FR3126005A1 - Activateur pharmacologique et/ou génétique pour son utilisation pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire en bloquant la sénescence - Google Patents

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Abstract

L’invention concerne un activateur pharmacologique et/ou génétique pour son utilisation pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire. L’invention se caractérise en ce que ledit activateur pharmacologique et/ou génétique est un activateur de la voie de signalisation du récepteur de la thyréostimuline (TSHR) dans des cellules souches musculaires (cellules satellites) pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire en bloquant la sénescence. L’invention concerne également une combinaison d’un activateur pharmacologique pour son utilisation selon l’invention et d’un activateur génétique pour son utilisation selon l’invention, ainsi qu’un vecteur adénoviral comprenant une séquence protéique du récepteur de la thyréostimuline (TSHR) de SEQ ID NO :1 ou un variant fonctionnel ayant une séquence protéique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :1, ou une séquence nucléotidique du TSHR de SEQ ID NO :2 ou un variant fonctionnel ayant une séquence nucléotidique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :2 pour son utilisation à titre de médicament. Figure 7L

Description

Activateur pharmacologique et/ou génétique pour son utilisation pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire en bloquant la sénescence
L’invention concerne un nouvel activateur pharmacologique et/ou génétique pour son utilisation pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire en bloquant la sénescence, en particulier pour prévenir et/ou traiter les myopathies, préférentiellement la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), ainsi que la sarcopénie. L’invention concerne également un nouveau vecteur adénoviral pour son utilisation à titre de médicament.
La dystrophie musculaire est une atteinte neuromusculaire héréditaire de nature progressive, résultant de la mutation d’un ou de plusieurs gènes destinés à assurer les fonctions et structures musculaires.
La dystrophie musculaire de Duchenne est la plus répandue des myopathies de l'enfant. Elle est due à des anomalies d’une protéine indispensable aux muscles, la dystrophine. Elle se caractérise par un déclin de la régénération musculaire contribuant à la perte de masse musculaire.
Chez les patients atteints de myopathie de Duchenne, en l’absence de dystrophine, les fibres qui constituent les muscles squelettiques, les muscles lisses et le muscle cardiaque s’abiment à chaque contraction et finissent par se détruire.
La dystrophie musculaire de Duchenne est due à une anomalie génétique récessive dans le gène DMD, sur le chromosome X, entraînant l'absence de dystrophine.
La dystrophine est une grande protéine qui assure le lien entre le cytosquelette contractile et la matrice extracellulaire, par l'intermédiaire d'un complexe protéique appelé complexe membranaire de la dystrophine, et joue un rôle majeur dans le maintien de l'intégrité des fibres musculaires lors de la contraction.
La dystrophine est une protéine constituée de 3685 acides aminés pour un poids moléculaire de 427 kDa. Elle est encodée par le gène DMD qui permet la synthèse de 7 isoformes principales, de tailles différentes, grâce à la présence de 7 promoteurs tissus-spécifiques.
Trois de ces promoteurs (appelés promoteurs M, B et P indiquant une expression dans les tissus « Muscle (Muscle) », « Cerveau (Brain) » et « Neurones de Purkinje du cortex cérébelleux (Purkinje cerebellar neurons) ») sont situés en amont du premier exon et permettent la synthèse des dystrophines de pleine longueur fonctionnellement équivalentes.
Les quatre autres promoteurs sont intra-géniques et permettent la synthèse d’isoformes de taille réduite.
La dystrophine fait partie de la famille des protéines filamenteuses de type « spectrine » qui sont présentes dans les tissus musculaires squelettique et cardiaque, le cerveau, la rétine, les cellules gliales et de Purkinje et en quantité très réduite dans les lymphocytes.
La dystrophine est composée de quatre grands domaines qui interagissent avec plusieurs partenaires de la cellule musculaire et jouent un rôle essentiel durant le cycle de contraction-relaxation musculaire :
  • le domaine N-terminal ou domaine de liaison à l’actine (Actin Binding Domain ou ABD1), comprenant les premiers 246 acides aminés ;
  • le domaine central (ou rod domain) allant de l’acide aminé 247 au 3045. Il est constitué de 24 répétitions homologues à la spectrine (ou spectrine like, R1 à R24) et de 4 charnières riches en proline (ou hinges, H1 à H4) divisant le domaine central en 3 sous-domaines ;
  • le domaine riche en cystéine (cysteine rich repeats ou CR) allant de l’acide aminé 3080 à 3360 ; et
  • le domaine C-terminal formé des 325 derniers résidus.
De nombreux essais cliniques sont en cours pour le traitement de la dystrophie musculaire de Duchenne en thérapie génique ou pharmacologique.
Les thérapies géniques visent à obtenir une production de dystrophine fonctionnelle dans le muscle.
Un premier essai clinique a démarré récemment en France. Il évalue un produit de thérapie génique associant une version raccourcie du gène DMD et un vecteur viral adéno-associé AAV.
Les thérapies pharmacologiques agissent sur certaines manifestations de la maladie pour ralentir son évolution. Plusieurs médicaments sont à l’étude pour améliorer et/ou protéger la fonction musculaire et/ou cardiaque, lutter contre l’inflammation et les effets de l’absence de dystrophine sur les cellules musculaires : le tamoxifène, le nébivolol, le givinostat, le riméporide, etc.
Le document brevet WO2018155913 concerne une composition comprenant des composés chimiques choisis parmi les inhibiteurs de la pan-histone désacétylase, les inhibiteurs de l'ALK5 (inhibiteur de la kinase 5 semblable au récepteur de l'activine A) et les activateurs de signalisation de l'AMPc permettant d'induire la différenciation de cellules somatiques, de cellules souches mésenchymateuses ou de cellules souches adultes (à l’exception des cellules souches musculaires) en cellules de muscle squelettique pour le traitement de maladies du muscle squelettique. Il met en œuvre un procédé dans lequel des cellules sont cultivées dans un milieu de culture contenant la composition induisant la différenciation en cellules de muscle squelettique. Les cellules de muscle squelettique ainsi obtenues ne présentent aucun risque d'oncogenèse après implantation du fait de la différenciation à partir de cellules somatiques, et présentent l'avantage d'être génétiquement stables en raison de l'utilisation d'un mélange de composés de faible poids moléculaire seuls, sans introduction de génétique.
Problème technique
Considérant ce qui précède, un problème que se propose de résoudre la présente invention consiste à développer une nouvelle thérapie pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire et traiter notamment la dystrophie musculaire de Duchenne.
Or, à ce jour, aucune thérapie connue ne vise à cibler la sénescence cellulaire des cellules souches musculaires pour traiter la dystrophie musculaire de Duchenne. La sénescence des cellules souches musculaires est un des effets causés par la dystrophie musculaire de Duchenne (Sugihara, Hidetoshi et al.“Cellular senescence-mediated exacerbation of Duchenne muscular dystrophy.”Scientific reports vol. 10,1 16385. 12 Oct. 2020, doi:10.1038/s41598-020-73315-6). Ceci contribue à la forte réduction de la régénération musculaire et provoque ainsi l’aggravation de la pathologie.
Solution apportée
La solution à ce problème posé a pour premier objet un activateur pharmacologique et/ou génétique de la voie de signalisation du récepteur de la thyréostimuline (TSHR) dans des cellules souches musculaires (cellules satellites) pour son utilisation pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire en bloquant la sénescence.
De manière surprenante, cibler la signalisation du TSHR de manière pharmacologique et/ou génétique permet de préserver les capacités de prolifération et de différenciation des cellules souches musculaires en bloquant la sénescence. L'activation de la signalisation TSHR dans les cellules souches musculaires augmente les propriétés de régénération des muscles atteints notamment de la dystrophie musculaire de Duchenne et préserve la structure et la fonction musculaires, en empêchant la fonte musculaire rapide qui se produit avec la progression de la pathologie.
Elle a également pour objet une combinaison d’un activateur pharmacologique et d’un activateur génétique pour leurs utilisations selon l’invention.
L’invention a également pour objet un vecteur adénoviral caractérisé en ce qu’il comprend une séquence protéique du récepteur de la thyréostimuline (TSHR) de SEQ ID NO :1 ou un variant fonctionnel ayant une séquence protéique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :1, ou une séquence nucléotidique du TSHR de SEQ ID NO :2 ou un variant fonctionnel ayant une séquence nucléotidique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :2pour son utilisation à titre de médicament.
Avantages apportés
Le Demandeur a notamment pu développer un activateur pharmacologique et/ou génétique de la voie de signalisation du récepteur de la thyréostimuline (TSHR) dans les cellules souches musculaires permettant d’augmenter la régénération musculaire en prévenant la perte de masse musculaire et la substitution par des tissus adipeux et fibreux. Cette approche permettra de maintenir la fonctionnalité des muscles et de ralentir la progression de la dystrophie musculaire de Duchenne.
L’invention et les avantages qui en découlent seront mieux compris à la lecture de la description et des modes de réalisation non limitatifs qui suivent, illustrés au regard des dessins annexés dans lesquels :
Fig.1
illustre la génération des rats R-DMDdel52 telle que détaillée dans l’exemple 1 dans laquelle :
1A) est une observation de la Dystrophine et de la β-Dystroglycane (en gris) par immunofluorescence au niveau du tibia antérieur des rats WT et des rats R-DMDdel52 à l’âge de 3 semaines et de 12 mois. (Barre d’échelle = à 20µm).
1B) est une analyse du taux d’expression de la Dystrophine au niveau du tibia antérieur d’un rat WT et de deux rats R-DMDdel52 (DMD #1, DMD#2) à l’âge de 16 semaines par Western Blot. La β-Tubuline est utilisé comme gène de ménage.
1C) représente une courbe de survie des rats WT et des rats DMD par l’estimateur de Kaplan Meier.
1D) détaille la coloration du tissu musculaire du tibia antérieur, à l’Hématoxyline et l’Eosine (panel du dessus) et au rouge Sirius (panel du dessous), provenant de rats WT et R-DMDdel52 à l’âge de 12 mois. (Barre d’échelle = 20 µm).
1E) représente la quantification de dépôt de tissu fibreux grâce au pourcentage de surface teinté au rouge Sirius au niveau du tibia antérieur chez des rats WT et R-DMDdel52 de l’âge de 12mois. Moyenne ± écart-type (n=3), test de Mann-Whitney.
1F) correspond au pourcentage de myofibrilles à noyau central au niveau du tibia antérieur des rats WT et R-DMDdel52 à l’âge de 12 mois. Moyenne ± écart-type (n=3), test de Mann-Whitney.
1G) correspond au pourcentage de distribution des tailles des fibres musculaires de la section transversal au niveau du tibia antérieur chez des rats WT et R-DMDdel52 de l’âge de 12mois. Moyenne ± écart-type (n=3), test ANOVA. Les p values sont calculés par le Sidak’s post test.
1H) détaille la coloration des muscles extra-oculaires, à l’Hématoxyline et l’Eosine (panel du dessus, en blanc) et au rouge Sirius (panel du dessous, en noir), provenant de rats WT et R-DMDdel52 à l’âge de 12 mois. (Barre d’échelle = 20 µm).
1I) représente la quantification de dépôt de tissu fibreux grâce au pourcentage de surface teinté au rouge Sirius au niveau des muscles extra-oculaires chez des rats WT et R-DMDdel52 de l’âge de 12 mois. Moyenne ± écart-type (n=3), test de Mann-Whitney.
1J) correspond au pourcentage de myofibrilles à noyau central au niveau des muscles extra-oculaires des rats WT et R-DMDdel52 à l’âge de 12 mois. Moyenne ± écart-type (n=3), test de Mann-Whitney.
1P) correspond au pourcentage de distribution de la section transversal au niveau des muscles extra-oculaires chez des rats WT et R-DMDdel52 de l’âge de 12 mois. Moyenne ± écart-type (n=3), test ANOVA. Les p values sont calculés par le Sidak’s post test.
Fig.2
illustre la régénération continue musculaire des muscles extra-oculaires progressive dans le modèle DMD du rat telle que détaillée dans l’exemple 2 dans laquelle :
2A) est une observation de la chaine légère de myosine embryonnaire (eMHC – embryonic myosin heavy chain, amas gris dans le panel du dessous à gauche) et de la laminine (sous forme de réseau) au niveau du tibia antérieur des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 3 semaines, 6 mois et 12 mois, par immunofluorescence, le noyau est marqué grâce au colorant bleu Hoechst. (Barre d’échelle = 20 µm).
2B) correspond aux quantifications du nombre d’eMHC par mm2 au niveau du tibia antérieur des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 3 semaines, 6 mois et 12 mois. Moyenne ± écart-type (n=3), test de Mann-Whitney.
2C) est une observation de la chaine légère d’eMHC (amas gris) et de la laminine (sous forme de réseau condensé) au niveau des muscles extra-oculaires des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 3 semaines, 6 mois et 12 mois, par immunofluorescence, le noyau est marqué grâce au colorant bleu Hoechst. (Barre d’échelle = 20 µm).
2D) correspond aux quantifications du nombre d’eMHC par mm2 au niveau des muscles extra-oculaires des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 3 semaines, 6 mois et 12 mois. Moyenne ± écart-type (n=3), test de Mann-Whitney.
2E) correspond à une coloration représentative par co-immunofluorescence au niveau du tibia antérieur, utilisant des anticorps Ki67 (en triangle blanc), Pax7 (encadré 0), laminine (sous forme de réseau) et Hoechst (les ronds dans les cellules). Les encadrés jaunes indiquent une co-expression de Pax7 et Ki67 et les rectangles gris indiquent PAX7+/Ki67- des cellules souches musculaires. (Barre d’échelle = 10 µm).
2F) représente la quantification de E montrant le nombre de cellules musculaires (PAX7+) par fibre au niveau du tibia antérieur des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 3 semaines, 6 mois et 12 mois. Moyenne ± écart-type (n=3), test de Mann-Whitney.
2G) représente la quantification du pourcentage de CSM (Cellules souches musculaires) quiescentes (Pax7+/Ki67-) et de CSM prolifératives (Pax7+/Ki67+) sur les TA isolés des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 3 semaines, 6 mois et 12 mois. Moyenne ± écart-type (n=3), test de Mann-Whitney.
Fig.3
illustre le potentiel myogénique des CSM des rats R-DMDdel52 du TAin vitrodans laquelle:
3A-B) correspondent à une coloration représentative par co-immunofluorescence de Ki67 (rond), MyoD (carré) et des noyaux (Hoechst, étoile) de myoblastes isolés à partir du tibia antérieur (A) et des muscles extra-oculaires (B) des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 3 semaines. Les flèches indiquent les myoblastes prolifératifs co-marqués par Ki67 et MyoD. Barre d’échelle 20 µm.
3C) correspond aux quantifications des myoblastes MyoD+/Ki67+ et MyoD+/Ki67- à partir du tibia antérieur et des muscles extra-oculaires des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 3 semaines. Moyenne ± écart-type (n=3), test de Mann-Whitney.
3D-E) représentent le marquage par immunofluorescence des myosines sarcomériques (MF20 sous formes de filaments) et des noyaux (Hoechst,) des myotubes différentiés au niveau du tibia antérieur (D) et des muscles extra-oculaires (E) des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 3 semaines. Barre d’échelle 20 µm.
3F) est une évaluation de l'indice de fusion par champ sur les myotubes différenciés du et des MEO (Muscles Extra-Oculaires) à l’âge de 3 semaines. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
3G) représente le nombre de noyaux par myotube par champ (mm2) pour les myotubes WT et R-DMDdel52 isolés de TA et MEO à l’âge de 3 semaines. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
H-I) correspondent à une coloration par co-immunofluorescence de Ki67, MyoD et noyaux (Hoechst) de myoblastes isolés du TA (H) et des MEO (I) de rats WT et R-DMDdel52 âgés de 6 mois. Les flèches indiquent les myoblastes prolifératifs co-marqués par Ki67 et MyoD, tandis que les étoiles mettent en évidence les myoblastes MyoD+/Ki67-. Barre d'échelle de 20μm.
3J) représente les quantifications des myoblastes MyoD+/Ki67+ et MyoD+/Ki67- provenant du TA et des MEO WT et R-DMDdel52 à 6 mois. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
3K-L) correspondent à une coloration par immunofluorescence des myosines sarcomériques (MF20, vert) et des noyaux (Hoechst, bleu) des myotubes différenciés du TA (K) et des MEO (L) de rats WT et R-DMDdel52 âgés de 6 mois. Barre d'échelle de 20μm.
3M) est une évaluation de l'indice de fusion par champ sur les myotubes différenciés du TA et des MEO des rats âgés de 6 mois. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
3N) représente le nombre de noyaux par myotube par champ (mm2) pour les myotubes WT et R-DMDdel52 isolés du TA et MEO des rats âgés de 6 mois. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
3O) correspond à une coloration par co-immunofluorescence de l'EdU, de Pax7/MyoD et des noyaux (Hoechst) de myoblastes triés par FACS provenant de muscles de membres isolés de rats WT et R-DMDdel52 âgés de 6 mois. Les flèches indiquent les myoblastes prolifératifs co-marqués par Ki67 et MyoD, tandis que les étoiles mettent en évidence les myoblastes MyoD-positifs négatifs pour ki67. Barre d'échelle de 20μm.
3P) correspond au pourcentage de type cellulaire (Pax7+/MyoD+ et Pax7+/MyoD-) pour évaluer la pureté des cellules après le tri FACS.
3Q) correspond à la quantification des myoblastes prolifératifs (EdU+) (Pax7:MyoD+) à partir de cellules triées par FACS et isolées des muscles des membres de rats WT et R-DMDdel52 âgés de 6 mois. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
3R) est une coloration par immunofluorescence des myosines sarcomériques (MF20, sous forme de large bande (WT) et un trait épais (DMD)) et des noyaux (Hoechst, en rond) sur des myotubes différenciés à partir de myoblastes triés par FACS de rats WT et R-DMDdel52 âgés de 6 mois. Barre d'échelle 50μm.
3S) correspond à la quantification de l'indice de fusion par champ pour l'expérience réalisée en (R).
Fig.4
illustre l’expression des marqueurs de sénescence au niveau des cellules satellites du muscleTibialis anterior(TA) R-DMDdel52 telle que détaillée dans l’exemple 4, dans laquelle :.
4A) correspond à un graphique tracé par l’algorithme t-SNE sur le regroupement des populations de cellules résidant dans les muscles, révélé par l'analyse scRNA-seq sur le TA de rats WT et R-DMDdel52 âgés de 12 mois.
4B) correspond à un graphique t-SNE divisé entre WT et R-DMDdel52.
4C) correspond à un graphique t-SNE montrant l'expression deCdkn1aetCdkn2aau niveau des cellules souches musculaires (CSM) des échantillons WT et R-DMDdel52.
4D) représente des diagrammes de violon montrant la distribution de l'expression génique de Pax7 et Myf5 comme gènes spécifiques de CSM et deCdkn1aetCdkn2acomme marqueurs de sénescence.
4E-F-G) correspondent à une coloration du TA par co-immunofluorescence, en utilisant des anticorps contre Pax7 , Cdkn2a (aussi appelé p16 ; étoile, E) ou Cdkn1a (aussi appelé p21 ; étoile, F) ou γH2AX (étoile, G), laminine (sous forme de réseau) et Hoechst pour les noyaux. Les triangles mettent en évidence les CSM PAX7+. Barre d'échelle 10μm.
4H) correspond à la quantification de E montrant le pourcentage de CSM (Pax7+) co-exprimant Cdkn2a à 3 semaines, 6 mois et 12 mois au niveau du TA des rats WT et R-DMDdel52. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
4I) correspond à la quantification de F montrant le pourcentage de CSM (Pax7+) co-exprimant Cdkn1a à 3 semaines, 6 mois et 12 mois au niveau du TA chez les rats WT et R-DMDdel52. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
4J) correspond à la quantification de G montrant le pourcentage de CSM (Pax7+) co-exprimant γH2AX à l’âge de 3 semaines, 6 mois et 12 mois au niveau du TA des rats WT et R-DMDdel52. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
Fig.5
illustre l’expression des marqueurs de sénescence au niveau des CSM de patients humains atteints de DMD telle que détaillée à l’exemple 5, dans laquelle :
5A) représente une immunofluorescence pour la chaîne lourde de la myosine embryonnaire (eMHC, gros cercle gris rempli) et la laminine (sous forme de réseau) sur des biopsies humaines témoins et DMD à l'âge de 1-2, 3-4, 5-6, 7-8 ans. Barre d'échelle 20μm.
5B) correspond à la quantification du nombre de myofibres eMHC+ par mm2par rapport à A. Moyennes ± écart-type (Contrôle n=12 ; DMD n=20), test de Mann-Whitney.
5C) est une coloration par co-immunofluorescence de biopsies musculaires de DMD et de contrôle, en utilisant des anticorps contre Pax7, Cdkn2a (rouge) et Hoechst. Les triangles jaunes mettent en évidence les CSM PAX7+. Barre d'échelle 10μm.
5D) représente la quantification de C montrant le pourcentage de CSM Pax7 co-exprimant Cdkn2a dans les biopsies musculaires DMD et contrôle. Moyennes ± écart-type (Contrôle n=12 ; DMD n=20), test de Mann-Whitney.
5E) représente un test de corrélation de Pearson montrant la corrélation entre les CSM DMD exprimant Cdkn2a et l'âge (Contrôle n=12 ; DMD n=20).
5F) est une coloration représentative par co-immunofluorescence de biopsies musculaires de DMD et de contrôle, en utilisant des anticorps contre Pax7, γH2AX (étoile) et Hoechst. Les triangles mettent en évidence les CSM PAX7+. Barre d'échelle 10μm.
5G) représente la quantification de F montrant le pourcentage de CSM (Pax7+) co-exprimant γH2AX dans les biopsies musculaires DMD et contrôle. Moyennes ± écart-type (Contrôle n=12 ; DMD n=15), test de Mann-Whitney.
5H) représente un test de corrélation de Pearson entre les CSM DMD exprimant γH2AX et l'âge (Contrôle n=12 ; DMD n=15).
Fig.6
illustre l’expression d’une signature spécifique des CSM au niveau des MEO distincte de celle au niveau du TA telle que détaillée à l’exemple 6, dans laquelle :
6A) est un graphique tracé par l’algorithme t-SNE du regroupement des populations de cellules résidant dans les muscles, révélé par scRNA-seq au niveau du TA (panneaux de gauche) et des MEO (panneaux de droite) de rats WT et R-DMDdel52 âgés de 12 mois, montrant l'expression dePax7, Pitx2, Cdkn1a, Cdkn2aetTshr. Les carrés indiquent le groupe de CSM.
6B-C) représentent des diagrammes de Violon montrant la distribution de l'expression génique dePax7, Cdkn1a, Cdkn2aen B etMyf5, Pitx2 et Tshr en C à partir de l'analyse scRNAseq effectuée au niveau du TA et des MEO de rats WT et R-DMDdel52 âgés de 12 mois.
6D) est une analyse qPCR des myoblastes dérivés des MEO et des membres en tant que pli d'expression relatif aux myoblastes dérivés des MEO pour Cdkn1a, Cdkn2a et Tshr. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
6E-G) correspondent à une coloration par co-immunofluorescence des MEO, en utilisant des anticorps contre Pax7, Cdkn2a (E) ou Cdkn1a (F) ou γH2AX (, G), laminine (sous forme de réseau) et Hoechst. Les triangles mettent en évidence les CSM (PAX7+). Barre d'échelle 10μm.
6H) correspond à la quantification de E montrant le pourcentage de CSM (Pax7+) co-exprimant Cdkn2a à l’âge de 3 semaines, 6 mois et 12 mois des rats au niveau du TA WT et R-DMDdel52. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
6I) correspond à la quantification de F montrant le pourcentage de CSM (Pax7+) co-exprimant Cdkn1a à 3 semaines, 6 mois et 12 mois chez les TA WT et R-DMDdel52. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
6J) correspond à la quantification de G montrant le pourcentage de CSM (Pax7+) co-exprimant γH2AX à 3 semaines, 6 mois et 12 mois chez les TA WT et R-DMDdel52. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
Fig.7
illustre la régulation de la sénescence au niveaux des myoblastes isolés des MEO chez les rats R-DMDdel2, dans laquelle :
7A) correspond à une immunofluorescence pour TSHR (étoiles) et Pax7/MyoD sur des myoblastes des rats âgés de 3 mois isolés des MEO (à gauche) et des muscles des membres (à droite). Les noyaux ont été colorés avec du Hoechst. Barre d'échelle de 20μm.
7B) est une coloration par co-immunofluorescence de l'EdU (panels du milieu), de Pax7/MyoD (panels à gauche) et des noyaux (Hoechst, panels de droite) des myoblastes dérivés de l'OME traités par véhicule (DMSO) ou ML224. Barre d'échelle de 20μm.
7C) correspond aux quantifications des myoblastes prolifératifs (EdU+) (Pax7/MyoD+) provenant de myoblastes dérivés des MEO traités avec le véhicule (DMSO) ou l’inhibiteur du TSHR ML224. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
7D) est une coloration par immunofluorescence des myosines sarcomériques (MF20, sous forme de bande) et des noyaux (Hoechst) de myotubes différenciés issus de cellules MEO traitées avec véhicule (DMSO) ou ML224. Barre d'échelle de 20μm.
7E) est une évaluation de l'indice de fusion par champ sur les myotubes différenciés des MEO, traités avec le véhicule (DMSO) ou ML224. Moyennes ± écart-type (n = 4), test de Mann-Whitney.
7F) correspond à une analyse qPCR sur les myoblastes dérivés des MEO traités avec véhicule ou ML224, évaluant l'expression génétique deCdkn1aetCdkn2a. Moyennes ± écart-type (n = 4-5), test de Mann-Whitney.
7G) représente une coloration représentative par co-immunofluorescence de Pax7/MyoD (panels de gauche), de l'EdU (panels du milieu) et des noyaux (Hoechst, panels de droite) sur des myoblastes isolés de muscles de membres WT et R-DMDdel52 traités par véhicule (DMSO) ou par l’activateur de l’adénylate cyclase Forskoline. Barre d'échelle de 20μm.
7H) correspond aux quantifications des myoblastes Pax7:MyoD+/EdU+ et Pax7:MyoD+/EdU- provenant de myoblastes WT et R-DMDdel52 isolés à partir de muscles des membres après traitement par la Forskoline ou par le véhicule (DMSO). Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
7I-J) correspondent à l’analyse qPCR sur des myoblastes dérivés de membres traités par véhicule ou par Forskoline provenant de rats WT et R-DMDdel52, évaluant l'expression génétique de Cdkn1a (I) et Cdkn2a (J). Moyennes ± écart-type (n = 4), test de Mann-Whitney.
7K) représente une coloration par immunofluorescence des myosines sarcomériques (MF20, sous forme de bandes) et des noyaux (Hoechst, ronds) de myotubes différenciés provenant de cellules de membres WT et R-DMDdel52 traitées par véhicule (DMSO) ou par Forskoline. Barre d'échelle de 20μm.
7L) est une évaluation de l'indice de fusion par champ sur des myotubes différenciés provenant de muscles de membres WT et R-DMDdel52, traités avec le véhicule (DMSO) ou la Forskoline. Moyennes ± écart-type (n = 4), test de Mann-Whitney.

Claims (14)

  1. Activateur pharmacologique et/ou génétique de la voie de signalisation du récepteur de la thyréostimuline (TSHR) dans des cellules souches musculaires (cellules satellites) pour son utilisation pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire en bloquant la sénescence.
  2. Activateur pour son utilisation selon la revendication 1, pour prévenir et/ou traiter les myopathies, préférentiellement la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD).
  3. Activateur pour son utilisation selon la revendication 1, pour prévenir et/ou traiter la sarcopénie.
  4. Activateur pharmacologique pour son utilisation selon l’une des revendications 1 à 3, choisi parmi un agoniste du récepteur TSHR ou un activateur de l’adénylate cyclase.
  5. Activateur pharmacologique pour son utilisation selon la revendication 4, caractérisé en ce qu’il est un activateur de l’adénylate cyclase, préférentiellement la Forskoline.
  6. Activateur génétique pour son utilisation selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu’il consiste en un vecteur choisi parmi un liposome comprenant une séquence protéique du récepteur de la thyréostimuline (TSHR) de SEQ ID NO :1 ou un variant fonctionnel ayant une séquence protéique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :1, un vecteur adénoviral comprenant la séquence protéique de SEQ ID NO :1 ou un variant fonctionnel ayant une séquence protéique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :1, ou une séquence nucléotidique du TSHR de SEQ ID NO :2 ou un variant fonctionnel ayant une séquence nucléotidique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :2, et un vecteur adénoviral comprenant une séquence CRISPR-Cas9 fusionnée avec un domaine transactivateur préférentiellement choisi parmi VP16, VP64, p65, NCO1A1, FOXO1A pour activer l’expression du TSHR.
  7. Activateur génétique pour son utilisation selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que ledit vecteur adénoviral est un virus adéno-associé (AAV), préférentiellement un AAV8 ou un AAV9.
  8. Combinaison d’un activateur pharmacologique pour son utilisation selon la revendication 4 ou 5 et d’un activateur génétique pour son utilisation selon la revendication 6 ou 7.
  9. Combinaison pour son utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que l’activateur pharmacologique est la Forskoline et l’activateur génétique est un virus adéno-associé (AAV) comprenant une séquence protéique du récepteur de la thyréostimuline (TSHR) de SEQ ID NO :1 ou un variant fonctionnel ayant une séquence protéique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :1, ou une séquence nucléotidique du TSHR de SEQ ID NO :2 ou un variant fonctionnel ayant une séquence nucléotidique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :2.
  10. Vecteur adénoviral caractérisé en ce qu’il comprend une séquence protéique du récepteur de la thyréostimuline (TSHR) de SEQ ID NO :1 ou un variant fonctionnel ayant une séquence protéique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :1, ou une séquence nucléotidique du TSHR de SEQ ID NO :2 ou un variant fonctionnel ayant une séquence nucléotidique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :2 pour son utilisation à titre de médicament.
  11. Vecteur adénoviral pour son utilisation selon la revendication 10, pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire en bloquant la sénescence.
  12. Vecteur adénoviral pour son utilisation selon la revendication 11, pour prévenir et/ou traiter les myopathies, préférentiellement la DMD.
  13. Vecteur adénoviral pour son utilisation selon la revendication 11, pour prévenir et/ou traiter la sarcopénie.
  14. Vecteur adénoviral pour son utilisation selon l’une des revendications 10 à 13, caractérisé en ce que ledit vecteur est un virus adéno-associé (AAV), préférentiellement un AAV8 ou un AAV9.
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