FR3081169A1

FR3081169A1 - Substitution de la coiffe des arn messagers par deux sequences d'arn introduites a leur extremite 5'

Info

Publication number: FR3081169A1
Application number: FR1854052A
Authority: FR
Inventors: Jerome Lemoine
Original assignee: Messenger Biopharma
Current assignee: Messenger Biopharma
Priority date: 2018-05-15
Filing date: 2018-05-15
Publication date: 2019-11-22
Anticipated expiration: 2038-05-15
Also published as: JP2021522849A; EP3794144A1; AU2019270556A1; CA3136882A1; FR3081169B1; CN112567046A; WO2019220058A1; US20210214729A1

Abstract

L'invention a pour objet une molécule d'acide ribonucléique messager (ARNm) dépourvue de molécule de coiffe, dont le coût de la synthèse par transcription in vitro est fortement réduit, comprenant de 5'à 3'au moins un exemplaire d'une séquence consensus GUCAGRYC(N7-19)GCCA(N12-19)UGCNRYCUG résistante à l'exoribonucléase Xrn1, un exemplaire d'une séquence d'ARN interne d'entrée de ribosomes (IRES), et une phase de lecture ouverte.

Description

Substitution de la coiffe des ARN messagers par deux séquences d’ARN introduites à leur extrémité 5’

Domaine

La présente invention se rapporte au domaine des acides ribonucléiques, et plus particulièrement à la synthèse in vitro de l’acide ribonucléique messager (ARNm), à sa stabilité et à sa traduction en polypeptide, notamment dans des cellules transfectées.

Introduction

L’ARNm est une molécule essentielle dans la production des polypeptides à l’échelle industrielle. Sa stabilité et l’efficacité de sa transcription et traduction influent fortement sur le rendement des polypeptides en aval et donc sur leur coût.

L’ARNm est également une molécule de choix dans les compositions pharmaceutiques utilisées dans la thérapie génique et dans la vaccination génétique. En effet, l’intégration d’une molécule d’ARNm dans le génome d’une cellule transfectée n’a jamais été démontrée, contrairement aux molécules d’ADN. Cependant, il est peu stable en solution car sensible à la dégradation par des ribonucléases. La synthèse des molécules d’ARN stables in vitro et in vivo est donc critique pour réduire les quantités d’ARNm nécessaires pour une efficacité thérapeutique optimum et ainsi réduire leur coût. De plus, l’utilisation de plus faibles quantités d’ARNm plus stable réduit le risque d’effets secondaires liés au traitement.

La synthèse in vivo se fait par des cellules en culture, telles que des levures ou des bactéries. Cependant, cette méthode présente de nombreux désavantages. La purification de l’ARNm d’intérêt intact est ainsi onéreuse et complexe, notamment du fait des problèmes de dégradation et de la présence d’autres ARN cellulaires. Elle génère de façon générale un rendement plus faible que celle obtenu par la transcription in vitro.

De ce fait, le procédé de synthèse d’ARNm à grande échelle couramment utilisé est un système acellulaire de transcription in vitro. Cette méthode n’utilise que quelques composés purifiés (i.e. un tampon de réaction, une molécule d’ADN portant un gène, une ARN polymérase recombinante et quatre ribonucléotides triphosphates) ; et le seul ARN à être produit est l’ARNm que l’on souhaite synthétiser. À la fin de la réaction, il n’y a pas de produits de dégradation de l’ARNm du fait de l’absence de RNase dans le mélange réactionnel. Il n’y a pas non plus d’autres espèces d’ARN, ce qui est un avantage majeur par rapport à la synthèse d’ARNm par des cellules en culture. La purification de l’ARNm est ainsi grandement simplifiée.

Pour assurer sa stabilité dans des cellules eucaryotes, un ARNm est doté d’une molécule de coiffe à son extrémité 5’, qui protège cette dernière des exoribonucléases. La coiffe est une molécule complexe composée de deux guanosines reliées par leur carbone 5’ par une chaîne de trois groupements phosphate. La guanosine terminale est méthylée en position 7 de la guanine. L’ARNm est stabilisé grâce à la résistance que lui procure la coiffe vis-à-vis d’une dégradation enzymatique progressive de 5’ en 3’ réalisée par l’exoribonucléase Xrn1. En plus de son rôle dans la stabilisation de l’ARNm, la coiffe exerce d’autres fonctions, dont notamment le recrutement des ribosomes (Cowling, 2010). Pour cela, la coiffe commence par recruter des facteurs d’initiation de la traduction, puis ceux-ci recrutent des ribosomes. Ces derniers traduisent ensuite l’ARNm en protéines.

À l’échelle industrielle, pour améliorer la stabilité de l’ARNm et permettre une traduction efficace de l’ARNm en polypeptides dans les cellules transfectées, une molécule de coiffe doit être incorporée à l’extrémité 5’. Lors de la transcription in vitro, la molécule de coiffe peut être ajoutée lors d’une étape ultérieure à la transcription en utilisant un enzyme de coiffage, tel que le 2'-O-methyltransferase du virus Vaccina (Martin et al., 1975). Cependant, cette étape supplémentaire augmente la complexité de la synthèse, nécessite la purification de l’enzyme de coiffage et n’est pas très efficace (Contreas et al., 1982). De plus, cet enzyme nécessite de la S-adénosyl-Lméthionine, qui est une molécule instable en solution aqueuse.

Pour simplifier la transcription in vitro, des analogues de la coiffe ont été développés dans l’art antérieur, qui ne sont toutefois pas satisfaisants. À titre d’exemple, on peut citer l’analogue P¹-(5'-7-methyl-guanosyl) P³-(5'-(guanosyl))triphosphate) ou l’analogue P¹-(5'-2,2,7-trimethyl-guanosyl) P³-(5'-(guanosyl))triphosphate). Ces analogues permettent un coiffage co-transcriptionnel médié par une ARN polymérase phagique, évitant ainsi l’étape supplémentaire de synthèse de la coiffe, et peuvent également améliorer la stabilité de l’ARNm. Cependant, selon le type d’analogue, jusqu’à 50% des molécules incorporées ont une orientation inversée, avec le nucléotide Ίméthylguanosine à proximité de la molécule d’ARN et non en position terminale, réduisant ainsi la stabilité et l’efficacité de la traduction de l’ARNm (Pasquinelli et al., 1995). Des analogues de la coiffe de type « anti-reverse » (ARCA) ont ensuite été développés, comme celui décrit dans US 7074596. Ces analogues empêchent l’incorporation inversée de la molécule. Cependant, ils restent insatisfaisants car leur utilisation induit une forte baisse du rendement de la synthèse in vitro de l’ARNm. De plus, la synthèse de la molécule de coiffe et de ses nombreux analogues modifiés chimiquement est onéreuse du fait de la complexité de ces composés. L’inclusion d’une de ces molécules dans le mélange réactionnel d’une transcription in vitro à l’échelle industrielle, augmente fortement le coût de la synthèse d’ARNm.

En effet, pour s’assurer d’une efficacité de coiffage élevée lors de la transcription in vitro, il est nécessaire de fournir un excès d’analogue de coiffe, contribuant ainsi au coût élevé des matières premières. En effet, un ratio de 4 molécules d’analogue de coiffe est préconisé par molécule de GTP pour maximiser les chances que chaque molécule d’ARNm ait une coiffe. Malgré cela, il est estimé que seulement 80% de l’ARNm synthétisé sera coiffé. De plus, la concentration en GTP est diminuée de cinq fois par rapport aux trois autres ribonucléotides triphosphates, ce qui diminue le rendement de la transcription de cinq fois.

Pour réduire le coût élevé de la transcription in vitro, une solution consiste à réduire le coût de la production de l’ADN et/ou de l’ARN polymérase utilisés dans cette méthode. Cependant, les baisses de coût obtenues restent relativement faibles. À titre alternatif, il est possible de synthétiser un ARNm circulaire dépourvu de coiffe par transcription in vitro dans un système acellulaire (WO 2014/186334 A1). Cependant, les auteurs ont démontré que l’ARNm circulaire est moins efficacement traduit dans une cellule transfectée qu’un ARNm linéaire coiffé (voir par ex. les Figures 2 et 3 et paragraphes [00121] et [00131] de WO 2014/186334 A1).

Par conséquent, il existe toujours un besoin d’une molécule d’ARNm ayant une stabilité ainsi qu’une efficacité de traduction élevée, de préférence ayant une stabilité et une efficacité de traduction au moins aussi élevée qu’une molécule d’ARNm coiffé. Il existe également un besoin d’une molécule d’ARN ayant une méthode de production simple et dont le coût de fabrication soit notablement réduit.

Description

La présente invention a pour objet une molécule d’ARNm stable pouvant être traduite avec une efficacité élevée et dépourvue de coiffe. Cet ARNm est particulièrement avantageux car son coût de production est très inférieur à celui d’un ARNm classique comprenant une molécule de coiffe ou un analogue de celle-ci. La présente invention a également pour objet une molécule d’ARNm dont le rendement de sa transcription in vitro est amélioré par rapport à celui d’un ARNm classique comprenant une molécule de coiffe ou un analogue de celle-ci. En effet, l’ARNm de l’invention est également avantageux car, malgré la baisse importante du coût de sa production et/ou l’augmentation du rendement de sa synthèse, ledit ARNm est au moins aussi performant qu’un ARNm classique doté d’une coiffe lors de la transfection de cellules en culture et de tissus. En effet, les inventeurs ont démontré de façon très surprenante que les niveaux et durées d’expression obtenus après transfection in vivo sont au moins aussi élevés que ceux d’un ARNm doté d’une coiffe. En particulier, la cinétique d’expression dans les cellules Caco-2 d’une protéine rapporteuse est identique, que l’on transfecté l’ARNm de l’invention ou un ARNm coiffé témoin (Figures 2 et 3). De même, les inventeurs ont démontré de façon très surprenante que l’expression d’une protéine rapporteuse est 2 fois à environ 10 fois supérieure lorsqu’on transfecté l’ARNm de l’invention in vivo, dans le derme ou le muscle d’une souris que lorsqu’on transfecté un ARNm coiffé témoin (Figure 5 et Figure 15). Cependant, la réaction est simplifiée car l’étape supplémentaire de coiffage n’est pas nécessaire. Il n’est pas non plus utile d’inclure de molécule d’analogue de la coiffe dans le mélange réactionnel lors de la transcription in vitro. La molécule d’ARNm de l’invention est donc nettement avantageuse en termes de coûts réduits et de production facilitée par rapport à un ARNm de l’art antérieur, pour une expression au moins aussi élevée.

Par « molécule d’ARNm » on entend au sens de la présente demande tout enchaînement linéaire de ribonucléotides. Dans la présente demande, ces enchaînements sont exprimés dans le sens 5’ vers 3’ en commençant par la région 5’-UTR.

Par « ribonucléotide » on entend tout ribonucléotide naturel (e.g. guanine, cytidine, uridine, adénosine), ainsi que des analogues de ces nucléotides ainsi que des nucléotides ayant des bases modifiées de façon chimique ou biologique (e.g. par méthylation, alkylation, acylation, thiolation, etc.), des bases intercalées, des groupements riboses modifiés et/ou des groupements phosphates modifiés.

Les inventeurs ont démontré ici de façon surprenante que la coiffe à l’extrémité 5’ d’une molécule d’ARNm peut être remplacée par au moins un exemplaire d’une séquence résistante à l’exoribonucléase Xrn1 (xrRNA), issue de la région 3’-UTR d’un virus du genre Flavivirus, de préférence accompagné d’une séquence interne d’entrée de ribosomes (1RES) par phase de lecture ouverte. De façon très avantageuse, le coût de la production par transcription in vitro d’une telle molécule d’ARNm est diminué d’environ 30 fois, par rapport à une molécule d’ARNm coiffé, et son rendement est amélioré. De plus, la molécule d’ARNm de l’invention est particulièrement stable dans des cellules transfectées, tout en étant traduite efficacement, alors même qu’elle ne possède pas de coiffe.

Par « coiffe » on entend le nucléoside 7-methylguanosine (N7-methyl guanosine or m7G) ainsi que tout mutant, variant, analogue ou fragment de celle-ci qui peut être reliée au premier nucléotide transcrit d’un ARNm par une liaison 5 -5' triphosphate. De façon nonlimitatif, les analogues de la coiffe comprennent des analogues non-méthylés (e.g. P¹(Guanosyl) P³-(5'-(guanosyl)) triphosphate), monométhylés (e.g. P¹-(5'-7-méthylguanosyl) P³-(5'-(guanosyl)) triphosphate), triméthylés (e.g. P¹-(5'-2,2,7-triméthylguanosyl) P³-(5'-(guanosyl)) triphosphate), ou ayant une substitution du groupement 3 OH de la moitié guanine m⁷ par un groupement 3'-0-methyl (e.g. l’ARCA P¹-(5'-(3'-Ométhyl)-7-méthyl-guanosyl) P³-(5'-(guanosyl))triphosphate).

Selon un premier aspect, l’invention a donc pour objet une molécule d’acide ribonucléique messager (ARNm) dépourvue de molécule de coiffe comprenant :

• une région 5’-UTR comprenant au moins un exemplaire d’une séquence consensus GUCAGRYC(N₇.₁₉)GCCA(N₁₂.₁₉)UGCNRYCUG (xrRNA) ;

• au moins un exemplaire d’une séquence d’ARN interne d’entrée de ribosomes (1RES) ; et • au moins une phase de lecture ouverte.

De préférence, une séquence d’ARN 1RES se trouve en amont de chaque phase de lecture ouverte.

Selon un mode préférentiel, l’invention a pour objet une molécule d’acide ribonucléique messager (ARNm) dépourvue de molécule de coiffe comprenant de 5’ à 3’ :

• une région 5’-UTR comprenant au moins un exemplaire d’une séquence consensus GUCAGRYC(N₇-19)GCCA(N₁₂.₁₉)UGCNRYCUG (xrRNA) ;

• un exemplaire d’une séquence d’ARN interne d’entrée de ribosomes (1RES) ; et • une phase de lecture ouverte.

De préférence, la molécule d’ARNm comprend également une région 3’-UTR.

De préférence, la molécule d’ARNm comprend également au moins un ARN aptamère favorisant la pénétration de la molécule d’ARNm dans les cellules, de préférence dans des cellules musculaires. L’ARN aptamère peut notamment favoriser la pénétration directement ou indirectement via un peptide.

De préférence, la molécule d’ARNm comprend en outre une tige-boucle à l’extrémité 5’.

Dans un mode de réalisation préférentiel, l’invention a pour objet une molécule d’acide ribonucléique messager (ARNm) dépourvue de molécule de coiffe consistant en, de 5’ à 3’ :

• une région 5’-UTR comprenant au moins un exemplaire d’une séquence consensus GUCAGRYC(N₇.19)GCCA(N₁₂.₁₉)UGCNRYCUG (xrRNA) ;

Il a été démontré dans l’art antérieur que la région non-traduite 3’-UTR des Flavivirus a la propriété de bloquer Xrn1 et de protéger ainsi la séquence en aval (Chapman et al., 2014). Cette région d’ARN est composée d’au moins une séquence qui se replie sur ellemême en formant une structure tridimensionnelle complexe, laquelle inhibe la progression de Xrn1 et donc la dégradation des ARN subgénomiques viraux. Cependant, de telles séquences n’avaient jusqu’ici jamais été insérées en 5’ d’un ARNm. On pouvait en effet craindre que ces séquences puissent nécessiter d’être dans le contexte du 3’UTR du génome des Flavivirus pour exercer leur fonction. En particulier, ces structures tridimensionnelles pourraient ne pas se replier correctement lorsqu’elles ne sont plus entourées par les séquences de la région 3’UTR flavivirale.

Alors que l’art antérieur suggérait que les séquences xrRNA inhibent la traduction, les inventeurs ont cependant démontré ici de façon surprenante que les fonctions protectrice et d’initiation de la traduction de la coiffe peuvent être remplacées avec succès par au moins un exemplaire d’une séquence xrRNA et au moins un exemplaire d’une séquence 1RES, de préférence du virus EMCV sans affecter l’efficacité de la traduction. De façon très surprenante, l’utilisation des séquences xrRNA et 1RES permet même d’améliorer l’efficacité de la traduction de façon très importante.

Par « Flavivirus » on entend tout virus du genre Flavivirus, comprenant le virus de la fièvre jaune, de la dengue, du Nil occidental (WNV), du Zika, d’encéphalite japonaise, de Rocio, de vallée de Murray, de Bagaza, de Kokobera, de Ntaya, de Kedougou, de Sepik, de Saint Louis, d’Usutu, d’Alfuy, de Wesselbron, d’Ilheus, de Bussuquara, de Tembusu, de Chaoyang, de Yokose, de Donngang, ainsi de tout autre virus du genre Flavivirus.

L’invention a ainsi pour objet une molécule d’ARNm stable comprenant au moins un exemplaire d’une séquence xrRNA dans la région 5’ dudit ARNm. Ledit ARNm est efficacement traduit en protéine à des niveaux et durées semblables à ceux d’une molécule coiffée. Selon un mode préféré de l’invention, la molécule d’ARNm comprend deux exemplaires de xrRNA.

Par « séquence d’ARN résistante à Xrn1 » ou « xrRNA » on entend toute séquence polynucléotidique permettant de réduire, ralentir ou empêcher la dégradation d’un ARNm par l’exoribonucléase Xrn1. De préférence, la séquence xrRNA comprend une séquence consensus.

Par « séquence consensus » on entend toute séquence comprenant au moins la séquence représentée par : S’-GUCAGRYCjNMçjGCCAjN^.^jUGCNRYCUG-S’, dans laquelle chaque N peut représenter de façon indépendante un nucléotide sélectionné parmi A, C, T, G, et U ou un analogue d’un de ceux-ci. Chaque R représente une purine et chaque Y représente une pyrimidine. Le nombre de nucléotides N entre les bases conservées peuvent varier dans la séquence consensus, de 5’ à 3’, de 7 à 19 bases et de 12 à 19 bases, comme indiqué. Ladite séquence forme une structure tridimensionnelle de type tige-boucle.

De préférence, la molécule d’ARNm comprend au moins un exemplaire d’une séquence xrRNA choisie parmi les séquences représentées par : SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 44. Quand la molécule d’ARNm comprend plus d’un exemplaire desdites séquences, ces exemplaires peuvent être identiques ou différents. Ainsi de façon plus préférée, la molécule d’ARNm comprend au moins un exemplaire d’une des séquences représentées par SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 26. De façon encore plus préférentielle, la molécule d’ARNm comprend un exemplaire de la séquence représentée par SEQ ID NO : 11 et un exemplaire de la séquence représentée par SEQ ID NO : 26.

De préférence, quand il y a deux séquences xrRNA dans la région 5’UTR, elles sont séparées par une séquence d’espacement. De même, il pourrait y avoir une séquence d’espacement entre une séquence xrRNA et une séquence 1RES. De façon préférentielle, la séquence d’espacement entre deux séquences de xrRNA correspond à SEQ ID NO : 47.

De façon préférentielle, la séquence d’espacement entre la séquence xrRNA et la séquence 1RES correspond à SEQ ID NO : 48. Une séquence d’espacement peut aussi être présente entre deux phases de lecture ouvertes ou entre une phase de lecture ouverte et une séquence PIRES, lorsque la molécule d’ARNm comprend au moins deux phases de lecture ouvertes.

Par « séquence d’espacement » on entend toute séquence polynucléotidique non codante permettant de séparer physiquement la séquence en amont de ladite séquence d’espacement de la séquence en aval. La molécule d’ARNm selon l’invention peut notamment comprendre une ou plusieurs séquences d’espacement.

Dans certains modes de réalisation, la séquence d’espacement peut être de 2 à 300 nucléotides en longueur. De préférence elle est comprise 2 et 10 nucléotides, encore plus préférentiellement entre 2 et 5 nucléotides. À titre alternative, elle peut être comprise entre 10 et 150 nucléotides et de façon encore plus préférentielle, entre 15 et 40 nucléotides. De préférence, la séquence d’espacement ne génère pas de structures secondaires.

L’ARNm de l’invention comprend en outre au moins une séquence d’ARN interne d’entrée de ribosomes (1RES).

Par « internai ribosome entry site » ou « 1RES » on entend toute séquence polynucléotidique qui permet d’initier la traduction d’une molécule d’ARNm indépendamment de la coiffe. Elles interagissent directement avec des facteurs d’initiation de la traduction, qui recrutent ensuite les ribosomes au niveau d’un codon d’initiation de la traduction. De nombreuses séquences 1RES sont connues (Mokrejs et al., 2010). L’homme du métier pourra donc identifier des séquences fonctionnant comme des 1RES et choisir celles adaptées à la mise en œuvre de l’invention. La séquence 1RES selon l’invention peut ainsi être d’origine eucaryote ou virale, par exemple issue du genre Picornavirus. De préférence elle est issue du virus de l’encéphalomyocardite (EMCV) (Borman et al.1995) ou de l’ARNm humain elF4G. De façon encore plus préférentielle, la séquence ADN de l’IRES correspond à SEQ ID NO : 45.

Les séquences 1RES sont habituellement localisées dans la région 5’-UTR. Elles peuvent aussi être situées entre deux phases de lecture ouverte, ce qui permet d’initier une traduction bi- ou polycistronique à partir d’un seul ARNm. Dans un mode de réalisation préféré, l’ARNm de l’invention comprend un seul exemplaire d’une séquence 1RES dans la région 5’ dudit ARNm. Selon un mode de réalisation préféré, un deuxième exemplaire d’une séquence 1RES est situé entre deux phases de lecture ouverte. Selon encore un autre mode de réalisation préféré, l’ARNm de l’invention comprend un exemplaire d’une séquence 1RES dans la région 5’ et un exemplaire d’une séquence 1RES entre deux phases de lecture ouverte. Avantageusement, ladite(s) séquence(s) 1RES est/sont située(s) en aval de(s) séquence(s) xrRNA. Cette organisation permet, de façon avantageuse, de protéger ces séquences de l’exoribonucléase Xrn1. Lorsque la molécule d’ARNm comprend au moins deux séquences 1RES, lesdites séquences peuvent être identiques ou différentes. En particulier, une ou plusieurs séquences 1RES peuvent être sélectionnées selon leur efficacité d’initiation de la traduction. La sélection de deux séquences 1RES différentes est particulièrement avantageuse lorsque la molécule d’ARNm comprend au moins deux phases de lecture ouvertes différentes et que l’efficacité de traduction souhaitée pour la première phase de lecture ouverte diffère de celle souhaitée pour la deuxième.

Les éléments 1RES ont également des structures tridimensionnelles complexes. De ce fait, une interférence réciproque entre séquences xrRNA et 1RES est possible par la formation d’appariements entre des séquences d’ARN de chacune des deux régions. Une telle interférence pourrait empêcher la formation des structures correctes des séquences xrRNA et 1RES respectivement. De plus, les structures xrRNA pourraient en particulier empêcher le recrutement des facteurs d’initiation de la traduction et des ribosomes effectué par l’IRES. De façon encore plus inattendue, les inventeurs ont montré que la présence des séquences xrRNA et 1RES permet d’obtenir des rendements d’expression protéique dans des cellules transfectées, qui sont au moins similaires à ceux obtenus avec une molécule d’ARNm coiffée. Les séquences xrRNA et 1RES ensemble peuvent donc se substituer à une molécule de coiffe ou d’analogue de coiffe. Elles sont indispensables pour assurer la traduction d’une phase ouverte de lecture contenue dans l’ARNm de l’invention et la stabilité de l’ARNm.

Dans des cellules transfectées, l’ARNm de l’invention est ainsi au moins aussi stable qu’un ARNm doté d’une coiffe, tout en étant au moins aussi efficacement traduit. De plus, le coût de sa synthèse par transcription in vitro est fortement réduit par rapport à celui d’un ARNm coiffé.

Selon un mode de réalisation particulière, l’ARNm de l’invention comprend en outre une tige-boucle dans la région 5’-UTR en amont de la séquence consensus GUCAGRYC(N₇.

^JGCCAÎN^.^JUGCNRYCUG (xrRNA), de préférence à l’extrémité 5’ de la molécule d’ARNm.

Par « tige-boucle » on entend toute séquence polynucléotidique formant une structure en forme de double hélice dans laquelle l'extrémité 5' d'un brin est physiquement liée à l'extrémité 3' de l'autre brin à travers une boucle non appariée. Ainsi, la tige-boucle est constituée d'une tige double brin et d'une boucle simple brin non appariée. Ladite liaison physique peut être soit covalente soit non covalente. Préférentiellement, ledit lien physique est une liaison covalente. La taille de la boucle d’ARN peut être par exemple entre 3 et 30 nucléotides. La taille de la boucle est de préférence d’au moins 3 nucléotides, de préférence d’au moins 4 nucléotides. La longueur de la tige double brin peut être par exemple compris entre 5 et 50 nucléotides. La longueur de la tige est de préférence entre 5 et 50, 5 et 40, 5 et 30, 5 et 25, ou plus préférentiellement entre 5 et 10 nucléotides. Encore plus préférentiellement, la longueur de la tige est de 6, 7, ou 8 nucléotides.

Dans le cadre de la présente invention, une tige-boucle est préférentiellement formée à l’extrémité 5’ de la molécule d’ARNm. Selon un mode de réalisation préférentiel, la tigeboucle à la séquence de SEQ ID NO : 87. La tige-boucle est préférentiellement séparée de la séquence xrRNA par une séquence d’espacement. De préférence, ladite séquence d’espacement a une longueur égale ou inférieure à 5 nucléotides (i.e. de 5, 4, 3, ou 2 nucléotides). En effet, de façon très surprenante, les inventeurs ont démontré que l’ajout d’une structure tige-boucle à l’extrémité 5’ de la molécule d’ARNm (aussi appelée 5’-SL ici, pour « stem-loop » à l’extrémité 5’) permet d’améliorer encore plus la traduction in vivo, lorsque celle-ci est à proximité de la séquence xrRNA (e.g. à 5 nucléotides ou moins). En effet, les inventeurs n’ont pas observé d’effet avantageux lorsque la tige-boucle placée à l’extrémité 5’ est séparée de la séquence xrRNA par une séquence d’espacement ayant une longueur d’environ 70 nucléotides (voir la Fig. 15).

Sans être liée par la théorie, et de façon très surprenante, on pourrait penser que la séquence xrRNA masque l’extrémité 5’ vis-à-vis des phosphatases et de Xrn1, au moins lorsque cette séquence est en forme de tige boucle et à proximité.

Dans un mode de réalisation préférentiel, l’invention a donc pour objet une molécule d’acide ribonucléique messager (ARNm) dépourvue de molécule de coiffe comprenant de 5’ à 3’ :

• un exemplaire d’une séquence d’ARN interne d’entrée de ribosomes (1RES) ; et • une phase de lecture ouverte, comprenant en outre une tige-boucle à l’extrémité 5’.

La molécule d’ARNm peut comprendre en outre une deuxième séquence 1RES suivi par une deuxième phase de lecture ouverte. La molécule d’ARNm peut comprendre en outre un ARN aptamère telle que défini ici, localisé entre la tige-boucle et la/les séquence(s) xrRNA ou, de préférence, entre la/les séquence(s) xrRNA et la séquence 1RES. La molécule d’ARNm peut comprendre en outre une région 3’-UTR telle que définie ici.

Dans un mode de réalisation préférentiel, l’invention a pour objet une molécule d’acide ribonucléique messager (ARNm) dépourvue de molécule de coiffe comprenant de 5’ à 3’ :

• une région 5’-UTR comprenant une tige-boucle à l’extrémité 5’ suivi par au moins un exemplaire d’une séquence consensus GUCAGRYC(N7_₁₉)GCCA(N₁₂. ₁₉)UGCNRYCUG (xrRNA) ;

• optionnellement, un ARN aptamère ;

• une région 5’-UTR comprenant une tige-boucle à l’extrémité 5’ suivi par au moins un exemplaire d’une séquence consensus GUCAGRYC(N7.₁₉)GCCA(N₁₂. ₁₉)UGCNRYCUG (xrRNA) ;

• optionnellement, un ARN aptamère ;

• un exemplaire d’une séquence d’ARN interne d’entrée de ribosomes (1RES) ; et • une phase de lecture ouverte ; et • une région 3’-UTR.

Par « aptamère » on entend tout acide nucléique présentant des propriétés de reconnaissance et de spécificité liées à sa capacité à adopter des structures tridimensionnelles particulières, notamment semblables aux anticorps monoclonaux (voir par exemple Dunn et al., 2017). Un aptamère peut être composé d’ADN, d’ARN et/ou d’ARN modifié, de préférence d’ARN. Ledit aptamère peut être composé de 6 à 50 nucléotides, tel que des ribonucléotides tels que définis ci-dessus. À titre d’exemple non-limitatif, l’aptamère peut être isolé selon différentes techniques qui sont bien connues de l’homme de métier, telle que l’identification d’un aptamère in vitro par un ou plusieurs cycles de sélection in vitro ou à partir de banques combinatoires d'un grand nombre de composés de séquence aléatoire par une méthode de sélection itérative (technique «SELEX»). L’identification d’un aptamère in vitro par sélection permet avantageusement d’obtenir des aptamères ayant un effet ou fonction précise, sans toutefois avoir besoin de connaître la cible contre laquelle ledit aptamère est dirigé. La fabrication ou la sélection d'aptamères est, e.g., décrit dans la demande de brevet européen EP0533838. Avantageusement, des ARN aptamères ont été identifiés dans le cadre de la présente invention selon leur capacité à pénétrer des cellules d’intérêt, plus particulièrement des cellules tissulaires, de préférence des cellules musculaires (e.g. des cellules de fibres musculaires). Avantageusement, l’aptamère selon l’invention est capable de traverser une membrane cellulaire, plus préférablement la membrane plasmique et/ou la membrane endosomale d’une cellule de mammifère.

L’aptamère selon l’invention comprend avantageusement 6 à 50 nucléotides, plus avantageusement de 10 à 45 nucléotides, de 20 à 40 nucléotides, encore plus avantageusement de 30 à 40 nucléotides. Avantageusement, l’aptamère est composé de ribonucléotides, tels que définis ci-dessus. Avantageusement, l’aptamère selon l’invention à au moins 70 % d’identité, plus avantageusement au moins 80 % d’identité, au moins 90 % d’identité, au moins 95 % d’identité, au moins 96 % d’identité, au moins 97 % d’identité, au moins 98 % d’identité, encore plus avantageusement au moins 99 % d’identité avec l’aptamère A ayant la séquence de SEQ ID NO : 64, l’aptamère B ayant la séquence de SEQ ID NO : 65, ou l’aptamère C ayant la séquence de SEQ ID NO : 66.

Les pourcentages d’identité auxquels il est fait référence dans le cadre de l’exposé de la présente invention sont déterminés sur la base d’un alignement global des séquences à comparer, c’est-à-dire sur un alignement des séquences prises dans leur intégralité sur toute la longueur en utilisant tout algorithme bien connu de l'homme du métier tel que l’algorithme de Needleman et Wunsch, 1970. Cette comparaison de séquences peut être effectuée à l'aide de tout logiciel bien connu de l'homme du métier, par exemple le logiciel needle en utilisant le paramètre « Gap open » égal à 10.0, le paramètre « Gap extend » égal à 0.5 et une matrice « Blosum 62 ».

Avantageusement, l’aptamère selon l’invention est choisi parmi l’aptamère A ayant la séquence de SEQ ID NO : 64, l’aptamère B ayant la séquence de SEQ ID NO : 65, et l’aptamère C ayant la séquence de SEQ ID NO : 66, encore plus avantageusement, choisi parmi l’aptamère A ayant la séquence de SEQ ID NO : 64 et l’aptamère C ayant la séquence de SEQ ID NO : 66.

De préférence, la molécule d’ARNm selon l’invention comprend au moins un exemplaire d’un aptamère capable de traverser une membrane, de préférence une membrane plasmique et/ou une membrane endosomale de mammifère. Ainsi de façon avantageuse, lorsque la molécule d’ARN selon la présente invention comprend un aptamère, ledit aptamère favorise sa pénétration dans des cellules, de préférence dans des cellules musculaires ou de la peau. De préférence, la molécule d’ARNm selon l’invention comprend au moins un exemplaire de l’aptamère A ayant la séquence de SEQ ID NO : 64, de l’aptamère B ayant la séquence de SEQ ID NO : 65, et/ou l’aptamère C ayant la séquence de SEQ ID NO : 66.

L’aptamère favorisant la pénétration de la molécule d’ARNm dans des cellules cibles, n’a pas nécessairement besoin d’être protégé de la dégradation par les exonucléases, qui a lieu majoritairement dans le cytosol des cellules. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, la molécule d’ARNm comprend l’aptamère dans la région 5’-UTR en amont de l’une ou plusieurs séquence(s) consensus GUCAGRYCjNMçjGCCAjN^. YUGCNRYCUG (xrRNA). Selon un mode de réalisation alternatif, l’aptamère est placé dans la région 5’-UTR en aval de l’une ou plusieurs séquence(s) consensus GUCAGRYCjNMçjGCCAjN^.^jUGCNRYCUG (xrRNA) mais en amont des séquences 1RES et des phases de lecture ouvertes. (Voir la Figure 1J et 1K pour des schémas représentatifs de ces deux possibilités.) Ainsi, selon un mode préféré, l’invention a pour objet une molécule d’acide ribonucléique messager (ARNm) dépourvue de molécule de coiffe comprenant de 5’ à 3’ :

• une région 5’-UTR comprenant au moins un aptamère capable de traverser une membrane cellulaire, de préférence une membrane plasmique et/ou endosomale, de préférence d’une cellule de mammifère, de préférence au moins un aptamère choisi parmi les aptamères A, B, et C tels que décrits ici, et au moins un exemplaire d’une séquence consensus GUCAGRYCjNMçjGCCAjN^. ₁₉)UGCNRYCUG (xrRNA) ;

De préférence, la molécule d’ARNm comprend l’aptamère dans la région 5’-UTR en amont de(s) séquence(s) consensus GUCAGRYCiNy.^JGCCAiN^.^JUGCNRYCUG (xrRNA) (voir par exemple la Figure 1F). Toutefois, la molécule d’ARN peut également comprendre l’aptamère en aval de(s) séquence(s) consensus GUCAGRYCiNy.^JGCCAiN^. ₁₉)UGCNRYCUG (xrRNA), par exemple, entre la/les séquences(s) consensus xrRNA et la/les séquences(s) 1RES.

Ainsi, selon un mode préféré, l’invention a pour objet une molécule d’ARNm dépourvue de molécule de coiffe comprenant de 5’ à 3’ :

• une région 5’-UTR comprenant une tige-boucle à l’extrémité 5’ suivi par au moins un exemplaire d’une séquence consensus GUCAGRYC(Ny.₁₉)GCCA(N₁₂. ₁₉)UGCNRYCUG (xrRNA) ;

• au moins un aptamère capable de traverser une membrane cellulaire ;

Alors que les aptamères B et C ont été sélectionnés pour leur capacité à pénétrer des cellules de fibres musculaires, l’aptamère A correspond à l’aptamère « shot47 », identifié par Tsuji et al., 2013. L’aptamère A se lie avantageusement à un motif peptidique de type poly-histidine avec une grande affinité. L’aptamère A peut ainsi fixer toute molécule (e.g. un peptide ou une protéine) comprenant une étiquette polyhistidine (e.g. le motif HHHHHH). À titre d’exemple non-limitatif, la molécule d’ARNm selon l’invention peut être liée par le biais de l’aptamère A à une molécule lui permettant de mieux pénétrer des cellules, tel qu’un « peptide pénétrant les cellules » ou « CPP », ledit CPP comprenant une étiquette poly-histidine.

Par « peptide pénétrant les cellules » ou « CPP » on entend tout peptide, polypeptide, ou protéine qui est capable de traverser une membrane cellulaire, plus préférablement la membrane plasmique et la membrane endosomale, d’une cellule de mammifère. Avantageusement, le CPP conserve cette propriété lorsqu’il est lié à une autre molécule, notamment une molécule d’ARNm, entraînant ainsi la traversée de la membrane par cette dernière. Dans le contexte de la présente invention, tout mécanisme possible de la traversée de la membrane est envisagé comprenant, par exemple, des mécanismes de transport dépendant de l’énergie (c'est-à-dire actifs, par exemple l’endocytose) et des mécanismes de transport indépendant de l'énergie (par exemple la diffusion). De façon générale, les CPPs sont des peptides cationiques (Poillot et De Waard, 2011). À titre d’exemple non-limitatif, la molécule d’ARNm peut être liée de façon non covalente au vu de sa charge négative au CPP, en profitant des interactions électrostatiques et/ou de l’hydrophobicité. De façon alternative, la molécule d’ARNm peut être liée de façon covalente au CPP. Les CPPs peuvent former des oligomères constitués d'au moins deux molécules peptidiques identiques ou différentes.

Dans la cadre de la présente invention, un CPP se lie de préférence de façon non covalente sur un ARN aptamère. En effet, ce type de liaison est avantageux du fait de sa simplicité, par simple mélange des molécules CPP et ARNm, de son faible coût et du fait que ces molécules sont entièrement biodégradables. En effet, aucun groupement chimique non naturel et non biodégradable n’est nécessaire.

La longueur des CPPs selon la présente invention est de préférence d’environ 8 résidus d’acides aminés à environ 60 résidus d’acides aminés. Plus préférablement, la longueur est de 8 à 40 résidus d’acides aminés, plus préférablement de 8 à 30 résidus d’acides aminés, encore plus préférablement de 10 à 25 résidus d’acides aminés (par exemple, 13 ou de 20 résidus d'acides aminés). L’homme du métier reconnaîtra toutefois que la longueur des CPPs n'est pas nécessairement limitée à celles décrites ci-dessus. Des dérivés des CPPs décrits ici, ayant par exemple des longueurs différentes, peuvent notamment être créés par l'homme du métier au vu de ses connaissance générales.

À titre d’exemple non-limitatif, le CPP de l’invention peut être le CPP « M12 » tel que décrit par Gao X. et al., 2014, le CPP « CPP2 » ou « CPP3 » tel que décrit par Kamada et al. 2007, ou le CPP « CPP1 » tel que décrit par Lee et al., 2012, ainsi que tout variant ou dérivé de ceux-ci. Selon un mode préférentiel, ledit CPP comprend un motif polyhistidine (e.g. hexahistidine), préférentiellement lié audit CPP par un espaceur. Avantageusement, l’espaceur est un espaceur hydrophile, avantageusement non structuré et non chargé, encore plus avantageusement constitué de glycines et de sérines. Avantageusement, l’espaceur a une longueur d’environ 21 acides aminés, de préférence de 21 acides aminés.

Avantageusement, les CPPs selon l’invention ont au moins 70 % d’identité, plus avantageusement au moins 80 % d’identité, au moins 90 % d’identité, au moins 95 % d’identité, au moins 96 % d’identité, au moins 97 % d’identité, au moins 98 % d’identité, encore plus avantageusement au moins 99 % d’identité avec le peptide M12-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 75, le peptide CPP1-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 76, le peptide CPP2-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 77, ou le peptide CPP3-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 78. Selon un mode particulièrement préféré, le CPP selon l’invention est choisi parmi : M12-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 75, CPP1-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 76, CPP2-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 77, et CPP3-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 78, encore plus préférentiellement choisi parmi : CPP1-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 76, CPP2-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 77, et CPP3-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 78. Avantageusement, le CPP est lié à la molécule d’ARNm de façon non covalente ou covalente, de préférence non covalente. Avantageusement, le CPP est lié à un ARN aptamère compris dans la molécule d’ARNm (i.e. l’aptamère A lorsque le CPP comprend une étiquette polyhistidine).

De préférence, les CPPs de la présente invention n'exercent pas d'effets cytotoxiques et / ou immunogènes significatifs sur leurs cellules cibles après avoir traversé la membrane plasmique, c'est-à-dire qu’ils n’interfèrent pas avec la viabilité cellulaire, transfection cellulaire et / ou pénétration. Par le terme « non significatif », tel qu'utilisé dans ce contexte, on entend que moins de 50 %, de préférence moins de 40 % ou 30 %, de préférence moins de 20 % ou 10 % et en particulier moins de 5% des cellules cibles sont tués après que la molécule d’ARNm liée au CPP a traversé la membrane plasmique, et a donc été internalisé par la cellule. L'homme du métier connaît bien les méthodes de détermination de la cytotoxicité d’un composé donné et / ou de la viabilité d’une cellule cible à laquelle un tel composé est appliqué (voir, par exemple, Ausubel et al., 2001). Des kits de dosage correspondants sont disponibles dans le commerce auprès de divers fournisseurs. Dans des modes de réalisation spécifiques, les effets cytotoxiques et / ou immunogènes intrinsèques potentiels d'un CPP de l'invention peuvent être « masqués » en introduisant une ou plusieurs modifications dans le peptide, par exemple au moyen de la synthèse chimique ou de l’ADN recombinant. De telles modifications peuvent comprendre, par exemple, l’addition, l’élimination ou la substitution de groupes fonctionnels ou la variation des positions de ces groupes fonctionnels. L’homme du métier sait très bien comment un tel « masquage » peut être accompli pour un peptide donné.

• une région 5’-UTR comprenant au moins l’ARN aptamère A de SEQ ID NO : 64 et au moins un exemplaire d’une séquence consensus GUCAGRYC(N7.₁₉)GCCA(N₁₂. ₁₉)UGCNRYCUG (xrRNA) ;

selon laquelle ladite molécule d’ARNm est liée à un peptide pénétrant les cellules (CPP) fusionné à une étiquette poly-histidine, ledit CPP étant choisi de préférence parmi : M12-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 75, CPP1-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 76, CPP2-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 77, et CPP3-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 78. De préférence, ledit CPP est lié de façon non covalente à l’aptamère.

Par « phase de lecture ouverte » on entend toute séquence polynucléotidique qui peut être traduite en un polypeptide d’intérêt. Une phase de lecture ouverte est lue en blocs de trois nucléotides successifs, appelés codons, chaque codon représentant un acide aminé. Lors de la traduction, le polypeptide est synthétisé par la traduction des codons de ladite phase de lecture ouverte par des ribosomes.

Le premier acide aminé du polypeptide est généralement indiqué sur la molécule d’ARNm par le codon AUG, lequel indique donc le début de la phase de lecture ouverte. D'autres codons de départ sont connus, tels que AUN, ou NUG, dans laquelle N correspond à A, C, U ou G. La fin du polypeptide est indiquée sur la molécule d’ARNm sous la forme d'un codon stop UAA, UGA ou UAG. Le codon stop indique la fin de la phase de lecture ouverte sur la molécule d’ARNm.

Les phases de lecture ouvertes selon l’invention sont plus particulièrement des phases de lecture ouvertes dont la traduction dans la cellule transfectée génère des produits ayant un intérêt thérapeutique ou vaccinal pour des applications en médecine humaine ou vétérinaire. De préférence, les produits d’intérêt thérapeutique sont des protéines.

Parmi les protéines d'intérêt thérapeutique, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, etc. (FR 92 03120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc., les apolipoprotéines : ApoAl, ApoAIV, ApoE, etc. (FR 93 05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 91 11947), les protéines suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev, etc. (FR 93 04745), les facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII, IX, etc., les protéines proapoptotiques : thymidine kinase, cytosine désaminase, etc. ; ou encore tout ou partie d'une immunoglobuline naturelle ou artificielle (Fab, ScFv, etc., voir par exemple WO 2011/089527), un ARN ligand (WO 91/19813), etc.

La protéine d'intérêt codée par l’ARNm peut aussi être un antigène, capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire, en vue de la réalisation de vaccins. Il peut s'agir notamment de protéines antigèniques spécifiques du virus d’Epstein Barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212). Enfin, la protéine d’intérêt peut être une protéine adjuvante, qui stimule la réponse immunitaire, afin d’améliorer l’efficacité d’un vaccin.

La protéine d'intérêt codée par l’ARNm peut être une protéine qui a un effet favorable sur une molécule d’ARNm dépourvu de coiffe ou la protéine exprimée par ladite molécule. Cet effet favorable pourrait résulter de différents mécanismes. À titre d’exemple non-limitatif, une protéine codée par l’ARNm dépourvu de coiffe peut augmenter la stabilité d’une molécule d’ARNm dépourvu de coiffe en se liant à ladite molécule ou en dégradant au moins une protéine ayant une activité RNase. À titre d’exemple non-limitatif, une protéine codée par l’ARNm dépourvu de coiffe peut augmenter la traduction de ladite molécule en favorisant le recrutement des facteurs d’initiation ou en liant les ARNm cellulaires coiffés afin d’inhiber leur traduction. À titre d’exemple non-limitatif, la protéine d'intérêt codée par l’ARNm est la protéine 2Apro issue d’un picornavirus, tel que le rhinovirus humain de type 2 (HRV2). Sans être liée par la théorie, on peut penser que la protéine 2Apro augmente l’expression de l’ARNm dépourvu de coiffe au vu de son activité protéase, clivant l’extrémité N-terminale du facteur d’initiation elF4G et empêchant ainsi ledit facteur d’initiation de reconnaître un ARNm coiffé. Ce clivage pourrait permettre de réduire la compétition entre l’ARNm de l’invention et les ARNm coiffés in vivo. En effet, les inventeurs ont montré de façon surprenante que la co-transfection des cellules avec un premier ARNm selon l’invention codant 2Apro et un deuxième ARNm selon l’invention codant une protéine rapporteuse permet d’augmenter l’expression de la protéine rapporteuse. La présence de la protéine 2Apro est donc particulièrement avantageuse car elle permet d’augmenter l’expression spécifique de la protéine codée par un ARNm de l’invention dépourvu de coiffe (Figure 7).

Selon un mode de réalisation préférentiel, l’ARNm de l’invention code une protéine 2Apro, de préférence une protéine 2Apro issue d’un picornavirus, encore plus préférentiellement du virus HRV2. Selon un mode de réalisation particulier, la protéine 2Apro a la séquence de SEQ ID NO : 81 Selon un mode de réalisation particulier, la protéine 2Apro est codée par un ARNm ayant la séquence de SEQ ID NO : 80.

La phase de lecture ouverte peut également coder un ARNm thérapeutique. Celui-ci peut-être, par exemple, une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler la transcription ou la traduction d’ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d’ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308.

De préférence, l’ARNm de l’invention comprend, en outre la(les) séquence(s) xrRNA et la séquence 1RES, une phase de lecture ouverte codant un polypeptide d’intérêt. De préférence, cette phase de lecture ouverte est située en aval de la(les) séquence(s) xrRNA. L’homme du métier comprendra aisément que l’ARNm peut comprendre plusieurs phases de lecture ouvertes. Ainsi, l’ARNm peut être monocistronique, bicistronique ou polycistronique. L’ARNm est monocistronique quand il ne comprend qu’une seule phase de lecture ouverte. Il est bicistronique quand il comprend deux phases de lecture ouvertes et polycistronique quand il comprend au moins deux phases de lecture ouvertes.

L’ARNm de l’invention peut également comprendre une ou plusieurs régions non codantes. Ces régions non codantes peuvent notamment être des régions entre deux phases de lecture ouvertes. Dans ce cas, des séquences 1RES sont avantageusement dans ces régions non codantes situées entre deux phases de lecture ouvertes.

Selon un mode de réalisation particulier, la molécule d’acide ribonucléique messager (ARNm) dépourvue de molécule de coiffe ou d’analogue de coiffe comprend de 5’ à 3’ :

• une région 5’-UTR comprenant au moins un exemplaire d’une séquence consensus GUCAGRYC(N₇.₁₉)GCCA(N₁₂.₁₉)UGCNRYCUG (xrRNA), le ou lesdites exemplaires de ladite séquence étant suivis par un seul exemplaire d’une séquence d’ARN interne d’entrée de ribosomes (1RES) ;

• une phase de lecture ouverte ; et • une région 3’-UTR comprenant une séquence poly(A).

Avantageusement ladite molécule d’ARNm comprend également au moins un ARN aptamère favorisant la pénétration de ladite molécule dans des cellules cibles, de préférence des cellules musculaires. Avantageusement, ladite molécule d’ARNm comprend au moins un aptamère choisi parmi l’aptamère A ayant la séquence de SEQ ID NO : 64, l’aptamère B ayant la séquence de SEQ ID NO : 65, et l’aptamère C ayant la séquence de SEQ ID NO : 66.

Selon un autre mode de réalisation particulier, la molécule d’acide ribonucléique messager (ARNm) dépourvue de molécule de coiffe ou d’analogue de coiffe consiste en de 5’ à 3’ :

• une région 5’-UTR comprenant au moins un exemplaire d’une séquence consensus GUCAGRYC(N₇-i₉)GCCA(N₁₂.₁₉)UGCNRYCUG (xrRNA), le ou lesdites exemplaires de ladite séquence étant suivis par un seul exemplaire d’une séquence d’ARN interne d’entrée de ribosomes (1RES) ;

Par « région 5’-UTR » on entend toute région d’acide nucléique qui se trouve en amont du codon d’initiation de la traduction. Cette région n’est pas codante mais peut comprendre des éléments régulant l’expression de l’ARNm en aval. Outre les éléments xrRNA et 1RES, cette région peut comprendre d’autres éléments tels que les « riboswitch » et/ou « T-box». Dans certains modes de réalisation, la région 5’-UTR peut être de 10 à 2000 nucléotides en longueur. De préférence elle est comprise entre 50 et 1500 nucléotides, et plus préférentiellement de 200 à 1000 nucléotides.

Par « région 3’-UTR » on entend toute région d’acide nucléique qui se trouve en aval du codon de terminaison de la traduction. Cette région peut influencer l’expression et/ou la stabilité de l’ARNm, sa localisation dans une cellule, ou contenir des sites de fixation pour des protéines ou des petits ARN interférents ou les micro-ARN. Cette région peut comprendre, par exemple, des éléments tels qu’une queue polyadénylée (poly(A)), une structure tige-boucle d’histone, et/ou une région riche in pyrimidines ou purines. Il peut contenir des séquences codantes ou non codantes. Dans certains modes de réalisation, la région 3’-UTR peut être de 50 à 500 nucléotides en longueur. De préférence elle est comprise entre 50 et 200 nucléotides, et plus préférentiellement de 50 à 100 nucléotides. Dans un mode de réalisation préféré, l’ARNm comprend une queue polyadénylée (poly(A)), comprenant une séquence de nucléotides d’adénine ou d’un analogue ou variant de ceux-ci, de 10 à 300 nucléotides, et de préférence entre 50 et 100 nucléotides.

Selon un deuxième aspect, l’invention a pour objet une molécule d’acide désoxyribonucléique (ADN) comprenant un polynucléotide pouvant être transcrite en molécule d’ARNm de l’invention. De préférence, la molécule d’ADN comprend la région 5’-UTR de SEQ ID NO : 50, 71, 72, 73, 85, ou 86.

De préférence, ladite molécule d’ADN est comprise en une cassette d’expression.

Par « cassette d’expression », on entend ici un fragment d’ADN comprenant un polynucléotide d’intérêt, par exemple un polynucléotide pouvant être transcrit dans la molécule d’ARNm de l’invention, lié de façon fonctionnelle à un ou plusieurs éléments régulateurs contrôlant l’expression des séquences géniques, comme, par exemple, les séquences promotrices et les séquences « enhancers ».

Un polynucléotide est « lié de façon fonctionnelle » à des éléments régulateurs quand ces différentes séquences d’acides nucléiques sont associées sur un seul fragment d’acide nucléique de telle façon que la fonction de l’une est affectée par les autres. Par exemple, une séquence d’ADN régulatrice est « liée de façon fonctionnelle » à une séquence d’ADN codant un ARN ou une protéine si les deux séquences sont situées de telle façon que la séquence d’ADN régulatrice affecte l’expression de la séquence codante d’ADN (autrement dit, que la séquence codante d’ADN soit sous le contrôle transcriptionnel du promoteur). Les séquences codantes peuvent être liées de façon fonctionnelle à des séquences régulatrices aussi bien dans une orientation sens que dans une orientation antisens. Préférablement, les séquences codantes de l’invention sont liées de façon fonctionnelle aux séquences régulatrices dans l’orientation sens.

Par « séquences régulatrices » ou « éléments régulateurs », on entend ici des séquences polynucléotidiques qui sont nécessaires pour affecter l’expression et la maturation des séquences codantes auxquelles elles sont ligaturées. De telles séquences régulatrices comprennent notamment les séquences d’initiation et de terminaison de la transcription, les séquences promotrices et les séquences « enhancer » ; les signaux de maturation efficace des ARN, comme les signaux d’épissage et de polyadénylation ; les séquences stabilisant les ARNm cytoplasmiques ; les séquences améliorant l’efficacité de la traduction (par exemple, les séquences de Kozak) ; les séquences qui augmentent la stabilité des protéines ; et, si nécessaire, des séquences qui augmentent la sécrétion des protéines.

De préférence, les séquences régulatrices de l’invention comprennent des séquences promotrices, c’est-à-dire que le gène codant l’ARNm de l’invention est de préférence lié de façon fonctionnelle à un promoteur qui permet l’expression dudit ARNm correspondant. Un gène codant l’ARNm de l’invention est de préférence lié de façon fonctionnelle à un promoteur quand il est situé en aval de ce dernier, c’est-à-dire en 3’ de celui-ci, formant ainsi une cassette d’expression.

On entend ici par « promoteur » une séquence nucléotidique, le plus souvent située en amont (5 ) de la séquence codante, qui est reconnue par l’ARN polymérase et les autres facteurs nécessaires pour la transcription, et ainsi contrôle l’expression de ladite séquence codante. Un « promoteur » tel qu’on l’entend ici comprend en particulier les promoteurs minimaux, c’est-à-dire de courtes séquences d’ADN composées d’une boite TATA et d’autres séquences qui permettent de spécifier le site de démarrage de la transcription. Un « promoteur » au sens de l’invention comprend aussi des séquences nucléotidiques incluant un promoteur minimal et des éléments régulateurs capables de contrôler l’expression d’une séquence codante. Par exemple, les séquences promotrices de l’invention peuvent contenir des séquences régulatrices comme des séquences « enhancer » pouvant influencer le niveau d’expression d’un gène.

Avantageusement, les promoteurs selon l’invention sont ceux qui fonctionnent avec une ARN polymérase utilisée dans un système acellulaire de transcription. Par exemple, des promoteurs reconnus par les ARN polymérases des phages SP6 et T7 sont largement connus de l’homme du métier. Ainsi les vecteurs pMBx-luc2 qui portent des promoteurs reconnus par l’ARN polymérase T7 (Rogé et Betton, 2005) ont été utilisés dans la partie expérimentale ci-après. Des vecteurs contenant de tels promoteurs sont par ailleurs disponibles commercialement.

Dans un mode de réalisation particulier, l’invention comprend une molécule d’ADN codant l’ARNm de l’invention qui est liée de façon fonctionnelle à au moins un élément régulateur. De préférence, la molécule d’ADN codant l’ARNm de l’invention est liée de façon fonctionnelle à une séquence promotrice, située en amont, formant ainsi une cassette d’expression. Dans un autre mode de réalisation l’invention consiste en une molécule d’ADN codant l’ARNm de l’invention qui est liée de façon fonctionnelle à une séquence promotrice, située en amont, formant ainsi une cassette d’expression.

De façon encore plus préférentielle, la molécule d’ADN de l’invention comprend :

• un promoteur reconnu par l’ARN polymérase T7, ledit promoteur comprenant une séquence représentée par SEQ ID NO : 46 ;

• une région 5’-UTR comprenant une séquence représentée par SEQ ID NO : 50, 71, 72, 73, 85, ou 86 ;

• une phase de lecture ouverte ; et • une région 3’-UTR comprenant une séquence choisie parmi les séquences représentées par SEQ ID NOs : 53, 54, 55, et 56.

Avantageusement, les séquences régulatrices de l’invention comprennent des séquences terminatrices de la transcription, c’est-à-dire que le gène codant l’ARNm de l’invention est de préférence lié de façon fonctionnelle à un terminateur de transcription. Le terme « terminateur de transcription » désigne ici une séquence du génome qui marque la fin de la transcription d'un gène ou d'un opéron, en ARN messager. Le mécanisme de terminaison de la transcription est différent chez les procaryotes et chez les eucaryotes. L’homme du métier connaît les signaux à utiliser en fonction des différents types cellulaires. Par exemple, s’il souhaite exprimer l’ARNm de l’invention dans une bactérie, il utilisera un terminateur Rho-indépendant (séquence répétée inversée suivie d'une série de T (uracües sur l'ARN transcrit) ou un terminateur Rho-dépendant (constitués d'une séquence consensus reconnue par la protéine Rho). Un gène codant l’ARNm de l’invention est de préférence lié de façon fonctionnelle à un terminateur quand il est situé en amont de ce dernier, c’est-à-dire en 5’ de celui-ci, formant ainsi une cassette d’expression.

Avantageusement, les terminateurs selon l’invention sont ceux qui fonctionnent avec une ARN polymérase utilisée dans un système acellulaire de transcription. Par exemple, des terminateurs reconnus par les ARN polymérases des phages SP6 et 17 sont largement connus de l’homme du métier. Des vecteurs contenant de tels terminateurs sont disponibles commercialement.

Dans un mode de réalisation particulier, l’invention comprend une molécule d’ADN codant l’ARNm de l’invention qui est liée de façon fonctionnelle à au moins un élément régulateur et au moins un terminateur de transcription.

Dans un troisième aspect, l’invention vise également un vecteur comprenant au moins la molécule d’ADN ou d’ARNm selon l’invention.

Le terme « vecteur », tel qu'utilisé ici, désigne une molécule d'acide nucléique capable de transporter un autre acide nucléique auquel elle a été liée. Un type de vecteur est un « plasmide », qui se réfère à une double boucle circulaire d'ADN simple brin dans laquelle des segments d'ADN supplémentaires peuvent être ligaturés. Un autre type de vecteur est un vecteur viral, dans lequel des segments d'ADN supplémentaires peuvent être ligaturés dans le génome viral. À titre alternatif, le vecteur viral peut comprendre l’ARNm dans un génome viral (comme par exemple les rétrovirus ou les virus à ARN). Certains vecteurs sont capables de réplication autonome dans une cellule hôte dans laquelle ils sont introduits (par exemple, des vecteurs bactériens ayant une origine bactérienne de réplication et des vecteurs mammaliens épisomiques). D'autres vecteurs (comme par exemple des vecteurs de mammifères intégratifs) peuvent être intégrés dans le génome d'une cellule hôte lors de l'introduction dans la cellule hôte, et ainsi sont répliqués avec le génome de l’hôte.

De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus de l’homme du métier. Le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de cette séquence sous forme extrachromosomique ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte (par exemple, les plasmides sont de préférence introduits dans des cellules bactériennes, tandis que les YACs sont de préférence utilisés dans des levures). Ces vecteurs d'expression peuvent être des plasmides, des YACs, des cosmides, des rétrovirus, des épisomes dérivés d'EBV, et tous les vecteurs que l'homme du métier peut juger appropriés à l'expression desdites chaînes. Dans un mode de réalisation préféré de l’invention, le vecteur utilisé pour coder l’ARNm de l’invention est un vecteur pouvant être propagé chez la bactérie. De façon plus préférée, ce plasmide comprend un promoteur reconnu par une ARN polymérase utilisée dans un système acellulaire de transcription, telle que celles des phages SP6 et T7. De façon encore plus préférée, ce promoteur porté par ce plasmide est capable de diriger l’expression de l’ARNm de l’invention en présence d’au moins ladite ARN polymérase.

De façon préférée, le vecteur de l’invention comprend une origine de réplication pour permettre la multiplication dudit vecteur dans la cellule hôte. Le terme « origine de réplication » (aussi appelée ori) est une séquence unique d'ADN permettant l'initiation de la réplication. C'est à partir de cette séquence que débute une réplication unidirectionnelle ou bidirectionnelle. L’homme du métier sait que la structure de l'origine de réplication varie d'une espèce à l'autre ; elle est donc spécifique bien quelles aient toutes certaines caractéristiques. Un complexe protéique se forme au niveau de cette séquence et permet l'ouverture de l'ADN et le démarrage de la réplication.

Avantageusement, le vecteur contenant la cassette d’expression de l’invention comprend en outre un marqueur de sélection, afin de faciliter l’identification des cellules contenant ledit vecteur, notamment après transformation. Un « marqueur de sélection » selon l’invention est une séquence polynucléotidique portée par un vecteur, qui permet l’identification et la sélection des cellules possédant ledit vecteur. Les marqueurs de sélection sont bien connus de l’homme du métier. De manière préférée, il s’agit d’un gène codant une protéine conférant une résistance à un antibiotique.

Les vecteurs de l’invention, comprenant le ou les acide(s) nucléique(s) d’intérêt de l’invention, sont préparés par des méthodes couramment utilisées par l’homme du métier. Les clones résultants peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards connues de l'homme du métier pour introduire des polynucléotides dans une cellule hôte. De telles méthodes peuvent être la transformation à l'aide de dextrane, la précipitation par du phosphate de calcium, la transfection à l'aide de polybrène, la fusion de protoplastes, l'électroporation, l'encapsulation des polynucléotides dans des liposomes, l'injection biolistique et la micro-injection directe d'ADN dans le noyau. On peut également associer ladite séquence d’ADN ou d’ARNm (isolée ou insérée dans un vecteur plasmidique ou viral) avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules hôtes, telle qu'un transporteur comme un nanotransporteur ou une préparation de liposomes, ou de polymères cationiques. En outre, on peut avantageusement combiner ces méthodes, par exemple en utilisant l’électroporation associée à des liposomes.

Selon un mode préférentiel de l’invention, le vecteur de l’invention comprend une molécule d’ADN codant l’ARNm de l’invention. De préférence, le vecteur de l’invention est un plasmide. De façon encore plus préférentielle, le vecteur de l’invention comprend une cassette d’expression, un terminateur de transcription, une origine de réplication, et un marqueur de sélection. Dans un autre mode préférentiel, le vecteur consiste en une cassette d’expression.

Selon un autre mode préférentiel de l’invention, le vecteur comprend une molécule d’ARNm de l’invention. De préférence, le vecteur de l’invention est un virus ou un vecteur d’ARN synthétique.

Selon un autre aspect, l’invention a pour objet une cellule hôte comprenant ledit vecteur. Le terme « cellule hôte », tel qu'utilisé ici, est destiné à se référer à une cellule dans laquelle un vecteur d'expression recombinant a été introduit afin d'exprimer l’ARNm de l'invention. Ce terme doit être compris comme englobant non seulement ladite cellule hôte particulière mais aussi la descendance de celle-ci. Il est bien entendu que certaines modifications peuvent se produire au cours des générations à cause de mutations ou d'influences environnementales. La descendance peut, de ce fait, ne pas être exactement identique à la cellule mère, mais est néanmoins aussi incluse dans le terme « cellule hôte », tel qu'utilisé ici.

L’ADN et/ou les vecteurs décrits plus haut sont particulièrement intéressants pour produire de grandes quantités de l’ARNm de l’invention.

Selon un autre aspect, l’invention a pour objet une méthode de production de l’ARNm de l’invention à l’aide de l’ADN ou du vecteur décrit plus haut. L’ARNm peut ainsi être produit par toute méthode connue de l’homme du métier. Cela peut être fait, par exemple, par une synthèse chimique, par expression in vivo ou par expression in vitro.

De façon préférée, l’ARNm est exprimé in vitro, à l’aide d’un système acellulaire d’expression d’ARNm. Par « système acellulaire d’expression d’ARNm », on entend au sens de l’invention un système biochimique permettant la synthèse de l’ARNm de l’invention en l’absence d’une cellule. Le système acellulaire a comme principe de base l’utilisation de la machinerie transcriptionnelle d’un organisme afin de produire à partir d’une information génétique exogène un ARNm spécifique. Le système acellulaire d’expression de l’ARNm au sens de l’invention contient donc tous les éléments nécessaires pour la production d’ARNm en l’absence d’une cellule. Les organismes à partir desquels cette machinerie est extraite sont multiples et variés, et proviennent d’organismes procaryotes et eucaryotes.

En particulier, ce système comprend, entre autres, la machinerie transcriptionnelle provenant de la cellule. Plus particulièrement, ce système comprend une ARN polymérase capable de reconnaître le promoteur de la cassette d’expression décrite plus haut. En présence des nucléotides appropriés et dans les conditions ioniques adéquates, cette ARN polymérase est ainsi capable de diriger la transcription du gène codant l’ARNm de l’invention. De tels systèmes sont bien connus de l’homme du métier depuis plusieurs dizaines d’années (pour une revue, voir par exemple : Beckert et Masquida, 2011). De nombreuses méthodes sont disponibles pour transcrire des ADN en ARN dans des systèmes acellulaires. Il est aussi possible d’utiliser des kits proposés par de nombreuses sociétés : New England Biolabs, Sigma Aldrich, Thermo Scientific, Promega, Roche Diagnostics, Ambion, Invitrogen, etc.

Outre l’ARN polymérase, le système acellulaire de transcription in vitro comprend un tampon de réaction. Avantageusement, ledit système comprend chacun des quatre ribonucléotides triphosphates. Très avantageusement, ces quatre ribonucléotides triphosphates sont présents à des concentrations identiques. Notamment, la concentration du GTP est identique à celle des trois autres ribonucléotides triphosphates. Le rendement de la transcription in vitro de l’ARNm de l’invention est ainsi beaucoup plus élevé que celui d’un ARNm doté d’une coiffe issue d’une réaction in vitro, ce qui diminue fortement le coût de la synthèse de l’ARNm.

De préférence, la méthode de production comprend une étape de purification dudit ARNm.

Dans un mode de réalisation préféré, de l’ADN plasmidique, comprenant un promoteur reconnu par une ARN polymérase phagique et suivie par une séquence ADN codant l’ARNm d’intérêt, est mise en contact avec une ARN polymérase de phage dans un système acellulaire de transcription in vitro. L’ARNm synthétisé par ladite méthode peut ensuite être purifié. De préférence, ledit ADN plasmidique est linéarisé avant d’être mis en contact avec l’ARN polymérase dans le système acellulaire de transcription in vitro. De façon plus préférentielle, ledit ADN est linéarisé par digestion enzymatique en aval de la région 3’-UTR. De façon encore plus préférentielle, ledit ADN est linéarisé par digestion enzymatique par Sspl ou Eco53kl.

De préférence, l’ARN polymérase est l’ARN polymérase du bactériophage T7.

La molécule d’ARNm est capable de diriger la production d’un polypeptide d’intérêt dans un organisme eucaryote dans lequel elle est introduite. De ce fait, elle est particulièrement appropriée pour la thérapie génique ou la vaccination génique. La molécule d’ARNm de la présente invention peut ainsi être utilisée en tant que médicament ou en tant que vaccin.

Selon un autre aspect, l’invention a également pour objet une composition pharmaceutique ou une composition vaccinale.

Plus particulièrement, la présente invention vise donc une composition pharmaceutique ou vaccinale comprenant l’ARNm de l’invention. Les ARNm compris dans la composition transfectent les cellules, qui peuvent les traduire ensuite en protéines. De préférence, ces protéines ont une activité prophylactique ou une activité thérapeutique.

En effet, les inventeurs ont démontré de façon surprenante que l’ARNm selon l’invention est plus performant qu’un ARNm classique doté d’une coiffe lors de la transfection de tissus. En effet, les inventeurs ont démontré de façon très surprenante que les niveaux et durées d’expression obtenus après transfection in vivo sont au moins aussi élevés que ceux d’un ARNm doté d’une coiffe. En particulier, l’expression de l’ARNm de l’invention in vivo, dans le derme ou le muscle d’une souris, est supérieure à celle d’un ARNm coiffé témoin (Figure 5, Figure 15). De plus, les inventeurs ont démontré de façon très surprenante que l’ARNm selon l’invention persiste dans des cellules à long terme (i.e. plus de 7 semaines). Enfin, les inventeurs ont démontré de façon surprenante que la co-transfection des cellules avec un premier ARNm selon l’invention codant la protéine 2Apro et un deuxième ARNm selon l’invention codant une deuxième protéine permet d’augmenter la traduction de cette deuxième protéine.

Ainsi, selon un autre objet de l’invention, la composition pharmaceutique comprend la protéine 2Apro ou un ARNm codant ladite protéine. De préférence, la protéine 2Apro a la séquence de SEQ ID NO : 81. De préférence, lARNm codant ladite protéine a la séquence de SEQ ID NO : 80. Selon un mode particulier de l’invention, la composition pharmaceutique comprend au moins deux molécules différentes d’acide ribonucléique messager (ARNm) dépourvue de molécule de coiffe comprenant de 5’ à 3’ :

- une région 5’-UTR comprenant au moins un exemplaire d’une séquence consensus GUCAGRYC(N₇.₁₉)GCCA(N₁₂.₁₉)UGCNRYCUG (xrRNA) ;

- un exemplaire d’une séquence d’ARN interne d’entrée de ribosomes (1RES) ; et

- une phase de lecture ouverte, selon laquelle au moins une des molécules d’ARNm comprend une phase de lecture ouverte codant la protéine 2Apro.

De préférence, ladite composition pharmaceutique comprend une première molécule d’ARNm, ladite première molécule d’ARNm comprenant une phrase de lecture codant la protéine 2Apro, et au moins une deuxième molécule d’ARNm, ladite deuxième molécule d’ARNm comprenant une phase de lecture ouverte codant une deuxième protéine d’intérêt. De façon plus préférée, ladite deuxième protéine d’intérêt n’est pas la protéine 2Apro. De façon encore plus préférée, ladite deuxième molécule d’intérêt est un antigène ou une protéine thérapeutique tels que définis plus haut. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, le rapport molaire entre le premier ARNm et le deuxième ARNm est compris entre 540/1 et 240/1, préférentiellement entre 540/1 et 315/1, encore plus préférentiellement de 465/1.

De préférence, ladite composition sera additionnée d’un excipient et/ou d’un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Dans la présente description, on entend désigner par véhicule pharmaceutiquement acceptable, un composé ou une combinaison de composés entrant dans une composition pharmaceutique ne provoquant pas de réactions secondaires et qui permet par exemple la facilitation de l’administration du ou des composés actifs, l’augmentation de sa durée de vie et/ou de son efficacité dans l’organisme, l’augmentation de sa solubilité en solution ou encore l’amélioration de sa conservation. Ces véhicules pharmaceutiquement acceptables sont bien connus et seront adaptés par l’homme de l’art en fonction de la nature et du mode d’administration du ou des composés actifs choisis. Dans la présente description, on entend désigner par « excipient pharmaceutiquement acceptable », un composé ou une combinaison de composés entrant dans une composition pharmaceutique ne provoquant pas de réactions secondaires et qui permet par exemple la facilitation de l’administration du ou des composés actifs, l’augmentation de sa durée de vie et/ou de son efficacité dans l’organisme, l’augmentation de sa solubilité en solution ou encore l’amélioration de sa conservation. Ledit excipient peut notamment être ajouté à la composition juste avant administration, par exemple si l’ARN est conservé sous la forme d’un lyophilisât. Les excipients/véhicules pharmaceutiquement acceptables sont bien connus et seront adaptés par l’homme de l’art en fonction de la nature et du mode d’administration du ou des composés actifs choisis. Divers excipients sont notamment décrits dans The Science and Practice of Pharmacy de Remington, 22nd éd., Pharmaceutical Press, London, UK (2013). À titre d’exemple, la composition pharmaceutiquement acceptable comprend l’eau stérile et/ou la chloroquine en tant qu’excipient. L’excipient « chloroquine » comprend également tout variant ou analogue de celle-ci, telle que la primaquine.

En effet, les inventeurs ont démontré de façon surprenante que, dans certaines conditions, la co-injection de la chloroquine avec de l’ARNm permet d’améliorer l’efficacité de la transfection. En particulier, l’efficacité de la transfection par un ARNm complexé à un peptide de type « CPP » est améliorée (cf. Figure 10).

Selon un mode préféré, la composition pharmaceutique comprend en outre de la chloroquine. À titre d’exemple non-limitatif, la composition pharmaceutique comprend un ratio en poids compris entre 1 / 0,5 à 1 / 4 d’ARNm / chloroquine, et plus particulièrement un ratio en poids de 1 / 1 d’ARNm / chloroquine. À titre d’exemple non-limitatif, la composition pharmaceutique comprend en outre 5 pg d’ARN / 2,5 à 20 pg de chloroquine.

Selon un mode préféré, la composition pharmaceutique comprend en outre au moins un CPP tel que décrit ici, liée de façon non covalente à la molécule d’ARNm selon l’invention. Avantageusement, le CPP est sélectionné pour favoriser la pénétration de l’ARNm dans les cellules cibles (e.g. selon le type d’organe ou lignée cellulaire, par exemple des cellules musculaires, ou dermiques).

De préférence, ces compositions seront administrées par voie intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale ou sous-cutanée, par voie respiratoire, ou par voie topique. Ces compositions sont préférentiellement destinées à être injectées dans des tissus de mammifères, encore plus préférentiellement chez l’homme. Ces compositions sont préférentiellement destinées à être injectées par voie intramusculaire, intraveineuse, intradermique, intrapéritonéale ou sous-cutanée, selon les méthodes connues par l’homme de métier. La composition pharmaceutique de l’invention peut être administrée à plusieurs reprises, de manière étalée dans le temps. Son mode d’administration, sa posologie et sa forme galénique optimale peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l’établissement d’un traitement adapté à un patient comme par exemple l’âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés.

Les formes administrables par voie parentérale incluent les suspensions aqueuses, les solutions salines isotoniques ou les solutions stériles et injectables qui peuvent contenir des agents de dispersion et/ou des mouillants pharmacologiquement compatibles. Les formes administrables par voie respiratoire incluent les aérosols. Les formes administrables par voie topique incluent les patchs, les gels, les crèmes, les pommades, les lotions, les sprays, les collyres.

Des procédés pour préparer des composés administrables par voie parentérale seront connus ou évidents pour l'homme du métier et sont décrits plus en détail dans, par exemple, Pharmaceutical Sciences de Remington, 17e éd., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985), et le 18e et 19e éditions de ceux-ci. L'utilisation de milieux et d’agents pour des substances pharmaceutiquement actives est bien connue dans la technique. Pour générer une composition pharmaceutiquement acceptable appropriée pour administration, ladite composition comprendra une quantité suffisante de molécules d’ARNm pour être thérapeutiquement efficace.

La dose efficace d’un composé de l’invention varie en fonction de nombreux paramètres tels que, par exemple, la voie d’administration choisie, le poids, l’âge, le sexe, l’état d’avancement de la pathologie à traiter et la sensibilité de l’individu à traiter.

Selon un aspect particulier, l’invention a pour objet ladite composition pour son utilisation dans la thérapie génique. La composition de la présente invention peut être utilisée dans le traitement ou la modulation d’une variété de maladies, à titre d’exemple : le cancer, les maladies génétiques (telles que l’hémophilie, la thalassémie, la déficience en adénosine-désaminase, la déficience en alpha-1 antitrypsine), le diabète, des troubles cérébraux tels que l’Alzheimer et la maladie de Parkinson, les allergies, les maladies auto-immunes, et les maladies cardiovasculaires.

Selon un autre aspect, l’invention a pour objet ladite composition pour son utilisation dans la vaccination génétique. À titre d’exemple, la composition de la présente invention peut être utilisée dans la vaccination contre le cancer et la grippe, ainsi que d’autres pathogènes viraux et bactériens. La vaccination peut concerner l’homme ainsi que les animaux de compagnie et d’élevage.

Les inventeurs ont notamment montré que l’ARNm de la présente invention est stable in vivo. En effet, l’ARNm de l’invention induit la synthèse d’une quantité de protéine in vivo au moins aussi élevée que celle d’un ARNm coiffé, indiquant que sa résistance à Xrn1 est au moins aussi efficace que celle d’un ARNm coiffé. De plus, les inventeurs ont notamment montré que l’ARNm de la présente invention persiste dans des cellules à long terme. Une telle molécule d’ARNm est également très avantageuse car son coût de production est largement inférieur à celui des molécules d’ARNm coiffés. Enfin, les inventeurs ont montré que l’ARNm comprenant un ARN aptamère pénétrant directement dans les cellules (e.g. ARN aptamère C) ou via un peptide CPP (e.g. ARN aptamère A), transfecté les cellules plus efficacement, ce qui permet, de façon avantageuse, d’améliorer la production d’une ou de plusieurs protéines d’intérêt.

L’invention sera décrite plus précisément au moyen des exemples ci-dessous.

LEGENDES DES FIGURES

Figure 1 : Schéma des ARN messagers.

(A) L’ARNm MB5-luc2 coiffé correspond à un ARN messager traditionnel codant la luciférase, doté d’un analogue de coiffe à son extrémité 5’ et une région 3’-UTR comprenant une queue poly(A). (B) L’ARNm MB5-luc2 est identique à (A), excepté qu’il est dépourvu d’analogue de coiffe. (C) L’ARNm MB7-luc2 est dépourvu de coiffe et doté à son extrémité 5’ d’une tige-boucle et de la séquence interne d’entrée de ribosome (1RES) du virus EMCV. (D) L’ARNm MB8-luc2 est dépourvu de coiffe et doté à la fois d’une tige-boucle, de deux séquences résistantes à Xrn1 (xrRNAI et xrRNA2) provenant du virus du Nil occidental (WNV) et de PIRES du virus EMCV dans la région 5’UTR. (E) L’ARNm MB9-luc2 est similaire à (D), excepté que le 3’UTR et le poly(A) de ce dernier ont été remplacés par le 3’UTR du virus Kunjin (KUN). (F) L’ARNm MB11-luc2 sans coiffe est similaire à (D), excepté que l’aptamère A a été ajouté en 5’, en amont des deux séquences résistantes à Xrn1 (xrRNAI et xrRNA2) provenant du virus du Nil occidental (WNV) et de PIRES du virus EMCV et qu’il n’a pas de tige-boucle. Les ARNm MB13-luc2 (G) et MB14-luc2 (H) ont cette même configuration, mais comprennent une tige boucle en 5’ suivi par les ARN aptamères B et C, respectivement. (I) L’ARNm MB15-luc2 coiffé est similaire à (A), excepté que l’aptamère A a été ajouté en 5’ après la coiffe. (J) L’ARNm MB17-luc2 est similaire à (D), excepté que l’aptamère A a été ajouté en 5’ entre la tige boucle et les séquences xrRNA. (K) L’ARNm MB18-luc2 est similaire à (J), excepté que l’aptamère A est placé dans la région 5’ en aval des séquences xrRNA et en amont de la séquence 1RES.

Figure 2 : Cinétique d’expression luciférase sur quatre jours dans des cellules Caco-

2.

Des cellules Caco-2 confluentes ont été transfectées avec les ARNm MB5-luc2 coiffé (losange) et dépourvu de coiffe (cercle), ainsi que les ARNm MB7-luc2 (triangle) etMB8luc2 (carré). La cinétique d’expression a été suivie pendant quatre jours.

Figure 3 : Cinétique d’expression luciférase sur dix jours dans des cellules Caco-2.

Des cellules Caco-2 confluentes ont été transfectées avec les ARNm MB5-luc2 coiffé (losange), MB8-luc2 (carré) etMB9-luc2 (triangle). La cinétique d’expression a été suivie pendant dix jours.

Figure 4 : Cinétique d’expression luciférase à long terme dans des cellules souche mésenchymateuses humaines.

Des cellules souches mésenchymateuses ont été transfectées avec 2 pg d’ARNm MB8luc2 complexé au peptide pepMBI à un ratio de charge positive du peptide pepMBI / charge négative de l’ARNm d’environ 2,2 / 1 par puits dans des plaques de 48 puits pendant 1 heure. L’activité luciférase a ensuite été suivie pendant environ 48 jours.

Figure 5 : Transfection du muscle et du derme de souris.

Le muscle et le derme de souris BALB/cByJ mâles ont été transfectés respectivement avec 10 pg et 5 pg de l’ARNm MB8-luc2 dépourvu de coiffe ou de l’ARNm MB5-luc2 coiffé. L’activité luciférase a été mesurée dans le muscle et dans la peau, 16 heures et 18 heures après les injections, respectivement.

Figure 6 : Étude de toxicologie de l’ARNm MB8-2Apro.

Des cellules C2C12 ont été transfectées avec l’ARNm MB8-luc2 seul ou l’ARNm MB8-luc2 mélangé à l’ARNm MB8-2Apro à un ratio de 465/1 ou 9/1, afin d’évaluer l’effet cytotoxique de l’expression de la protéine 2Apro. La cytotoxicité a été déterminée par mesure de la lactate déshydrogénase (LDH) libérée dans le milieu extracellulaire. L’activité LDH est déterminée par mesure de l’absorbance à 490 nm. Témoin négatif : Cellules non transfectées ou transfectées avec l’ARNm MB8-luc2 seul sans lyse. Témoin positif : Cellules non transfectées lysées avec du Triton X-100.

Figure 7 : Effet de la protéine 2Apro sur l’expression luciférase en fonction du ratio molaire ARNm MB8-luc2 / ARNm MB8-2Apro.

Des cellules C2C12 ont été transfectées avec l’ARNm MB8-luc2 en présence d’une quantité croissante d’ARNm MB8-2Apro. Le ratio molaire ARNm MB8-luc2 / ARNm MB82Apro est de 540/1 à 240/1. La quantité totale d’ARNm transfecté était de 750 ng par puits. L’activité luciférase a été mesurée 18 heures après la transfection.

Figure 8 : Cinétique d’expression luciférase sur sept jours en présence ou non de l’ARNm MB8-2Apro.

Des cellules C2C12 confluentes ont été transfectées avec les ARNm MB8-luc2 seul (ligne noir) ou en combinaison avec l’ARNm MB8-2Apro (ligne gris pointillé). Le ratio molaire ARNm MB8-luc2 / ARNm MB8-2Apro est de 465/1. La cinétique d’expression, mesurée par le niveau d’activité luciférase, a été suivie pendant sept jours.

Figure 9 : Effet de la protéine 2Apro sur l’expression luciférase de différents ARN messagers.

L’effet de la protéine 2Apro sur l’expression luciférase à partir de différents ARN messagers a été évalué. Dans chaque cas, l’ARNm codant la luciférase a été transfecté seul (-) ou co-transfecté avec un deuxième ARNm codant la protéine 2Apro (+) et ayant les mêmes caractéristiques au ratio molaire optimal de 465 / 1. (1) ARNm MB8-luc2 seul ; (2) co-transfection de l’ARNm MB8-luc2 avec l’ARNm MB8-2Apro ; (3) ARNm MB5luc2 coiffé seul ; (4) co-transfection de l’ARNm MB5-luc2 coiffé avec l’ARNm MB82Apro non coiffé ; (5) ARNm MB5-luc2 dépourvu d’analogue de coiffe seul ; (6) co transfection de l’ARNm MB5-luc2 dépourvu d’analogue de coiffe avec l’ARNm MB82Apro dépourvu d’analogue de coiffe ; (7) ARNm MB7-luc2 seul ; (8) co-transfection de l’ARNm MB7-luc2 avec l’ARNm MB8-2Apro. L’activité luciférase a été mesurée 18 heures après la transfection.

Figure 10 : Effet de différents aptamères sur l’efficacité de la transfection dans le muscle d’une molécule d’ARNm dépourvue de coiffe.

Le muscle de souris BALB/cByJ mâles a été transfecté avec : 5 pg d’ARNm MB8-luc2, d’ARNm MB13-luc2, d’ARNm MB14-luc2, d’ARNm MB11-luc2 complexé au peptide M12H6, ou d’ARNm MB11-luc2 complexé au peptide M12-H6 en présence de 5 pg de chloroquine. L’activité luciférase a été mesurée 16 heures après les injections.

Figure 11 : Efficacité de la transfection dans le derme de l’ARNm selon le ratio molaire du peptide CPP3-H6 / ARNm MB11-luc2.

Le derme de souris OF1 mâles a été transfecté avec 5,6 pg de l’ARNm MB11-luc2 complexé au peptide CPP3-H6 à des ratios molaires croissants (ratios molaires compris entre 1/8 et 1,125/1 de CPP3-H6 / ARNm MB11-luc2). L’activité luciférase a été mesurée 18 heures après les injections. Le ratio molaire permettant une transfection optimale a été de 1 CPP3-H6 / 4 ARNm MB11-luc2.

Figure 12 : Efficacité de la transfection dans le derme de l’ARNm selon le ratio molaire du peptide CPP1-H6 / ARNm MB11-luc2.

Le derme de souris OF1 mâles a été transfecté avec 5,6 pg de l’ARNm MB11-luc2 complexé au peptide CPP1-H6 à des ratios molaires croissants (ratios molaires compris entre 1/8 et 3/1 de CPP1-H6 / ARNm MB11-luc2). L’activité luciférase a été mesurée 18 heures après les injections. Le ratio molaire permettant une transfection optimale a été de 1 CPP1-H6 / 4 ARNm MB11 -luc2.

Figure 13 : Efficacité de la transfection dans le derme de l’ARNm selon le ratio molaire du peptide CPP2-H6 / ARNm MB11-luc2.

Le derme de souris OF1 mâles a été transfecté avec 5,6 pg de l’ARNm MB11-luc2 complexé au peptide CPP2-H6 à des ratios molaires croissants (ratios molaires compris entre 1/4 et 2,75/1 de CPP2-H6 / ARNm MB11-luc2). L’activité luciférase a été mesurée 18 heures après les injections. Le ratio molaire permettant une transfection optimale a été de 2 CPP2-H6 / 1 ARNm MB11-luc2.

Figure 14 : Effet de l’aptamère A sur l’efficacité de la transfection dans le derme d’une molécule d’ARNm coiffé.

L’ARN aptamère A a été inséré dans le 5’UTR de l’ARNm conventionnel MB5-luc2 coiffé pour générer l’ARNm MB15-luc2 coiffé. Le derme de souris 0F1 mâles a été transfecté avec 5,6 pg de l’ARNm MB15-luc2 coiffé complexé ou non au peptide CPP2-H6 au ratio molaire 2 CPP2-H6 / 1 ARNm MB15-luc2, au vu des résultats obtenus auparavant (voir Fig. 12). La transfection n’a pas été améliorée avec cette construction, en présence ou absence de l’aptamère A ainsi que le peptide CPP2-H6.

Figure 15 : Effet du 5’-SL sur l’efficacité de la transfection dans le derme d’une molécule d’ARNm.

L’effet d’une tige-boucle (ici « 5’-SL » ayant la séquence selon SEQ ID NO : 87) sur l’efficacité de la transfection lorsque la tige-boucle est suivie par la séquence xrRNAI, 5 nucléotides en aval (ARNm MB8-luc2 et MB18-luc2), par rapport à un ARNm dépourvu de tige-boucle (ARNm MB11-luc2) et un ARNm dont la tige-boucle se situe à plus de 70 nucléotides en amont de xrRNAI (ARNm MB17-luc2). L’ARNm conventionnel MB5-luc2 coiffé sert de témoin à l’efficacité de 5’-SL suivi de deux séquences xrRNA. Le derme de souris OF1 mâles a été transfecté avec 5,6 pg de chacun des différents ARNm et l’activité luciférase a été mesurée 18 heures après les injections. L’aptamère A de MB11-luc2 n’est pas lié à un peptide, et n’a donc pas d’effet sur l’efficacité de transfection de cette ARNm.

EXEMPLES

L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. Ces enseignements comprennent des alternatives, des modifications et des équivalents, tels que pourront être apprécié par un homme de métier.

Exemple 1 : Construction des plasmides

Les séquences d’ADN correspondant à des séquences 5’ non codantes de SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO : 50, ou SEQ ID NO : 51 ont été synthétisées chimiquement, intégrées dans un vecteur d’ADN et séquencées par ProteoGenix. Les fragments d’ADN ont été excisés par des enzymes de restriction. Les plasmides de la série pMBx-luc2 ont été digérés avec les mêmes enzymes de restriction et les fragments d’ADN ont été intégrés dans ces plasmides par l’action de l’ADN ligase T4. Ces plasmides contiennent le gène codant l’enzyme luciférase (SEQ ID NO : 62), inséré en aval du promoteur du bactériophage T7.

Une courte séquence 3’-UTR non codante suivie par une séquence de polyadénylation transcriptionnelle, selon SEQ ID NO : 53, se situent en aval du gène luciférase. Les différentes séquences 5’-UTR non codantes séparent le promoteur du gène luciférase. Les plasmides ainsi construits ont été amplifiés, vérifiés et linéarisés en aval de la séquence de polyadénylation transcriptionnelle par une enzyme de restriction.

Exemple 2 : Linéarisation des plasmides et transcription in vitro des ARNm

Un site de restriction Sspl se situe immédiatement en aval du poly(A) de chaque plasmide (cf. SEQ ID NO : 54). Dix microgrammes de plasmide ont été digérés par vingt unités de l’enzyme de restriction Sspl-HF (New England Biolabs) dans du tampon CutSmart 1X, pendant quatre heures, à 37°C.

Huit microlitres de plasmide linéarisé par Sspl-HF ont ensuite été mélangés à deux microlitres de tampon de réaction 10X de l’ARN polymérase T7, deux microlitres de chacun des quatre nucléotides triphosphates (ATP, GTP, CTP et UTP) et deux microlitres de solution d’ARN polymérase T7 (New England Biolabs). Un analogue de coiffe a été inclut dans ce mélange réactionnel pour la synthèse d’ARNm dotés d’une coiffe. Il en a été omis pour la synthèse d’ARNm dépourvus de coiffe.

La transcription a duré de trois à dix heures et a été effectuée dans un bain à sec à 37°C. Puis, un microlitre de TURBO DNase (Thermo Fisher) a été ajouté pour dégrader le plasmide et le mélange a été incubé à 37°C pendant 15 minutes.

L’ARNm MB5-luc2 est un ARNm classique codant la luciférase. Il est doté d’une séquence 5’ non codante (UTR) selon SEQ ID NO : 57, qui a été sélectionnée pour une initiation optimale de la traduction ainsi qu’une région 3’UTR comprenant une queue poly(A) selon SEQ ID NO : 60. Cet ARNm a été synthétisé avec ou sans coiffe (cf. Figure 1 (A) et (B)).

L’ARNm MB7-luc2 sans coiffe dispose à son extrémité 5’, à la place du 5’-UTR de l’ARNm MB5-luc2, d’une tige-boucle à l’extrémité 5’, suivi de la séquence 1RES du virus EMCV. Cette dernière lui permettrait ainsi de recruter efficacement des ribosomes, malgré l’absence de coiffe. Par contre, cet ARNm serait sensible à l’enzyme Xrn1 (cf. Figure 1 (C)). La région 5’-UTR de l’ARNm MB7-luc2 correspond à SEQ ID NO : 58 et la région 3’UTR à SEQ ID NO : 60.

L’ARNm MB8-luc2 sans coiffe dispose d’une tige-boucle à son extrémité 5’, suivi, dans la région 5’UTR, de deux séquences successives résistantes à Xrn1, issue du 3’-UTR du

Flavivirus WNV, nommées xrRNAI et xrRNA2 (Kieft et al., 2015). Ces séquences sont suivies par celle de l’IRES du virus EMCV, qui est par conséquent protégée par les deux séquences résistantes à Xrn1 (cf. Figure 1 (D)). La région 5’-UTR de l’ARNm MB8-luc2 correspond à SEQ ID NO : 59 et la région 3’-UTR à SEQ ID NO : 60. Le coût de la production de l’ARNm MB8-luc2 sans coiffe est environ 30 fois moindre que le coût de la production d’un ARNm avec coiffe.

L’ARNm MB9-luc2 sans coiffe ne diffère de l’ARNm MB8-luc2 sans coiffe que par son extrémité 3’. En effet, le 3’UTR et la séquence poly(A) de MB8-luc2 ont été remplacés par la région 3’UTR du virus Kunjin. Cette région ne dispose pas d’une séquence poly(A) (cf. Figure 1 (E)). La région 3’-UTR de l’ARNm MB9-luc2 correspond à SEQ ID NO : 61.

L’ARNm MB11-luc2 sans coiffe ne diffère de l’ARNm MB8-luc2 sans coiffe que par l’absence d’une tige-boucle à l’extrémité 5’, et la présence d’un aptamère en région 5’ en amont des deux séquences successives résistantes à Xrn1 (cf. Figure 1 (F)). L’ARNm MB11-luc2 comprend l’aptamère A de SEQ ID NO : 64 ; la région 5’-UTR de l’ARNm MB11-luc2 correspond donc à SEQ ID NO : 67.

Les ARNm MB13-luc2, et MB14-luc2 sans coiffe ne diffère de l’ARNm MB8-luc2 sans coiffe que par la présence d’un aptamère en région 5’ en amont des deux séquences successives résistantes à Xrn1 (cf. Figure 1 (G, H)). L’ARNm MB13-luc2 comprend l’aptamère B de SEQ ID NO : 65 ; la région 5’-UTR de l’ARNm MB13-luc2 correspond donc à SEQ ID NO : 68. L’ARNm MB14-luc2 comprend l’aptamère C de SEQ ID NO : 66 ; la région 5’-UTR de l’ARNm MB14-luc2 correspond donc à SEQ ID NO : 69.

L’ARNm MB15-luc2 correspond à l’ARNm MB5-luc2 coiffé, dans lequel l’aptamère A (SEQ ID NO : 64) a été inséré dans la région 5’-UTR (cf. Figure 1 (I)) ; la région 5’-UTR de l’ARNm MB15-luc2 correspond donc à SEQ ID NO : 70.

L’ARNm MB17-luc2 ne diffère de l’ARNm MB11-luc2 sans coiffe que par la présence d’une tige-boucle à l’extrémité 5’ en amont de l’aptamère A (cf. Figure 1 (J)). L’ARNm MB17-luc2 comprend l’aptamère A de SEQ ID NO : 64 ; la région 5’-UTR de l’ARNm MB17-luc2 correspond donc à SEQ ID NO : 83.

L’ARNm MB18-luc2 sans coiffe ne diffère de l’ARNm MB8-luc2 sans coiffe que par la présence d’un aptamère en région 5’ entre les deux séquences successives résistantes à Xrn1 et la séquence 1RES (cf. Figure 1 (K)). L’ARNm MB18-luc2 comprend l’aptamère A de SEQ ID NO : 64 ; la région 5’-UTR de l’ARNm MB18-luc2 correspond donc à SEQ ID NO : 84.

Exemple 3 : Purification des ARN messagers

La purification des différents ARNm luciférase a été réalisée à l’aide du kit MegaClear (Ambion). Soixante-dix-neuf μΐ d’Elution Solution, 350 μΐ de Binding Solution Concentrate et 250 μΐ d’éthanol 100% ont été ajoutés aux 21 μΐ du mélange précédent. Ces 700 μΐ ont été déposés sur un Filter Cartridge et centrifugés à 10000 g, pendant une minute. Le filtre a retenu l’ARN messager. Deux lavages ont été effectués avec 500 μΐ de Wash Solution, en centrifugeant à 10000 g, pendant une minute. L’ARN a ensuite été élué du filtre en ajoutant, à deux reprises, 50 μΐ d’Elution Solution et en chauffant à 70°C, pendant dix minutes, dans un bain à sec. L’élution a été obtenue par centrifugation à 10000 g, pendant une minute.

Une seconde étape de purification a été effectuée par précipitation au chlorure de lithium. Soixante μΐ de LiCl Precipitation Solution ont été ajoutés aux 100 μΐ de l’éluât. Le mélange a été refroidi à -20° C pendant une heure, avant d’être centrifugé à vitesse maximale à quatre degrés, pendant 15 minutes. Le culot a été lavé avec 500 μΐ d’éthanol 70% et une dernière centrifugation a été effectuée à vitesse maximale à quatre degrés, pendant 5 minutes. Le culot d’ARN messager, séché pendant quelques minutes à l’air, a été resuspendu dans de l’eau déminéralisée stérile. La concentration de la solution d’ARNm a été déterminée par la mesure de l’absorbance à 260 nm, à l’aide d’un spectrophotomètre.

Exemple 4 : Assemblage des complexes ARN messager / pepMBI

Le peptide cationique pepMBI a été synthétisé, purifié et lyophilisé par ProteoGenix. Sa séquence en acides aminés est la suivante : CRRRRRRRRC. Le lyophilisât a été resuspendu dans de l’eau déminéralisée stérile.

Cinq microgrammes d’ARNm luciférase ont été mélangés à cinq microgrammes de pepMBI à une concentration finale en ARN de 20 pg/ml. Les mélanges ont été incubés à température ambiante (20-25°C) pendant 15 minutes avant d’être congelés à -80°C. Les complexes ARNm / pepMBI ont ensuite été lyophilisés pendant environ 20 heures.

Exemple 5 : Transfection des cellules Caco-2 ou C2C12

Matériels et Méthodes :

a) Culture et ensemencement des cellules de la lignée Caco-2 ou C2C12

Toutes les manipulations de cellules ont été réalisées sous une hotte à flux laminaire. La lignée cellulaire Caco-2 (ECACC) a été cultivée dans du DMEM (Gibco) additionné d’acides aminés non essentiels, d’un mélange d’antibiotiques et d’antimycotique et de sérum de veau fœtal (15% final). La culture a été effectuée à 37°C dans des flasques de 75 cm² (Corning).

Lorsque le nombre de cellules nécessaire à l’ensemencement d’une plaque de 48 puits (Corning) a été atteint, les cellules ont été détachées du fond de la flasque à l’aide de 3 ml de TryPLE Select 1X (Gibco) à 37°C, pendant 5 minutes. 7 ml de DMEM ont été ajoutés, afin de neutraliser le TryPLE Select 1X. Les cellules ont été centrifugées à 100 g, pendant 10 minutes, à température ambiante. Le culot cellulaire a ensuite été resuspendu dans 10 ml de milieu de culture. 250 pl de cette suspension cellulaire ont été introduits dans chaque puits d’une plaque de 48 puits et cette dernière a été placée dans un incubateur à 37° C, contenant 5% de CO₂.

Les cellules C2C12 peuvent être conservées à confluence dans les puits d’une plaque de 48 puits que pendant une douzaine de jours après leur ensemencement. Au-delà de cette période, ces cellules se différentient en épithélium intestinal, ce qui affecte la traduction de l’ARNm. En revanche, les cellules souche mésenchymateuses humaines peuvent être conservées en culture confluente pendant plus de 7 semaines. Les cellules souches mésenchymateuses (Millipore, Human Mesenchymal Stem Cell (Bone Marrow)) ont donc été cultivées dans des plaques de 48 puits (Corning) dans un milieu prêt à l’emploi (Millipore, Mesenchymal Stem Cell Expansion Medium) jusqu’à 48 jours. Pour les cellules qui seront lysées plus de cinq jours après la transfection, le milieu de culture a été changé trois fois par semaine.

b) Transfection des cellules Caco-2 ou C2C12

Pour les cellules Caco-2, la transfection par chaque ARNm a été réalisée dans cinq puits différents. Les lyophilisats de complexes ARNm / pepMBI (Proteogenix) ont été resuspendu dans 750 pl de tampon de transfection (20 mM Hepes, 40 mM KCl et 100 μΜ trifluoroacétate).

Pour les cellules C2C12, la transfection par l’ARNm-MB8 est réalisée comme indiquée cidessous. Les complexes ARNm MB8-luc2 / pepMBI (Proteogenix) sont assemblés en incubant l’ARNm en présence des peptides à un ratio de charge positif du peptide / charge négatif de l’ARNm d’environ 2,2 pendant 30 min à température ambiante. La solution est ensuite diluée avec du DMEM 3X afin d’obtenir du DMEM 1X final.

Dans les deux cas, les puits ont été vidés du milieu de culture qu’ils contenaient, afin d’introduire 150 pl de solution de complexe ARN / pepMBI (correspondant à 1 pg d’ARNm par puits pour les cellules Caco-2 et à 2 pg par puits pour les cellules C2C12). Les cellules ont été incubées pendant 30 minutes (cellules Caco-2) ou 1 heure (cellules C2C12), à 37°C, dans un incubateur à CO₂. La solution de complexe ARNm / pepMBI a ensuite été aspirée et remplacée par 250 pl de milieu de culture. Les cellules ont alors été incubées, pendant 6 heures à 48 jours en fonction du type cellulaire, à 37°C, dans un incubateur à CO₂.

c) Lyse des cellules Caco-2 ou C2C12 et mesure de l’activité luciférase

Six heures à 48 jours après la transfection, les cellules ont été lysées afin de réaliser des cinétiques d’expression de la protéine luciférase. Le milieu de culture a été aspiré et remplacé par 250 pl de tampon de lyse (Luciferase Assay System, Promega). 20 pl de chaque lysat cellulaire ont été introduits dans un tube adapté au luminomètre (Berthold Technologies). 100 pl de substrat de la luciférase (Promega) ont été ajoutés au lysat cellulaire par le luminomètre. Ce dernier a ensuite mesuré la quantité de lumière émise par la réaction enzymatique catalysée par la luciférase. Les résultats s’expriment en unités relatives de lumière (RLU). La quantité de protéine luciférase, produite par les cellules Caco-2 ou les cellules C2C12, grâce à l’ARNm luciférase, a été normalisée en dosant les protéines cellulaires totales avec le kit 660 nm Protein Assay (Pierce). Pour cela, 100 pl de lysat cellulaire ont été mélangés à 1,5 ml de réactif et l’absorbance a été mesurée à 660 nm. Une gamme d’étalonnage a été réalisée à l’aide de solutions de sérum albumine bovine. L’activité luciférase s’exprime donc en RLU par milligramme de protéines.

Résultats :

Les résultats sont illustrés dans les Figures 2, 3 et 4. L’ARNm MB5-luc2 sans coiffe induit une faible et courte expression de la protéine luciférase dans les cellules Caco-2. En l’absence de coiffe, l’ARNm est rarement traduit en protéine et est rapidement dégradé parXrnl (cf. FigureZ).

L’ARNm MB7-luc2 sans coiffe donne une expression plus forte et plus durable de la protéine luciférase, dans les cellules Caco-2, que celle de l’ARNm MB5-luc2 sans coiffe. La région 1RES recrute des ribosomes, mais ne procure pas de résistance significative vis-à-vis de Xrn1 (cf. Figure 2).

L’ARNm MB8-luc2 sans coiffe induit une cinétique d’expression luciférase similaire à celle obtenue avec l’ARNm MB5-luc2 coiffé (cf. Figures 2 et 3). Cela signifie que l’ajout des deux séquences résistantes à Xrn1 du virus WNV, procure à l’ARNm une résistance à Xrn1 similaire à celle de la coiffe de l’ARNm MB5-luc2. L’ARNm MB7-luc2, qui est dépourvu de coiffe et de séquences résistantes à Xrn1, induit une expression luciférase intermédiaire entre celle de l’ARNm MB8-luc2 sans coiffe et celle de l’ARNm MB5-luc2 sans coiffe (cf. Figure 2).

L’ARNm MB9-luc2 se différentie de l’ARNm MB8-luc2 par son extrémité 3’UTR dépourvue de poly(A). L’expression luciférase qu’il induit dans les cellules Caco-2 est notablement moins élevée et moins durable que celle induite par l’ARNm MB8-luc2 (cf. Figure 3).

Dans les cellules souches mésenchymateuses humaines, l’ARNm MB8-luc2 induit, de façon surprenante et avantageuse, une expression luciférase qui persiste à très long terme. En effet, même si l’expression diminue au cours du temps, elle reste toujours détectable même 48 jours après la transfection (cf. Figure 4).

Exemple 6 : Transfection du muscle et du derme de souris.

Matériels et méthodes :

a) Hébergement des animaux :

Pour le muscle, des souris BALB/cByJ mâles, âgées de 8 semaines, ont été hébergées dans des cages ouvertes à cinq animaux par cage. Les cycles jour /nuit ont été gérés par un automate (12h de jour / 12h de nuit). Elles ont été nourries et ont eu accès à de l’eau filtrée ad libitum. Pour la peau, des souris OF1 mâles, âgées de 6 semaines, ont été hébergées dans des cages ouvertes à quatre animaux par cage.

b) Préparation extemporanée des échantillons d’ARNm :

Pour chaque injection intramusculaire, 100 pl d’une solution d’ARNm nu contenant du NaCl 230 mM ont été préparés.

Pour chaque injection intradermique, 17 pl d’une solution d’ARNm nu contenant du NaCl 160 mM ont été préparés.

Lorsqu’un peptide CPP-H6 a été utilisé, celui-ci a été mélangé à l’ARNm et incubé pendant 30 minutes à température ambiante en présence de 5 mM d’Hepes pH 7,5 et de 0,7 mM de MgCl₂.

c) Injections intradermiques et intramusculaires des ARNm :

L’anesthésie des souris a été réalisée par l’utilisation d’isoflurane. Pour les injections intramusculaires, une analgésie a été pratiquée par l’injection de buprénorphine. Pour les injections intradermiques, la peau du dos a été tondue trois à quatre jours auparavant (voir l’Exemple 10 pour plus de détails).

100 pl et 17 μΐ de solution d’ARNm ont été injectés dans le biceps femoris et dans la peau, respectivement. Les animaux ont été replacés dans leur cage jusqu’au lendemain matin.

d) Prélèvements de peau et de muscle :

Pour le muscle, 16 heures après les injections, les souris ont été euthanasiées au CO₂. Pour la peau, 18 heures après les injections, les souris ont été anesthésiées à l’isoflurane et euthanasiées par dislocation cervicale. Les sites d’injection au niveau de la peau et du muscle ont été prélevés. Ces biopsies ont été lavées avec du sérum physiologique, découpés en fins morceaux et introduits dans des tubes contenant du tampon de lyse (Promega). Ces tubes ont été immédiatement congelés dans de l’azote liquide.

e) Lyse des cellules des biopsies de peau et de muscle :

Chaque biopsie de peau et de muscle a subi trois cycles de congélation / décongélation. En effet, les tubes contenant les biopsies et du tampon de lyse ont été congelés à -80° C pendant 10 minutes. Puis, ils ont été décongelés dans un bain-marie à température ambiante pendant deux minutes et brièvement mélangés à l’aide d’un vortex.

Les tubes ont ensuite été centrifugés à 5000 g, à 20°C, pendant 5 minutes, afin de précipiter les débris tissulaires et obtenir un surnageant clarifié de lysat cellulaire.

f) Mesure de l’activité luciférase :

μΐ de chaque lysat cellulaire ont été utilisés pour la mesure de l’expression luciférase dans chaque biopsie. Un luminomètre à tubes a ajouté 100 μΐ de substrat de la luciférase (Promega) dans chaque échantillon et a mesuré la quantité de lumière émise pendant 10 secondes. Les résultats s’expriment en unités relatives de lumière ou RLU.

Les lysats cellulaires ont ensuite été dilués de huit à vingt fois pour le dosage des protéines, à l’aide du kit 660 nm Protein Assay (Pierce). Cent μΐ de lysat cellulaire dilués ont été mélangés à 1,5 ml de réactif pendant 6 minutes et l’absorbance a été mesurée à 660 nm. Une gamme d’étalonnage a été réalisée avec de l’albumine sérique bovine de 0 à 750 pg/ml.

Résultats :

Les résultats sont illustrés dans la Figure 5. L’ARNm MB8-luc2 dépourvu de coiffe induit une expression luciférase, dans le muscle squelettique (A) et dans la peau (B), supérieur à l’ARNm MB5-luc2 coiffé, 16 heures (pour le muscle) ou 18 heures (pour le derme) après leurs injections. Ces résultats indiquent que la présence des deux séquences xrRNA (ici du virus WNV) et l’IRES (ici d’EMCV) procure à l’ARNm une résistance à Xrn1 et une efficacité de la traduction supérieures à celles de la coiffe de l’ARNm MB5-luc2 in vivo. En effet, de façon très surprenante, la transfection de 10 pg d’ARNm MB8-luc2 dans le tissue musculaire chez la souris, résulte en une expression luciférase 2,6 fois plus élevée que celle obtenue avec la même dose d’ARNm MB5-luc2 doté d’une coiffe (cf. Figure 5A). De même, la transfection de 5 pg d’ARNm MB8-luc2 dans la peau résulte en une expression luciférase 9,3 fois plus élevée que celle obtenue avec la même dose d’ARNm MB5-luc2 doté d’une coiffe (cf. Figure 5B).

L’ARNm MB8-luc2 peut donc pleinement se substituer à l’ARNm MB5-luc2 coiffé, et serait même encore plus avantageux.

Exemple 7 : Toxicité cellulaire de l’ARNm MB8-2Apro

Matériels et méthodes :

L’expression de la protéine 2Apro dans une cellule de mammifère peut induire une toxicité au point d’entraîner la mort cellulaire par apoptose ou par nécrose (Goldstaub et al., 2000). Au cours de ces processus, les cellules libèrent de la lactate déshydrogénase (LDH) dans le milieu extracellulaire. Cette activité LDH peut être mesurée à l’aide d’un kit commercial, CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay, Promega.

L’ARNm MB8-2Apro (SEQ ID NO : 80) est un ARNm codant la protéine non structurale 2A (2Apro, ayant la séquence de SEQ ID NO : 81) issu du génome du rhinovirus humain 2 (HRV2). Il est doté d’une séquence 5’ non codante (UTR) selon SEQ ID NO : 57, qui est identique à celle de l’ARNm MB8-luc2, ainsi qu’une région 3’UTR comprenant une queue poly(A) selon SEQ ID NO : 60.

750 ng d’ARNm MB8-luc2 seul ou d’un mélange d’ARNm MB8-luc2 et d’ARNm MB8-2Apro ont été complexés au peptide pepMBI, tel que décrit à l’Exemple 4.

L’ARNm MB8-luc2 seul ou l’ARNm MB8-luc2 mélangé à l’ARNm MB8-2Apro, à deux ratios molaires différents, ont été transfectés dans des cellules C2C12. Plus précisément, les cellules C2C12 d’un puits d’une plaque de 48 puits ont été incubées pendant une heure avec les complexes ARNm / pepMBI. 18 heures plus tard, l’activité luciférase a été mesurée (Figure 6). Des cellules C2C12 non transfectées et non lysées servent de témoin négatif alors que des cellules C2C12 non transfectées ont été lysées avec du Triton X-100, pour libérer la totalité de la LDH dans le milieu de culture, servent de témoin positif.

Résultats :

Les mélanges d’ARNm n’ont pas induit de cytotoxicité, même au ratio molaire le plus élevé (ratio ARNm MB8-luc2 / l’ARNm MB8-2Apro de 9 / 1). Cela signifie que l’expression de la protéase virale n’induit pas de cytotoxicité (Figure 9).

Exemple 8 : Cinétique d’expression luciférase optimisée par la co-transfection d’ARNm MB8-luc2 et MB8-2Apro

Matériels et méthodes :

En l’absence de toxicité, les ARNm MB8-luc2 et MB8-2Apro ont ensuite été cotransfectés dans des cellules C2C12 à des ratios différents, selon les méthodes décrites ci-dessus. 18 heures plus tard, l’activité luciférase a été mesurée (Figure 7). Une cinétique a ensuite été réalisée de 6h à 7 jours post-transfection, afin de déterminer si l’amélioration de l’expression luciférase ne s’observe que 18h post-transfection, selon les méthodes décrites ci-dessus.

Résultats :

De façon surprenante, la co-transfection des ARNm MB8-luc2 et MB8-2Apro augmente l’expression luciférase de l’ARNm MB8-luc2 d’au moins 2,5 fois dans les cellules C2C12 à tous les ratios testés. Le meilleur ratio molaire ARNm MB8-luc2 / ARNm MB8-2Apro est de 465 /1, et augmente l’expression luciférase de 3,4 fois.

Une cinétique réalisée de 6h à 7 jours post-transfection démontre de façon surprenante que l’amélioration de l’expression luciférase est observée pendant au moins une semaine. En effet, l’expression luciférase est en moyenne augmentée de 2,4 fois (Figure 7)·

Exemple 9 : Effet d’ARN aptamères sur l’efficacité de la transfection d’ARNm dans le muscle

Afin d’améliorer l’internalisation de la molécule d’ARNm selon l’invention, différents aptamères ont été incorporés dans la molécule d’ARN, telle que détaillé ci-dessous. L’effet de ces aptamères a ensuite été évalué in vivo, afin de déterminer si une amélioration de l’expression luciférase pouvait être observée.

Matériels et méthodes :

Sélection d’aptamères

Des aptamères pénétrant dans les cellules C2C12 ont été sélectionnés. Tout d’abord, de l’ADN double brin a été généré par l’hybridation d’une amorce en 5’ suivie par l’extension d’ADN simple brin d’une bibliothèque d’ADN simple brin. L’ADN double brin ainsi obtenu a ensuite été précipité et purifié selon des méthodes bien connues de l’homme du métier.

Une bibliothèque d’ARN aptamères a ensuite été obtenue par transcription des fragments purifiés en utilisant le kit de transcription T7 DuraScribe (20 μΐ / run) suivi par la purification de l’ARN en utilisant un kit de purification de ssDNA et RNA. Enfin, la solution est traitée à la DNAse I afin d’éliminer l’ADN contaminant. Les aptamères sont dissous dans du DMEM + ITS 1X à 8 μΜ d’ARN (1288 μg / 5 ml). Afin de sélectionner les aptamères, 5 ml de la solution DMEM / ITS / ARN est ajouté sur les cellules préalablement lavées 2 fois avec du DMEM sans antibiotiques ni sérum. Les cellules sont incubées à 37°C pendant 1 heure, en agitant brièvement la flasque contenant le mélange toutes les 15 minutes. La flasque contenant les cellules est ensuite placée sur de la glace et les cellules sont lavées 5 fois avec 15 mL de PBS 1x froid afin d’éliminer les ARN aptamères n’ayant pas pénétré dans les cellules. Les cellules sont ensuite lysées avec du TRIzol (Invitrogen) et les ARN totaux extrait par la méthode « phénolchloroforme ». Les ARN endogènes sont digérés avec de la RNAse A, et les ARN restants hybridés avec des amorces 3’ et rétrotranscrits par l’enzyme Superscript III (ThermoFisher), avant amplification par PCR en présence de primer 5’ (100 μΜ), primer 3’ (100 μΜ), la polymérase ADN « Q5 High Fidelity » (NEB) et le tampon Q5 High-Fidelity Master Mix correspondant à une concentration de 1X. L’ensemble de ces étapes permettant d’obtenir une bibliothèque d’ARN aptamères est répété. Ainsi deux cycles de sélection des ARN aptamères pénétrant des cellules C2C12 sont effectués.

Deux ARN aptamères (B et C) pénétrant dans les cellules C2C12 ont été sélectionnés et séquencés (SEQ ID NO : 65 et 66, respectivement). Les ARN aptamères B et C ont ensuite été insérés dans le 5’UTR de l’ARNm MB8-luc2, en amont de xrRNAI, pour générer les ARNm MB13-luc2 et MB14-luc2, respectivement.

Aptamère fixant fortement le motif peptidique poly-histidine

Une seconde stratégie visant à améliorer l’internalisation de l’ARNm a consisté à insérer dans le 5’UTR de l’ARNm MB8-luc2, en amont de xrRNAI, un autre ARN aptamère (l’aptamère A) capable de fixer fortement le motif peptidique poly-histidine en présence de magnésium. L’ARNm doté de l’ARN aptamère A a été nommé MB11-luc2. Un peptide pénétrant les fibres musculaires de souris, M12 (voir Gao et al., 2014), a été lié par l’intermédiaire d’un espaceur (ici comprenant les acides aminés glycine et serine) au motif hexahistidine. Différents espaceurs sont illustrés à titre d’exemple dans les séquences de SEQ ID NO : 75 (RRQPPRSISSHPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGHHHHHH), SEQ ID NO : 76 (PQRDTVGGRTT PPSWGPAKAGGGGSGGGGSGGGGHHHHHH), SEQ ID NO : 77 (GPFHFYQFLFPPVGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSGHHHHHH) ou SEQ ID NO : 781GSPWGLQHHPPRTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGHH HHHH) ; séquence espaceur soulignée). Le peptide ainsi formé a été nommé M12-H6 (SEQ ID NO : 75). L’ARNm MB11luc2 a été incubé pendant 30 minutes à température ambiante avec le peptide M12-H6, avant d’être injecté dans le biceps femoris de souris.

Transfection in vivo

Le muscle biceps femoris de souris BALB/cByJ mâles a été transfecté avec 5 pg d’ARNm MB8-luc2, d’ARNm MB13-luc2, d’ARNm MB14-luc2, ou d’ARNm MB11-luc2 complexé au peptide M12-H6 en présence ou absence de 5 pg de chloroquine. L’activité luciférase a été mesurée 16 heures après les injections.

Résultats :

L’ARNm MB13-luc2 transfecté le muscle aussi bien que l’ARNm MB8-luc2 (Figure 10). De façon très avantageuse, l’ARNm MB14-luc2 comprenant l’aptamère C transfecté le biceps femoris 2,1 fois plus efficacement que l’ARNm MB8-luc2. L’ARN aptamère C a donc amélioré l’internalisation dans les fibres musculaires de la molécule d’ARNm dans lequel il a été inséré.

L’efficacité de la transfection de l’ARNm MB11-luc2 a été modeste (Figure 10). De façon surprenante, la co-injection de 5 pg d’ARNm MB11-luc2, du peptide M12-H6 et de 5 pg de chloroquine a toutefois amélioré l’efficacité de la transfection de 31 fois par rapport à l’ARNm MB11-luc2 en présence du peptide, sans chloroquine. De plus, de façon très avantageuse, l’expression luciférase obtenu avec l’ARNm MB11-luc2 en présence de M12-H6 et la chloroquine a été 2,7 fois plus élevée que celle obtenue avec l’ARNm MB8luc2.

Sans être liée par la théorie, on peut penser que l’efficacité importante de la transfection de l’ARNm MB11-luc2 complexé au peptide M12-H6 et en présence de chloroquine a été favorisée par un ralentissement de l’acidification de l’endosome par la chloroquine suite à la pénétration de l’ARNm dans les cellules. La chloroquine permettrait le ralentissement de la protonation de l’hexahistidine à pH acide et donc empêcherait la déstabilisation des complexes entre l’ARNm MB11-luc2 et le peptide M12-H6. De ce fait, l’ARNm s’échapperait de l’endosome de façon améliorée, en traversant sa membrane à l’aide de M12-H6 auquel il est toujours complexé, pour pénétrer dans le cytosol où l’ARNm est ensuite traduit.

Exemple 10 : Protocole d’injection intradermique chez la souris a-Préparation des solutions

Une solution de 60 pl contenant 20 pg d’ARN messager a été préparée pour chaque souris. Pour cela, de l’eau déminéralisée, de l’Hepes 50 mM (1/8 d’Hepes, 7/8 d’Hepes de sodium), du NaCl (160 mM final), du MgCl₂, un ARNm et optionnellement un peptide ont été mélangés. Une incubation de 30 minutes à température ambiante a permis au peptide de se fixer à l’ARN. Il n’y pas eu d’incubation lorsque l’ARNm n’a pas été complexé à un peptide. Les solutions d’ARNm ont été congelées à -80°C, afin de les conserver jusqu’à ce qu’elles soient injectées.

b-lnjection intradermique et prélèvements de biopsies

Des souris OF1 mâles de 6 semaines ont été utilisées (Charles River). Elles ont été tondues trois à quatre jours avant l’injection intradermique. Les anesthésies ont été réalisées à l’aide d’un masque. L’induction de l’anesthésie a été obtenue par l’utilisation de 4% d’isoflurane (Piramal Heathcare). Le maintien de l’anesthésie a été réalisé à un pourcentage d’isoflurane de 2%. Avant l’injection, la peau du dos préalablement tondue a été nettoyée avec une lingette imbibée d’alcool. Les solutions d’ARNm ont été lentement décongelées à température ambiante, afin de remplir les seringues à insuline U-100 (30G) de 0,3 mm x 8 mm (Becton-Dickinson). Trois injections d’environ 17 μΐ de solution d’ARN ont réalisées dans la peau du dos tondue de chaque souris. Des papules se sont formées avant de se résorber. Ces dernières ont été délimitées à l’aide d’un marqueur indélébile, afin de permettre le repérage de la zone de peau à biopsier le lendemain. Un marquage de la queue a été également réalisé à l’aide d’un marqueur, afin de différencier les animaux de la même cage.

heures après les injections, des biopsies de peau ont été réalisées au niveau des zones injectées. Pour cela, les souris ont été anesthésiées, puis euthanasiées par dislocation cervicale. Les biopsies ont été découpées en petits morceaux à l’aide d’une paire de ciseaux, afin de faciliter la lyse des cellules, et introduits dans des tubes contenant 500 μΐ de tampon de lyse 1X (Luciferase Cell Culture Lysis 5X (Promega), dilué dans de l’eau). Chaque tube a été congelé à -20°C jusqu’à l’étape suivante.

c-Lyse des cellules, dosages de la luciférase et des protéines

La lyse des tissus prélevés a été obtenue en effectuant trois cycles de congélation / décongélation : -80° C pendant 10 minutes, 3 minutes dans un bain-marie à température ambiante et mélange à l’aide d’un agitateur-vortex pendant quelques secondes. Les tubes ont ensuite été centrifugés à 5 000 g pendant 5 minutes à 20°C pour sédimenter les débris tissulaires. Le surnageant a été transvasé dans un autre tube.

Le dosage luciférase a été réalisé à l’aide du kit Luciferase Assay System (Promega). 20 μΐ de chaque échantillon ont été introduits dans des tubes dédiés au luminomètre (Berthold AutoLumat Plus LB 953). L’appareil a injecté 100 μΐ de substrat et a mesuré la quantité de lumière émise (RLU).

Le dosage des protéines a été effectué à l’aide du Kit Pierce 660nm Protein Assay (Thermo scientific). Une gamme d’étalonnage a été préalablement réalisée avec de la Sérum Albumine Bovine (Thermo scientific) et du tampon de lyse 1X comme diluant. Elle a couvert une gamme de 100 à 500 pg de protéines par millilitre. Le blanc a été obtenu en utilisant 100 μΐ de tampon de lyse 1X. Les lysats ont été dans certains cas dilués avec du tampon de lyse 1X. 100 μΐ de chaque échantillon ont été utilisés pour le dosage des protéines. 1,5 ml de réactif a été ajouté au blanc et aux échantillons. Après précisément 5 minutes d’incubation à température ambiante et dans l’obscurité, l’absorbance à 660 nm de chaque échantillon a été mesuré à l’aide d’un spectrophotomètre.

Exemple 11 : Effet des CPPs sur l’efficacité de transfection d’ARNm dans la peau

La stratégie visant à améliorer l’internalisation de l’ARNm nu par la fixation d’un peptide pénétrant les cellules (CPP) à l’ARN aptamère A, n’est pas restreinte au muscle, tel que décrit à l’Exemple 9 ci-dessus. Cette stratégie a été appliquée ici à la peau de souris en utilisant différents CPP.

Matériels et méthodes :

Trois CPPs ont été utilisés ici : CPP1, CPP2 et CPP3 (voir Kamada et al., 2007 et Lee et al., 2012). Ils ont été connectés à de l’hexahistidine par un espaceur constitué de glycines et de sérines pour former les peptides CPP1-H6, CPP2-H6 et CPP3-H6 ayant les séquences de SEQ ID NO : 76, 77, et 78, respectivement.

L’ARNm MB11-luc2 a été incubé avec des quantités croissantes de peptide CPP3-H6, CPP1-H6, ou CPP2-H6 pendant 30 minutes dans du tampon préalablement optimisé comprenant 160mM NaCl, 0,7 mM MgCl₂ et 5 mM Hepes. L’ARNm MB11-luc2 seul et l’ARNm MB8-luc2 dilué dans de l’eau déminéralisée, ultrapure et stérile, additionnée de 160 mM de NaCl, ont également été injectés, et servent ici de témoins.

Une injection intradermique de 5,6 pg d’ARNm MB8-luc2 ou de MB11-luc2 a été effectué chez la souris OF1 selon le protocolé détaillé à l’exemple 10. La peau de souris a également été injectée avec un mélange d’ARNm MB11-luc2 et ARNm MB8-luc2 à un ratio de 1 /1, et la même quantité de CPP3-H6 que celle du ratio molaire de 0,5 afin de déterminer si le peptide CPP3-H6 peut se dissocier de l’ARN aptamère A, présent dans l’ARNm MB11-luc2, après l’injection intradermique. L’activité luciférase a été mesurée 18 heures après les injections.

Résultats :

Comme attendu, une injection d’ARNm MB8-luc2 a abouti à une transfection efficace de la peau. La co-injection de CPP3-H6, de 0,7 mM de MgCl₂ et de 5 mM d’Hepes à l’ARNm MB8-luc2 n’a pas affecté de manière significative l’efficacité de la transfection (Figure 11).

La quantité optimale de peptide CPP3-H6, qui permet d’augmenter de façon avantageuse l’efficacité de la transfection de 9,2 fois par rapport à l’ARNm MB11-luc2 seul, correspond à un ratio molaire de 1 peptide CPP3-H6 pour 2 ARNm (Figure 11). De plus, de façon très avantageuse, l’activité luciférase est 2,1 fois plus élevée que celle obtenue avec l’ARNm MB8-luc2 et 19,5 fois plus élevée que celle obtenue avec l’ARNm classique MB5-luc2 coiffé.

Lorsqu’un ARNm sur deux ne fixe pas le CPP3-H6, la transfection chute de 12,3 fois (Figure 11, 2,8 pg de chacun des ARNm MB8-luc2 et MB11-luc2). Cela signifie que le peptide CPP3-H6 peut se dissocier de l’ARN aptamère A, présent dans l’ARNm MB11luc2, après l’injection intradermique. Si la moitié de l’ARNm est dépourvue d’ARN aptamère A (ARNm MB8-luc2), CPP3-H6 ne peut plus améliorer aussi efficacement la transfection.

L’ARNm MB11-luc2 a également été incubé avec le peptide CPP1-H6 à différents ratios molaires. Le meilleur ratio molaire a été de 1 peptide CPP1-H6 pour 4 ARNm MB11-luc2 (Figure 12). L’efficacité de la transfection a augmenté de 5,4 fois par rapport à l’ARNm MB11-luc2 seul.

CPP1-H6 a donc donné un moins bon résultat que CPP3-H6. Cela peut s’expliquer par le nombre d’exemplaires du ou des récepteur(s) de chaque CPP présent(s) dans la membrane plasmique des cellules de la peau et de l’affinité de chaque CPP pour son ou ses récepteur(s).

Enfin, l’ARNm MB11-luc2 a également été incubé avec CPP2-H6 à divers ratios molaires. Le meilleur ratio molaire a été de 2 peptides CPP2-H6 pour 1 ARNm MB11-luc2 (Figure 13). L’efficacité de la transfection a augmenté de 10,6 fois par rapport à l’ARNm MB11luc2 seul, et est également supérieure à celle obtenue avec le peptide CPP3-H6. L’expression luciférase est ainsi 22,8 fois plus élevée que celle obtenue avec l’ARNm classique MB5-luc2.

Exemple 12 : Effet d’un CPP-H6 sur l’efficacité de transfection d’un ARNm coiffé dans la peau

Matériels et méthodes :

Afin d’évaluer l’effet d’un CPP (ici CPP2-H6) sur l’efficacité de transfection d’un ARNm coiffé, l’aptamère A a été inséré dans le 5’UTR de l’ARNm conventionnel MB5-luc2 coiffé pour générer l’ARNm MB15-luc2 coiffé ayant la séquence de SEQ ID NO : 70. L’ARNm MB15-luc2 a été incubé avec CPP2-H6 pendant 30 minutes dans du tampon comprenant 0,7 mM MgCl₂ et 5 mM Hepes, comme décrit ci-dessus à l’exemple 11.

Une injection intradermique de 5,6 pg d’ARNm MB15-luc2 a été effectuée chez la souris OF1 selon le protocole détaillé à l’exemple 10. L’activité luciférase a été mesurée 18 heures après les injections.

Résultats :

En l’absence de peptide CPP2-H6, l’expression luciférase obtenue avec l’ARNm MB15luc2 coiffé est 1,68 fois plus faible que celle obtenue avec l’ARNm MB5-luc2 coiffé.

La co-injection de l’ARNm MB15-luc2 coiffé et du peptide CPP2-H6, à un ratio molaire de 2 peptides par ARNm, n’a amélioré l’efficacité de la transfection que de 1,48 fois par rapport à l’ARNm MB15-luc2 seul. Cela signifie que l’insertion de l’ARN aptamère A dans le 5’UTR d’un ARNm classique coiffé et la fixation d’un peptide CPP-H6 à cet ARN aptamère n’améliore pas l’efficacité de la transfection par rapport à celle observée avec l’ARNm dépourvu de coiffe, MB11-luc2 (10,6 fois). Quel que soit la molécule d’ARNm coiffé (avec ou sans aptamère, liée ou non au CPP CPP2-H6), l’efficacité de la transfection reste largement inférieure à celle observée pour les ARNm MB8-luc2 et MB11-luc2. Il est donc très avantageux d’utiliser les molécules d’ARNm de l’invention plutôt que des molécules d’ARNm coiffés.

Exemple 13 : Effet du 5’-SL sur l'expression luciférase in vivo dans la peau

Matériels et méthodes :

Les ARNm suivants : MB8-luc2, MB11-luc2, MB17-luc2, MB18-luc2, et MB5-luc2 coiffé ont été injectés dans la peau et l’activité luciférase mesurée 18 heures après injection, selon le protocole détaillé à l’Exemple 10 ci-dessus.

Résultats :

Comme illustré à la Figure 15, l’ARNm selon l’invention comprenant au moins une séquence xrRNA et une séquence 1RES (MB11 -luc2) augmente l'expression luciférase dans la peau d’environ 2 fois par rapport à l’ARNm coiffé (MB5-luc2). De façon très surprenant, l’ajout d’une tige-boucle (ici la 5’-SL ayant la séquence de SEQ ID NO : 87) augmente l'expression luciférase dans la peau d’environ 4,3 fois supplémentaire par rapport aux seules séquences xrRNA et 1RES (MB11-luc2), lorsque la tige-boucle est localisée cinq nucléotides en amont de la séquence xrRNAI (MB8-luc2 et MB18-luc2). Toutefois, lorsque la tige-boucle est localisée environ 70 nucléotides en amont de la séquence xrRNA, la tige-boucle n’améliore pas l’efficacité au-delà de ce qui est déjà observée en l’absence de la tige-boucle. En effet, l’efficacité de la traduction est similaire pour les ARNm MB11-luc2 et MB17-luc2. Le placement de l’aptamère A entre les séquences xrRNA et la séquence 1RES (MB18-luc2) augmente l’efficacité de la traduction encore plus par rapport aux ARNm MB11-luc2 et MB17-luc2 de façon très surprenante. Les ARNm MB8-luc2 et MB18-luc2 ont ainsi une efficacité de la traduction similaire.

Conclusion :

Une molécule d’ARNm selon l’invention a un coût de synthèse réduit d’environ 30 fois, par rapport à un molécule d’ARNm coiffé, tout en ayant un rendement accru d’expression protéique d’au moins 2 fois, de préférence d’environ 10 fois. De plus, l’ARNm de l’invention est au moins aussi stable qu’un ARNm coiffé, et sa production par transcription in vitro est simplifiée par l’absence de molécule de coiffe ou d’un 10 analogue de celle-ci. Un ARNm de l’invention codant pour la protéase 2A du HRV2 permet d’augmenter la traduction d’un ARNm codant pour une protéine d’intérêt lorsque ces deux molécules sont co-transfectées. De plus, l’efficacité de la transfection dans un tissu, tel que le muscle ou la peau peut être améliorée par exemple par l’insertion dans la région 5’-UTR de la molécule d’ARNm selon l’invention d’un ARN 15 aptamère pénétrant directement dans des cellules, d’un CPP (fixé à un ARN aptamère tel que décrit ci-dessus), et/ou par l’ajout d’une tige-boucle à l’extrémité 5’ de la région 5’-UTR en amont de la/les séquences(s) xrRNA.

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Claims

REVENDICATIONS

1. Une molécule d’acide ribonucléique messager (ARNm) dépourvue de molécule de coiffe comprenant de 5’ à 3’ :

- une région 5’-UTR comprenant au moins un exemplaire d’une séquence consensus GUCAGRYC(N₇.₁₉)GCCA(N₁₂.₁₉)UGCNRYCUG (xrRNA) ;

- un exemplaire d’une séquence d’ARN interne d’entrée de ribosomes (1RES) ; et

- une phase de lecture ouverte.
2. La molécule d’ARNm selon la revendication 1 comprenant deux exemplaires de xrRNA.
3. La molécule d’ARNm selon la revendication 1 ou 2 comprenant au moins une SEQ ID NO parmi SEQ ID NO : 1 à 44, de préférence comprenant la SEQ ID NO : 11 et la SEQ ID NO : 26.
4. La molécule d’ARNm selon l’une des revendications 1 à 3 comprenant la séquence 1RES du virus de l’encéphalomyocardite (EMCV).
5. La molécule d’ARNm selon l’une des revendications 1 à 4 comprenant une tigeboucle, de préférence selon SEQ ID NO :87, ladite tige-boucle étant localisé à l’extrémité 5’ de la région 5’-UTR.
6. La molécule d’ARNm selon l’une des revendications 1 à 5 comprenant au moins un aptamère choisi parmi l’aptamère A ayant la séquence de SEQ ID NO : 64 et l’aptamère C ayant la séquence de SEQ ID NO : 66.
7. La molécule d’ARNm comprenant l’aptamère A selon la revendication 6, selon laquelle ladite molécule d’ARNm est liée à un peptide pénétrant les cellules (CPP) fusionné à une étiquette poly-histidine, ledit CPP étant choisi de préférence parmi : M12-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 75, CPP1-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 76, CPP2-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 77, et CPP3-H6 ayant la séquence de SEQ ID NO : 78.
8. La molécule d’ARNm selon l’une des revendications 1 à 7 selon laquelle une phase de lecture ouverte code la protéine 2Apro du virus HRV2.
9. Une molécule d’acide désoxyribonucléique (ADN) comprenant une séquence codant l’ARNm telle que décrit dans l’une quelconque des revendications précédentes, de préférence comprenant

-un promoteur reconnu par l’ARN polymérase T7, ledit promoteur comprenant une séquence représentée par SEQ ID NO : 46 ;

-une région 5’-UTR comprenant une séquence représentée par SEQ ID NO : 50, 71, 72, 73, 85, ou 86 ;

-une phase de lecture ouverte ; et

-une région 3’-UTR comprenant une séquence choisie parmi les séquences représentées par SEQ ID NOs : 53, 54, 55, et 56.
10. Un vecteur comprenant la molécule d’ARNm telle que décrit dans l’une des revendications 1 à 5 ou d’ADN selon la revendication 9.
11. Une méthode de production in vitro d’au moins un ARNm comprenant la mise en contact de la molécule d’ADN telle que décrite dans la revendication 9 avec au moins une ARN polymérase.
12. La méthode de production selon la revendication 11 comprenant une étape de purification dudit ARNm.
13. Une composition pharmaceutiquement acceptable comprenant l’ARNm selon l’une des revendications 1 à 7 et un excipient et/ou un adjuvant physiologiquement acceptable.
14. La composition selon la revendication 13 pour son utilisation dans la thérapie génique ou dans la vaccination génétique.
15. La composition selon l’une des revendications 13 ou 14 comprenant une deuxième molécule d’ARNm telle que décrite dans l’une des revendications 1 à 7, selon laquelle une phase de lecture ouverte code la protéine 2Apro.