FR3072279A1 - Utilisation de la cloxacilline pour inhiber/ empecher la formation de biofilm - Google Patents

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Abstract

La présente invention se rapporte à une composition pharmaceutique comprenant de la cloxacilline pour son utilisation comme médicament pour la prévention de la formation d'un biofilm bactérien. La présente invention se rapporte également à l'utilisation de la cloxacilline pour la prévention et/ou l'inhibition de la formation d'un biofilm bactérien sur une surface.

Description

UTILISATION DE LA CLOXACILLINE POUR INHIBER/ EMPECHER LA
FORMATION DE BIOFILM
Domaine technique
La présente invention se rapporte à une composition pharmaceutique comprenant de la cloxacilline pour son utilisation comme médicament pour la prévention de la formation d’un biofilm bactérien.
La présente invention se rapporte également à l’utilisation de la cloxacilline pour la prévention et/ou l’inhibition de la formation d’un biofilm bactérien sur une surface.
La présente invention se rapporte également un dispositif médical comprenant à sa surface de la cloxacilline.
La présente invention trouve une application notamment dans le domaine pharmaceutique, le domaine médical.
Etat de la technique
Les biofilms sont formés de différentes couches de bactéries ou de microorganismes, souvent contenus dans une matrice solide. Ils se développent pour former des communautés microbiennes, dont l’une des propriétés est d’adhérer aux surfaces submergées. Cette adhésion est soit non spécifique (adhérence), soit spécifique (adhésion proprement dite) (Costerton et al., « Bacterial Biofilms : a common cause of persistent infections ». Science 1999 ; 284, 1318-1322) :
- L’adhérence ou adhésion réversible : Les microorganismes présents se rapprochent des surfaces par gravimétrie, mouvements browniens ou par chimiotactisme s’ils possèdent des flagelles. Au cours de cette première étape de fixation, faisant intervenir uniquement des phénomènes purement physiques et des interactions physico-chimiques faibles, les microorganismes peuvent encore être facilement décrochés.
- L’adhésion : Cette étape plus lente fait intervenir des interactions de plus forte énergie ainsi que le métabolisme microbien et les appendices cellulaires du microorganisme (flagelles, pilis,....). L’adhésion est un phénomène actif et spécifique. Certains premiers colonisateurs vont s’attacher de manière irréversible à la surface grâce notamment à la synthèse d’exopolysaccharides (EPS). Ce processus est relativement lent et dépend des facteurs environnementaux et des microorganismes en présence.
Ces biofilms sont omniprésents dans de nombreux domaines, dans lesquels ils présentent des risques sanitaires et causent des dommages relativement importants.
En santé humaine par exemple, les biofilms sont responsables d’infections de plus en plus difficiles à juguler : sur toute la sphère ORL (conduit auditif, muqueuse nasale, conjonctive de l’œil ...), sur les dents (apparition de tartre, de caries, ...), sur les bronches, les poumons (chez les patients atteints de pneumopathies, mucoviscidose ...), au niveau du tractus urogénital, des plaies. Ils sont en outre à l’origine de la plupart des pathologies nosocomiales (plus de 10 000 décès par an) en se formant au niveau de cathéters, ou d’implants (valves cardiaques, hanches artificielles, sondes urinaires,... ) (Costerton et al., « Bacterial Biofilms : a common cause of persistent infections ». Science 1999 ; 284, 1318-1322).
Les biofilms bactériens se développant sur des implants ou lors d’infections chroniques constituent des réservoirs de pathogènes à l’origine de nombreuses infections nosocomiales.
Malgré la mise en œuvre de mesures préventives, les biofilms sont difficiles à prévenir et à éradiquer en raison de leur tolérance caractéristique aux doses thérapeutiques d’antibiotiques prescrites, et même à des doses élevées d’antibiotiques. Cette tolérance permet aux microorganismes de persister (d’où le nom de persisters qui leur est attribué) et ensuite de développer des résistances au sein du biofilm (apparition de mutations, échanges de gènes de résistances) (Hoiby, N. et al. ; (2010) Antibiotic résistance of bacterial biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents, 35, 322-332).
Les infections ostéoarticulaires sont des infections qui touchent les os et/ou les articulations qui sont fréquemment dues à des staphylocoques. Il existe également des infections ostéoarticulaires complexes qui apparaissent plus particulièrement chez les individus porteurs de prothèse articulaire ou de dispositifs médicaux implantables. Ces infections sont particulièrement difficiles à traiter dans la mesure où elles présentent fréquemment une tolérance (également appelée récalcitrance) aux antibiotiques, notamment de par la présence de biofilm, ainsi que des résistances comme décrit précédemment.
En particulier, il est connu que la surface de prothèses, notamment articulaire est un territoire favorable pour la prolifération des bactéries et la formation de biofilm.
Il a été montré, sur la base d’une cohorte de 124 patients atteints d’ostéomyélite liée à un implant, due à une infection à Staphylococcus epidermidis (responsable d’environ 20% des infections ostéo-articulaires) que les taux de guérison diminuent lorsque la capacité de formation de biofilm des isolats augmente. En particulier, le taux de guérison des infections ostéo-articulaires est de 84% pour les infections provoquées par une souche/bactérie ne formant pas de biofilm, le taux de guérison est de 76% pour une souche/bactérie faible formateur de biofilm et le taux de guérison est de 60% pour une souche/bactérie formateur de biofilm les plus marqués (Morgenstern et al., J Orthop Res. 2016 Nov;34(11):1905-1913). Cette analyse sur le taux d’échec est à mettre en lien avec une étude in vitro montrant l'inefficacité d’un traitement à la gentamicine du ciment osseux sur la formation de biofilm par des isolats cliniques de S. aureus (Tunney et al., J Orthop Res. 2007 Jan;25(1 ):2-10). Egalement, une étude compilant des analyses in vitro, in vivo et le séquençage de l’ADN de souches suggère que la chronicisation de S. aureus dans les cas d’infections ostéo-articulaires est en particulier associée à la formation de biofilm (Trouillet-Assant et al., Cell
Microbiol. 2016 Oct; 18(10):1405-14). Enfin, une étude sur 66 patients a conduit à conclure que le taux d’échecs de traitement d’infections ostéoarticulaires est de 24,2% (Valour et a I. BMC Infect Dis. 2014Aug 16; 14:44), et ce, malgré l’utilisation d’antibiothérapie censées être adaptées au pathogène.
Une étude de l’ampicilline et la pénicilline (de la famille des bêtalactamines) sur une éventuelle action préventive de la formation de biofilm en microplaque de polystyrène a été réalisée (Singh et Mishra « Synergistic and antagonistic actions of antibiotics against biofilm forming Staphylococcus aureus », Asian Journal of Plant Science and Research, 2012). Toutefois aucune application et/ou utilisation particulière pour ces deux composés n’a été envisagée, les auteurs concluant que les composés testés individuellement ne sont pas assez actifs, alors que seules des associations d’antibiotiques de la famille des beta-lactamines avec des macrolides pourrait être efficace in-vitro. Ce document ne décrit aucune application in-vivo ni ne présente d’élément susceptible d’envisager un quelconque effet in-vivo.
Il a de plus été montré qu’un antibiotique, à une dose inférieure à sa CMI (subCMI), peut favoriser l’attachement de bactéries. Par exemple, les aminoglycosides à des doses subCMI induisent l’adhésion de souches de Pseudomonas aeruginosa et de Escherichia coli (Hoffman et al, 2005, Nature, 436 : 1171 -1175), le metronidazole augmente la formation de biofilm par Clostridium difficile (Vuotto et al, 2016, Pathod Dis, 74, doi: 10.1093/femspd/ftv114), l’amoxicilline à des doses subCMI induit l’attachement de la souche de S. aureus USA 300 (Mlynek et al, 2016, Antimicrob Agents Chemother., 60:2639-51, mais surtout, l’oxacilline, comme la vancomycine, à des doses subCMI induisent la formation de biofilm par S. aureus (Mirani et al., 2011, J Basic Microbiol., 51:191-5. Cet effet est largement observé pour de nombreuses souches bactériennes, par de nombreux antibiotiques (revue par Kaplan, 2011, Int J Artif Organs 34: 737-751). Il est connu que le taux ou concentration sérique d’une substance entre deux administrations varie dans le temps autour de sa concentration efficace, à savoir un temps supérieur, puis dans la plage de concentration efficace et enfin, préalablement à la nouvelle prise, inférieure à la plage de concentration efficace. Ainsi, pour un antibiotique, il existe un temps pendant lequel la concentration de l’antibiotique est inférieure à la CMI (concentration minimale inhibitrice) favorisant ainsi l’attachement de bactéries et éventuellement la formation de biofilm.
Il existe donc un réel besoin de trouver un nouveau moyen/composé palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l’art antérieur, en particulier d’un moyen/composé permettant d’empêcher la formation de biofilm et/ou dégrader les biofilms.
En particulier, il existe donc un réel besoin de trouver un nouveau moyen/composé palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l’art antérieur, en particulier d’un moyen/composé permettant d’empêcher la formation de biofilm et/ou dégrader les biofilms présents notamment à la surface de prothèses et/ou de dispositif médical implantable.
Il existe donc un réel besoin de trouver un nouveau moyen/composé palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l’art antérieur, en particulier d’un moyen/composé permettant d’empêcher la formation de biofilm et/ou dégrader les biofilms.
En particulier, il existe un réel besoin de trouver un nouveau moyen/composé palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l’art antérieur, en particulier d’un moyen/composé permettant d’empêcher la formation de biofilm et/ou dégrader les biofilms présents notamment à la surface de prothèses et/ou de dispositif médical implantable.
Il existe également un réel besoin de trouver un nouveau moyen/composé permettant de prévenir/traiter les biofilms d’infections ostéo-articulaires, de plaies incluant les plaies superficielles, profondes, les infections du pied diabétique, brûlures, escarres.
En particulier, il existe donc un réel besoin de trouver un nouveau moyen/composé palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l’art antérieur, en particulier d’un moyen/composé permettant d’empêcher la formation de biofilm au niveau des plaies et/ou d’infections, par exemple ostéo-articulaires.
Description de l’invention
La présente invention résout les inconvénients et obstacles de l’art antérieur via l’utilisation de la cloxacilline à une concentration supérieure à 4mg/L, par exemple comprise de 4 mg/L à 16mg/L.
Les inventeurs ont démontré de manière surprenante et inattendue que l’utilisation à une concentration supérieure à 4mg/L, par exemple comprise de 4 mg/L à 16mg/L permet avantageusement d’inhiber la formation et/ou le développement de biofilms sur une surface.
La présente invention résout également les inconvénients et obstacles de l’art antérieur en utilisant la cloxacilline à une dose supérieure à 25 mg/Kg, par exemple comprise de 25 à 100mg/Kg, préférentiellement de 25 à 50mg/Kg comme médicament permettant ainsi d’inhiber la formation et/ou le développement de biofilms sur une surface.
Les inventeurs ont démontré de manière surprenante et inattendue que l’utilisation de la cloxacilline comme médicament à une dose supérieure à 25 mg/Kg, par exemple comprise de 25 à 100mg/Kg, préférentiellement de 25 à 50mg/Kg permet avantageusement d’inhiber la formation et/ou le développement de biofilms.
Dans la présente, par mg/Kg, on entend une dose en milligramme par kilogramme de l’individu à traiter.
La présente invention résout également les inconvénients et obstacles de l’art antérieur en fournissant une composition pharmaceutique comprenant de la cloxacilline à une dose supérieure à 4mg/L, par exemple comprise de 4 mg/L à 16mg/L. pour son utilisation comme médicament pour la prévention et/ou l’inhibition de la formation d’un biofilm bactérien.
Les inventeurs sont les premiers à avoir démontré de manière surprenante une inhibition de formation de biofilm par la cloxacilline. En particulier, les inventeurs sont les premiers à avoir démontré de manière surprenante une inhibition de formation de biofilm par la cloxacilline à une concentration/quantité utilisée qui est totalement différente et indépendante de la concentration/quantité connue et/ou utile pour son utilisation en tant que bactéricide ou « tueuse de bactéries ».
En particulier, les inventeurs ont notamment démontré une inhibition de la formation de biofilm dans des conditions in vitro utilisées comprenant en une incubation courte (4h) de souches cliniques de Staphylococcus aureus, en présence de cloxacilline dès le début de l’incubation. Tel que démontré dans les exemples, les inventeurs ont démontré et caractérisé l’effet de la cloxacilline, sur la formation initiale du biofilm, les étapes d’adhérence et adhésion. De la même façon que pour des tests de sensibilité aux antibiotiques permettent de définir, sur une gamme de doses testées, une dose correspondant à la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI), les inventeurs ont démontré qu’au-dessus d’une concentration particulière et/ou dans une gamme de concentrations particulière, la cloxacilline inhibe la formation de biofilms. La concentration minimale permettant d’inhiber la formation de biofilm est également désignée dans le texte par Concentration Minimale Inhibitrice de biofilm (CMIb). Les inventeurs ont également démontré que la CMIb peut varier, comme la CMI, selon les souches, toutefois, ils ont également démontré que la variation peut être comprise dans une plage de valeurs permettant avantageusement l’utilisation de la cloxacilline pour inhiber la formation de biofilm, sans besoin de caractérisation, par exemple détermination de la CMI et/ou CMIb, de la souche, par exemple par utilisation d’une concentration et/ou dose correspondant à une CMIb fréquemment retrouvée.
La cloxacilline est un antibiotique de la famille des β-lactamines, du groupe des pénicillines du groupe M. Son action est de type bactéricide, c’est-à-dire qu’elle va avoir pour effet de tuer les bactéries, et elle est utilisée dans ce sens. Elle est utilisée pour traiter les infections causées par les staphylocoques produisant des pénicillinases, incluant les pneumocoques, les streptocoques β -hémolytiques du groupe A et les staphylocoques sensibles ou résistants à la pénicilline G. Son utilité est donc de contourner un mécanisme de résistance à des pénicillines dans le seul but de tuer les germes.
La cloxacilline est une β-lactamine de formule (I) suivante :
Figure FR3072279A1_D0001
Parmi les bactéries aérobies, la cloxacilline est utilisée contre Streptococcus pyogenes, une bactérie aérobie à Gram + habituellement sensible, et contre d’autres bactéries aérobies à Gram + comme Staphylococcus aureus et les staphylocoques coagulase négative, mais certains staphylocoques présentent maintenant des résistances.
Pour ce qui est des utilisations thérapeutiques, la cloxacilline est utilisée, par voie orale, dans la prise en charge d’infections cutanées staphylococciques et/ou streptococciques. Par voie injectable, la cloxacilline est utilisée dans la prise en charge de pathologies largement associées à une infection à staphylocoque telles que : infections ostéoarticulaires, endocardites, infections respiratoires, infections urogénitales. Les infections dermatologiques staphylococciques peuvent également être traitées par voie injectable.
La cloxacilline est également connue sous une forme galénique de gélule, par exemple commercialisé sous la marque ORBENINE 500 mg gélule (cloxacilline), et est indiquée chez l'adulte et chez l'enfant dans le traitement des infections cutanées peu sévères dues aux staphylocoques et/ou aux streptocoques sensibles. Dans toutes ces utilisations thérapeutiques, la cloxacilline est utilisée et décrite comme un antibiotique bactéricide, c’est-à-dire comme une molécule « tueuse de bactéries ». Par exemple, la cloxacilline Panpharma 500mg est destinée à être administrée, après solubilisation, par voie intraveineuse, en traitement curatif ou préventif. En traitement préventif, la posologie est, pour un adulte sans problèmes rénaux ni hépatiques, de 8 à 12 g/jour, répartis en 4 à 6 administrations journalières. En traitement préventif, l'antibioprophylaxie de prévention des infections post-opératoires en chirurgie est généralement de 2g à l’anesthésie, poursuivie par des injections de 1g toutes les 2h. Par exemple, la cloxacilline est connue et utilisée comme tueuse de bactéries dans le traitement des infections ostéo-articulaires, en particulier quand le germe responsable, identifié, est une souche de Staphylococcus aureus, sensible à la méthicilline. Toutefois, bien que l’antibiothérapie semble adaptée du fait de la sensibilité de la souche, (déterminée par des tests de sensibilité aux antibiotiques classiques, tels que Etest, Vitek® ou Vitek® 2 de bioMérieux, antibiogramme), un taux d’échec thérapeutique est non négligeable, à savoir plus de 20% d’echec (Valour et a I., BMC Infect Dis. 2014 Aug 16; 14:44)).
Dans la présente par biofilm on entend tout biofilm connu de l’homme du métier formé par un microorganisme, par exemple il peut s’agir d’un biofilm bactérien.
Dans la présente invention par surface on entend toute surface connue de l’homme du métier sur laquelle un biofilm peut se former. Il peut s’agir par exemple d’une surface biotique ou abiotique.
Dans la présente par surface biotique on entend toute surface biotique connue de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’une surface biotique choisie dans le groupe comprenant la peau, les muqueuses, les dents, toute surface du système vasculaire, par exemple les vaisseaux sanguins, les parois de l’endocarde, toute surface du système lymphatique, toute surface du système digestif, toute surface du système respiratoire, par exemple les parois du système broncho-pulmonaire, toute surface de la sphère Oto-Rhino-Laryngée.
Dans la présente la surface biotique peut être une surface saine et/ou présentant au moins une lésion et/ou infection. Il peut s’agir par exemple d’une surface biotique comprenant une plaie, une plaie infectée, une plaie en voie de cicatrisation, une plaie suturée, une cicatrice, une brûlure.
Dans la présente, par plaie, on entend toute plaie connue de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’une plaie superficielle, par exemple de plaie de l’épiderme et/ou du derme, par exemple de taille inférieure à 5 cm. Il peut s’agir également de plaie profonde, par exemple une plaie de l’épiderme et du derme avec exposition du tissu sous cutané. Il peut s’agir également de brûlures, escarres. Il peut s’agir également de toutes plaies susceptibles de s’infecter, par exemple de toutes plaies susceptibles d’être infectées, l’infection retardant ou compromettant la guérison de la plaie.
Dans la présente par infection on entend toute infection connue de l’homme du métier pour lesquels des biofilms sont susceptibles de se former. Il peut s’agir par exemple d’infections choisies dans le groupe comprenant les infections ostéoarticulaires, les infections du pied diabétique, les infections de plaies cutanées telles que brûlures et escarres, les infections du système respiratoire, par exemple système bronchopulmonaire, les infections de la sphère Oto-Rhino-Laryngée, les infections du système cardio-vasculaire, les infections du système digestif.
Dans la présente par surface abiotique on entend toute surface abiotique connue de l’homme du métier. Il peut s’agir également de toute surface de dispositif connue de l’homme du métier sur laquelle une bactérie est susceptible de former un biofilm. Il peut s’agir par exemple de la surface d’un dispositif médical, par exemple un cathéter, une aiguille, un cathéter à chambre implantable (ou Porth-a-Cath), une valve, par exemple une valve cardiaque, une prothèse, par exemple une prothèse articulaire, une prothèse ligamentaire, un implant dentaire, une prothèse de voies urinaires, la membrane péritonéale, des cathéters de dialyse péritonéale, des greffes vasculaires synthétiques, des stents, les dispositifs de fixation interne, des sutures percutanées et/ou trachéale, des tubes de ventilation.
Il peut s’agir par exemple de toute surface présente dans les salles/pièces d'urgence médicales, de traitements médicaux, d'opération, les blocs opératoires, les salles/pièces des unités de soins intensifs (UTI), les salles/pièces des unités de maladies infectieuses, les salles/pièces des unités d'oncologie et / ou d'autres unités recevant des patients gravement immunodéprimés, des salles/pièces d'isolement, de cabines d'avion, Il peut s’agir également de toute surface des salles/pièces de laboratoire, de laboratoire biologique, de laboratoire d’analyses biologiques, de salle d'incubation et d'un autre volume clos de toute nature dans laquelle un biofilm est susceptible de se former.
Dans la présente, la surface abiotique peut être formée par tout matériau connu de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’un matériau biocompatible ou non. Par exemple, le matériau peut être tout matériau biocompatible connu de l’homme du métier, par exemple une prothèse, par exemple une prothèse ostéo-articulaire, une valve cardiaque, un implant dentaire. Par exemple, le matériau peut être tout matériau utilisé dans des tuyaux ou tout contenant permettant le passage d’un fluide, par exemple dans des unités de production de l’industrie agro-alimentaire, pharmaceutique.
Dans la présente, la surface abiotique peut être par exemple une surface métallique, une surface formée par un alliage, une surface polymérique. Par exemple, le métal peut être tout métal connu de l’homme du métier, par exemple un métal choisi dans le groupe comprenant le titane, le cuivre, le fer, l’aluminium, le nickel, le tungstène, l’argent, l’or, le palladium, le vanadium, le molybdène. Par exemple, l’alliage peut être tout alliage connu de l’homme du métier, par exemple un alliage choisi dans le groupe comprenant l’acier, le laiton, le cuivre-nickel, cuivre-palladium, argent-or, argent-palladium, molybdène-vanadium, molybdène-tungstène. Par exemple, le polymère peut être tout polymère connu de l’homme du métier susceptible de constituer et/ou recouvrir une surface. Il peut s’agir par exemple d’un polymère choisi dans le groupe comprenant le polytétrafluoroéthylène (PTFE), les polysiloxanes, les polyuréthanes, les polymères fonctionnalisés.
Dans la présente, l’utilisation de la cloxacilline pour inhiber la formation d’un biofilm bactérien sur une surface peut être effectuée à une dose comprise de 25 à 100mg/Kg d’individu, préférentiellement de 25 à 50mg/Kg d’individu.
Avantageusement, lorsque la cloxacilline est utilisée à une dose comprise de 25 à 100mg/Kg d’individu, préférentiellement de 25 à 50mg/Kg d’individu, elle permet d’obtenir des concentrations sériques de cloxacilline comprise de 4 à 16 mg/L, préférentiellement à des concentrations sériques de 4 à 8 mg/L.
Dans la présente, la concentration de la cloxacilline utilisée peut être fonction de la surface.
Selon l’invention, lorsque la surface est une surface abiotique, la cloxacilline peut être utilisée à une dose comprise de 25.à 100mg/Kg d’individu, par exemple de 25.à 50mg/Kg, et/ou à une concentration de 4 à 16mg/L, préférentiellement de 4 à 8mg/L.
Selon l’invention, lorsque la surface est une surface biotique, la cloxacilline peut être utilisée à une dose comprise de 25.à 100mg/Kg d’individu, par exemple de 25.à 50 mg/Kg d’individu.
Avantageusement, lorsque la cloxacilline est appliquée directement sur une surface, par exemple biotique ou abiotique, la cloxacilline peut être utilisée à une concentration de 4 à 16mg/L, préférentiellement de 4 à 8mg/L.
Tel que mentionné ci-dessus, les inventeurs ont démontré de manière surprenante que la cloxacilline permet à des concentrations particulières et non usuelles d’inhiber la formation de biofilm et en particulier d’inhiber la première étape indispensable à cette formation, à savoir l’adhésion et la fixation, également dénommé respectivement adhérence et adhésion, des bactéries sur une surface. Ainsi, les inventeurs ont clairement démontré que l’utilisation de la cloxacilline permet avantageusement, notamment par l’inhibition de l’étape d’adhésion, de prévenir la formation d’un biofilm.
Aussi, la présente invention a également pour objet l’utilisation de la cloxacilline à une concentration supérieure à 4 mg/L comprise de 4.à 16 mg/L pour prévenir la formation de biofilms sur une surface
La surface peut être une surface telle que définie précédemment.
Dans la présente par « prévenir la formation de biofilms » on entend empêcher en présence de microorganismes l’adhésion et/ou la fixation de ceux-ci sur ladite surface.
Lors de son utilisation pour la prévention de la formation d’un biofilm sur une surface, la cloxacilline peut être mise en contact et/ou appliquée sur ladite surface par tout procédé et/ou dispositif adapté connu de l’homme du métier. Par exemple, la mise en contact et/ou application peut être effectuée par aspersion de la cloxacilline sur la surface, par trempage de la surface dans une composition comprenant de la cloxacilline, par aspersion ou trempage de cloxacilline en association avec un composant censé agir également contre la formation de biofilm, tel que le cuivre. L’homme du métier, de par ces connaissances générales saura choisir et/ou adapter les procédés connus d’application et/ou de mise en contact en fonction des surfaces.
Par exemple, lorsque la cloxacilline est utilisée pour la prévention et/ou l’inhibition de la formation d’un biofilm bactérien sur une surface abiotique, par exemple un dispositif médical, elle peut être appliquée sur la surface externe dudit dispositif par tout procédé connu de l’homme du métier. Par exemple, la mise en contact ou application peut être effectuée par aspersion de la cloxacilline sur ladite surface, par trempage du dispositif médical dans une solution comprenant la cloxacilline, par aspersion ou trempage de ladite solution. La solution peut comprendre en outre un ou plusieurs actifs, par exemple un composé connu pour inhiber la formation de biofilm, par exemple du cuivre.
Lorsque la cloxacilline est utilisée pour la prévention et/ou l’inhibition de la formation d’un biofilm bactérien sur une surface abiotique, la cloxacilline peut être sous toute forme adaptée connue de l’homme du métier. Par exemple la cloxacilline peut être utilisée sous forme liquide et/ou sous forme de poudre.
Par exemple, lorsque la cloxacilline est utilisée pour la prévention et/ou l’inhibition de la formation d’un biofilm bactérien sur une surface abiotique, par exemple un dispositif médical, elle peut être appliqué préalablement à l’implantation et/ou l’utilisation dudit, par exemple, dispositif médical.
Lorsque la cloxacilline est utilisée pour la prévention et/ou l’inhibition de la formation d’un biofilm bactérien sur une surface biotique, la cloxacilline peut être sous toute forme adaptée connue de l’homme du métier. Par exemple la cloxacilline peut être utilisée sous forme liquide, par exemple administrée par voie parentérale, et/ou sous forme ingérable, par exemple administrée per os, ou sous une forme adaptée pour une application topique, par exemple une pommade, une crème, un pansement/support tissé ou non tissé imprégné.
L'homme de l'art comprend bien que le terme forme tel qu'utilisé ici se réfère à la formulation pharmaceutique du médicament pour son utilisation pratique.
Les inventeurs ont également démontré de manière surprenante que l’utilisation de la cloxacilline selon l’invention permet avantageusement d’inhiber la formation de biofilm et en particulier inhibe notamment la première étape indispensable à cette formation, à savoir le dépôt et la fixation, également dénommé respectivement adhérence et adhésion, des bactéries, par exemple sur des plaies et/ou au niveau d’infections ostéoarticulaires En particulier, les inventeurs ont notamment démontré cette inhibition, telle que décrit dans les exemples, dans des conditions in vivo en via une inoculation sur un cathéter implanté en sous-cutané dans la cuisse d’une souris et en mesurant l’effet, dans des exemples de conditions de pharmacocinétique/pharmacodynamique définies en fonction des effets de la cloxacilline sur l’installation en biofilm sur le cathéter des mêmes souches cliniques utilisées in vitro.
Les inventeurs ont également démontré de manière surprenante que la cloxacilline, administrée à une dose thérapeutique établie sur la base de la CMI d’une souche, est inefficace sur la formation de biofilm, donc sur l’installation d’une infection. En particulier, les inventeurs ont démontré de manière surprenant que l’utilisation d’antibiotiques aux doses thérapeutiques connues ne permet pas d’empêcher et/ou inhiber la formation/le développement d’un biofilm un dispositif médical, par exemple un cathéter implanté.
La présente invention a donc également pour objet l’utilisation de la cloxacilline à une dose supérieure à 25 mg/Kg comprise de 25 à 100 mg/Kg d’individu comme médicament pour inhiber la formation et/ou le développement d’un biofilm sur une surface.
La surface peut être une surface telle que définie précédemment. Par exemple, la surface peut être une surface abiotique, par exemple une surface externe de prothèse médicale. La surface peut être également une surface biotique, par exemple la peau, les muqueuses, les dents, toute surface du système vasculaire, les parois de l’endocarde, toute surface du système lymphatique, toute surface de la sphère Oto-Rhino-Laryngée.
Dans la présente, l’utilisation de cloxacilline comme médicament selon l’invention peut être effectuée simultanément sur plusieurs surfaces, par exemple chez un même mammifère. Par exemple, l’utilisation peut être effectuée sur une surface biotique et abiotique, par exemple sur une surface de prothèse et sur une surface de tissus biologiques entourant ladite prothèse. Par exemple, l’utilisation peut être effectuée sur au moins deux surfaces biotiques et/ou abiotiques.
Dans la présente par « inhibition de la formation d’un biofilm » on entend l’inhibition en présence de microorganismes, par exemple de microorganismes formant des biofilms, de l’adhésion et/ou la fixation de ceux-ci sur ladite surface.
Dans la présente par «inhibition du développement d’un biofilm sur une surface» on entend l’inhibition en présence de microorganismes, par exemple de microorganismes formant des biofilms, de l’adhésion et/ou la fixation de ceux-ci sur ladite surface.
Selon l’invention, le médicament peut être destiné à un mammifère, par exemple un mammifère choisi dans le groupe comprenant l’ordre Monotremata, Didelphimorphia, Paucituberculata, Microbiotheria, Notoryctemorphia, Dasyuromorphia, Peramelemorphia, Diprotodontia, Tubulidentata, Sirenia, Afrosoricida, Macroscelidea, Hyracoidea, Proboscidea, Cingulata, par exemple le tatou, Pilosa, Scandentia, Dermoptera, Primates, Rodentia, Lagomorpha, Erinaceomorpha, Soricomorpha, Chiroptera, Pholidota, Carnivora, Perissodactyla, Artiodactyla et Cetacea.
Il peut s’agir par exemple d’un humain ou d’un animal. Il peut s’agir par exemple d’un animal d’élevage, d’un animal de compagnie, d’un animal en voie de disparition ou de tout autre animal.
Par exemple, l’animal d’élevage peut être choisi dans le groupe comprenant les bovins, porcins, ovins, caprins, camelins, canins, équins, murins. Par exemple, l’animal de compagnie peut être choisi dans le groupe comprenant les canins et les félins.
Dans la présente, par médicament on entend un médicament à usage humain ou un médicament vétérinaire.
Dans la présente par individu on entend un mammifère, par exemple un mammifère choisi dans le groupe comprenant l’ordre Monotremata, Didelphimorphia, Paucituberculata, Microbiotheria, Notoryctemorphia, Dasyuromorphia, Peramelemorphia, Diprotodontia, Tubulidentata, Sirenia, Afrosoricida, Macroscelidea, Hyracoidea, Proboscidea, Cingulata, par exemple le tatou, Pilosa, Scandentia, Dermoptera, Primates, Rodentia, Lagomorpha, Erinaceomorpha, Soricomorpha, Chiroptera, Pholidota, Carnivora, Perissodactyla, Artiodactyla et Cetacea.
Il peut s’agir par exemple d’un humain ou d’un animal. Il peut s’agir par exemple d’un animal d’élevage, d’un animal de compagnie, d’un animal en voie de disparition ou de tout autre animal.
Par exemple, l’animal d’élevage peut être choisi dans le groupe comprenant les bovins, porcins, ovins, caprins, camelins, canins, équins, murins. Par exemple, l’animal de compagnie peut être choisi dans le groupe comprenant les canins et les félins.
Pour son utilisation comme médicament, la cloxacilline peut être sous toute forme susceptible être administrée à un humain ou à un animal. L'administration peut être effectuée directement, c'est-à-dire pure ou pratiquement pure, ou après mélange de la cloxacilline avec un support et/ou un support pharmaceutiquement acceptable.
Selon la présente invention, le médicament peut être sous forme de poudre, par exemple pour solution injectable, ou pour administration orale à avaler sous forme de gélules. Selon la présente invention, le médicament peut être un médicament pour administration orale. Par exemple, lorsque le médicament est un médicament pour administration orale, il peut se présenter par exemple sous la forme d'une gélule.
Selon la présente invention, le médicament peut être un médicament pour une administration parentérale, par exemple une administration intraveineuse.
Selon la présente invention, le médicament peut être un médicament pour administration topique, par exemple pour une application cutanée, par exemple une pommade, une crème, un pansement imprégné, un patch galénique, une vaporisation.
Selon l’invention, lorsque la cloxacilline est utilisé comme médicament, elle peut être à une dose comprise de 25 à 100mg/Kg d’individu, par exemple de 25 à 50 mg/Kg d’individu et/ou à une concentration comprise entre 4 et 16 mg/L, par exemple de 4 à 8 mg/L.
Selon l’invention, lorsque la surface est une surface biotique, la cloxacilline peut être utilisée à une concentration comprise de 4 à 16 mg/L, par exemple de 4 à 8 mg/L.
Selon l’invention, lorsque la surface est une surface biotique, la cloxacilline peut être utilisée à une concentration comprise de 25 à 100 mg/kg., par exemple de 25 à 50 mg/kg d’individu, et/ou à une concentration comprise entre 4 et 16 mg/L, par exemple de 4 à 8 mg/L.
Selon l’invention, l’utilisation de la cloxacilline comme médicament peut être effectuée à une concentration telle que sa biodisponibilité au niveau de la surface peut être comprise de 4.à 16mg/L.
Les inventeurs ont démontré de manière surprenante que l’utilisation de la cloxacilline à des quantités/concentrations particulières permet avantageusement d’inhiber la formation et/ou le développement d’un biofilm à la surface de dispositifs médicaux et notamment de dispositifs médicaux implantés chez un mammifère. En particulier les inventeurs ont démontré de manière surprenante que l’utilisation de la cloxacilline selon l’invention permet avantageusement d’inhiber la formation et/ou le développement d’un biofilm à la surface notamment d’un cathéter implanté, alors que l’utilisation de la cloxacilline à une dose thérapeutique usuelle, c’est-à-dire celle utilisée pour le traitement d’infections bactériennes, ne permet pas d’empêcher l’implantation et/ou la formation du biofilm ni d’inhiber son développement.
En d’autres termes, l’utilisation de la cloxacilline selon l’invention permet avantageusement d’empêcher/d’inhiber la formation d’un biofilm et également l’installation d’une infection/d’une colonie bactérienne contrairement aux utilisations connues.
Les inventeurs ont donc démontré que l’utilisation selon l’invention permet avantageusement de prévenir une tolérance et/ou une résistance et/ou une multi-résistance bactérienne liée à la formation et/ou le développement d’un biofilm sur une surface.
Les inventeurs ont également démontré que l’utilisation selon l’invention permet avantageusement de prévenir une tolérance bactérienne liée à la formation et/ou le développement d’un biofilm sur une surface.
Les inventeurs ont également démontré que l’utilisation selon l’invention permet avantageusement de prévenir une résistance bactérienne liée à la formation et/ou le développement d’un biofilm sur une surface.
La présente invention a donc également pour objet la Cloxacilline pour son utilisation comme médicament pour prévenir une multi-résistance bactérienne liée à la formation et/ou le développement d’un biofilm sur une surface.
La présente invention a donc également pour objet l’utilisation de la cloxacilline à une dose supérieure à 25 mg/Kg d’individu, par exemple comprise de 25.à 100mg/Kg d’individu et/ou à une concentration comprise entre 4 et 16 mg/L, par exemple de 4 à 8 mg/L comme médicament pour prévenir une multi-résistance bactérienne liée à la formation et/ou le développement d’un biofilm sur une surface.
Avantageusement, lorsque la cloxacilline est utilisée à une dose supérieure à 25 mg/Kg d’individu, par exemple comprise de 25.à 100mg/Kg d’individu comme médicament pour prévenir une multi-résistance bactérienne liée à la formation et/ou le développement d’un biofilm sur une surface, elle permet d’obtenir une concentration sérique de cloxacilline comprise de 4 à 16mg/L permettant avantageusement de prévenir une multirésistance bactérienne liée à la formation et/ou le développement d’un biofilm sur une surface.
Dans la présente, par multi-résistance bactérienne on entend la capacité des bactéries à résister à plusieurs traitements antibiotiques, en particulier la capacité des bactéries à résister à au moins deux traitements antibiotiques.
La présente invention a donc également pour objet la Cloxacilline pour son utilisation comme médicament pour prévenir une tolérance bactérienne liée à la formation et/ou le développement d’un biofilm sur une surface.
La présente invention a également pour objet l’utilisation de la cloxacilline à une dose supérieure à 25 mg/Kg d’individu, par exemple comprise de 25.à 100mg/Kg d’individu et/ou à une concentration comprise entre 4 et 16 mg/L, par exemple de 4 à 8 mg/L comme médicament pour prévenir tolérance bactérienne liée à la formation et/ou le développement d’un biofilm sur une surface.
Avantageusement, lorsque la cloxacilline est utilisée à une dose supérieure à 25 mg/Kg d’individu, par exemple comprise de 25.à 100mg/Kg d’individu comme médicament pour prévenir une tolérance bactérienne liée à la formation et/ou le développement d’un biofilm sur une surface, elle permet d’obtenir une concentration sérique de cloxacilline comprise de 4 à 16mg/L permettant avantageusement de prévenir une tolérance bactérienne liée à la formation et/ou le développement d’un biofilm sur une surface.
Dans la présente, par tolérance bactérienne on entend la capacité des bactéries à résister naturellement, c’est-à-dire sans que soit identifié(s) de mutation(s) ou de gène(s) conférant une ou plusieurs résistance(s), à un ou plusieurs traitement(s) antibiotique(s).
La présente invention a également pour objet la Cloxacilline pour son utilisation comme médicament pour prévenir une résistance bactérienne liée à la formation et/ou le développement d’un biofilm sur une surface.
La présente invention a également pour objet l’utilisation de la cloxacilline à une dose supérieure à 25 mg/Kg d’individu, par exemple comprise de 25.à 100mg/Kg d’individu et/ou à une concentration comprise entre 4 et 16 mg/L, par exemple de 4 à 8 mg/L comme médicament pour prévenir une résistance bactérienne liée à la formation et/ou le développement d’un biofilm sur une surface.
Avantageusement, lorsque la cloxacilline est utilisée à une dose supérieure à 25 mg/Kg d’individu, par exemple comprise de 25.à 100mg/Kg d’individu comme médicament pour prévenir une résistance bactérienne liée à la formation et/ou le développement d’un biofilm sur une surface, elle permet d’obtenir une concentration sérique de cloxacilline comprise de 4 à 16mg/L permettant avantageusement de prévenir une résistance bactérienne liée à la formation et/ou le développement d’un biofilm sur une surface.
Dans la présente, par résistance bactérienne on entend la capacité des bactéries mutantes ou ayant acquises un ou plusieurs gène(s) de résistance, à résister à un ou plusieurs traitement(s) antibiotique(s). En particulier, la mutation et/ou l’acquisition du gène de résistance permet à la bactérie de résister à un ou plusieurs traitement(s) antibiotique(s).
Les conditions, quantités et voies d’administration de la cloxacilline utilisée selon l’invention peuvent être telles que décrites dans la présente, par exemple ci-dessus. L’homme du métier de par ces connaissances générales saura adapter les conditions et formes utilisées en fonction de la surface.
Avantageusement, les inventeurs ont démontré que l’utilisation selon l’invention permet d’inhiber ou prévenir la formation d’un biofilm sur une surface et ainsi une éventuelle tolérance (également appelée récalcitrance) et/ou résistance aux antibiotiques, notamment de par la présence de biofilm. Ainsi, l’utilisation selon la présente invention permet à la fois d’inhiber ou empêcher la formation d’un biofilm et d’éventuellement traiter l’infection.
Les inventeurs ont également démontré que l’utilisation selon l’invention de la cloxacilline sur des surfaces biotiques, par exemple sur la peau, par exemple sur des plaies cutanées, permet avantageusement de prévenir et/ou inhiber la formation de biofilm. Avantageusement, l’utilisation selon l’invention permet de prévenir et/ou d’inhiber une infection supplémentaire et/ou surinfection par des bactéries formant des biofilms, par exemple au niveau de plaies.
La présente invention a donc également pour objet l’utilisation de la cloxacilline à une concentration supérieure à 25 mg/Kg d’individu, par exemple comprise de 25 à 100mg/Kg d’individu et/ou à une concentration comprise entre 4 et 16 mg/L, par exemple de 4 à 8 mg/L comme médicament pour prévenir et/ou d’inhiber une infection supplémentaire et/ou surinfection par des bactéries formant des biofilms d’une surface biotique infectée.
Dans la présente, par « prévenir et/ou d’inhiber une infection supplémentaire et/ou surinfection par des bactéries » on entend l’inhibition en présence de microorganismes, par exemple de microorganismes formant des biofilms, de l’adhésion et/ou la fixation de ceux-ci sur ladite surface infectée.
Dans la présente, par surface biotique infectée on entend toute surface biotique connue de l’homme du métier qui peut présenter une infection bactérienne.
Dans la présente par infection bactérienne on entend toute infection bactérienne connue de l’homme du métier susceptible d’affecter une surface biotique ou abiotique.
Des exemples d’infections bactériennes, par exemple de surfaces biotiques, par exemple de la peau peuvent être des abcès, la folliculite, les furoncles, la furonculose, l’anthrax, les panaris, le phlegmon, le perlèche, l’intertrigo, l’orgelet, l’érysipèle, l’impétigo, le prurigo.
Selon l’invention, lorsque la cloxacilline est utilisée comme médicament pour prévenir et/ou d’inhiber une infection supplémentaire et/ou surinfection par des bactéries formant des biofilms d’une surface biotique infectée, elle peut être utilisée à une dose comprise de 25.à 100mg/Kg d’individu, par exemple de 25 à 50 mg/Kg d’individu et/ou à une concentration comprise entre 4 et 16 mg/L, par exemple de 4 à 8 mg/L.
Avantageusement, lorsque la cloxacilline est utilisée à une dose supérieure à 25 mg/Kg d’individu, par exemple comprise de 25 à 100mg/Kg d’individu comme médicament pour prévenir et/ou d’inhiber une infection supplémentaire et/ou surinfection par des bactéries formant des biofilms d’une surface biotique infectée, elle permet d’obtenir une concentration sérique de cloxacilline comprise de 4 à 16mg/L, par exemple de 4 à 8 mg/L permettant avantageusement de prévenir une multi-résistance bactérienne liée à la formation et/ou le développement d’un biofilm sur une surface.
Selon lorsque la cloxacilline est utilisée comme médicament pour prévenir et/ou d’inhiber une infection supplémentaire et/ou surinfection par des bactéries formant des biofilms d’une surface biotique infectée, elle peut être utilisée à une concentration comprise de 25 à 100 mg/kg d’individu, par exemple de 25 à 50 mg/Kg d’individu et/ou à une concentration comprise entre 4 et 16 mg/L, par exemple de 4 à 8 mg/L.
Avantageusement, lorsque la cloxacilline est utilisée à une dose supérieure à 25 mg/Kg d’individu, par exemple comprise de 25 à 100mg/Kg d’individu comme médicament pour prévenir et/ou d’inhiber une infection supplémentaire et/ou surinfection par des bactéries formant des biofilms d’une surface biotique infectée, elle permet d’obtenir une concentration sérique de cloxacilline comprise de 4 à 16mg/L, par exemple de 4 à 8 mg/L permettant avantageusement de prévenir une multi-résistance bactérienne liée à la formation et/ou le développement d’un biofilm sur une surface.
Selon l’invention, l’utilisation de la cloxacilline comme médicament peut être effectuée à une concentration telle que sa biodisponibilité au niveau de la surface peut être comprise de 4.à 16 mg/L.
Pour son utilisation comme médicament pour prévenir et/ou d’inhiber une infection supplémentaire et/ou surinfection par des bactéries formant des biofilms d’une surface biotique infectée, la cloxacilline peut être sous toute forme adaptée connue de l’homme du métier. Il peut s’agir d’une forme telle que mentionnée ci-dessus.
L’homme du métier de par ces connaissances générales saura adapter les conditions et formes utilisées en fonction de la surface.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant de la cloxacilline à une dose supérieure à 0,4%, par exemple comprise de 0,4 %.à 1,6 % en pourcentage en poids par rapport au poids total de la composition destinée à être utilisée comme médicament pour la prévention de la formation d’un biofilm sur une surface.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant de la cloxacilline à une dose supérieure à 4 mg/L par exemple comprise de 4 à 16mg/L destinée à être utilisée comme médicament pour la prévention de la formation d’un biofilm sur une surface.
L’utilisation de la composition selon l’invention peut être effectuée sur toute surface connue de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’une surface biotique ou abiotique telle que définie ci-dessus. Il peut s’agir par exemple d’une ou plusieurs surfaces telles que définies ci-dessus.
Dans la présente, lors de l’utilisation d’une composition pharmaceutique comprenant de la cloxacilline comme médicament pour la prévention de la formation d’un biofilm bactérien au niveau de surface, la concentration/quantité cloxacilline peut être supérieure à 0,4%, par exemple comprise de 0,4 %.à 1,6% en pourcentage en poids par rapport au poids total de la composition
Dans la présente, lors de l’utilisation d’une composition pharmaceutique comprenant de la cloxacilline comme médicament pour la prévention de la formation d’un biofilm bactérien au niveau de surface, la concentration/quantité cloxacilline peut être supérieure à 4 mg/L par exemple comprise de 4 à 16mg/L.
Les conditions, quantités et voies d’administration de la composition selon l’invention peuvent être telles que décrites dans la présente, par exemple ci-dessus. L’homme du métier de par ces connaissances générales saura adapter les conditions et voies d’administrations de la composition.
Dans la présente invention, les compositions pharmaceutiques de la présente invention peuvent comprendre en outre un support pharmaceutiquement acceptable, un adjuvant ou un véhicule.
Dans la présente invention, un support pharmaceutiquement acceptable, un adjuvant ou un véhicule inclut n’importe quel solvant, diluant ou autre véhicule liquide, dispersion ou auxiliaire de suspension, agent tensio-actif, agent isotonique, agent épaississant ou émulsifiant, conservateur, liant solide, lubrifiant et analogue, adaptés à la forme posologique particulière souhaitée. Remington Pharmaceutical Sciences, seizième édition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) décrit différents supports utilisés dans la formulation de compositions pharmaceutiquement acceptables et des techniques connues pour leur préparation. Sauf dans le cas où un milieu support conventionnel s’avérerait incompatible avec les composés selon l’invention, par exemple en produisant un quelconque effet biologique indésirable ou bien en interagissant de manière délétère avec tout autre composant (s) de la composition pharmaceutiquement acceptable, son utilisation est envisagée comme tombant dans le cadre de la présente invention. Quelques exemples de constituants qui peuvent servir de supports pharmaceutiquement acceptables comprennent, mais ne sont pas limités à, des échangeurs d'ions, l'alumine, le stéarate d'aluminium, la lécithine, des protéines sériques telles que l'albumine sérique humaine, des substances tampons telles que les phosphates, la glycine, l'acide sorbique, ou sorbate de potassium, des mélanges de glycérides partiels d'acides gras végétaux saturés, l'eau, des sels ou des électrolytes tels que le sulfate de protamine, le phosphate disodique, l'hydrogénophosphate de potassium, le chlorure de sodium, des sels de zinc, la silice colloïdale, le trisilicate de magnésium, le polyvinylpyrrolidone, des polyacrylates, des cires, les polymères de polyéthylène-polyoxypropylène, des sucres tels que le lactose, le glucose et le saccharose ; des amidons tels que l'amidon de maïs et de pomme de terre ; la cellulose et ses dérivés tels que la carboxyméthylcellulose sodique, l'éthylcellulose et l'acétate de cellulose; la tragacanthe en poudre ; malt ; gélatine ; talc ; des excipients tels que le beurre de cacao et les cires pour suppositoires ; des huiles telles que l'huile d'arachide, l'huile de graine de coton ; l'huile de carthame ; huile de sésame ; huile d'olive ; huile de maïs et l'huile de soja ; glycols ; un tel propylène glycol ou le polyéthylène glycol ; des esters tels que l'oléate d'éthyle et le laurate d'éthyle ; la gélose ; des agents tels que l'hydroxyde de magnésium et l'hydroxyde d'aluminium en tampon ; l'acide alginique ; une solution saline isotonique ; la solution de Ringer ; l'alcool éthylique, et de tampon de phosphate de solutions, ainsi que d'autres lubrifiants compatibles non toxiques tels que le laurylsulfate de sodium et le stéarate de magnésium, ainsi que des agents colorants, des agents de démoulage, des agents d'enrobage, des agents édulcorants, aromatisants et parfumants, des conservateurs et des antioxydants peuvent également être présents dans la composition, selon le jugement du galéniste.
Les compositions pharmaceutiquement acceptables de la présente invention peuvent être administrées à des humains et autres animaux par voie orale, rectale, parentérale, intracisternale, intravaginale, intrapéritoneale, topique (comme par des poudres, des pommades ou des gouttes), buccale, sous forme de pulvérisation orale ou nasale, ou similaire, selon la gravité de l'infection à traiter.
Les formes galéniques liquides pour l'administration orale comprennent, mais sans s'y limiter, des émulsions pharmaceutiquement acceptables, des microémulsions, des solutions, des suspensions, des sirops et des élixirs. En plus des composés actifs, les formes galéniques liquides peuvent contenir des diluants inertes couramment utilisés dans l'art tels que, par exemple, l'eau ou d'autres solvants, des agents et des émulsifiants tels que l'alcool éthylique, l'alcool isopropylique, le carbonate d'éthyle, l'acétate d'éthyle, l'alcool benzylique, le benzoate de benzyle, le propylèneglycol, le 1,3-butylène glycol, le diméthylformamide, les huiles (en particulier, les graines de coton, d'arachide, de maïs, de germe, d'olive, et de sésame), le glycérol, l'alcool tétrahydrofurfurylique, des polyéthylèneglycols et des esters d'acides gras de sorbitan et des mélanges de ceux-ci. Outre les diluants inertes, les compositions orales peuvent également comprendre des adjuvants tels que des agents mouillants, des agents émulsifiants et de suspension, des édulcorants, des aromatisants et des agents parfumants.
Les formes galéniques solides pour une administration orale comprennent des capsules, des comprimés, des pilules, des poudres et des granulés. Dans de telles formes galéniques solides, le composé actif est mélangé avec au moins un support inerte, excipient ou support pharmaceutiquement acceptable tel que le citrate de sodium ou le phosphate dicalcique et / ou a) des charges ou des diluants tels que les amidons, le lactose, le saccharose, le glucose, le mannitol et l'acide silicique,
b) des liants tels que, par exemple, la carboxyméthylcellulose, l'alginate, la gélatine, la polyvinylpyrrolidone, le saccharose et la gomme arabique, c) des humectants tels que le glycérol, d) des agents délitants tels que l’agar-agar, le carbonate de calcium, l’amidon de pomme de terre ou de manioc, l'acide alginique, certains silicates et le carbonate de sodium, e) des accélérateurs d'absorption tels que des composés d'ammonium quaternaire, f) des agents mouillants tels que, par exemple, l'alcool cétylique et le monostéarate de glycérol, g) des absorbants tels que le kaolin, le talc et l'argile bentonite et h) des lubrifiants tels que le stéarate de calcium, le stéarate de magnésium, des polyéthylèneglycols solides, le laurylsulfate de sodium et des mélanges de ceux-ci. Dans le cas des capsules, des comprimés et des pilules, la forme galénique peut également comprendre des agents tampons.
Des compositions solides d'un type similaire peuvent également être employées comme charges dans des capsules de gélatine molle ou dure en utilisant des excipients tels que le lactose ou sucre de lait ainsi que des polyéthylèneglycols de haut poids moléculaire de polyéthylène et analogues. Les formes galéniques solides de comprimés, dragées, gélules, pilules et granules peuvent être préparées avec des enrobages et des enveloppes tels que des enrobages entériques et d'autres enrobages bien connus dans l'art pharmaceutique, la formulation. Elles peuvent éventuellement contenir des agents opacifiants et peuvent également être d'une composition telle qu'elles libèrent l'ingrédient actif (s) uniquement, ou préférentiellement, dans une certaine partie du tractus intestinal, facultativement de manière retardée. Des exemples de compositions d'enrobage qui peuvent être utilisées comprennent des substances polymères et des cires. Des compositions solides d'un type similaire peuvent également être employées comme charges dans des capsules de gélatine molle et dure en utilisant des excipients tels que le lactose ou sucre de lait ainsi que des polyéthylèneglycols de haut poids moléculaire de polyéthylène et analogues.
Dans la présente, les utilisations et/ou compositions selon l’invention peuvent être associées avec des agents antibactériens classiques, tels que des antibiotiques, par exemple des bactéricides et/ou des bactériostatiques. Par exemple, les agents antibactériens classiques peuvent être utilisés ou administrés préalablement, simultanément, à l’utilisation et/ou la composition selon l’invention.
Dans la présente, les utilisations et/ou compositions selon l’invention peuvent être associées avec des agents antifongiques classiques, par exemple des antifongiques disponibles dans le commerce, par exemple le niconazole. Par exemple les agents antifongiques classiques peuvent être utilisés ou administrés préalablement, simultanément, à l’utilisation et/ou la composition selon l’invention.
Par exemple, la cloxacilline peut être utilisée selon l’invention et/ou la composition pharmaceutique peut être utilisée selon l’invention selon l’invention en combinaison avec au moins un des antibiotiques choisi dans le groupe comprenant les aminoglycosides, les fluoroquinolones, des macrolides, la novobiocine, la rifampicine, les oxazolidinones, l'acide fusidique, la mupirocine , pleuromutilines, daptomycine, vancomycine, tétracyclines, sulfamides, le chloramphénicol, triméthoprime, fosfomycine, cyclosérine et polymyxine.
D’autres avantages pourront encore apparaître à l’homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif.
Brève description des figures :
La Figure 1 comprend une image numérisée (scan) de plaque 96 puits et un diagramme représentant l’évolution de l’index biofilm (BFI) (en ordonnée) en fonction de la concentration de cloxacilline en pg/mL. La figure 1Aest une image numérisée de la plaque après magnétisation et représente le résultat brut de l’Antibiofilmogramme de la souche S14 et de la souche S39, les lignes E et A correspondent respectivement aux souches S14 et S39 cultivées en présence de différentes concentrations de cloxacilline. Les lignes B, C et D correspondent à d’autres souches non mentionnées ici. La ligne F correspond aux témoins en absence de souche (présence normale d’un spot), les puits en H1 et H2 correspondent à la souche S14 seule, et les puits H9 et H10 correspondent à la souche S39 seule. Chaque colonne de 1 à 12 correspond à des concentrations différentes en pg/ml de cloxacilline à savoir de la colonne 1 à la colonne 12): 32/16/8/7/6/5/ 4/3/2/1 /0,5/0,25 pg/ml.
La figure 2 représente des images acquises en microscopie confocale de la surface du fond de puits dans lequel des bactéries ont été mises en culture, les taches claires sur ces photographies correspondent aux bactéries formant le biofilm. Le diagramme représente le pourcentage de recouvrement de surface par un biofilm (en ordonnée). La figure 2A correspond aux résultats obtenus avec la souche bactérienne S14 cultivée sans antibiotique (Témoin) avec une concentration de cloxacilline inférieure à la CMI (<CMI), une concentration de cloxacilline égale à sa CMI (CMI), une concentration comprise entre la CMI et la concentration inhibant la formation de biofilm (<cmib) et une concentration égale à la concentration inhibant la formation de biofilm (cmib).
La figure 2B correspond aux résultats obtenus avec la souche bactérienne S39 cultivée sans antibiotique (Témoin) avec une concentration de cloxacilline inférieure à la CMI (<CMI), une concentration de cloxacilline égale à sa CMI (CMI), une concentration comprise entre la CMI et la concentration inhibant la formation de biofilm (<cmib) et une concentration égale à la concentration inhibant la formation de biofilm (cmib).
La figure 3 représente des diagrammes correspondant au dénombrement des bactéries attachées sur un cathéter implanté chez des souris en fonction de la présence ou absence de cloxacilline. L’ordonnée correspond au log décimale d’unités formant colonies (Log10 CFU) par gramme de cathéter (Log-ιο CFU/Gram of cathéter). L’abscisse au temps après infection par la souche et en fonction du traitement par la cloxacilline : sans cloxacilline (Control) après 12 heures (H12), 24 heures (H24), après 30 heures (H30) ou avec traitement par la cloxacilline (Cloxa) à différentes concentration (< ou >). La figure 3A représente le diagramme obtenu avec la souche S14, la cloxacilline étant administrée à une concentration de 3mg/kg (<2) ou 15mg/kg (>2). La figure 3B représente le diagramme obtenu avec la souche S39, la cloxacilline étant administrée à une concentration de 4mg/kg (<4) ou 25mg/kg (>4).
La figure 4A montre la mesure du score de cicatrisation chez des souris infectées, traitées soit par la cloxacilline correspondant à la CMI de la souche S14 (3mg/Kg), soit par la cloxacilline correspondant à la dose CMIb (15mg/Kg), soit par du sérum physiologique (véhicule).
La figure 4B montre la mesure du score de cicatrisation chez des souris non infectées (contrôle), traitées soit par la cloxacilline correspondant à la CMI de la souche S14 (lnfecté/3mg/Kg), soit par la cloxacilline correspondant à la dose CMIb (lnfecté/15mg/Kg), soit par du sérum physiologique (Infecté/contrôle).
La figure 4C montre le dénombrement des bactéries installées dans la plaie. Leur nombre est classiquement exprimé en CFU (Colony
Forming Units) correspondant au nombre de colonies dénombrées sur boite de Pétri.
EXEMPLES
Exemple 1 : démonstration in vitro de la cloxacilline comme inhibiteur de la formation de biofilm
Dans cet exemple, un Antibiofilmogramme a été réalisé afin de démontrer l’inhibition de la formation d’un biofilm par la cloxacilline et déterminer des doses de cloxacilline efficaces contre la formation de biofilm dans un puits de microplaque en polystyrène. Cet exemple démontre clairement que les Concentrations Minimales Inhibitrices de formation de biofilm (CMIb) sont différentes des Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) définissant la sensibilité à l’antibiotique par rapport à son activité bactéricide. Ces CMIb peuvent différer entre 2 souches alors que les CMI pour ces mêmes souches sont proches (0,125 et 0,25pg/ml, ou mg/L) et d’autre part être très éloignées des CMI.
Pour déterminer et mesurer l’effet de la cloxacilline sur la formation de biofilm, plus précisément l’adhésion des bactéries, première étape de la formation d’un biofilm, les souches S14 et S39 de Staphylococcus aureus ont été incubées dans les puits d’une microplaque 96 puits en présence de différentes concentrations de cloxacilline. Les concentrations testées allaient de 0,25pg/ml à 32pg/ml de cloxacilline. Ce test est dénommé, par la société BioFilm Control, Antibiofilmogramme (marque déposée). L’inoculum de bactéries était de 4.106 bactéries/ml, dans 200pl de milieu BHI (Brain Heart Infusion, bouillon cœur cerveau), en présence de microbilles magnétiques (Toner 4, référence TON004) à la concentration de 2μΙ pour 200μΙ, soit 10μΙ/ml).
La microplaque a été incubée pendant 4h à 37°C, puis a été recouverte de 120μΙ de liquide contraste (Liquide de contraste ; référence LIC001) et a été posée 1 minute sur un bloc porte-aimants (référence BKTMB) conçu de telle sorte que chaque mini-aimant soit centré par rapport aux 96 puits. La microplaque a été ensuite posée sur un scanner et l’image a été acquise, puis analysée par le logiciel BFCE3 qui quantifie l’agrégation des microbilles magnétiques au centre des puits, et fournit une valeur de BFI (Biofilm Formation Index). Un BFI de 20, ou proche de 20 correspond à une agrégation maximale, donc une absence de formation de biofilm, donc une efficacité anti-adhésion de la cloxacilline. Au contraire, un BFI de 0 correspond à une totale immobilité des microbilles complètement bloquées par les bactéries adhérées. Toutes les valeurs intermédiaires, permettant une mesure quantitative de l’efficacité de la cloxacilline sont possibles.
La figure 1A est une image numérisée (scan) de la plaque après magnétisation et représente le résultat brut de l’Antibiofilmogramme de la souche S14 et la figure 1B est un diagramme représentant l’évolution de la BFI (ordonnée) en fonction de la concentration en cloxacilline en pg/mL.
Sur la Figure 1 A, les lignes E et A correspondent respectivement aux souches S14 et S39 cultivées en présence de concentrations variables de cloxacilline. Les lignes B, C et D correspondent à d’autres souches non mentionnées ici. La ligne F correspond aux témoins en absence de souche (présence normale d’un spot) et les puits en H1 et H2 correspondent à la souche S39 seule, et les puits H9 et H10 correspondent à la souche S39. Les souches sont testées aux concentrations suivantes, en partant de la colonne 1 à la colonne 12) : 32 /16 / 8 / 7 / 6 / 5 / 4 / 3 / 2 /1 / 05 / 0,25pg/ml,
La Figure 1 B représente les courbes correspondant aux BFI mesurés dans les puits de la figure 1A. Tel que représenté pour la souche S14 une concentration de 2pg/mL permet une mobilité totale des microbilles et pour la souche S39 une concentration de 6 pg/mL permet une mobilité totale des microbilles, avec un décrochement de la courbe pour des concentrations entre 3 et 5pg/ml. Tel que montré sur la figure 1 B, la CMIb de la cloxacilline est de 6pg/ml (ou 4-6pg/ml) pour la souche S39 et de 2 pg/ml pour la souche S14 de Staphylococcus aureus.
Dans le présent exemple, l’effet antibiofilm de la cloxacilline a été également démontré sur 26 souches cliniques de Staphylococcus aureus. Le procédé et protocole expérimental était celui décrit ci-dessus.
La détermination de chaque Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) de la cloxacilline a été mesurée classiquement par la mesure de la croissance de chaque souche, en microplaque 96 puits, en présence de concentrations d’antibiotique, par absorbance.
La mesure de la CMI a été réalisée en milieu Mueller-Hinton (MH; milieu de référence pour les tests de sensibilité aux antibiotiques) et en 10 milieu Bouillon Cœur Cerveau (BHI).
La mesure de la CMIb (détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice biofilm), à l’aide du BioFilm Ring Test® a été réalisée en milieu BHI. La conversion en mg/Kg. Les résultats sont résumés dans le tableau 1 en fonction des souches testées.
SOUCHES CMI MH (pg/ml) CMI BHI (pg/ml) CMIb (pg/ml) mg/Kg (équivalent CMIb)
S02 0,125 0,25 2 15
S04 0,25 0,5 4 25
S08 0,25 0,5 2 15
S11 0,5 0,5 4 25
S14 0,25 0,25 2 15
S16 0,25 0,5 4 25
S19 0,5 0,5 2 15
S21 0,25 0,5 4 25
S22 0,5 0,5 4 25
S26 0,25 0,25 4 25
S27 0,25 0,25 4 25
S31 0,25 0,5 4 25
S34 0,5 0,5 8 50
S38 0,5 0,5 16 95
S39 0,5 0,125 8 50
S40 0,5 0,5 4 25
S43 0,25 0,25 4 25
S44 0,25 0,5 4 25
S46 0,25 0,125 2 15
S47 0,25 0,25 2 15
S51 0,25 0,25 4 25
S58 0,25 0,25 16 95
S62 0,25 0,5 8 50
S63 0,25 0,25 8 50
S74 0,25 0,25 4 25
S83 0,125 0,125 16 95
Les CMI en milieu MH et BHI étaient très similaires, montrant que le milieu de culture dans lequel ont été cultivées les bactéries pour le test de sensibilité à la cloxacilline était sans effet.
Les valeurs de CMIb étaient systématiquement supérieures aux valeurs de CMI, et varient selon les souches. Le tableau 1 démontre clairement que l’obtention d’une valeur de CMI ne permet pas de prédire la CMIb. En particulier, les résultats ci-dessus démontrent clairement que la concentration de cloxacilline pour l’effet antibiofilm est indépendante de la 10 CMI et ainsi ne permet pas de prédire une quelconque valeur correspondante. Par exemple, les souches S02 et S83 ont des CMI, en milieu MH, de 0,125pg/ml alors que leurs CMIb étaient respectivement de 2 et 16pg/ml. A l’inverse, les souches S38, S58 et S83 ont une CMIb de 16pg/ml et ont des CMI de 0.5, 0,25 et 0,125pg/ml respectivement.
Cet exemple démontre que, sur un panel de 26 souches, la moyenne des CMIb étaient de 5,5pg/ml avec un écart-type de 4,2pg/ml. Seules 7 souches sur les 26 présentent une CMIb supérieure à cette moyenne (avec des CMIb de 8 ou 16pg/ml, et seulement 3 présentent une valeur de CMIb supérieure à la moyenne + écart-type (9,7pg/ml), avec une CMIb de 16pg/ml. L’administration de cloxacilline, exprimée en mg/Kg, conduisant à une concentration sérique minimale entre 2 administrations, exprimée en pg/ml ou mg/L, supérieure à 8 ou 16pg/ml est susceptible d’être efficace contre l’ensemble des staphylocoques dorés, ainsi que d’autres microorganismes dont la CMIb serait similaire, c’est-à-dire comprise dans la gamme de valeur définie par l’écart type, par exemple inférieure à 9,7 pg/ml. Afin d’empêcher la formation de biofilm et/ou d’obtenir un effet antibiofilm pour une bactérie ayant une CMIb de 8mg/L, l’utilisation de cloxaciline peut être effectuée une dose de 49mg/Kg d’individu, l’utilisation a cette dose permettant d’obtenir une concentration sérique idoine. Afin d’empêcher la formation de biofilm et/ou d’obtenir un effet antibiofilm pour une bactérie ayant une CMIb de 16mg/L, l’utilisation de cloxacilline peut être effectuée à une dose de 95mg/Kg d’individu, l’utilisation a cette dose permettant d’obtenir une concentration sérique idoine.
Tel que démontré dans cet exemple l’utilisation de la cloxaciline comme médicament pour inhiber la formation et/ou le développement de biofilm sur une surface est effectuée à des concentrations et/ou doses très différentes de celles connues pour un effet antibiotique. Par exemple, pour une bactérie présentant une CMIb de 8mg/L, l’administration de cloxacilline à une dose, par exemple de 49mg/Kg dudit sujet permet avantageusement d’inhiber la formation et/ou le développement de biofilm par ladite bactérie.
Cet exemple démontre clairement que l’utilisation de la cloxacilline à des concentrations supérieures ou égale à 4mg/L ou comprise de 4mg/L à 16 mg/L, correspondant à des administrations de 25 à 10Omg/Kg de l’individu/du patient permet l’inhibition de la formation de biofilm, notamment par la majorité des souches de Staphylococcus aureus. Cet exemple démontre donc également clairement que les concentrations utiles pour inhiber la formation des biofilms sont très différentes et distinctes des concentrations thérapeutiques usuelles.
Exemple 2 : démonstration in vitro par microscopie confocale de l’inhibition de l’adhésion des bactéries sur une surface par la cloxacilline
L’exemple 2 confirme par microscopie confocale les interprétations de l’Antibiofilmogramme. Il est clairement montré que l’antibiotique cloxacilline, utilisé à la dose CMI (dose définie comme étant suffisante pour l’activité bactéricide de la cloxacilline sur la souche considérée) à savoir notamment la souche S14 et S39 n’est pas actif sur la formation de biofilm sur le plastique. Par contre, à la dose CMIb (définie comme efficace en prévention de formation de biofilm), la souche n’a pas adhéré à la surface. Ces résultats ont été obtenus pour les souches S14 et S39 dont les CMI sont très proches et caractérisent les souches comme sensibles à la cloxacilline.
En d’autres termes, cet exemple démontre clairement que la cloxacilline permet d’inhiber la formation de biofilm indépendamment de son effet antibiotique connu.
Des microplaques 6 puits en polystyrène de la même nature et présentant exactement les mêmes propriétés que les microplaques utilisées dans l’exemple 1 (Antibiofilmogramme (marque déposée)) à savoir microplaque Costar 6 puits, référence 3736. Les microplaques 6 puits ont été utilisées afin d’obtenir une surface suffisante de formation de biofilm pour une observation en microscopie confocale. Les concentrations correspondant aux CMI et CMIb des souches ont été testées. En parallèle, les contrôles en absence d’antibiotiques, des souches S14 et S39 ont été réalisés. Après une incubation de 4h à 37°C (similaire aux conditions utilisées dans l’exemple 1 (Antibiofilmogramme (marque déposée)), les fonds des microplaques ont été découpés et assemblés avec une lame de verre afin de pouvoir procéder à l’observation en microscopie confocale. Les conditions d’observation étaient les suivantes : Objectif : x40 ; Zoom : x2 ; Format : 2048*2048 pixels ; Puissance laser ; Zmax et Zmin : nombre d’images de la pile ; Taille entre chaque image : 0,42pm. Une coloration « Live/Dead » a été réalisée. Le colorant SYTO9 colore les bactéries vivantes (et les mortes), alors que le colorant Propidium iodide colore spécifiquement les bactéries mortes. Le résultat a été obtenu avec une analyse de 2880 Images (« Slices »).
Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 2. Le taux de recouvrement de la surface du fond des puits par le biofilm en pourcentage de recouvrement de surface est indiqué en ordonnée. Sur la figure 2 A, la densité de bactéries S14 adhérées sur le fond des puits a été montrée et analysée. Tel que montré sur la figure 2 A en l’absence d’antibiotique et/ou à des concentrations inférieures à la CMI, notamment égale à 0,5 CMI (sub CMI) l’antibiotique était sans effet sur la formation de biofilm. En outre, cet exemple démontre également que l’antibiotique, à une dose la dose CMI permet une diminution de l’adhésion des bactéries, mais ne permet pas de l’inhiber. En particulier, de 10 à plus de 20% de la surface du fond du puits a été recouverte après 4h d’incubation ce qui est trop pour envisager une utilisation dans un traitement thérapeutique à cette dose.
Les doses CMIb (2pg/mL) et subCMIb (1pg/mL ;inférieure à la CMIb, mais supérieure à la CMI) ont été capables d’inhiber totalement l’adhésion de la souche S14 de S. aureus. En effet, tel que montré sur la figure 2A, l’incubation à une concentration égale aux doses CMIb et subCMIb ont permis d’inhiber l’adhésion des bactéries notamment de la souche S14 de S. aureus et donc la formation de biofilm. Par contre, les doses CMI (0,25pg/ml) et subCMI (0,125pg/ml) n’inhibent pas l’adhésion de la souche S14 puisque 10% de la surface est recouverte par les bactéries à la dose CMI.
La figure 2B représente les résultats obtenus avec la souche S39 de S. aureus. En particulier, la figure 2B représente la densité de bactéries S39 adhérées sur le polystyrène et comprend l’analyse correspondante. Tel que démontré, par rapport au contrôle (témoin) ne comprenant pas d’antibiotique, les doses subCMI (1/2 CMI) et CMI (0,125pg/ml) étaient sans effet sur l’adhésion des bactéries. Les résultats obtenus sont effet similaire à celui de la condition contrôle (sans antibiotique).
Les doses CMIb (6pg/mL) et subCMIb (3pg/mL ; inférieure à la CMIb, mais supérieure à la CMI) ont été capables d’inhiber totalement l’adhésion de la souche S39 de S. aureus. En effet, tel que montré sur la figure 2B, l’incubation à une concentration égale aux doses CMIb et subCMIb ont permis d’inhiber l’adhésion des bactéries notamment de la souche S39 de S. aureus et donc la formation de biofilm.
Exemple 3 : démonstration in-vivo de l’inhibition de la formation de biofilm/adhésion de bactéries sur une surface par la cloxacilline
Dans cet exemple, l’effet de la cloxacilline a été observé sur l’infection d’un cathéter implanté dans un modèle animal.
Cet exemple démontre et confirme dans un modèle animal d’infection que la cloxacilline, utilisée aux doses en lien à la CMIb a permis d’inhiber l’adhésion des bactéries sur le cathéter et peut donc être utilisée pour prévenir l’infection d’un cathéter (simulant une prothèse).
Deux souches de Staphylococcus aureus, S14 et S39, ont été utilisées. Elles se caractérisent, pour la cloxacilline, par des CMI (Concentration Minimale Inhibitrice) de 0,125 pg/ml pour S14 et 0,25pg/ml pour S39, ainsi que des CMIb (Concentration Minimale Inhibitrice de formation biofilm) de 2pg/ml pour S14 et 4pg/ml pour S39. Une concentration de cloxacilline pouvant être sous-estimée pour la CMIb a été utilisée dans ce modèle in vivo.
La taille d’inoculum testée était de 7 Log CFU/souris (soit 8,3 Log CFU/mL). Les souches ont été isolées sur milieu Chapman agar puis mises en culture à 37°C pendant 18h. Pour chaque souche, une colonie isolée a été re-suspendue dans 9mL de milieu BHI en agitation pendant 6h à 37°C puis le bouillon ainsi obtenu a été inondé sur milieu MH agar (extrait de bœuf 2g/L ; hydrolysat acide de caséine 17,5g/L ; amidon 1,5g/L ; agar 17g/L) placé à 37°C pendant 18h. La culture sur boite a été ensuite raclée dans 10mL d’eau physiologique stérile (en présence de billes de verre pour éviter la formation d’agrégats) et vortexée 5 secondes à vitesse maximale. Des dilutions successives ont été réalisées afin de mesurer la densité optique à une longueur d’onde de 595nm (DO595nm) (Spectrophotomètre Eppendorf) et la charge bactérienne après culture des dilutions sur milieu MH agar a été déterminée. Il a été considéré qu’une DO = 0,250 a permis d’obtenir un inoculum de 8,3 Log CFU/mL soit 7 Log CFU/souris.
Pour la souche S14, les souris ont reçu (30 minutes pré-infection) un traitement antibiotique « préventif » (Cloxacilline 5mg/kg ou 30mg/Kg ou sérum physiologique stérile) par voie intrapéritonéale. Ces doses ont été déterminées suite à une étude PK/PD réalisée en interne.
Pour la souche S39, les souris ont reçu (30 minutes pré-infection) un traitement antibiotique « préventif » (Cloxacilline 7mg/kg ou 45mg/Kg ou sérum physiologique stérile) par voie intrapéritonéale. Ces doses ont été déterminées suite à une étude PK/PD réalisée en interne. Les concentrations sériques de cloxacilline selon les différentes conditions ont été mesurées par HPLC. L’ensemble des résultats a été intégré dans un logiciel de simulation pharmacocinétique puis un logiciel PKPD afin d’estimer les différents paramètres liés à la CMI planctonique (Cmax/CMI, AUC/CMI et T>CMI) et la CMIb (Cmax/CMIb, AUC/CMIb et T>CMIb).
En parallèle, les animaux témoins ont reçu du sérum physiologique.
Une solution commerciale de cloxacilline (Orbenine (marque déposée) 1g, France, Pfizer, France) a été utilisée. Puis une anesthésie fixe par injection intrapéritonéale d’un mélange kétamine (50mg/kg) et xylazine (10mg/kg) a été administrée. Le mélange d’anesthésiques a été réalisé comme suit : 4ml Kétamine + 2ml de xylazine +10 ml d’eau physiologique. Environ 120μΙ ont été injectés en IP chez la souris. Les flancs ont été rasés puis désinfectés (cycle Bétadiné). Une incision cutanée puis sous-cutanée de 0,2cm a été réalisée stérilement et un segment d’1cm de cathéter en polyuréthane coupé en deux parties longitudinales (Ref ES-04730 Arrow international) a été inséré en sous cutané (à 2 cm de distance du point d’incision). Le dépôt de l’inoculum bactérien a été effectué dans un même temps. Le volume déposé était de 50pL par souris et la concentration testée était de 107 log CFUs par cathéter. L’incision a été ensuite suturée et désinfectée. Les souris ont ensuite été traitées toutes les deux heures après le premier traitement préventif pendant 10 heures avec, soit de la cloxacilline à 3mg/kg ou 15mg/kg (pour la souche S14), soit de la cloxacilline à 4mg/kg ou 25mg/kg (pour la souche S39), soit du sérum physiologique. Ces doses ont été déterminées préalablement de façon à simuler des concentrations sanguines comprises entre les CMI planctoniques et les CMI biofilm respectives des souches S14 et S39. Les souris ont été euthanasiées à différents temps post-infection (12h, 24h et 30h) par anesthésie puis dislocation cervicale. Les segments de cathéter ont été prélevés. Ils ont été utilisés pour quantification bactérienne après sonication.
Chaque segment en polyuréthane a été individuellement et stérilement lavé dans un tube Eppendorf (3 lavages successifs avec 300pL d’eau physiologique stérile). Après le dernier lavage, le cathéter a été remis en suspension dans 1mL d’eau physiologique stérile, placé dans un bain à ultrasons à température ambiante pendant 3 min (AdvantageLab) puis vigoureusement vortexé de façon à décrocher les bactéries adhérentes au cathéter. Des cultures de dilutions successives (pur, 10-2, 10-4) de cette suspension bactérienne ont été ensuite réalisées sur géloses Chapman. Les cultures ont été placées à l’étuve à 37°C pendant 48h avant lecture.
Les résultats sont illustrés sur la figure 3. La figure 3 A, représente le dénombrement des bactéries de la souche S14 attachées sur le cathéter implanté en fonction de l’absence de cloxacilline (témoin), une concentration égale à la CMI ou à une concentration égale à la CMIb. Tel que démontré sur la figure 3A, la concentration de cloxacilline dans les conditions contrôle et CMI, montre l’inefficacité de la cloxacilline à la dose CMI d’inhiber l’adhésion des bactéries, aux temps de mesure 12h, 24h et 30h. Une analyse de variance ANOVA One Way complétée par un test post-hoc de Bonferroni a été utilisée. Une différence était considérée comme statistiquement significative si p<0,05 (*), p<0,01 (**) ou p<0,001 (***). A l’inverse, pour les temps 12h, 24h et 30h, le traitement par la cloxacilline à la dose CMIb a statistiquement montré une différence significative par rapport au contrôle (***). Les résultats sont exprimés en log(CFU)/g de cathéter, CFU signifiant Colony Forming Unit, soit le nombre de colonies bactériennes sur une boite.
La figure 3 B représente le dénombrement des bactéries de la souche S39 attachées sur le cathéter implanté en fonction de l’absence de cloxacilline (témoin), une concentration égale à la CMI ou à une concentration égale à la CMIb. Tel que démontré sur la figure 3B, la concentration de cloxacilline dans les conditions contrôle et CMI, montre l’inefficacité de la cloxacilline à la dose CMI d’inhiber l’adhésion des bactéries, aux temps de mesure 12h, 24h et 30h. Une analyse de variance ANOVA One Way complétée par un test post-hoc de Bonferroni a été utilisée. Une différence était considérée comme statistiquement significative si p<0.05 (*), p<0.01 (**) ou p<0.001 (***). A l’inverse, pour les temps 12h, 24h et 30h, le traitement par la cloxacilline à la dose CMIb a statistiquement montré une différence significative par rapport au contrôle (***). Les résultats sont exprimés en log(CFU)/g de cathéter, CFU signifiant Colony Forming Unit, soit le nombre de colonies bactériennes sur une boite.
Cet exemple démontre clairement que la cloxacilline permet d’inhiber l’adhésion des bactéries sur une surface, par exemple une prothèse. En outre cet exemple démontre clairement que les concentrations usuelles d’utilisation de la cloxacilline comme antibiotique ne permettent pas d’empêcher/inhiber l’adhésion des bactéries.
Exemple 4 : inhibition in-vivo de la formation de biofilm / de l’adhésion des bactéries sur une surface dans un modèle de cicatrisation de plaie cutanée infectée par la cloxacilline
L’objectif de ces essais était de tester l’efficacité de la cloxacilline, à des doses choisies, dans un modèle in vivo d’infection de plaies sur la peau de souris par les souches de Staphylococcus aureus. L’efficacité in vivo de doses de cloxacilline particulières, déduites des doses CMI et CMIb in vitro, a été déterminée par la mesure de la charge bactérienne (établie sous forme de biofilm) aux temps 12h, Jour 5 et Jour J 11 post-infection, et par mesure de la cicatrisation aux Jour 5 et Jour 11 post-infection (sous la forme d’un score de cicatrisation).
Dans cet exemple, les souris utilisées étaient des femelles C57BL/6, âgées de 7 semaines, d’un poids compris entre 20 et 22g, provenant de Janvier Labs, Le Genest St Isle, 53941 St Berthevin, France. Le nombre de souris utilisées était de 5 par condition testée.
Dans cet exemple, la cloxacilline utilisée provenait d’une solution commerciale de cloxacilline (Orbenine (marque déposée) 1g, France, Pfizer, France).
Une souche de Staphylococcus aureus, S14, a été utilisée. Elle se caractérise, pour la cloxacilline, par une CMI (Concentration Minimale Inhibitrice) de 0,125pg/ml, ainsi qu’une CMIb (Concentration Minimale Inhibitrice de formation biofilm) de 2pg/ml.
Le modèle de plaie cutanée a été réalisé comme suit.
La concentration de S. aureus a été ajustée dans du PBS pour obtenir une concentration de 106 CFU dans 10μΙ (108 CFU/ml). Les souris, rasées sur le dos, ont été anesthésiées au gaz Isoflurane puis 4 incisions ont été faites de chaque côté de la colonne vertébrale, définissant 2 aires. Sur chaque souris, seule une des aires a été infectée par injection souscutanée de 10μΙ d’une solution de S. aureus, l’aire contralatérale servant de contrôle non infecté.
Pour tester l’effet de la cloxacilline, 3 groupes de souris ont reçu, 30 minutes pré-infection, un traitement « préventif » de 5mg/kg de cloxacilline (pour les souris recevant ensuite la cloxacilline à 3mg/Kg) ou 30mg/kg de Cloxacilline (pour les souris recevant ensuite la cloxacilline à 15mg/Kg) ou du sérum physiologique stérile par voie intrapéritonéale. Ces doses ont été déterminées suite à une étude PK/PD réalisée en interne.
Les concentrations sériques de cloxacilline selon les différentes conditions ont été mesurées par HPLC selon un protocole classiquement décrit (voir par exemple Jonsson et al, « Cloxacillin concentrations in sérum, subcutaneous fat, and muscle in patients with chronic critical limb ischemia » Eur J Clin Pharmacol, (2014) 70(8):957-63). L’ensemble des résultats a été intégré dans un logiciel de simulation pharmacocinétique à savoir puis un logiciel PKPD afin d’estimer les différents paramètres liés à la CMI planctonique (Cmax/CMI, AUC/CMI et T>CMI) et la CMIb (Cmax/CMIb, AUC/CMIb et T>CMIb).
En parallèle, les animaux témoins, à savoir 5 souris, ont reçu du sérum physiologique.
Les souris ont ensuite été traitées toutes les deux heures après le premier traitement préventif pendant 10 heures avec de la cloxacilline à 3mg/kg ou 15mg/kg ou du sérum physiologique. Ces doses ont été déterminées préalablement de façon à simuler des concentrations sanguines comprises entre la CMI planctoniques et la CMI biofilm de la souche S14.
Trois groupes de souris ont été utilisés, un premier groupe étant sacrifié à t + 12h après infection pour mesurer la charge bactérienne. Un second groupe est traité de façon identique et sacrifié 5 jours après infection et un troisième groupe, traité de façon identique est sacrifié 11 jours après infection. Chaque jour, un score de cicatrisation est établi sur les animaux, et sur les animaux sacrifiés, un dénombrement des bactéries installées est réalisé (à J5 et J11). Le score est établi comme suit, attribuant une valeur entre 0 et 3.
: cicatrisation complète ;
: blessure non totalement cicatrisée, avec présence d’une croûte ;
: blessure rouge, non cicatrisée (inflammation) ;
: blessure jaune, non cicatrisée (présence de pus).
La peau au niveau des blessures est découpée, rincée dans du PBS pour éliminer les bactéries non adhérées puis le tissu est homogénéisé dans les tubes Precellys à l’aide de billes de verre. L'homogénat résultant a été dilué en série, et différentes dilutions ont été étalées sur des plaques de milieu TSA et cultivées toute la nuit à 37 ° C. Les colonies (CFU) ont été quantifiées pour chaque dilution et la charge bactérienne au site de la plaie a ainsi été déterminée.
Résultats
La figure 4A montre la mesure du score de cicatrisation chez des souris infectées, traitées soit par la cloxacilline correspondant à la CMI de la souche S14 (3mg/Kg), soit par la cloxacilline correspondant à la dose CMIb (15mg/Kg), soit par du sérum physiologique (véhicule).
La figure 4B montre la mesure du score de cicatrisation chez des souris non infectées (contrôle), traitées soit par la cloxacilline correspondant à la CMI de la souche S14 (lnfecté/3mg/Kg), soit par la cloxacilline correspondant à la dose CMIb (lnfecté/15mg/Kg), soit par du sérum physiologique (Infecté/contrôle).
La figure 4C montre le dénombrement des bactéries installées dans la plaie. Leur nombre est classiquement exprimé en CFU (ColonyForming Units) correspondant au nombre de colonies dénombrées sur boite de Pétri.
Il apparaît sur la figure 4A que, au moins jusqu’au 6ème jour, le score de cicatrisation chez les animaux infectés décroît plus rapidement chez les animaux recevant la dose de cloxacilline sensée inhiber la formation de biofilm, et témoigne ainsi d’une cicatrisation plus efficace. La courbe correspondant à la condition d’administration de cloxacilline à la dose CMI se superpose à celle correspondant au contrôle sans cloxacilline, montrant l’absence d’effet de la cloxacilline sur la cicatrisation à cette dose.
La figure 4B montre que la cloxacilline n’a pas un effet per se sur la cicatrisation en absence d’infection. Parallèlement, le comptage des bactéries installées sur la plaie après 12h, 5 jours et 11 jours (figure 4C), montre que l’administration de cloxacilline à la dose CMIb de la souche (15mg/Kg) permet de diminuer significativement la charge bactérienne sur le site de la blessure (Iogio6.1 contre Iogio8.82 pour le contrôle à 12h), soit presque 3logio de diminution, puis la charge bactérienne continue à diminuer plus vite que les conditions contrôle sans cloxacilline et cloxacilline à la dose CMI alors que la dose CMIb de cloxacilline conduit, au jour 5, à une mesure de Iogio4.9 pour la dose CMIb contre Iogio6.86 pour la condition CMI et Iogio6.84 pour le contrôle. L’évolution parallèle, à partir de 5 jours, des conditions contrôle sans cloxacilline et cloxacilline à la dose CMI laisse supposer que c’est le système immunitaire qui est responsable de la diminution de la charge bactérienne.
Cet exemple montre l’effet inhibiteur d’installation de Staphylococcus aureus sur le site d’une plaie (formation d’un biofilm) par la cloxacilline à la dose correspondant à la CMIb, qui est corrélée à une meilleure cicatrisation du site blessé, et permet de conclure à l’effet favorisant de la cicatrisation de la cloxacilline à la dose CMIb de la souche par l’inhibition de l’installation de la souche. L’administration de cloxacilline à une dose efficace en tant qu’antibiotique (dose CMI) est par contre sans effet.
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Claims (11)

  1. REVENDICATIONS
    1. Utilisation ex-vivo de la cloxacilline à une concentration supérieure à 4mg/L pour inhiber la formation et/ou le développement d’un biofilm sur une surface.
  2. 2. Utilisation de la cloxacilline selon la revendication 1 à une concentration comprise de 4 mg/L à 16mg/L.
  3. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2 dans laquelle la surface est une surface abiotique.
  4. 4. Cloxacilline destinée à être utilisée comme médicament pour inhiber la formation et/ou le développement d’un biofilm sur une surface.
  5. 5. Cloxacilline destinée à être utilisée comme médicament pour prévenir la tolérance et/ou la résistance et/ou la multi-résistance bactérienne liée à la formation et/ou le développement d’un biofilm sur une surface.
  6. 6. Cloxacilline pour son utilisation selon la revendication 5 dans laquelle la cloxacilline est utilisée à une concentration supérieure à 4 mg/L
  7. 7. Cloxacilline pour son utilisation selon la revendication 5 ou 6 dans laquelle la surface est une surface biotique.
  8. 8. Composition pharmaceutique comprenant une concentration de cloxacilline supérieure à 4 mg/L de composition pour son utilisation comme médicament pour la prévention de la formation d’un biofilm bactérien sur une surface.
  9. 9. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 8 dans laquelle la cloxacilline est à une concentration comprise de 4 à 8 mg/L de composition.
  10. 10. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 8 ou 9 dans laquelle la surface est une surface biotique ou abiotique.
    5
  11. 11. Cloxacilline pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 4 à 7 ou composition pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 8 à 10 pour la prévention de la formation d’un biofilm bactérien au niveau des plaies et/ou d’infections.
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