sowie Crotonobetain, -derivaten und -salzen zugesetzt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß E. coli 044 K74 auf einem Komplexmedium anaerob oder partiell anaerob kul-tiviert wird, wobei eine Fumaratkonzentration von 50 mM eingehalten wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß E. Coli 044 K74 auf einem Komplexmedium anaerob oder partiell anaerob kulti-viert wird. wobei das Komplexmedium 50 mM Crotonobetain, 5 g/l pankreati-sches Pepton, 5 g/l NaCl und 50 mM Fumarat enthält, einen pH von 7,5 auf-weist, und die Reaktion in einem kontinuierlich arbeitenden Membranreaktor abläuft.
10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Rückführung der Bakterien in den Reaktor kontinuierlich unter Verwendung kommersielier Querstromfiltrations- oder Hohlfaser-Module, die aus an sich bekannten Ultra- oder Mikrofiltrations-Membranen unterschiedlicher chemischer Zusammensetzung wie Cellulose, Polysuilphon oder polysalphoniertem Polysulphon mit einer Ausschußgrenze von 300 klDa bzw. 0,211 bestehen, erfolgt.
11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Synthese unter anaeroben oder partiell anaeroben Bedingungen durchgeführt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Camitinproduktion in einem kontinuierlich arbeitenden Reaktor bei unterschiedlichen Verdünnungsraten, die durch zwei Pumpen, der Dosierund Filtrationspumpe, eingestellt und bei verschiedenen Rührgeschwindigkeiten und Biomasse- Konzentrationen durchgeführt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichet, daß die Ausflußrate des Filtrationsstromes prozeßleitend kontrolliert wird.