JP2023518928A - バイオフィルムの形成を妨害する為の且つバイオフィルム関連障害を処置する為の組成物 - Google Patents

バイオフィルムの形成を妨害する為の且つバイオフィルム関連障害を処置する為の組成物 Download PDF

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Abstract

本開示は、チオ硫黄含有組成物、特にはプロピルプロパンチオスルホナート（PTSO：propyl-propane thiosulfonate）及びプロピルプロパンチオスルフィナート（PTS：propyl-propane-thiosulfinate）に関する。そのような組成物は、イン・ビボ（in vivo）及びイン・ビトロ（in vitro）の両方で感染を処置し、且つバイオフィルムを低減又は分解する為に有用である。特に、そのような組成物は、乳腺炎、趾皮膚炎及び慢性創傷感染症を包含するがこれらに限定されないバイオフィルム関連障害の処置において有用である。【選択図】なし

Description

本開示は、チオ硫黄含有組成物、特にはプロピルプロパンチオスルホナート（PTSO：propyl-propane thiosulfonate）及びプロピルプロパンチオスルフィナート（PTS：propyl-propane-thiosulfinate）に関する。そのような組成物は、イン・ビボ（in vivo）及びイン・ビトロ（in vitro）の両方で感染を処置し、且つバイオフィルムを低減又は分解する為に有用である。特に、そのような組成物は、乳腺炎、趾皮膚炎（digital dermatitis）及び慢性創傷感染症を包含するがこれらに限定されないバイオフィルム関連障害の処置において有用である。
乳房の健康状態は、健康及びウェルネスの観点からも並びに経済的な観点からも酪農動物において重要な役割を果たす。酪農動物、例えば乳牛、の乳腺の感染症（乳房炎として知られている）は、世界中の酪農場に重大な経済的インパクトを有する。年間の全世界の損失は、40億～50億ユーロと推定されている。乳腺炎において、乳房は微生物の侵入に対して効果的な防御反応を起こすことができない。幾つかの要因が乳房のレベルでバランスを乱すことが知られており、それが乳腺炎を引き起こす微生物を殺す、酪農動物の能力を損なう可能性がある。その結果、宿主の応答メカニズムが、侵入病原体を排除する為の効率的な防御応答を引き起こすことができない可能性があり、乳房の細菌コロニー形成と臨床的又は無症候性の乳腺炎の発症をもたらす。
細菌のコロニー形成、特には乳牛の乳房における細菌リザーバーの形成、は一般的に、対処が難しく、抗生物質の有無にかかわらず、或る処置戦略にもかかわらず持続する可能性がある慢性感染症を引き起こす。乳牛における乳房の細菌感染症の持続性に関連付けられた重要な要因は、上皮接着（epithelial adhesion）、バイオフィルムの生成、及び食作用に対する細菌の感受性である。
乳牛における乳腺炎を制御又は予防する為に、並びに疾病の臨床的且つ経済的影響を軽減する為に、幾つかの戦略、例えば幾つかの例を挙げると抗生物質処置及びワクチン接種、が使用されている。しかしながら、ほとんどの処置及び戦略は、疾病を改善する効果がほとんどないか、又は全くない。幾つかの理由が、有効性の欠如の為に考えられる。第一に、単一成分ワクチンの為の潜在的な抗原として多くの病原性因子が示唆されているが、実験的試験は、単一因子に対する免疫の誘導が、乳牛における乳腺炎を引き起こす細菌に対する強力な保護を与えるのに十分ではないことが実証されている。第二に、細菌抗原は免疫原性が低く、且つ適切なアジュバントを必要とする。第三に、乳腺炎の制御における主要な課題は、例えば細菌によるバイオフィルムの形成の結果として、乳房内の細菌プールに到達することができる効果的な抗生物質である。
微生物、例えば細菌、は、必ずしもバイオフィルムを生成する必要はないが、微生物が例えば上皮細胞に接着することができる場合には、該微生物は宿主内で生存する可能性がはるかに高くなる。接着（adhesion）は、一連の付着（attachments）と剥離（detachments）とを伴う能動的なプロセスであり、その結果、バイオフィルムの形成を生じ、該形成は、微生物における重大な遺伝的且つその後の生理学的変化を伴い、その結果、なかんずく、事実上全てのクラスの抗生物質に対する感受性を失う。従って、細菌性乳房感染症の管理は、抗生物質に耐性である細菌性病原体の出現と蔓延により、益々困難になっている。場合によっては、低用量の抗生物質がバイオフィルム形成を高めることさえでき、抗生物質の致死効果を回避する際に細菌の自然な防御メカニズムを示唆する。この複雑で且つ問題のある状況の故に、乳房炎は、近年の乳房全体の健康改善における進歩にもかかわらず、依然として乳牛の最も重要な疾病の1つである。
加えて、牛が抗生物質で頻繁に又は継続的に処置される場合に、該抗生物質とその分解生成物がまた糞尿中に見つけられる。該抗生物質とその分解生成物を含む肥料は、土壌に散布される。該抗生物質の存在は、土壌中の細菌の多様性に影響を与えることが示されている。これは、環境に対して望ましくない影響である。牛における感染症を処置する為の代替組成物は、環境を通じた抗生物質の拡散を防ぎ、土壌のマイクロバイオームを回復するであろう。
細菌のバイオフィルムの記述は、科学文献においてはるか以前から見られることができるが、バイオフィルムの意味が1982年に知られるようになり、それは黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）が心臓ペースメーカーのリード線上にバイオフィルムを形成したことをコステルトン（Costerton）が観察したときである。その後の研究及び臨床観察により、細菌のバイオフィルムがインプラント及びカテーテル、人工装具、及び他の移植された生体材料において見つけられることができることが明らかになった。さらに重要なことは、微生物バイオフィルムがヒト及び動物の組織における生物学的表面、例えば、口腔内の歯周粘膜（歯垢）、副鼻腔（慢性副鼻腔炎）、内耳（中耳炎）、血管及び心臓弁（心内膜炎）、肺胞表面（多発性肺疾患）又は胆道及び膀胱、にまた形成されることができるという観察であった。
バイオフィルム形成の第一段階は、表面への細胞の付着を含む。第2段階において、細胞の増殖が、多くの細胞層を有する成熟した構造の形成を伴って生じる。粘液層がまた形成され、それは更に細菌を保護する。例えば、Melchior et al．Veterinary Journal 2006 171：398-407を参照。臨界量が達成されると、バイオフィルムの最も外側の細胞層が「浮遊有機体」（planktonic organisms）を放出しうる。これらの有機体は更に、他の表面にコロニーを形成しうる。バイオフィルムは、様々な表面、例えば、生体組織、留置型医療機器、工業用若しくは飲料水システムの配管、又は天然の水系を包含する上記様々な表面、において形成しうる。当業者に理解されるであろう通り、全ての感染がバイオフィルムの展開を導くわけではない。
過去20年間の研究により、集合的なバイオフィルム形成は、クオラム・センシング（QS：quorum sensing）と呼ばれる細菌コミュニケーションシステムによって促進されることが明らかになった。QSは、細菌によってそれらの環境内に恒久的に排泄される小さな化学分子（所謂、オートインデューサ、AI（auto-inducers））によって生じる。これらのシグナル伝達分子（signalling molecules）（例えば、オリゴペプチド（AIP）又はN-アセチルホモセリンラクトン（AHL））は、それらの近隣における他の細菌によって特定の受容体を介して認識され且つ監視される。AIの特定の密度に達するときに（定足数）、細菌細胞は集合的に遺伝子発現を変更し、そして、病原性因子を生成して体細胞を攻撃するか、又は代謝経路を活性化して組織表面にバイオフィルムを形成する。バイオフィルムの形成は、最初は主に多糖類である大きなポリマーからなる細胞外マトリックスの形成を含み、それは、成熟することに応じて、タンパク質及び脂質によって安定化され、三次元構造を結果として生じる。
一旦バイオフィルム感染が確立されると、それを根絶することは非常に困難である。成熟したバイオフィルムは、浮遊性細胞（planktonic cells）を断続的に放出するだろう。これは、断続的な悪化を伴う慢性感染症につながる可能性がある。抗生物質又は宿主の免疫応答が浮遊性細胞による症状を解決しうるが、成熟したバイオフィルムは残りうる。
バイオフィルムの保護下にある微生物細胞はしばしば、抗生物質並びに体の自然な免疫反応に対してより耐性がある。休眠細菌は代謝的に不活性であり、従って、多くの抗生物質の典型的な標的、例えば、細菌細胞壁成分（β-ラクタム系抗生物質、例えばペニシリン類及びセファロスポリン類及びバンコマイシン類、の標的）の合成、及び迅速タンパク質（アミノグリコシド類、テトラサイクリン類、マクロライド類及びリネゾリドの標的）及びDNA合成（フルオロキノロン類及びリファンピシン）又は葉酸合成（スルホンアミド、アミノピリミジン（例えばトリメトプリム）、を発現しない。それ故に、抗生物質処置だけでは一般的に、バイオフィルム感染を根絶する為には十分でない（Wu et al．Int J Oral Sci．2015 Mar；7（1）：1～7をまた参照）。抗生物質は分散した（浮遊性の）細菌に対して有効でありうるが、バイオフィルム内の微生物を根絶する為に必要な抗生物質の最小濃度にバイオフィルム内で到達することは困難である。様々なイン・ビトロ実験において、バイオフィルムにおいて増殖する細菌は、同じ菌株の浮遊性細菌と比較した場合に、様々な抗菌剤に対して10～1,000倍の耐性があることが実証されている（例えば、Amorena et al．1999 J．Antimicrob．Chemother．44：43～55；Ceri et al.，1999 J．Clin．Microbiol．37：1771～1776；and Olson et al.，2002 Can．J．Vet．Res．66：86～92を参照）。Olsen等は、バイオフィルムに誘発される抗生物質耐性（resistance）及び寛容性（tolerance）の様々なメカニズムを概説する（Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2015 34：877～886）。
ウシ乳腺炎については、黄色ブドウ球菌の野外株を用いた研究において報告されている（Melchior，Gaastra & Fink-Gremmels，J．Vet．Med．2006 53：326～332）。MIC50、最小細菌濃度（BMIC：Minimum bacterial concentration）、及び最小バイオフィルム根絶濃度（MBEC：minimal biofilm eradicating concentration）が、乳腺炎に感染したウシから分離された7株について測定された。試験された抗生物質は、ウシの乳腺炎の処置において一般的に使用されているもの、例えば、ペニシリン、アモキシシリン、クロキサシリン、セファロチン、セフォペラゾン、セフキノム、クロキサシリン／ペニシリンの組み合わせ、クロキサシリン／ペニシリンの組み合わせ、リンコマイシン、ピリミシン、チロシン、ネオマイシン、ゲンタマイシン、トリメトプリム／スルファメトキサゾール、フロルフェニコール、及びダノフロキサシン、を包含していた。試験された全ての抗生物質について、MIC（浮遊性細菌）とMBEC（バイオフィルム根絶濃度）との差は256倍超の差があり、非常に多くの場合2048倍超の差があった。
抗生物質がバイオフィルム形成を刺激する可能性があるという証拠がまたある。例えば、幾つかの抗生物質（例えば、テトラサイクリン、キノプリスチン-ダルホプリスチン及びエリスロマイシン）は、細菌の付着を促進するところの細菌中の遺伝子（例えば、ica遺伝子）の発現を刺激しうる（Melchior et al.，上を見よ）。興味深いことに、黄色ブドウ球菌乳腺炎分離株の間でica遺伝子の有病率が高いことが示されている（Melchior et al.，で総説されている、上を見よ）。これらの結果は、乳腺感染症がバイオフィルム形成に関連付けられているという仮説を支持する。
バイオフィルムはまた、休眠細菌を含みうる。バイオフィルムは、宿主の免疫応答、例えば免疫細胞の活動に影響を与えるレギュレーター／サプレッサーの活性化を包含し及び免疫細胞に対する物理的バリアとして機能する上記の免疫応答、を回避する為に多くのメカニズムを使用し（Gonzalez Pathog Dis．2018 Apr，76（3））、しかし、休眠状態から抜け出し、そして、活動的になることができる。一般的に、免疫系は活動中の細菌に対してのみ作用し、それ故に、休眠中の細菌は個体の免疫系から逃れることができる。休眠中の細菌はバイオフィルムから離れ、そして、すぐに活発になり、そして、宿主に害を及ぼす。
真菌関連のバイオフィルムは、浮遊性細胞と比較して抗真菌薬に対してより耐性があることがまた知られている（概説については、例えば、Fanning and Mitchell PLOS Pathog 2012 8：e1002585を参照）。従って、抗菌効果を有する化合物がバイオフィルムの処置又は防止に常に適しているとは限らない。
成熟したバイオフィルムにおいて、休眠段階が、一次代謝のダウンレギュレーション（遺伝子シフト）によって使用される。休眠は、バイオフィルム細菌が抗生物質の典型的な標的の発現、例えば、タンパク質及びDNAの合成、並びに細胞壁の再構築をほぼ完全に抑制することを含む。引き続き、バイオフィルムは抗生物質に対して本質的に非感受性であり、及び多くの場合、浮遊性（自由浮遊する（free-floating））細菌よりも、該抗生物質に対して1000倍以上耐性がある。その上、バイオフィルムにおいて見られるより高い細胞密度は、水平遺伝子伝達の可能性をかなり高め、それは、増加した耐性又は変更された病原性プロファイルを有する株の出現の可能性を増加させる。臨床転帰は、一般的な（最新でさえある）抗生物質に対する表現型の耐性である。
そのようなバイオフィルムの保護環境においては、細菌の生存時間が長くなる。その上に、自己構築された不活性な多糖類に富むマトリックスは非免疫原性であり、バイオフィルムに埋め込まれた細菌を宿主の免疫細胞による認識（PAMPS－病原体に関連付けられた分子パターンを介して）及び貪食から保護する。
バイオフィルムの形成は、医療環境、産業環境及び自然環境において深刻な悪影響をもたらす可能性がある。特に、バイオフィルムに関連付けられた感染症（すなわち、バイオフィルム関連障害）は、ヒト及び動物の両方において深刻な問題である。そのような障害は、再発性急性エピソードと抗菌療法及び／又は宿主防御に対する耐性とを伴う慢性炎症反応によって特徴付けられうる。創傷のバイオフィルムは組織の修復を遅らせ、慢性創傷を結果として生じる。現在、バイオフィルム感染は、全てのヒトの微生物感染の最大80％を占めることが示唆されている（Bartell JA et al.，20 Evolutionary highways to persistent bacterial infection．Nature Communications （2019） 10：629 and Sharma et al．2019 Antimicrobial Resistance and Infection Control 8：76）。Jamal等は、国立衛生研究所が、微生物感染症の65％と慢性感染症の80％がバイオフィルム形成に関連付けられていることを示したことを報告した（Journal of Chinese Medical Association 81：7～11）。バイオフィルム及びバイオフィルム関連障害は、文献において広く議論されている；例えば、Sharma et al．2019 Antimicrobial Resistance and Infection Control 8:76；Roy et al．2018 Virulence 9:522～554；and Jamal et al．2018 Journal of the Chinese Medical Association 81:7～11を参照。Vestby等は、細菌のバイオフィルムと疾患におけるそれらの役割を概説する（Antibiotics （Basel）．2020 Feb；9（2）：59）。バイオフィルム感染症の包括的な概要は、2014年に欧州臨床微生物学会及び感染症学会（European Clinical Society of Microbiology and Infectious Disease）において示されていた（David Lebeaux et al．Microbiol．Mol．Biol．Rev．2014；doi：10.1128/MMBR.00013～14をまた参照）。
例えば、院内感染を生じる生物である緑膿菌は、嚢胞性線維症の肺組織、コンタクトレンズ、及びカテーテルライン等の多様な表面にバイオフィルムを形成する。バイオフィルムとして成長する緑膿菌は、慢性創傷においてまた発見されており、及び創傷の治癒障害を生じる可能性がある。バイオフィルム、特に緑膿菌バイオフィルム、はまた、呼吸器疾患、例えば、気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患及び慢性副鼻腔炎、において慢性感染症を生じる。医療用器具おいて形成されたバイオフィルムは、体内に排出される可能性のある細菌のリザーバーとして機能し、慢性的な全身感染症を生じる。カンジダ・アルビカンス（酵母）は、病院において見られる最も一般的な真菌バイオフィルムであるが、処置することが非常に難しく、典型的な抗真菌剤処置に十分に反応しない。
乳牛における再発性乳腺炎及び複雑な創傷感染症に関与する故に、黄色ブドウ球菌（グラム陽性）及び緑膿菌（グラム陰性）に焦点を当てた細菌性バイオフィルム形成における先駆的な研究が行われた。加えて、連鎖球菌種（Streptococcus ssp）、トリ病原性大腸菌（APEC：avian pathogenic E．coli）及びカンピロバクター・ジェジュニ（C．jejuni）のバイオフィルム形成は、これらの細菌種が公衆衛生に関連している故に注目を集めた。引き続き、他の重要な動物病原体、例えば、アクチノバシラス・プルロニューモニエ（Actinobacillus pleuropneumoniae）（致命的になりうる豚における重度の肺感染症）、大腸菌（Escherichia coli）（局所及び全身感染症並びに全身性敗血症、それらは家禽においてしばしば致死的である）、犬及び猫における皮膚及び腸の疾病、並びに馬における創傷感染症及び子宮内膜炎を包含する上記動物病原体、が、バイオフィルム感染症として認識された。バイオフィルム形成はほとんど全ての微生物の一般的な特性である故に、このリストは排他的でない。
従って、バイオフィルム関連障害の代替処置の為の必要性が存在する。
本開示は、下記の好ましい実施態様を提供する。
１．バイオフィルム関連障害の処置において使用する為の、下記の式Iに従う化合物、又は前記式Iに従う化合物を含む組成物、ここで、好ましくは、前記組成物はジアリルチオスルフィナートを実質的に有しない
Figure 2023518928000001
 ここで、R1及びR2は独立して、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルケニル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、から選択される。
２．前記化合物がプロピルプロパンチオスルホナート（PTSO）である、実施態様１に記載の使用の為の、前記化合物又は前記組成物。
３．実施態様１に記載の使用の為の、前記化合物又は前記組成物、ここで、該組成物が、下記の式IIに従う化合物をさらに含み、好ましくは、前記式IIに従う化合物は、プロピルプロパンチオスルフィナート（PTS）である
Figure 2023518928000002
 ここで、R3及びR4は独立して、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルケニル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキルから選択される、但し、式IIは下記でない。
Figure 2023518928000003
４．バイオフィルム関連障害の処置において使用する為の、下記の式IIに従う化合物、ここで、好ましくは、前記化合物がプロピルプロパンチオスルフィナート（PTS）である、又は前記式IIに従う化合物を含む組成物、ここで、好ましくは、前記組成物はジアリルチオスルフィナートを実質的に有しない
Figure 2023518928000004
 ここで、R3及びR4は独立して、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルケニル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキルから選択される、但し、式IIは下記でない
Figure 2023518928000005
５．実施態様１～４のいずれか１項に記載の化合物又は前記組成物、ここで、前記組成物が、下記の式IIIを有する化合物をさらに含み、
Figure 2023518928000006
 ここで、nは、1、2又は3であり、並びにR1及びR2は独立して、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルケニル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキルから選択される、但し、式IIIは下記でない。
Figure 2023518928000007
６．前記使用が、抗菌剤、好ましくは抗真菌剤又は抗生物質から選択される抗菌剤、の投与をさらに含む、実施態様１～５のいずれか１項に記載の化合物又は前記組成物。
７．前記使用が、抗炎症剤の投与をさらに含む、実施態様１～６のいずれか１項に記載の化合物又は前記組成物。
８．前記処置が、バイオフィルムの形成若しくは成長の減少の為のものであり及び／又はバイオフィルムの分解若しくは低減の為のものである、実施態様１～７のいずれか１項に記載の化合物又は前記組成物。
９．前記バイオフィルム関連障害が、慢性感染症及び／又は持続感染症である、実施態様１～８のいずれか１項に記載の化合物又は前記組成物。
１０．前記バイオフィルム関連障害が、趾皮膚炎又は慢性創傷感染症である、実施態様１～９のいずれか１項に記載の化合物又は前記組成物。
１１．前記バイオフィルム関連障害が乳腺の感染症であり、好ましくは、前記バイオフィルム関連障害が乳腺炎である、実施態様１～１０のいずれか１項に記載の化合物又は前記組成物。
１２．前記処置が哺乳動物の為のものである、実施態様１～１１のいずれか１項に記載の化合物又は前記組成物。
１３．前記処置が、反芻動物、好ましくはウシ、の為のものである、実施態様１～１２のいずれか１項に記載の化合物又は前記組成物。
１４．前記組成物が、ジアリルチオスルフィナートを実質的に有しない、実施態様１～１３のいずれか１項に記載の化合物又は前記組成物。
１５．前記バイオフィルムが、細菌、酵母、真菌、微細藻類、又はそれらの組み合わせを含む、実施態様１～１４のいずれか１項に記載の化合物又は前記組成物。
１６．個体におけるバイオフィルム関連障害を処置する方法であって、該方法は、それを必要とする個体に、下記の式Iに従う化合物を含む組成物を投与することを含み、ここで、好ましくは、前記化合物がプロピルプロパンチオスルホナート（PTSO）であり、前記組成物はジアリルチオスルフィナートを実質的に有しない、前記方法
Figure 2023518928000008
 ここで、R1及びR2は独立して、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルケニル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキルから選択される。
１７．下記の式Iに従う化合物を含む組成物で少なくとも部分的に被覆された表面を有する物品であって、ここで、好ましくは、前記物品が、清掃用製品、医療用器具又は外科用器具であり、前記組成物はジアリルチオスルフィナートを実質的に有しない、前記物品
Figure 2023518928000009
 ここで、R1及びR2は独立して、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルケニル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキルから選択される。
１８．表面におけるバイオフィルムの形成若しくは成長を防止若しくは減少する為の、又は表面におけるバイオフィルムを分解若しくは低減する為のイン・ビトロ方法であって、前記方法は、組成物を前記表面に施与して、表面におけるバイオフィルムの形成若しくは成長を防止若しくは減少すること又は表面におけるバイオフィルムを分解若しくは低減することを含み、前記組成物が、下記の式Iに従う化合物を含み、ここで、前記組成物はジアリルチオスルフィナートを実質的に有しない、前記方法
Figure 2023518928000010
 ここで、R1及びR2は独立して置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルケニル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキルから選択される。
１９．下記の式Iに従う化合物を含む組成物であって、前記組成物が医薬組成物又は機能性食品であり、ここで、前記組成物はジアリルチオスルフィナートを実質的に有しない、前記組成物
Figure 2023518928000011
 ここで、R1及びR2は独立して、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルケニル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキルから選択される。
２０．前記化合物が、プロピルプロパンチオスルホナート（PTSO）である、実施態様１６～１９のいずれか１項に記載の物品、方法又は組成物。
２１．前記組成物が、抗菌剤、好ましくは抗真菌剤又は抗生物質から選択される抗菌剤、を更に含む、実施態様１６～２０のいずれか１項に記載の物品、方法又は組成物。
２２．前記組成物が、抗炎症剤を更に含む、実施態様１６～２１のいずれか１項に記載の物品、方法又は組成物。
２３．前記組成物が下記の式IIに従う化合物を更に含む及び／又は前記組成物が下記の式IIIを有する化合物を更に含む、実施態様１６～２２のいずれか１項に記載の物品、方法又は組成物
Figure 2023518928000012
 ここで、R3及びR4は独立して、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルケニル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキルから選択される、但し、式IIは下記でない
Figure 2023518928000013
Figure 2023518928000014
 ここで、nは、1、2又は3であり、並びにR1及びR2は独立して、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルケニル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキルから選択される、但し、式IIIは下記でない。
Figure 2023518928000015
図1A及び図1Bは、マイクロタイタープレートのウェル測定におけるQS1及びQS2のバイオフィルム根絶の効果を測定する為に使用される手順を示す。図1Aは、マイクロタイタープレートにおいてバイオフィルムを測定する為に使用される方法を示す。 図1A及び図1Bは、マイクロタイタープレートのウェル測定におけるQS1及びQS2のバイオフィルム根絶の効果を測定する為に使用される手順を示す。図1Bは、ペグ（pegs）のバイオフィルム形成を測定する方法を示す。 図2Aは、豊富培地条件における緑膿菌及び黄色ブドウ球菌の後期のバイオフィルム形成（late biofilm formation）におけるQS1及びQS2の効果を示す。左の図：ウェルにおける後期のバイオフィルム形成における影響；右の図：ペグにおける後期のバイオフィルム形成における影響。有意レベルはアスタリスクとして示されている（*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001；****：P<0.0001）。 図2Bは、最小培地条件における緑膿菌及び黄色ブドウ球菌の後期のバイオフィルム形成におけるQS1及びQS2の効果を示す。左の図：ウェルにおける後期のバイオフィルム形成における影響；右の図：ペグにおける後期のバイオフィルム形成における影響。有意レベルはアスタリスクとして示されている（*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001；****：P<0.0001）。 図3Aは、搾乳後に乳房から直接的に放出されたバイオフィルムを示す。 図3Bは、PTSO/PTS錠剤で処置してから1～3日後の、乳腺炎を有するウシの搾乳後の牛乳を篩いにかけた後に得られたバイオフィルムを示す。 図4は、感染の進行（直線矢印）及び治癒（点線矢印）を示す。
本開示は、バイオフィルムの形成を低減、分解、及び／又は防止する為に有用である化合物を提供する。本明細書に記載されている化合物は、驚くべきことに、非常に不均一な微生物集団を含むバイオフィルム（例えば、実施例2を参照）並びに既知のヒト病原体を含むバイオフィルム（例えば、実施例3及び実施例4を参照）を分解することが判明した。本開示は、該化合物がイン・ビトロ（in vitro）だけでなくイン・ビボ（in vivo）においてもバイオフィルムに対して活性であり、全身（例えば、経口）及び局所の両方で投与されることができることをさらに提供する（例えば、実施例5～8を参照）。
本開示は、下記の式Iに従うチオスルホナートを提供する
Figure 2023518928000016
 ここで、R1及びR2は独立して、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルケニル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキルから選択される。
幾つかの実施態様において、本開示は、下記の式IIに従うチオスルフィナートを提供する
Figure 2023518928000017
 ここで、R3及びR4は独立して、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルケニル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキルから選択される、但し、式IIは下記でない。
Figure 2023518928000018
幾つかの実施態様において、本開示は、下記の式IIIを有する化合物を提供する
Figure 2023518928000019
 ここで、nは、1、2又は3であり、並びにR1及びR2は独立して、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルケニル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキルから選択される、但し、式IIIは下記でない。
Figure 2023518928000020
式I、式II又は式IIIを有する化合物は、本明細書において、「化合物」、「治療用化合物」又は「治療用チオ硫黄化合物」として云われる。該化合物は、式I、式II又は式IIIの塩を包含する。好ましくは、該化合物は、式I又は式IIを有する。式I又は式IIを有する化合物は、式IIIを有する化合物と一緒に使用されうる。より好ましくは、該化合物は式Iを有する。好ましくは、式Iの化合物は、プロピルプロパンチオスルホナート（PTSO）である。PTSOは、下記の構造を有する。
Figure 2023518928000021
好ましくは、式IIの化合物は、プロピルプロパンチオスルフィナート（PTS）である。PTSは、下記の構造を有する。
Figure 2023518928000022
プロピルプロパンチオスルホナート（PTSO）及びプロピルプロパンチオスルフィナート（PTS）は、アリウム（Allium）科に属する植物において見られる天然化合物である。例えば、アリウム・サティヴム（Allium sativum）（ニンニク）、アリウム・セパ（Allium cepa）（タマネギ）、アリウム・アンペロプラスム（Allium ampeloprasum）（ネギ）、アリウム・スコエノプラスム（Allium schoenoprasum）（チャイブ）、アリウム・キネンセ（Allium chinense）（ラッキョウ）である。該化合物は、天然源から抽出することもでき、又は合成的に生成されることもできる。両方の化合物PTS及びPTSOはまた商業的に入手可能である。
幾つかの実施態様において、該化合物は、天然源、例えば植物、から得られる。該化合物は、様々な方法において植物材料から抽出されることができる。適切な方法は、該化合物の化学的性質によって異なる。例えば、該抽出は非極性溶媒で開始し、そして、極性の増加する溶媒がそれに続くことができる。代替的には、植物の該化合物がアルコールにおいて抽出されることができる。そのような抽出物は、例えば、約80％のPTSO及び約20％のPTSを含みうる。好ましい実施形態において、本明細書に開示されている該組成物は、PTSO及びPTSを少なくとも3：1、好ましくは約4：1、の重量比で含む。理論に縛られることは望まないが、本開示は、抗バイオフィルム活性が主にPTSOによるものであることを提示する。
ニンニク抽出物は、栄養補助食品における使用の為に以前に記載されている。ニンニクは世界中で栽培されているハーブである。それは、タマネギ、ネギ及びチャイブに関連する。ニンニク抽出物、特に化合物アリシン、は、様々な種類の疾病を処置する為のその可能性について研究されている。これは、心臓及び血液系に関連する状態に最も一般的に使用される。これらの状態は、高血圧、血液中の高レベルのコレステロール又はその他の脂肪、及び動脈硬化を包含する。
例えば、ニンニクは、ニンニク抽出物を含む錠剤である。それは、特別な剤形、すなわち腸溶性コーティングされた錠剤、で、制御された温度下で乾燥されたニンニク粉末として説明されている。このコーティングは、胃を通過する間に錠剤を保護し、そして、小腸において溶解して内容物を放出する。ニンニクは、高血清コレステロール値及び心臓病のリスクから保護するものとして提示されている。加えて、欧州特許出願公開EP2110128号は、抗生物質の代替物として動物飼料中の天然添加物としてネギ科由来の化合物の使用を開示する。
多数の異なる化合物を含むニンニク抽出物とは対照的に、PTSOは微量成分であり、本明細書において提供される組成物は好ましくは、天然のニンニク抽出物よりも高い濃度でPTSOを含む。加えて、天然のニンニク抽出物は多数の異なる物質を含み、それぞれが異なる（時には望ましくない）効果を有し、本明細書において提供される組成物は、ニンニク抽出物中の他の成分の望ましくない副作用無しにPTSOを提供する為に有用である。加えて、PTSOの為の豊富である組成物は、より高い用量を可能にする。
例えば、ニンニク抽出物は強い臭いを有する。動物がそのようなニンニク抽出物を与えられるときに、これらの臭いは、動物製品、例えば牛乳及び卵、において見られる。消費者は、これらの臭気を有する製品を腐ったものと認識し、そして、そのような臭気はまたそのような製品の味に影響を与える可能性がある。実際には、ニンニク抽出物を使用している間に収集された動物製品は、通常廃棄される必要がある。ヒトによってニンニク抽出物を摂取することにより、体臭及び口臭を生じる可能性がある。
対照的に、本明細書に開示された治療用化合物は好ましくは、上記されたニンニク抽出物の負の効果を有さない。例えば、農場の動物の場合、これにより、結果として生じる動物製品（例えば、牛乳及び卵）が消費者に適しているという点で、商業的に大きな利点を有していた。幾つかの実施態様において、本開示は、本明細書に開示される組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む方法を提供し、ここで、該処置は、体臭、口臭、体液（例えば、牛乳）における異常な臭気の存在を結果として生じず、又は鳥類の場合、卵における異常な臭気を又は少なくともニンニク抽出物よりも少ない程度の異常な臭気を結果として生じない。
本開示は、本明細書において開示されている化合物を含む組成物、特に式Iを有する化合物及び／又は式IIを有する化合物を含む組成物、を提供する。好ましくは、そのような組成物はジアリルチオスルフィナートを実質的に含まない。ジアリルチオスルフィナートは、アリシンという名前でよく知られている。アリシンは有機硫黄化合物である。新鮮なニンニクが刻まれたり又はつぶされたりしたときに、アリイナーゼという酵素がアリインをアリシンに転化換、それは、新鮮なニンニクの香りの要因である。生成されたアリシンは不安定であり、一連の他の硫黄含有化合物、例えばジアリルジスルフィド、に迅速に変化する。ニンニクの1片は、約5mg～約18mgのアリシンを含む。
本明細書において使用される場合に、「実質的に含まない」は、5重量％未満のジアリルチオスルフィナートを含む組成物を云う。幾つかの実施態様において、該組成物は、1重量％未満のジジアリルチオスルフィナート、好ましくは0.5重量％未満のジアリルチオスルフィナート、を含む。幾つかの実施態様において、該組成物は、少なくとも10：1、より好ましくは少なくとも100：1、の、ジアリルチオスルフィナートに対する治療用チオ硫黄化合物（例えば、PTSO及びPTS）の重量比を含む。
本開示の組成物はまた、好ましくは、ジアリルジスルフィドを実質的に含まない。幾つかの実施態様において、該組成物は、1重量％未満のジアリルチオスルフィナート、好ましくは0.5重量％未満のジアリルチオスルフィナート、を含む。幾つかの実施態様において、該組成物は、少なくとも10：1、より好ましくは少なくとも100：1、の、ジアリルジスルフィドに対する式I及び／又は式IIを有する化合物（例えば、PTSO及びPTS）の重量比を含む。
幾つかの実施態様において、活性成分の少なくとも50重量％、好ましくは少なくとも90重量％、が、本明細書において開示されている式I、式II又は式IIIに従う化合物であるところの組成物が提供される。幾つかの実施態様において、唯一の有効成分が、式I、式II又は式IIIに従う化合物であり及び任意的に、更なる抗菌剤及び／又は抗炎症剤を含むところの組成物が提供される。幾つかの実施態様において、活性成分の少なくとも50重量％、好ましくは少なくとも90重量％、が、本明細書に開示されている式I又は式IIに従う化合物であるところの組成物が提供される。幾つかの実施態様において、活性成分のみが式I又は式IIに従う化合物であり及び任意的に、更なる抗菌剤及び／又は抗炎症剤を含むところの組成物が提供される。
本明細書において開示されている化合物及びそれを含む組成物は、感染症の処置又は予防において有用である。例えば、特定の用途は、呼吸器感染症、腸感染症、乳房感染症（breast infection）、動物の乳房感染症（udder infection）、皮膚感染症、膀胱感染症、耳感染症、全身感染症、関節感染症、脳感染症の処置又は予防のためである。
本明細書において使用される場合に、「感染症」は例えば、疾病につながる可能性がある病原性感染症を云う。特に、そのような感染は細菌感染又は真菌感染である。好ましい実施態様において、該感染は細菌感染である。細菌と菌類とはほぼどこにでも見られ、及び非常に多様な形態で存在する。ほとんどは有害ではなく、並びに実際に地球上の生命に不可欠であり、並びに植物、動物及びヒトの健康に不可欠である。例えば、細菌及び真菌が宿主と共生しているところの、ヒト及び動物の腸内にあるマイクロバイオームは、所謂、腸内フローラである。また、細菌は皮膚上に自然に存在し、それは、免疫システムの一部を形成する。他の例は、細菌及び真菌で大部分が構成されている土壌生物学である。幾つかの細菌及び真菌は、例えば、動物又はヒトにおける病原性感染症を生じる可能性がある。これらの病的な感染症は、感染した個人の疾病及び病気につながる可能性がある。
本明細書において使用される場合に、「感染症の処置」は、感染症の重症度及び／又は持続期間のおける軽減、及び／又は感染からの症状の重症度及び／又は持続期間における軽減を云う。好ましくは、該処置は個体の健康の回復を結果として生じる。好ましくは、該個体は、より少ない疾病症状を有するか、又はより短い期間である。本明細書において使用される場合に、「感染の予防」は、感染又は感染に関連付けられた1以上の症状の発症を予防すること又はその発症を遅らせることを云う。
幾つかの微生物、例えば、細菌、微細藻類、真菌、は、バイオフィルムを形成することができる。本明細書において開示されている化合物はまた、バイオフィルムの形成若しくは成長の防止若しくは減少において及び／又バイオフィルムの分解若しくは低減の為に有用である。好ましくは、該化合物及びそれを含む組成物は、バイオフィルム関連障害の処置又は予防において有用である。
語「バイオフィルム」は、技術的且つ環境的微生物学において最初に使用され、天然又は人工の表面に付着した付着性細菌及びその他の微生物のコミュニティを表した。微生物バイオフィルムの形成は、細菌が付着し、そして有機ポリマーからなるぬるぬるしたフィルムを生成するところの表面上に、細菌をコロニーを形成することによって開始される。この一次バクテリアフィルムは、微生物、例えば、藻類及び原生動物、真菌及び原生動物、を引き付け、そして、目に見える複数種のバイオフィルムの形成を結果として生じる。このような3次元バイオフィルムは天然界に遍在しており、且つ水と接触している全ての表面において見られる。公衆衛生上の懸念事項は、地方自治体の水道及び家庭用水道のパイプライン及び装置における微生物バイオフィルムである。そのような多種環境バイオフィルムにおける式I、式II及び式IIIに従う化合物の有効性は、実施例2及び3において実証される。
本明細書において使用される場合に、語「バイオフィルム」は、界面（通常は固体／液体）に集中され且つ典型的には細胞外高分子粘液マトリックスに囲まれたところの微生物の集団を云う。バイオフィルムは、生きている表面において又は生きていない表面において形成され得、自然環境、産業環境及び病院環境において見られる。バイオフィルムは、様々な種類の微生物、例えば、細菌、古細菌、原生動物、真菌及び藻類、を含むことができ、好ましくは、そのようなバイオフィルムは、細菌、微細藻類（例えば、プロトセカ種（Prototheca spp.））又は真菌を含む。
本明細書において使用される場合に、「バイオフィルム関連障害の処置」は、本明細書において「バイオフィルムに関連付けられた障害」とまた呼ばれ、障害の重症度及び／又は持続期間における軽減、及び／又は障害からの症状、特に感染症の症状、の重症度及び／又は持続期間、好ましくは、該処置は個体の健康の回復を結果として生じる、好ましくは、該個体は、より少ない疾病症状を有するか、又はより短い期間である。
本明細書において使用される場合に、「バイオフィルムの形成又は成長の防止又は減少」とは、バイオフィルムの形成若しくは成長の防止、遅延、又は減少を云う。当業者には理解されるであろう通り、バイオフィルムの形成若しくは成長のそのような減少は、未処置のバイオフィルムの成長と比較して、バイオフィルムの成長を遅らせうる。好ましくは、該組成物は、バイオフィルムの形成若しくは成長を減少させる為に有用である。本明細書において使用される場合に、本明細書で使用される場合、「バイオフィルムの分解又は減少」は、バイオフィルムの部分的な除去又は完全な除去のいずれかを云う。当業者によって理解されるであろう通り、そのような処置の後、浮遊性細菌は依然として存在しうる。
本明細書において開示されている化合物は、バイオフィルム、例えば細胞外粘液マトリックス、の構造を破壊することができうる。幾つかの実施態様において、該化合物は細胞接着を阻害する為に有用である。特に、該化合物は、微生物バイオフィルム、特に遊離して生きている微生物（free living microbes）、において遭遇する全ての細胞タイプの静的又は生きた表面への接着を（細菌を死滅させること無しに）防止しうる。
理論に縛られることは望まないが、本開示は、本明細書において開示されている治療用化合物がクオラム・センシング（quorum sensing）に影響を与えることによってそれらの効果の一部を発揮しうることを提案する。クオラム・センシング（QS）シグナル伝達は、制御、例えば細菌病原性因子の発現の制御、において重要な役割を果たす。QSは、単一の細胞が細菌数の密度とシグナル伝達分子とを感知することを可能にするところの周囲環境におけるシグナル伝達分子の蓄積に関与し、それ故に、細菌集団全体として、協調的な反応を起こすことができる。これらの細胞間コミュニケーションシステムは、細菌の様々な機能、例えば、運動性、病原性、胞子形成、抗生物質産生、DNA交換、及びより複雑な多細胞構造、例えばバイオフィルム、の展開、を調節する。それ故に、QSシグナル伝達システムへの干渉は、永続的な（慢性的な）細菌感染症と戦う為の新しい戦略を提供する可能性がある。或る物質、例えば、クオラム・クエンチング（QQ：Quorum Quenching）能力を有する天然に生じる化合物、の能力は、抗接着化合物として及びバイオフィルム形成を妨げる化合物として使用されることができる。
本明細書において開示されている化合物は、バイオフィルム関連障害を処置する為に特に有用であり、該障害は、慢性感染症及び／又は持続感染症によって特徴付けられる。持続感染症及び慢性感染症はしばしば同じ意味で使用されるが、異なるメカニズムに基づく。持続感染症は通常、免疫防御によって抑えられているが、そのような免疫防御が弱まると活性化されうる。持続感染症はしばしば無症候性であり、及び免疫防御が病原体を制御できなくなった場合にのみ臨床的に目に見えるようになる。持続感染はしばしば無症候性であるが、当業者は、そのような持続感染を検出する手段、例えば、患者のサンプル（例えば、血液又は尿）から微生物を検出することを含む上記手段、をよく知っている。慢性感染症において、病原体は細胞の１つのグループ／組織の一部（例えば、関節又は肺組織）中にとどまる。患者は常に疾病の症状を有しているが、これらは感染の急性期よりも軽度でありうる。
バイオフィルム疾病の最も顕著な例は、ウシの乳腺炎のままである。ウシの乳腺炎は、ウシの乳腺の感染症の臨床用語であり、複数の病原体によって引き起こされる可能性があり、最も一般的な形態は、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactia）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Streptococcus dysgalactiae）、並びに霊菌（Serratia marescens）、及びその他の通性病原性腸内細菌科及びプロトセカ属（Prototheca spp.）であり、後者は、世界の多くの地域において攻撃的で治癒不可能な乳腺炎を引き起こす新たな病原体と見なされている。本発明は、そのような微生物を含むバイオフィルムを、本明細書において開示されている化合物及び組成物で処置することを包含する。
本明細書における実施例は、バイオフィルム感染症における幅広い活性を実証するウシの様々な野外試験におけるPTSOの驚くべき有効性を記載する。バイオフィルム感染症の他の1つの顕著な例は、慢性の非治癒性創傷感染症である。牛における既知のバイオフィルムに関連付けられた疾病である趾皮膚炎は、そのような遅延された創傷治癒プロセスの例として役立ち、及びPTSOで成功裡に処置された（実施例7を参照）。幾つかの実施態様において、本発明の化合物によって処置される創傷は、例えば、黄色ブドウ球菌；連鎖球菌；グラム陰性菌、例えば、トレポネマ種、大腸菌、エルシアニア・ペスティス（Yersiania pestis）、緑膿菌；又は酵母／菌類、例えば、カンジダ属菌（Candida spp）（カンジダ・アルビカンス（albicans））、クラドスポリウム・ヘルバルム（Cladosporidium herbarum）、トリコスポロン（Trichosporum）、ロドソポリジウム（Rhodosporidium）、及びマラセチア（Malassezia）を含む。
バイオフィルムに関連付けられた微生物が多数の感染症、例えば心内膜炎、骨髄炎、副鼻腔炎、尿路感染症、慢性前立腺炎、歯周炎、嚢胞性線維症患者における慢性肺感染症、中耳感染症、及び様々な院内感染症、特に全ての既知の留置デバイス（カテーテル、インプラント）に関連する感染症を包含する該感染症、を引き起こすことが現在、一般的に認識されている。バイオフィルム疾病の負担は重大であり、及び医療における主要な関心事である。
現在、ほとんど全ての細菌種がストレス条件下でバイオフィルムを形成することができることが知られているが、現在の臨床診療において、幾つかの細菌及び真菌種が大きな関心を集めている。これは、同じ種及び菌株の非バイオフィルム、浮遊性形態が一般的な治療剤（抗生物質及び抗真菌剤／殺菌剤）に対して非常に優れた感受性を示す場合にでさえも、関連付けられた感染症がほぼ完全に治療抵抗性である故である。
バイオフィルムに関連づけられた治療抵抗性の故に主要な臨床的懸念がある病原体の例が下記に示されている：
アスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）－肺アスペルギルス症（真菌性疾病）；
バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）－肺嚢胞性線維症重複感染症；
カンジダ属菌（Candida spp）（酵母）－消化管及び泌尿生殖路の粘膜表面；
ガードネラ・バジナリス（Gardnerella vaginalis）（尿生殖路）；
大腸菌（Escherichia coli）（多臓器及び敗血症）；
緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）（嚢胞性線維症を含む複数の臓器及び肺の感染症）；
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（複数の組織及び創傷感染、院内感染）；
表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）（複数の組織及び創傷感染）；
ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）（慢性呼吸器疾病）。そのようなバイオフィルム関連障害及びバイオフィルムに関連付けられた微生物の処置は、本発明に包含されている。
微生物バイオフィルムは、細菌によってだけでなく、他の微生物、特に病原性真菌（複数のアスペルギルス関連肺疾病の主な原因であるアスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus））及び酵母（カンジダ属菌（Candida spp））、によっても形成され、胃腸及び尿路生殖器の粘膜表面にコロニーを形成する。最も一般的なインプラント関連のバイオフィルムは、黄色ブドウ球菌（MSSA及びMRSA）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、緑膿菌、クレブシエラ肺炎（Klebsiella pneumonia）、及びエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）によって形成される。加えて、微細藻類、例えばプロトセカ種、は、バイオフィルムを形成することができ、並びにヒト及び動物における病気の原因である（プロトテコーシス（Protothecosis））。
幾つかの実施態様において、該バイオフィルムは、トレポネマ属（Treponema spp）、ペスト菌（Yersiania pestis）、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Streptococcus dysgalactiae）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、霊菌（Serratia marescens）、トゥルエペレラ・ピオゲネス（Trueperella pyogenes）、マンへミア・ヘモリチカ（Mannheimia haemolytica）、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、緑膿菌、バークホルデリア・セパシア（Burkolderia cepacia）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、インフルエンザ菌（Hemophilus influenza）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella neumophila）、壊死桿菌（Fusobacterium necrophorum）、羊仮性結核菌（Corynebacterium pseudotuberculosis）、ストレプトコッカス属（Streptococcus spp.）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）、緑膿菌、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、大腸菌、サルモネラ・エンテリティディス（Salmonella enteritidis）及び緑膿菌の１以上から選択される細菌を含む。幾つかの実施態様において、該バイオフィルムは、アブシディア属（Absidia spp.）、アクチノミセス属（Actinomyces spp.）、アスペルギルス（Aspergillus spp.）、ボトリティス属（Botrytis spp.）、カンジダ属（Candida spp.）、セントロスポラ属（Centrospora spp.）、セファロスポリウム属（Cephalosporium spp.）、ケラトシスティス属（Ceratocystis spp.）、ケトコニジウム属（Chaetoconidium spp.）、ケトミウム属（Chaetomium spp.）、クラドスポリウム属（Cladosporium spp.）、コレトトリカム属（Colletotrichum spp.）、コニディオボラス属（Conidiobolus spp.）、フルビア属（Fulvia spp.）、フザリウム属（Fusarium spp.）、ゲオトリクム属（Geotrichum spp.）、ギニャルディア属（Guignardia spp.）、ヘルミントスポリン属（Helminthosporium spp.）、ヒストプラズマ属（Histoplasma spp.）、レシトフォラ属（Lecythophora spp.）、マラセチア属（Malassezia spp.）、ネクトリア属（Nectria spp.）、ノカルジア属（Nocardia spp.）、オースポラ属（Oospora spp.）、オフィオボラス属（Ophiobolus spp.）、ペシロマイセス属（Paecilomyces spp.）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Paracoccidioides brasiliensis）、ペニシリウム属（Penicillium spp.）、フィマトリクム属（Phymatotrichum spp.）、フィトフソラ属（Phytophthora spp.）、ピシウム属（Pythium spp）.、ピエドライア・ホルタイ（Piedraia hortai）、リゾクトニア属（Rhizoctonia spp.）、クモノスカビ属（Rhizopus spp.）、ロドスポリジウム属（Rhodosporidium spp.）、サッカロミセス属（Saccharomyces spp.）、セロチウム属（Scerotium spp.）、スクレロチニア属（Sclerotinia spp.）、トルロプソシス属（Torulopsosis spp.）、及びトリコフィトン（Trichophyton spp.）から選択される真菌を含む。多くの医学的に重要な真菌、例えば、カンジダ、アスペルギルス、クリプトコッカス、トリコスポロン、コクシジオイデス及びニューモシスチス、がバイオフィルムを生成することが知られている。幾つかの実施態様において、該バイオフィルムは、微細藻類、例えばプロトセカ属（Prototheca spp.）、を含む。
或る実施態様において、細菌感染症、又はバイオフィルムに関連付けられた障害は、グラム陰性菌によって引き起こされる。或る実施形態において、細菌感染症又はバイオフィルムに関連付けられた障害は、多剤耐性菌によって引き起こされる。或る実施態様において、細菌感染は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA：methicillin-resistant Staphylococcus aureus）関連感染又は表皮ブドウ球菌（例えば、MRSE）関連感染である。
好ましい実施態様において、該バイオフィルム原因細菌は大腸菌であり、好ましくは、該バイオフィルム感染症は、再発性尿路感染症、カテーテル関連尿路感染症又は胆道感染症である。
好ましい実施態様において、該バイオフィルム原因細菌は緑膿菌であり、好ましくは、該バイオフィルム感染症は、嚢胞性線維症肺感染症、慢性創傷感染症、カテーテルに関連付けられた尿路感染症、慢性鼻副鼻腔炎、慢性中耳炎、気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患又はコンタクトレンズ関連角膜炎である。
好ましい実施態様において、該バイオフィルム原因細菌は黄色ブドウ球菌であり、好ましくは、該バイオフィルム感染症は、慢性骨髄炎、慢性鼻副鼻腔炎、心内膜炎、慢性中耳炎、又は（整形外科用）インプラントである。
好ましい実施態様において、該バイオフィルム原因細菌は表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）であり、好ましくは、該バイオフィルム感染症は、中心静脈カテーテル、整形外科用インプラント、又は慢性骨髄炎である。
好ましい実施態様において、該バイオフィルム原因細菌は肺炎連鎖球菌であり、好ましくは、該バイオフィルム感染症は、鼻咽頭の感染、慢性鼻副鼻腔炎、慢性中耳炎、又は慢性閉塞性肺疾病における感染である。
好ましい実施態様において、該バイオフィルム原因細菌は化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）であり、好ましくは、該バイオフィルム感染症は、口腔及び鼻咽頭の感染症、再発性扁桃炎である。
バイオフィルム感染症の臨床徴候は、医療従事者によって知られている （例えば、Wu et al．Int J Oral Sci．2015 Mar；7（1）：1～7の表1を参照）。そのようなバイオフィルム障害は、慢性感染症を引き起こしうる。急性感染症及び慢性感染症の決定がまた、医療従事者に知られている。例えば、Mayo Clinicに従うと、酵母菌感染症の発生が1年に4回以上の場合は、慢性的な酵母菌感染症の存在を示し、一方、6か月間に2回以上の膀胱感染症の発生は、慢性膀胱感染症（再発性尿路感染症としてまた云われる）の存在を示す。
細菌の病理学的感染症を処置する為の最も一般的な方法は、抗生物質の使用である。現在の抗生物質は、主に成長に依存するメカニズムを介して機能し、迅速に分裂する細菌を標的とする。しかしながら、非複製の細菌又は成長の遅い細菌（例えば、休眠持続細胞、バイオフィルム）は、高レベルの抗生物質耐性（resistance）及び／又寛容性（tolerance）を示し、持続的且つ反復的な感染に寄与する。本明細書において開示されている化合物は、抗生物質耐性細菌、抗生物質寛容性細菌、及び抗生物質持続性細菌を含む感染症又はバイオフィルムにおける使用の為に適している。本明細書に開示される化合物はまた、二次治療として、又はむしろ、以前の処置（例えば、抗菌処置）に反応しなかった個人、又は障害が、例えば1年若しくは6ヶ月以内に再発した個人の為に適している。
本開示は更に、バイオフィルムによって誘発される又はバイオフィルムに関連する何らかの障害を処置する為の、本明細書において開示されている化合物及びそれを含む組成物を提供する。バイオフィルムによって誘発される又はバイオフィルムに関連する障害は、当業者に周知である。特に、そのような障害はバイオフィルム関連感染症である。処置に適した障害は、例えば、細菌性前立腺炎、細菌性膣炎、胆道感染症、慢性副鼻腔炎、慢性肺疾患、虫歯、心内膜炎、腎臓結石、喉頭炎、嚢胞性線維症における肺感染症、歯肉炎、乳腺炎、中耳感染症、院内（血流）感染症、閉塞性肺疾患、骨髄炎、中耳炎、歯周炎、肺炎前立腺炎、副鼻腔炎（rhinosinusitis）、副鼻腔炎（sinusitis）、扁桃炎、結核、尿路感染症、及び創傷感染症を包含する。例えば、マイコプラズマ・ボビス（Mycoplasma Bovis）は動物の乳房感染症及び関節感染症を引き起こすことが知られている。バイオフィルム関連障害は、留置装置（例えば、医療用インプラント、カテーテル等）上に形成されたバイオフィルムによって引き起こされる障害を包含する。一般的に、そのような障害は、インプラントを除去／交換することによって処置される。好ましい実施形態において、該障害は乳腺炎である。幾つかの実施態様において、該障害は乳腺炎ではない。幾つかの実施態様において、該処置は炎症性腸疾患に対するものではなく、特に大腸炎でない。
本明細書において開示されている化合物及び組成物はまた、移植医療装置、例えば本明細書においてさらに開示されている人工関節及び心臓弁、の感染を処置及び予防する為に有用である。
本発明の化合物は、ウシの乳房において効果を有することが示されている。これは、該化合物が血乳関門を通過できることを示す。該血乳関門は、乳房上皮細胞の間の透過性の低いタイトジャンクションによって形成されて、乳汁の漏出を防ぐ。血流と乳との間のタイトな障壁を通過することは、化合物が血液脳関門をまた通過し、そして、脳の感染症を処置し、そして、腸上皮を通過して、バイオフィルム関連障害の全身的な処置を可能にすることを示す。実施例からのデータはまた、化合物を治療の為に適したものにする薬物動態特性を包含する、イン・ビボ（in vivo）での安全性及び有効性をまた示す。
本開示は更に、細菌感染又はバイオフィルムに応答した炎症を防止又は減少する為の、本明細書において開示されている化合物及びそれを含む組成物を提供する。炎症は、有害な刺激、例えば病原体、に対する身体組織の複雑な生物学的反応の一部であり、並びに、免疫細胞及び分子メディエーターが関与する防御反応である。炎症の機能は、病原体を排除することである。
好ましい実施態様において、本明細書において開示されている化合物又はそれを含む組成物を用いた個体の処置は、動物、好ましくはウシ、における臨床的炎症を予防又は軽減する。好ましくは、該処置は乳房の（臨床的）炎症を予防又は軽減する。別の実施形態では、該化合物及びそれを含む組成物を用いた個体の処置は、ヒトにおける（臨床的）炎症を予防又は軽減する。例えば、該処置は皮膚の炎症を予防又は軽減し、好ましくは湿疹を予防する。
理論に縛られることは望まないが、本明細書において開示されている化合物又はそれを含む組成物を用いた個体の処置は、バイオフィルムの形成又は成長を減少させ、及び／又はバイオフィルムの分解又は減少を引き起こす。それ故に、該個体は病原体の存在下で炎症反応にもはや反応しない。言い換えれば、バイオフィルムとこれらのバイオフィルム内の病原体のクリアランスは、炎症反応を減らし、そして、臨床的炎症を防ぐ。
バイオフィルムの処置中に、微生物（例えば、細菌及び真菌）がバイオフィルムから放出される。或る場合には、個人の免疫系が活性微生物に反応する。これは、組織の炎症を結果として生じうる。活性化された免疫細胞及び炎症反応はまた、組織、例えば乳腺、に損傷を与える可能性がある。それ故に、炎症反応の抑制は、該組織への損傷を防止又は減少しうる。例えば、乳腺の損傷が少なくなり、そして、ウシの乳生産がより早く回復するだろう。
その上、組織が損傷を受け、そして炎症が治まってきた後に、体は修復を開始する。まだ存在するマクロファージは、新しい血管の生成を刺激する。該マクロファージはまた、線維芽細胞の誘引を確実にする。これらの線維芽細胞は最終的に、肉芽組織の形成を引き起こす。例えば、乳牛の処置の場合、瘢痕組織が乳産生組織の代わりに形成されうる。それ故に、ウシの乳量は炎症前よりも低下しうる。
本明細書において記載されている化合物に加えて、更なる抗炎症薬が投与されて、炎症反応を抑制し、そして、組織損傷、例えば乳腺における組織損傷、を軽減することができる。好ましい実施態様において、本明細書において開示されている処置（治療及び予防の両方）は更に、抗炎症剤の投与を含む。抗炎症剤は例えば、非ステロイド系抗炎症剤（cox／lox阻害剤）、例えば、イブプロフェン、パラセタモール、アスピリン、ジクロフェナク、ケトプロフェン、トルメチン、エトドラク及びフェノプロフェン、を包含する。天然抗炎症剤、例えば、クルクミン、ジンジャー、スピルリナ、カイエン、シナモン、クローブ、セージ、ローズマリー、ブラックペッパー、天然アスピリン、ボスウェリア（Boswelia）、サングイナリア（Sanguinaria）、及び／又は緑茶、がまた使用されうる。幾つかの実施態様において、本明細書において開示されている方法及び使用は、本明細書において開示されている治療用チオ硫黄化合物と、抗炎症剤との併用治療を含む。該化合物は、一緒に又は別々に投与されうる。幾つかの実施態様において、抗炎症剤と共に、本明細書において開示されている治療用チオ硫黄化合物を含む組成物が提供される。
幾つかの実施態様において、該方法は、好ましくは、バイオフィルムの形成若しくは成長を防止若しくは低減する為に、バイオフィルムを分解若しくは低減する為に、及び／又は細菌感染症若しくは真菌感染症を処置若しくは防止する為に、本明細書において開示されている化合物を含む組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む。幾つかの実施態様において、該組成物は、疾病又は障害又は感染症の処置（例えば、治療剤）又は予防（例えば、予防剤）の為に個体に投与されることができる。幾つかの実施態様において、該個体は、バイオフィルム関連感染症を有するか、又は発症するリスクがある。
該組成物は、何らかの個体、特に動物、に投与されることができる。好ましくは、該動物は反芻動物（例えば、ウシ及びヤギ）、より好ましくはウシ、である。幾つかの実施態様において、該動物はウシでない。好ましくは、該動物は、非反芻動物、例えば、単胃動物、げっ歯類、非ヒト霊長類、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、又はトリ、である。幾つかの実施態様において、該動物はヒトである。幾つかの実施態様において、該動物は非ヒト動物である。幾つかの実施態様において、該動物は、水生動物、例えば、魚、軟体動物、及び甲殻類、でない。好ましくは、該動物は、哺乳類又は鳥類である。
理論に縛られることは望まないが、本開示は、本明細書において開示されている組成物が単回投与後に有利な効果を有することができることを提供する。好ましい実施態様において、効果は、本明細書において開示されている組成物の単回経口投与を提供することによって達成される。そのような経口投与は、例えば、本明細書において開示されている化合物の持続された放出を提供する錠剤としてでありうる。
本開示はまた、複数回の投与を提供する。例えば、該組成物は、1日当たり1回超、毎日、毎週、又は毎月提供されうる。例示的な実施態様において、該組成物は、１週間、又は症状が緩和されるまで、1日1回提供されうる。
本明細書において記載されている医薬製剤の実際の投与量レベルは、患者に毒性を与えること無しに、特定の患者、組成物及び投与様式に対して所望の治療反応を達成する為に有効である活性成分の量を得る為に変動しうる。選択される用量レベルは、様々な要因、例えば、特定の化合物の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度、処置期間、他の薬剤、は組み合わせて使用される化合物及び／又は物質、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康状態及び以前の病歴、並びに医療分野において周知である同様の要因を包含する上記様々な要因、に依存する。当分野の通常の技術を有する医者又は獣医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定し、且つ処方することができる。
幾つかの実施態様において、反芻動物、特に牛、は、少なくとも1グラム、好ましくは少なくとも2グラム、より好ましくは少なくとも5グラム、の本明細書において開示されている化合物が提供される。幾つかの実施態様において、反芻動物、特に牛、は、少なくとも3ｇのPTSOが提供される。反芻動物の為の化合物を含む組成物は好ましくは、経口錠剤として提供される。
より少量の化合物がより小さな反芻動物、例えばヤギ、に投与されることができることが当業者に明らかである。本実施例は、3.84gのPTSOと0.96gのPTSとを含む錠剤のウシへの投与を記載する。ウシの平均体重は約650kgである為、これは約5.9mg/kgのPTSO及び1.5mg/kgのPTSの投与量に相当する。当業者は、動物が小さいほど代謝率が高く、従って、動物が小さいほど体重ベースでより多くの薬剤用量を必要とすることを承知している。動物の間、並びにヒトと動物との間の用量換算は、Nair及びJacob（J Basic Clin Pharm．March 2016-May 2016；7（2）：27～31）並びにHolliday等（1967 The Relation of Metabolic Rate to Body Weight and Organ Size．A Review．Pediat．Res．1：185～195）において総説されている。
本明細書において開示されている方法及び使用の幾つかの実施態様において、本明細書において開示されている化合物の少なくとも5mg／日が（例えば、経口投与によって）ヒトに提供される。好ましくは、少なくとも10mg／日の化合物が提供される。幾つかの実施態様において、PTSOは、0.1mg/kg～100mg/kgの用量でヒトに提供される。そのような量の化合物は、化合物を全身的に（例えば、経口的に）提供する場合に特に有用である。当業者は、局所的に（例えば、皮膚、歯肉、創傷において）投与される場合に、より少ない量が使用されることができることを認識するであろう。本明細書において開示されている組成物は好ましくは、少なくとも1週間、又は症状が緩和されるまで提供される。そのような組成物は数回（例えば、週に1回、月に1回、年に2回等）提供されうるが、予防効果及び治療効果は、1回の使用後に観察される。
幾つかの実施態様において、本明細書において開示されている化合物を、1以上の追加の剤、例えば、抗生物質（例えば、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤）、抗炎症剤、解熱剤、及び鎮痛剤、とともに含む組成物が提供される。
幾つかの実施態様において、本明細書において開示されている化合物は、抗菌剤、例えば抗真菌剤又は抗生物質、と共に使用される。理論に縛られることは望まないが、本開示は、本明細書において開示されている化合物がバイオフィルムを標的とすることを提供する。その後、該抗菌剤は、残りの浮遊細胞並びに破壊されたバイオフィルム内の微生物細胞において効果を発揮する。当業者が理解するであろう通り、抗菌剤と本明細書において記載されている化合物との組み合わせは、該抗菌剤の投薬量及び／又は投薬頻度を低減することができる。
該併用治療において使用されうる例示的な抗菌剤は、抗真菌剤、例えば、ミコナゾール、ケトコナゾール、エコナゾール、テルビナフィン、シクロピロックス、トルナフテート、セルタコナゾール、スルコナゾール、アンホテリシンb、クロロキシレノール、クリオキノール、ブテナフィン、ナフチフィン、ナイスタチン、及びクロトリマゾール、を包含する。例示的な抗生物質は、ペニシリン系薬剤、テトラサイクリン系薬剤、セファロスポリン系薬剤、キノロン系薬剤、リンコマイシン系薬剤、マクロライド系薬剤、スルホンアミド系薬剤、グリコペプチド系薬剤、アミノグリコシド系薬剤、及びカルバペネム系薬剤を包含する。
本開示は、抗菌剤と共に、本明細書において開示されている化合物（特に、式Iの化合物）を含む組成物を提供する。当業者が理解するであろう通り、該化合物及び抗菌剤はまた、別々に提供されうる。幾つかの実施態様において、該化合物と抗菌療法が重複する。幾つかの実施態様において、本発明の化合物を用いた治療は、抗菌治療に先行する。
幾つかの実施態様において、本明細書において開示されている組成物は、食品若しくは機能性食品として提供されており又は食品若しくは機能性食品の中に提供される。本明細書において使用されている語「機能性食品」は、栄養特性だけでなく、特定の機能、例えば、健康の改善及び疾病にかかるリスクの軽減、を満たすように調製された食品を云う。そのような機能性食品はまた、栄養補助食品又は（動物）食品添加物として云われうる。この目的の為に、生物学的に活性な化合物、例えば、ミネラル、ビタミン、脂肪酸、有益な効果を有する細菌、食物繊維及び抗酸化剤、がそれらに添加される。そのような食品は、例えば、液体、ゲル、粉末、丸剤、錠剤の形態で、又はゲルカプセルの形態で、経口摂取の為に適した任意の形態でありうる。
該機能性食品はまた、アニマルダイジェスト（animal digest）、例えば、きれいで且つ分解されていない動物組織の化学的及び／又は酵素的加水分解から結果として生じる任意の材料、を含みうる。該機能性食品はまた、乾燥したビール酵母、例えば、醸造産業の副産物である乾燥した不活性な剤剤、を含みうる。アニマルダイジェスト及び乾燥したビール酵母は、該機能性食品の嗜好性を高めることがわかっている。該機能性食品中に存在する場合、アニマルダイジェストは該機能性食品の約10％～約90％を含み、及び乾燥ビール酵母は該機能性食品の約1％～約30％を含む。
例示的な実施態様において、本開示は、ペクチン、ユッカ、ビタミンＥ、炭酸カルシウム、プロバイオティクス、植物抽出物、ハーブ、及びオレガノを含む組成物を提供する。好ましくは、該組成物は、約1～約5グラムの治療用チオ硫黄化合物を含む。該組成物は、錠剤として、特にウシの処置の為に、適している。本実施例に記載されているとおり、該組成物は、乳中の細胞数を減少させる為に及び乳腺炎を処置する為に適している。
幾つかの実施態様において、本開示は、本明細書において開示されている治療用チオ硫黄化合物を、少なくとも１つの医薬的に許容される担体、希釈剤及び／又は添加剤と共に含む組成物を提供する（例えば、Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Alfonso R．Gennaro （Editor） Mack Publishing Company，April 1997を参照）。本明細書において使用される場合に、語「医薬的に許容される」は、それらの組成物、又は薬剤、材料若しくは組成物の組み合わせ、及び／又はそれらの剤形を云い、それらは、適切な医学的判断の範囲内であり、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又はその他の問題若しくは合併症無しに、妥当な利益／リスク比に見合った、ヒト及び動物の組織との接触における使用の為に適している。その上、語「医薬的に許容される希釈剤又は担体」は、薬学的に許容される材料、例えば、液体若しくは固体の充填剤、希釈剤、添加剤、溶媒、又はカプセル化材料、例えば、ある臓器又は身体の一部から別の臓器又は身体の一部へのペプチドの運搬又は輸送に関与する上記カプセル化材料、を云う。
医薬組成物は、任意の適切な経路及び様式によって投与されうる。当業者によって理解されるであろう通り、投与の経路及び／又は様式は、所望の結果に応じて変化するであろう。該医薬組成物は、任意の経路、例えば、非経口、局所（眼を包含する）、経口、舌下、経皮、による投与、又は吸入による投与、の為の通常の手順に従って製剤化されうる。非経口投与は、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、冠動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下（subcutaneous）、表皮下（subcapsular）、関節内、嚢下（subcapsular）、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射及び注入を包含する。好ましい経路は、経口又は局所投与である。
該組成物は、任意の適切な形態、例えば、液体、半固体及び固体の剤形、でありうる。該組成物は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、ロゼンジ（lozenge）、クリーム、若しくは液体製剤（特に、皮膚又は眼への投与の為の液体製剤）、例えば、無菌非経口溶液又は懸濁液、の形態、又はスプレー、エアロゾル若しくは他の慣用的な吸入方法の形態でありうる。本発明の医薬組成物は、経口、経鼻、局所（頬及び舌下を包含する局所）、直腸、膣及び／又は非経口投与に適したものを包含する。特定の実施態様において、該組成物は、クリーム、ゲル、軟膏、ローション、泡、懸濁物、スプレー、エアロゾル、又は粉末エアロゾルの形態における局所用組成物である。該組成物は、皮膚への投与の為に特に有用である。好適な組成物はまた、口腔ケア組成物、例えば、練り歯磨き、歯磨剤、歯磨き粉、歯磨きジェル、歯肉縁下ジェル、マウスリンス／マウスウォッシュ、人工唾液、義歯製品、マウススプレー、ロゼンジ、経口錠剤、及びチューインガム、を包含する。
本開示はまた、表面におけるバイオフィルムの形成若しくは成長を防止若しくは減少する為の、及び／又は表面におけるバイオフィルムを分解又は低減する為の、本明細書において開示されている組成物のイン・ビトロ（in vitro）での使用を提供する。好ましくは、該方法は、表面におけるバイオフィルム又はバイオフィルム形成を減少させる為のものである。幾つかの実施態様において、該方法は、表面に付着したバイオフィルムを、本明細書において開示されている組成物と接触させることを含む。該組成物は、例えば、洗浄組成物又は殺菌組成物を包含する。
任意の表面が、そのような表面をコーティングする為に、本明細書において開示されている組成物で処置されうる。該表面は例えば、該組成物に噴霧され、浸され（dipped）、又は浸漬される（soaked）ことができる。表面は、ガラス、金属、多孔質及び非多孔質の表面を包含する。該表面はまた、汚染される可能性のある機器の外部及び内部並びに表面、例えば、食品産業、又は病院及び医療施設において見られる医療機器、並びに配管システム（例えば、シンクの排水管）、カウンタートップ、建材、配管、クリーンルームにおいて見られる表面に関係する。表面はまた、パイプの内部若しくは外部、例えば排水管、並びにスイミングプール、タンク（例えば、養殖用）、浄化フィルター、便器、シンク、温室内の表面、を云う。表面はまた、水、例えば水飲み場からの水、を包含する。
幾つかの実施態様において、該表面が、医療用器具、例えば、補綴物（股関節インプラント、歯科インプラント、人工関節、音声補綴物、陰茎補綴物）、機械的心臓弁、心臓ペースメーカー、動静脈シャント、強膜バックル、カテーテル（例えば、中心静脈カテーテル、血管内カテーテル、尿道カテーテル、ヒックマン（Hickman）カテーテル、腹膜透析カテーテル、気管内カテーテル）、鼓膜切開チューブ、気管切開チューブ、外科用縫合糸、骨アンカー、骨ねじ、眼内レンズ、コンタクトレンズ、子宮内器具、大動脈大腿移植片、又は血管移植片、のものである。医療用器具からの他の感染は、腹部ドレーン、胆道ステント、乳房インプラント、心臓ペースメーカー、脳脊髄液シャント、コンタクトレンズ、除細動器、義歯、電気透析装置、気管内チューブ、尿道留置カテーテル、子宮内器具、静脈内カテーテル、人工関節、人工心臓弁、腎瘻チューブ、整形外科用インプラント、腹膜透析カテーテル、人工心臓弁、人工関節同種整形外科用器具（prosthetic joints allosplastic orthopedic devices）、組織充填材、尿道ステント、血管プロテーゼ、人工呼吸器関連肺炎、心室補助デバイス、心室派生、心室シャント、人工喉頭（voice prostheses）からのものを包含する。
幾つかの実施態様において、該表面は、外科用器具、例えば、クランプ、鉗子、はさみ、皮膚鉤、チューブ、針、開創器（retractor）、スケーラー、ドリル、ノミ、ヤスリ、又はのこぎり、である。
本明細書において使用される場合に、「含む」及びその活用形は、その非限定的な意味において使用され、該語に続く項目が含まれることを意味するが、具体的に言及されていない項目は除外されない。加えて、動詞「からなる」は、本明細書において定義されている化合物又は補助化合物が、具体的に特定されている化合物以外の追加の1以上の成分を含むことができることを意味する「から本質的になる」に置き換えられてもよく、ここで、該追加の1以上の成分は、本発明の独特な特徴と変更しない。
冠詞「1つ」（a）及び「1つ」（an）は、該冠詞の文法的目的語の1つ又は2以上（すなわち、少なくとも1つ）を云う為に本明細書において使用されている。例として、「1つの要素」は、1つの要素又は2以上の要素を意味する。
語「ほぼ」又は「約」は、数値に関連して使用される場合に（ほぼ10、約10）、好ましくは、該値が、該値の1％前後の10の所与の値でありうることを意味する。
本明細書において開示されている化合物及び組成物は、療法として及び治療処置において有用であり、従って、医薬品として有用であり得、及び医薬品を調製する方法において使用されうる。幾つかの実施態様において、本開示は、ヒト又は動物の体の処置でない方法、及び／又はヒトの生殖系列の遺伝的同一性を改変する為の方法を含まない方法を提供し、ここで、該細胞はヒト生殖細胞株でない。
本明細書において引用されている全ての特許及び参考文献が、参照によってそれらの全体が本明細書中に取り込まれている。
本発明は、以下の実施例において更に説明されている。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものでなく、単に本発明を明確にする為に役立つ。
実施例
Alliumから分離された幾つかの化合物が、抗生物質の為の代替品を開発することを目的として、細菌におけるそれら化合物の影響を判断する為にイン・ビトロ（in vitro）で研究されている。例えば、Sorlozano-Puerto等（Biomed Research International 2018 Article ID 7861207）は、MIC50及びMIC90の値、並びにMBC50及びMBC90の値（後者は直接的な殺菌効果を実証する為に使用される）を抗菌力の尺度として決定する為に、推奨基準方法（CLSI）を使用して、多数のヒト病原体（479人の異なる患者から得られた臨床サンプルから分離された212個のグラム陰性桿菌及び267個のグラム陽性球菌）に対するPTS及びPTSOの抗菌活性を記載する。PTSO及びPTSについてのデータは、そのような病原体に対する臨床診療において使用される様々な抗生物質と比較された。結果が、抗生物質のより低いMIC値によって示されている通り、全ての細菌株について、試験パネルからの幾つかの抗生物質がPTSO又はPTSよりも効果的であったことを示す。これらのイン・ビトロ（in vitro）の発見に基づいて、当業者は、PTSO又はPTSを、細菌感染症の処置における一般的な抗生物質の有用な代替物として考慮しないであろう。
Sorlozano-Puerto等において記載されているイン・ビトロ（in vitro）アッセイが、浮遊性微生物の増殖阻害を測定する。当業者によって理解されるであろう通り、浮遊性微生物に対する化合物の効果が、バイオフィルムに対するそのような化合物の効果を示すものでない。これは、以前に議論されている通り、多くの抗菌剤について実証されており、且つ文献においてまた十分に知られている。例えば、バイオフィルム内の細菌が慣用的な抗生物質に対する耐性を約1000倍増加させたことを示すRoy等を参照（2018 Virulence 9：522～554）。
浮遊性微生物に関する研究とは対照的に、本実験はバイオフィルムにおけるPTSO及びPTSの効果を初めて実証する。そのようなアッセイにおいて、培地及び培養条件（プレートを絶え間なく攪拌して、血流において起こることに匹敵するせん断力による応力を誘発する）が微生物、例えば細菌、を刺激して、バイオフィルムを迅速に形成する。そのようなバイオフィルムアッセイは、下記の2つの方法、すなわち、バイオフィルム形成を防止する可能性を評価する為に、実験の最初から試験化合物（例えば、PTSO）を追加することによって、又は試験化合物を、成熟したバイオフィルムに添加して、該バイオフィルムの溶解効果を評価する（例えば、既存のバイオフィルムがPTSOで処置されたところの実施例2に対応する）ことによって、実施されることができる。
バイオフィルムアッセイにおける化合物の主な作用機序は、クオラム・センシング（quorum sensing）のその阻害とそれに続く集団遺伝子スイッチにより細菌の接着と合成とを結果として生じること、又は細胞外マトリックスのアセンブリにより、バイオフィルムの3次元構造を形成することのいずれかに関連する。これらのメカニズムは、純粋な抗菌（antibacterial）／抗微生物（antimicrobial）の「殺傷」（killing）効果とは全く異なる。化合物がバイオフィルムアッセイで効果的に試験されたが、抗菌効果がない場合（例えば、バイオフィルム構造を不安定化する為に特定のバイオフィルムタンパク質に対して開発された或る抗体）、次に、該化合物は抗生物質と組み合わされて、バイオフィルムから放出された細菌が殺されることを確実にする。これは、動物の免疫システムが損なわれている場合に特に当てはまる。物質、例えばPTSO、が何らかの抗菌効果がある場合（他のメカニズムによるものではあるが）、これは臨床治療において望ましい追加的な効果と見なされ、自然免疫系による細菌集団の根絶をサポートする。
下記の実施例2～4は、イン・ビトロ（in vitro）バイオフィルムアッセイを用いた本発明の化合物の効果を記載する。そのようなアッセイは、Sorlozano-Puerto等に記載されているようなアッセイとは全く異なり、それは、浮遊性微生物の増殖阻害を測定する。本実施例は驚くべきことに、本発明の化合物がバイオフィルム根絶において効果を有することを示す。
実施例1 PTSO及びPTSの単離
範囲：PTSO及びPTSは、56％のPTSO及び14％のPTSを含む植物抽出物（本明細書において、「PTSO/PTS豊富な植物抽出物」と云う）から単離された。
研究設計：化合物の極性に従って、該化合物の溶出の順序がHPLCから推定され、そして、分離条件が、ヘプタンと酢酸エチルとを移動相として使用するTLCにおいて展開される。長さ110cm及び直径25cmを有するフラッシュカラムが、ヘプタン中の15kgのシリカ（ACROS Organics（商標）の粒子サイズ40～60μm）で充填され、そして該カラムが一晩安定化された。精製が、極性を0％～40％まで徐々に上げることによって行われた。関心のある画分であるPTS（＝ピーク6）及びPTSO（＝ピーク7）はいずれも1H-nmrによって識別され、移動相を20リットル使用した後に溶出が開始され、そして、2リットルの画分サイズで集められた。画分が各化合物のTLC同定に従って分離され、そして、各化合物（PTS及びPTSO）の対応する画分が一緒にされた。溶媒がロータリーエバポレーターによって蒸発されて、表1に概要が示されている通り、PTSの精製された画分（32435-2-A）及びPTSOの2つの精製された画分（MHA32435-2-B、MHA32435-2-C）を得た。
必要とされる98％超の純度が、画分MHA32435-2-B（＝PTSO）でのみ達成され、一方、画分MHA32435-2-A（PTS）及びMHA32435-2-C（＝PTSOの2番目の画分）は98％未満の純度を示し、所望の純度を得る為には2回目のフラッシュクロマトグラフィーによる個別の更なる精製が必要であった。
PTS（MHA32435-2-A）の再精製が、フラッシュカラム（長さ50cm及び直径20cm）に2kgのシリカ（ACROS Organics（商標）の粒子サイズ40～60μm）を充填し、酢酸エチルとヘプタンとを移動相として使用することによって、そして、極性を0％～20％まで上げることによって行われた。関心のある画分が250mlの画分サイズで集められ、TLCによって同定されて一緒にされた。溶媒がロータリーエバポレーターによって蒸発されて、98％超の純度を有するPTS（EWR32514-01-1）を得た。
PTSO（MHA32435-2-B）の不純画分の再精製が、3kgのシリカ（カラムを充填するため）を用い、極性を0％～30％まであげ、画分サイズが100mlであったことの違い以外は、MHA32435-2-Aと同じ移動相を使用して、同じフラッシュカラムで行われた。再精製により、表1に概要が示されている通り、98％超の純度を有するPTSOの2つの画分（EWR32514-02-1及びEWR32514-02-02）を結果として生じた。
Figure 2023518928000023
この実施例から、PTSO及びPTSが高純度まで精製されたことが実証されている。99％超の純度を有する試料が、本明細書において実施例に示されているように使用され、「純粋なPTSO」及び「純粋なPTS」と云う。
実施例2．PBR（Photo Bio-Reactor：フォトバイオリアクター）中のバイオフィルム
PTSO、PTS及びDPD（二硫化ジプロピル）の抗バイオフィルム効果を決定する為に、バイオフィルムが、ガラス管反応器、PBR中、制御された条件下で成長された。バイオフィルムの形成が該ガラス管中ではっきりと見えたので、フォトバイオリアクターがモデルシステムとして使用された。成熟したバイオフィルムが形成された後、純粋なPTSO、PTS又はDPDの増やされた量が添加され、そして、純粋なPTSO、PTS又はDPDの滴定によってバイオフィルムを除去し、そして、バイオフィルムが根絶された用量が決定された。その後、ディープシーケンシング（deep sequencing）によってバイオフィルムの微生物組成が決定された。
研究設計
従属栄養性微生物バイオフィルム：バイオフィルムが、曲がりを含めて37メートルのチューブ長さを有する26.5リットルのガラスフォトバイオリアクター（PBR）（LGEMのGemTube RD-25 Glass）中で培養された。PBRが、22リットルの滅菌されていない培地で満たされた（表1）。
Figure 2023518928000024
該培地は更に、1g／lのグルコースを含んでいた。接種が、デルフゴー（Delfgauw）近くのツイドポルダー（Zuidpolder）からの溝の水500mlを加えることによって行われた。空気が1.0リットル／分の速度で、ポンプで送り込まれた。この設定では、該培地内のPBRを通じる培地循環は可能な限り低くなったが、PBR内の培地循環を実現する為の安定したホールドアップがあった。該PBRは、光への露出を防ぐ為に暗いプラスチックスクリーンで覆われた。インキュベーションが、12～18℃で行われ、且つpHが1.5日に1回、週に5回、5.2～5.7に制御された。5g／lのグルコースの総投与量の後（1週間後）、該ガラス管の内面全体を覆うぬるぬるした層（バイオフィルム）が形成された。該バイオフィルムが形成された場合に、培地がグルコースを含まない新鮮な培地に交換された。
表に示されている通り、PTSO、PTS又はDPDがPBRに加えられた。純粋なPTSO及びPTSが、実施例1において示されているように得られ、そして、安定な溶液が、1000倍に希釈された混合物の超音波処理によって水中で調製された。DPD（二硫化ジプロピル 純度98％超）はSigmaによって供給された。各添加工程の後、該バイオフィルム培養物は24時間インキュベーションされて、該バイオフィルムの安定性を観察した。
バイオフィルム及び上清中の好気性、嫌気性／微好気性及び真菌のCFUの数が、下記の標準的な操作手順に従って決定された：1ml当たりの好気性コロニー形成単位（CFU/ml）については、https://www.iso.org/standard/53728.htmlを参照；嫌気性CFU／mlの測定については、https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AN0025A#/AN0025Aを参照（プレートは無酸素容器中で培養された）及び、真菌の為のコロニー形成単位の数に関しては、http://edgeanalytical.com/wp-content/uploads/Food_AOAC-997.02.pdfを参照（表2を参照）。
該バイオフィルムの微生物集団の組成は、メタゲノム分析（イルミナディープシーケンス（Illumina deep sequencing））を使用して決定された。
該バイオフィルムの別のサンプルが採取され、そして、一部は更なる研究の為に接種材料としてマイナス80℃で保存された。該バイオフィルムの他の部分は穏やかな超音波処理によって溶解され、そして、上記されたように、コロニー形成単位の好気性、嫌気性及び真菌の数を決定する為に使用された。その後、該培地中のコロニー形成微生物の数が、処置前の該バイオフィルム中の微生物の数と一致するかどうかが計算された。このようにして、該処置によって微生物が殺されたか、又は細菌が生きたままで、該バイオフィルムだけが可溶化されたかが計算された。
PTSOによるバイオフィルムの根絶
顕微鏡分析は、真菌、原生動物及び細菌の混合物を示した。
メタゲノム分析は、該バイオフィルムが高度に混合された集団で構成されていることを実証した。少なくとも611個の異なる属の細菌が特定された。最も豊富な5つの属とそれらの相対的な量は下記の通りである：シュードモナス（Pseudomonas）46％、アシドボラックス（Acidovorax）13％、バークホルデリア（Burkholderia）4％、アクロモバクター（Achromobacter）4％、及びレリオティア（Lelliotia）3％。真菌の少なくとも5つの異なる属が同定された。最も豊富な5つの属とそれらの相対的な量は下記の通りである：クラドブトリューム（Cladobotryum）5％、エミリセロプシス（Emiricellopsis）31％、フシコラ（Fusicolla）17％、ムコール（Mucor）37％、及びロゼリア（Rozella）10％。
PTSOの添加は、該バイオフィルムの崩壊を結果として生じた。これは、0.05μl／lのPTSOの最初の投与後に、該バイオフィルムからのフロックの放出によって視覚化されることができ、一方、0.65μl／lの総投与量では、該バイオフィルムは有意に薄くなり、且つ最高投与量ではほぼ完全に分解されたように見える。
PTSOがバイオフィルムの不安定化効果を有しているのか、又は単に微生物を殺すのかを調べる為に、処置前に該バイオフィルムからサンプルが採取され、そして、処置の前後に液体培地のサンプルが採取されて、上記された通りに接種されて、コロニー形成単位の数が決定された。バイオフィルム1ml当たりのコロニー形成単位及び上清中のコロニー形成単位は、プレーティング技術によって推定され、そして、表3に報告されている。その後、該培地中のコロニー形成微生物の数が、処置前の該バイオフィルム中の微生物の数と一致するかどうかが計算された。このようにして、該処置によって微生物が殺されたか、又は細菌が生きたままで、該バイオフィルムのみが可溶化されるかが計算された（表6）。
Figure 2023518928000025
PTSOの最低用量でさえも、好気性、嫌気性／微好気性及び真菌のCFUが増加する。これは、低用量でさえも、PTSOがバイオフィルム層を分解することを始め、その後細菌を放出することを示す。PTSOの最高濃度では、好気性、嫌気性／微好気性及び真菌のCFUが減少し、高用量ではPTSOが浮遊性微生物に影響を与えることを示す。
PTSによるバイオフィルムの根絶
バイオフィルムが、上記された通りに成長された。メタゲノム分析が、該バイオフィルムが高度に混合された集団で構成されていることを実証した。少なくとも362個の異なる属の細菌が同定された。最も豊富な5つの属とそれらの相対的な量は下記の通りである：シュードモナス（Pseudomonas）72％、ラウルテッラ（Raoultella）6％、フラボバクテリウム（Flavobacterium）3％、エンテロバクター（Enterobacter）1.5％、アシッドボラックス（Acidvorax）1％。
11.65μl／lの純粋なPTSの総投与量が添加された後、該バイオフィルムの視覚的な崩壊が検出可能であった。該バイオフィルムの可溶化により、培養中の、好気性細菌、嫌気性細菌及び真菌のいずれにおいてもCFUにおける増加を結果として生じた（表3）。
Figure 2023518928000026
PTSの最初の投与前に、該バイオフィルムからの或るPTS投与量に依存しない微生物放出が既にあったが、該バイオフィルムは目に見えて安定していた。ポイント0での最初の測定は、アーティファクトである可能性がある。PTSOと同様に、PTSはバイオフィルムの劣化を示す上清中の生きている微生物における増加を生じる。高用量ではCFUが減少し、高用量ではPTSが浮遊性微生物に影響を与えることを示す。
DPDによるバイオフィルムの根絶
バイオフィルムが、上記された通りに成長された。顕微鏡分析が、該バイオフィルムが真菌と細菌との両方で構成されていることを示した。有意差が該バイオフィルムの微生物集団に関して予想されなかった為、微生物集団分析は実行されなかった。
DPDが、表5に示されている通り培養液に添加された。最初の7回の投与の間、DPDの追加投与量に応じて視覚的に成長も縮小もしないバイオフィルムがリアクター中に存在していた。投与8の後、167μlの純粋なDPD／リットル培養物（＝160mgの純粋なDPD／リットル）の総添加後、バイオフィルムがガラスから放出し始め、そして、培地中に溶解した。このプロセスは、317μlの純粋なDPD／リットルの純粋な培養物の総投与量まで続けられた。より高い投与量では、以前は厚いバイオフィルムがあったところのガラス上にバイオフィルムスポットのみが残った。DPDの更なる添加により、残りの薄いバイオフィルムが除去されなかった。
Figure 2023518928000027
表5に基づくと、DPD（下記の式IIIを有する例示的な化合物）は、総用量が約167μl／lの後にバイオフィルムに影響を及ぼし始めるように見える。高濃度では、好気性、嫌気性／微好気性及び真菌のCFUが減少し、高用量では、DPDが浮遊性微生物に影響を与えることを示す。
Figure 2023518928000028
表6からのデータから、バイオフィルムにおいて検出される微生物数の変動が大きいにもかかわらず、おそらく該バイオフィルムの高い不均一性によって、示された分子の該バイオフィルムの根絶効果が、微生物を死滅させた後に該バイオフィルムを可溶化することによって該バイオフィルムを可溶化するものでなく、しかし、そのように微生物の生理機能を変更することにより、該バイオフィルムのみが不安定化され且つ可溶化されたことが、驚くべきことに明らかになった。
実施例3．イン・ビトロ（in vitro）バイオフィルムアッセイ
研究設計：バイオフィルム形成が、グラム陽性の黄色ブドウ球菌（S．aureus）とグラム陰性の緑膿菌（P．aeruginosa）を用いて研究された。これらの標本は潜在的な病原体であり、2つのPTSO含有サンプルのバイオフィルム根絶効果が、イン・ビトロで調査された。
試験された組成物は、下記の組成を有する：
QS1：530mg／リットルのPTSO及び133mg／リットルのPTSを含む236mgのPTSO／PTS豊富な植物抽出物が、250mlの脱塩水と混合された。
QS2：135mgの純粋なPTSOが、実施例1に示されているようにして得られ、そして、一晩撹拌することによって250mlの脱イオン水中に希釈された。これは、水中の540mg／リットルのPTSOに相当する。
バイオフィルム形成は、グラム陽性の黄色ブドウ球菌ATCC 6538（S．aureus）及びグラム陰性の緑膿菌ATCC 9027（P．aeruginosa）を使用して研究された。実験方法が、ASTM-E2799-17から採用された（Standard test method for testing disinfectant efficacy against Pseudomonas aeruginosa biofilm using the MBEC assay ASTM International，West Conshohocken，PA，2017）。この方法において、P．aeruginosaが使用され、そして、本実施例において、S．aureusに対する効果を試験する為に同じ試験がまた適用された。MBEC（Minimum Biofilm Eradication Concentration：最小バイオフィルム根絶濃度）アッセイが、様々な微生物のバイオフィルムに対する薬剤の有効性を判断する為のハイスループットスクリーニングツールである。下記の2つの方法が、96ウェルプレート中で成長したバイオフィルムに対するQS1及びQS2の効果を試験する為に使用された。図1Aはマイクロタイタープレート中でバイオフィルムを測定する為に使用される方法を示し、及び図1Bはペグ上のバイオフィルム形成を測定する為の方法を示す。
簡単に説明すると、P．aeruginosaとS．aureusの一晩培養物が、0.1（OD600）に希釈された。その後、細菌懸濁物が、最少培地中又は豊富培地中の96ウェルプレートに、1対9の比で、ピペットで入れられた。最小培地は、以下の組成を有する：カゼイン、0.5％；グルコース、2g/l；MgSO4、1mM；FeSO4*7H2O、0.5mg/L。pHがpH7.3に設定され、続いて滅菌された。該豊富培地は、以下の栄養素を含む：カゼインペプトン、17g/L；大豆ペプトン、3g/L；リン酸水素二カリウム、2.5g/L；塩化ナトリウム、5g/L；グルコース一水和物、2.5g/L。pHが7.3に設定され、続いて滅菌された。96ウェルプレートが37℃で24時間インキュベーションされ、そして、バイオフィルムが形成される。その後、該バイオフィルムは、図1に示されている通り、試験溶液に曝露される。
初期のバイオフィルム形成は0～24時間の期間に発生し、後期のバイオフィルムの形成は24～48時間の期間に発生する。懸濁物が廃棄され、ウェル／ペグが脱イオンH2Oで洗浄される。引き続き、クリスタルバイオレット（0.1％）が添加され、そして、15分間染色が行われる。その後、洗浄が、H2Oで脱塩して行われる。従って、該バイオフィルムが酢酸で脱色され、そして、実施例4で行われたようにマイクロタイタープレートに移された。吸光度はが、550nmで測定された。
結果及び議論：
MBECアッセイが、図2に示されている通り、QS1及びQS2のバイオフィルム（形成）に与える影響を判断する為に使用された。結果が、パーセンテージ成長（エフェクター100％なしの細菌に正規化された）として表示される；単語「ペグ」（peg）（図面）の追加は、ポリスチレンの円錐における成長を示す；「ペグ」無しの場合は、マイクロタイタープレートのウェル内での成長を示す。図2A（後期バイオフィルムの形成）に示されているように、QS1とQS2が両方の細菌標本の豊富な培地に添加される場合、成長阻害が該ウェル内で観察された。その上、QS1及びQS2の添加により、該ウェル内及び最小培地条件におけるペグ上でP．aeruginosa及びS．aureusの増殖阻害を結果として生じた（図2B）。
バイオフィルムアッセイ（ASTM-E2799に準拠）に基づいて、QS1及びQS2による明確なバイオフィルム阻害成長効果が、P．aeruginosa及びS．aureusで観察された。両方の細菌のバイオフィルムは、バイオフィルム形成の間に現在のアッセイにおいてQS1及びQS2によって強く影響された。
実施例4．イン・ビトロ（in vitro）でのバイオフィルムアッセイ
範囲：本明細書において記載されているように、浮遊性微生物に対する化合物の効果は、バイオフィルムに対するそのような化合物の効果を示すものでない。しかしながら、バイオフィルム感染を研究する為のイン・ビトロ（in vitro）モデルが開発されており、そのようなモデルからの結果は、イン・ビボ（in vivo）での効果をよりよく予測しうる。例えば、Bahamondez-Canas et al．Biomedicines．2019 Jun；7（2）：34は、傷のバイオフィルム感染を研究する為のイン・ビトロモデルの数を記載する。この例において、イン・ビトロ実験が、潜在的な病原性細菌である黄色ブドウ球菌とストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberus）の様々な菌株を使用して行われた。これは、ウシの乳腺炎に関与する微生物標本であり、ヒトにおける黄色ブドウ球菌に関してまた同様である。
研究設計：
本実施例において、下記の菌株が使用された：
黄色ブドウ球菌ATCC 25923は、ATCCコレクションから得られた；
黄色ブドウ球菌074は、オランダ国のユトレヒト大学（Utrecht University）獣医学部のFink教授から親切に提供され、それは、乳腺炎を有するウシからの臨床分離株として記載されている。菌株に関する情報は更に、以下で提供されている：Melchior，M．B.，Fink-Gremmels，J.，& Gaastra，W．（2006）．Comparative Assessment of the Antimicrobial Susceptibility of Staphylococcus aureus Isolates from Bovine Mastitis in Biofilm Versus Planktonic Culture．Journal of Veterinary Medicine Series B，53（7），326～332；
黄色ブドウ球菌ATCC 15564は、ATCCコレクションから得られ、及び
ストレプトコッカス・ウベリスは、乳腺炎を有するウシから臨床分離されたものであり、ブルガリア共和国のトラキア大学（Trakia University）、獣医微生物学、感染症及び寄生虫病学科のコレクションの一部である。
最小バイオフィルム阻害濃度（MBIC：Minimum Biofilm Inhibitory Concentration）及びマイクロタイターバイオフィルム根絶濃度（MBEC：Microtiter Biofilm Eradication concentration）が、下記の表7に示されている通りに定義され且つ測定される。
Figure 2023518928000029
表7においてまとめられた方法を適用して、上述された細菌が、実施例1に記載された、PTSO／PTS豊富な植物抽出物、純粋なPTSO及び純粋なPTS、並びに実施例2において記載されたDPDを用いて試験された。
結果を以下の表に示す。
Figure 2023518928000030
Figure 2023518928000031
最低のMBEC値は、PTSO／PTS豊富な植物抽出物の場合に観察され、PTSOのみ、及びPTSのみが続いた。データは対数希釈系列（log dilution series）で取得され、数値の違いは1つの希釈ステップのみを表す。これらをまとめると、イン・ビトロ実験は、本発明の化合物の抗バイオフィルム活性を実証し、それは、下記の実施例に記載されている臨床的所見によって裏付けられている。
実施例5-8：イン・ビボ（in vivo）でのバイオフィルム関連障害の処置
本明細書において開示されている化合物のイン・ビボ効果を実証する為に、PTSO及びPTSが、イン・ビボで多くのバイオフィルム関連障害について試験された。
牛の乳腺炎は、世界中で毎年何百万頭もの牛が罹患している疾病である。この疾病は、様々な非常に異なる細菌によって引き起こされ、ある場合には、授乳中のウシの乳腺に侵入する酵母が、持続感染症及び炎症反応を引き起こす。牛の乳腺炎は、様々なグラム陽性の病原体並びにグラム陰性の病原体によって引き起こされる可能性があり、個々の病原体の有病率は、国と大陸との間である程度異なりうる。乳腺炎の全ての形態の最も顕著な臨床的徴候は、乳房組織の（慢性）炎症反応によって引き起こされるヒトが消費することを目的とした乳中の体細胞数の望ましくない増加である。この二次的な炎症は牛乳の生産量を減少させ、従って、農家にとって深刻な経済的損失をもたらす。過去数十年にわたり、乳腺炎の原因と診断された主要な感染因子を処置する為に、単独又は組み合わせて投与される、様々なクラスの抗生物質を含む多数の医薬品が上市されている。これらの医薬品は、細菌感染と戦う為に、全身に（注射によって）、又は乳頭チャネルを介して局所的に投与される。しかしながら、これらの多大な努力にもかかわらず、抗生物質療法は一般的に一時的にのみ効果を有し、多くの原因で体細胞数（SCC：somatic cell counts）が乳腺炎の臨床的マーカーとして高いままであり、そして、乳量に悪影響を及ぼしている故に、牛の乳腺炎は依然として乳牛において最も一般的な疾病である。
乳腺炎は、既知のバイオフィルム関連障害である。細菌性バイオフィルムの形成は、細菌性バイオフィルムの形成（染色後及びバイオフィルム形成を駆動する遺伝子を測定することにより定量化可能）で有利な条件下で並びに感染したウシの乳房組織におけるバイオフィルムマトリックスを染色することによりイン・シチュー（in situ）で、乳腺炎病原体を培養するイン・ビトロ実験において実証されている。例えば、Schonborn S and Kromker V（2016 Journal Veterinary Microbiology，30；96：126～128）の図1は、乳腺炎を患っているウシの乳房組織からのバイオフィルムマトリックスを示す。
最近10年間の生物医学的研究は、バイオフィルム形成が乳房感染症及び牛乳腺炎の場合に発生するだけでなく、ヒト及び動物の組織に侵入し、持続感染症及び炎症を引き起こす微生物の一般的な特徴であることを明らかにした。今日まで、微生物のバイオフィルムは、ヒト及び動物における感染症の現代的な治療における主要な未解決の課題の1つである。
以下の実施例において提供される臨床的証拠は、重要なバイオフィルム疾病、例えば、牛の乳腺炎及び感染した慢性創傷（例えば、趾皮膚炎及びUCD）、の処置におけるPTSO（及び、それほどの程度でないがその派生体であるPTS）の予想外の治療効果を明らかにした。PTSOの適用が、処置された牛の体細胞数の長期にわたる安定した減少に直接的に関係していることを示す幾つかのフィールドトレイルが記載されており、細菌の治癒及び組織の再生を示唆する。更なる実施例は、バイオフィルム関連の慢性創傷（すなわち、趾皮膚炎及び乳房裂皮膚炎（UCD：Udder Cleft Dermatitis））に対する効果を記載する。
一般的な抗生物質はバイオフィルム感染に対して効果がないことが一般的に認識されている為に、これらの発見は注目に値する。これらの観察結果は、ヒト及び獣医学の多数の科学論文において記載されており、いずれも、バイオフィルムの形成が再発性及び持続感染症並びに組織炎症及び損傷の主な原因であることを示唆する。プロトタイプのバイオフィルム感染症に対するPTSO及びPTSの、提示された実験的（イン・ビトロ）有効性及びイン・ビボ（臨床的察）有効性は、これらの化合物がバイオフィルム感染症を防止及び解決する為に臨床現場において効果的に使用されることができることを示す。バイオフィルムの形成及び分解は、分子と微生物との間の直接的な相互作用として発生し、それ故に、宿主（動物又はヒト）とは無関係である。バイオフィルム形成に関与するメカニズムは細菌種の間で高度に保存されている為に、該化合物はヒト及び動物の幅広いバイオフィルム感染症に対して有効であるとまた考えられる。本実施例はまた、PTSO及びPTSが経口投与されることができ、別個の部位（例えば、乳腺及び爪）で効果を発揮することができることを実証する。
実施例5 乳腺炎
範囲
乳中の細胞数又は体細胞数（SCC：somatic cell count）に対する、3.84gのPTSOと0.96gのPTSとを含む錠剤の効果を調べる為に、実験が行われた。
SCCは、免疫系に見える4分の1にある病原体の量に関連する。各ウシの細胞数は、乳生産登録（MPR：milk production registration）で測定された。このMPRは、全ての農場で30～40日ごとに定期的に行われる。
体細胞数（SCC）は、牛乳の品質の主要な指標である。体細胞の大部分は白血球（leukocytes）（すなわち、白血球（white blood cells））であり、それは、乳腺炎の原因である病原体に対する免疫反応として通常は乳汁中に益々多く存在するようになり、及び、少数の上皮細胞であり、それは、感染が発生したときに乳房の内側から分泌される乳汁産生細胞である。炎症はしばしば乳房のクォーター（udder quarters）で起こり、この乳房の細胞数の増加を結果として生じる。しかしながら、乳房の他のクォーターで希釈される故に、細胞数の総増加量は少なくなる。SCCは、牛乳1ml当たりの細胞数として定量化される。SCCは、例えば乳腺炎の原因である病原体による（無症状の）動物の乳房感染症の存在を示し、乳質の主な指標である。SCCと乳腺炎との関係は、Sharma et al.，2011 Asian-Aust J Anim Sci 24：429～438において概説されている。
SCC及びMPR
SCCデータは、牛乳生産登録（MPR）から抽出された。MPRは、個々のウシごとに生産された牛乳の全ての詳細（例えば、SCC）を示すデータベースである。選択された農場のMPRは、30～40日ごとに定期的に入手可能であった。SCCは、牛乳1ml当たりの細胞数として定量化される。一般的に云うと、SCC値が100,000以下の個々のウシは「感染していない」ウシであり、無症状の乳腺炎による生産量の有意な損失はなかった。150,000の閾値SCCは、ウシが乳腺炎に感染しているかどうかを決定する。150,000超の結果を有するウシは、少なくとも4分の1で感染する可能性が非常に高くなる。重大な病原体に感染したウシは300,000以上のSCCを有する。
実施例5.1
上記された錠剤を用いた18頭のウシにおける細胞数調査。
上記された錠剤を用いた9頭のウシにおける細胞数調査及び11頭の無処置のウシとの比較。
3つの農場が研究の為に選択された。下記の表10は、農場の規模と生産される牛乳に関する情報を示す。
Figure 2023518928000032
処置前のSCCが250,000細胞細胞/ml以上であるウシが、錠剤の投与の為に選ばれた。各農場から、以下の数のウシが選ばれた。
農場1で：6頭のウシ；
農場2で：7頭のウシ；
農場3で：5頭のウシ
これにより、合計18頭のウシをもたらした。
SCCデータが、処置前と処置後の3つのMPRにおいて分析された。
結果及び考察
18頭のウシの番号と平均体細胞数が、下記の表11に示されている。処置後、全てのウシの細胞数は、MPR3で150,000細胞／ml未満であった。MPR3は、処置後約80～約100日である。合計の60％は、100,000細胞／mlよりもさらに低い細胞数を有していた。
Figure 2023518928000033
結論
選択されたウシにおける乳のSCCは、錠剤を用いた処置後に減少したことが示されている。これは、PTSO/PTSが腸によって吸収され、その後血流に入ることが明確に示されたので、非常に驚くべきことであった。PTSO／PTSは、本明細書において記載されている乳腺炎の臨床試験において経口的に投与された。臨床的に有意な効果が乳房組織において観察された為に、これは、PTSO/PTSがルーメン（rumen）を通過するだけでなく（ルーメン微生物に対する安定性を示す）、肝臓後の血流にも到達し（マイナー又は重要でない肝臓の生体内変化及び不活性化を示す）、そして、最終的には、治療的に効果のある濃度で乳腺に到達する。本実施例は、錠剤が効果的にSCCを減少させ、それ故に、乳房関連の感染症に対する良好な治療効果を有する。その上、全てのウシは、MPR3後に、150,000細胞／mlよりも低いSCCを示し、それは、この研究における全ての個々のウシに対する有効性を示す。
実施例5.2
分析には、以下に示されているように、農場1及び農場2が使用された。ウシは、MRP0（処置前）からの細胞数に基づいて選択された。200,000細胞/ml～500,000細胞/mlで、ウシが、同じ期間に、3.84gのPTSOと0.96gのPTSとを含む錠剤を用いて処理された場合と処理されなかった場合があった。
ウシの下記の数が、処置されたグループのウシとして選択された：
農場1：5頭のウシ
農場2：4頭のウシ
ウシの下記の数が、処置されなかったグループのウシとして選択された：
農場1：5頭のウシ
農場2：6頭のウシ
処置されたグループと処置されなかったグループについて、若いウシ（未経産牛）の乳中の細胞の健康な最大レベルに基づいて、150,000細胞／mlのSCCレベルが選択された。このレベルを下回るウシの割合が下記の表12に示されている。結果は、150,000未満のウシのパーセンテージは、処置されたグループにおいて増加し、一方、処置されなかったグループにおいて増加していないことが示された。処置されたグループは、MPR4の後に、最終的に100％に達する。処置されなかったウシは、SCCにおける大きな広がりが見られ、細胞数における有意な減少は見られなかった。
Figure 2023518928000034
細胞数が200,000～500,000細胞／mlの細胞数を有するウシへの錠剤投与は、処置されなかったウシと比較して、体細胞数の減少において有効であることが明確に示された。
実施例5.3
この調査は、搾乳ロボットを使用して、最小群数が80頭のウシ（ホルスタイン）を有する9つの農場で実施された。増加したSCCを有するウシのみが含まれていた。1ミリリットル当たり300,000個超の細胞が測定される場合、ウシは、増加したSCCを有していると見なされる。ウシは、非泌乳期間の5か月前までは、泌乳の初期段階であった。このようにして、ウシは、より長い期間監視されることができる。
SCCデータは、MPRに基づいて集められた。3.84gのPTSOと0.96gのPTSとを含む錠剤を用いて処置されたウシが、SCCに対する効果について分析された。その後、該データは、SCCにおける減少と細胞数における総減少を示したウシの数について評価された。その上、年齢の影響が存在する場合に、異なる泌乳段階を有するウシのグループの間で比較が行われた。
錠剤投与後のSCCにおける減少
MPRデータセットごとのSCCにおける減少を示すウシの数に関する結果が、下記の表13に示されている。錠剤投与後の最初のMPRは、63頭全てのウシで利用可能であった。44頭のウシについて、該錠剤の投与は、SCCを効果的に減少させた。42頭のウシについて、SCCが300,000細胞未満であった。2回目のMPR測定は48頭のウシについて利用可能であった。31頭のウシについて、SCCは錠剤の投与前よりも低かった。そのうち、31頭のウシが300,000細胞未満のSCCを示した。3回目のMPR測定は、12頭のウシでのみ利用可能である。これらの12頭のウシのうち、9頭のウシは、錠剤が必要とされる前よりも低い細胞数を有していた。
その上、細胞数における総減少がまた評価された。最初のMPRの結果が下記の表14に示されており、2回目のMPRの結果が下記の表15に示されている。該結果は、SCCにおける減少を示すウシの大部分が100,000～500,000の細胞のグループに分類されることを示す。該錠剤を投与する前のSCCにおける平均減少が、該錠剤の投与後における平均SCCと比較される場合に、平均減少は250,000細胞／mlである。
Figure 2023518928000035
Figure 2023518928000036
Figure 2023518928000037
授乳期
若いウシ（授乳期の第1段階又は第2段階）は、年長のウシよりも錠剤投与後のSCC減少においてより顕著な効果を示しうる。研究に含まれる63頭のウシのうち、32頭のウシは第1の授乳段階又は第2の授乳段階（若いウシ）であり、一方、他の31頭のウシは、第3の授乳段階から第6の授乳段階まで様々である。第1の授乳段階又は第2の授乳段階の牛のうち、合計32頭のウシのうちの23頭のウシで細胞数レベルが低下していた（72％）。数回の授乳が既に行われていた31頭のウシについて、18頭のウシは細胞数レベルが低下していた（58％）。驚くべきことに、これは、該処置が第1の授乳段階又は第2の授乳段階にあるウシにより良い効果を有することを示した。若いウシについて、細胞数は、2回目のMPR測定後も低いままであった。これは、（無症候性）乳腺炎の存在の指標として考えられるSCCを減少させることに関PTSO/PTS含有錠剤の有効性を明確に示す。
実施例5.4
高められたSCC値を有するウシの乳は、フロックとして該乳から選択されることができるバイオフィルムにおいて調査された。高められたSCCを有するウシの新鮮なミルクにおいて、フロックが分離された。顕微鏡観察の為のサンプル（標準グラム染色及びクリスタルバイオレットにより染色）が調製され、そして、ニコン蛍光顕微鏡を用いて観察された。細菌が検出された。該バイオフィルムが寒天プレート上に播種され、そして、該細菌が分離された。
黄色ブドウ球菌について、100μlの乳サンプルが、3.5％のL-テルライト（L-tellurite）を含む5％の卵黄乳濁液を有するベアードパーカー（Baird-Parker）寒天上に播種された。プレートが37℃で24時間インキュベーションされた。その後、同定された黄色ブドウ球菌コロニーの純粋培養物がヒツジ血液寒天培地において調製された。ストレプトコッカス・ウベリスの分離に関して、100μlの乳サンプルが、10mg／mlのポリミキシン及びネオマイシンを含むヒツジ血液寒天上に播種され、そして、37℃で24時間インキュベーションされた。コロニーが拾われ、5％のヒツジ血液寒天培地上に各種播種することによって純粋培養が行われた。分離された菌株は、20％のグリセロールを加えた1.5mlのTSB（トリプトン大豆ブロス）培地中で凍結された。株の同定は、Vitek2（Biomerieux Benelux B.V.，アメルスフォールト，オランダ王国）によって行われた。
バイオフィルムの調製の為に、細胞が、TSB培地中で108CVE／mlの濃度に希釈された。20μlが、96ウェルプレート中の2g／lのグルコースを含有する180μlのTSB培地に移されたた。該プレートがステーキングする（staking）こと無しに、37℃で5日間インキュベーションされた。その後、過剰な培地が除去され、そして、バイオフィルムが過剰なPBSリン酸緩衝生理食塩水ですすがれた。ウェルが風乾され、そして、上記された通り、顕微鏡染色及び分析の準備を整えられた。
ウシにPTSO/PTS錠剤（3.84gのPTSOと0.96グラムのPTS）を投与した後の数日間、乳に対する効果が監視された。
結果及び議論：
牛乳から分離されたバイオフィルムの顕微鏡観察は、バイオフィルム関連細胞の存在を明らかに実証した。これらの細胞は、使用して純粋な培養物を調製する為に使用され、そして、黄色ブドウ球菌及びストレプトコッカス・ウベリスとして同定された。次に、バイオフィルムがイン・ビトロで培養された。これは、乳腺炎感染に関してバイオフィルムの関与を明らかに実証した。
ウシにPTSO/PTS錠剤を投与した直後、処置されたウシからの乳は乳房から出るときに塊を含んでいた（図3A及び図3B）。ぼろぼろとした牛乳（crumbly milk）が数日間乳房から出てきて、その後、ウシは再び通常の牛乳を生産し始める。その後、乳房の赤い感染色は消え、そして、SCCはその後数週間で大幅に減少した。上記された観察は、PTSO/PTS錠剤の投与後の乳房炎の通常の治癒過程である。
実施例5.5
細胞数は乳房の健康の為の重要な指標であり、及び乳房の健康に対する、3.84gのPTSOと0.96グラムのPTSとを含む錠剤の効果を研究する為に測定される。2つの異なる農場からの20頭のウシの2つのグループが検査される。最後のMPRで又は第2～最後のMPRで、細胞数が250,000細胞／mlの限界を超える場合に、ウシが選択される。研究グループの各ウシは、PTSO／PTS錠剤を与える前にサンプリングされる。錠剤を投与された後、ウシが週に1回サンプリングされ、そして、該サンプルが体細胞数について3ヶ月間分析され、そして、細胞数の為の分析が3か月間毎週行われる。
毎週測定された両方の農場についての平均細胞数が、下記の表16に示されている。
Figure 2023518928000038
両方の農場の結果は、最初の約6週間で細胞数における急速な減少を示しその後、7週間後には徐々に減少することを示す。それは、用量の予想される効果と一致している。結論は、PTSO/PTS錠剤の初回投与による処置後、細胞数が250,000細胞／ml超のウシ牛は、細胞数が約250,000細胞／mlに有意に減少したことを示した。この実施例から、SCCの減少に対する効果が非常に長いことが実証された。
実施例5.6
4つの個々の農場と合計47頭のウシが、SCCに対する、3.84gのPTSOと0.96gのPTSとを含む錠剤の効果について調べられた。
研究設計：
農場1：11頭のウシ、第1の処置後、合計3MPRにおいて。
農場2：8頭のウシ、第1の処置後、合計9MPRにおいて。
農場3：16頭のウシ、第1の処置後、合計13MPRにおいて。
農場4：12頭のウシ、第1の処置後、合計2MPRにおいて。
農場に関するその他のデータが、下記の表17に示されている。
Figure 2023518928000039
結果及び議論：
個々の農場の牛乳の平均細胞数が、下記の表18において示されている。
Figure 2023518928000040
全ての場合において、SCC数は、処置後に減少される。農場2及び農場3について、SCCの安定した低い値を示す複数のMPRが利用可能であった。これは、長期間にわたるSCCの減少に対する錠剤の有効性を示す。
実施例5.7
カリフォルニア州ハンフォードにある5,500頭のウシを有する1つの農場において、3.84gのPTSOと0.96gのPTSとを含む錠剤が乳房の健康に及ぼす影響を研究する為に、体細胞数と乳生産量の統計が毎月測定された。ウシが以下に示されている様々な基準に基づいて選択され、そして、以下に示されている通りに処置された。SCCの低下におけるPTSO／PTS錠剤 対 対照グループの有効性が試験された。
目的は、以下のグループが処置後に比較された場合に有意差があるかどうかを調査することであった。
・PTSO/PTS処置されたグループ 対 対照グループにおいて、合計平均SCCが低い
・PTSO/PTS処置されたグループ 対 対照グループにおいて、200K未満のウシが多い
・PTSO/PTS処置されたグループ 対 対照グループにおいて、100K未満のウシが多い。
最初に、ウシが、以下のグループに分類された：
無症状の高SCCウシをサポートする為のPTSO/PTSを使用した農場試験の選択基準
・現在のSCC＞200,000 （SCC＞200）
・以前のSCC＞200,000 （PSCC＞200）
・第1及び第2の授乳動物 （LACT＜3）
・乳腺炎の処置された回数 （XMAST）＜3
・ウシを「繁殖禁止」にしない
・ドライオフ（dry-off）から60日以内。DCC＜145 （これは、子ウシの妊娠日数（現在妊娠している動物の現在の妊娠期間）を意味する。少なくとも2か月の追加の試験日数のSCCデータが必要であり、従って、該データを本発明者らが取得する前に該ウシがドライオフされなかった。
・2等分する。
・授乳期間（Lactation）によってソートされた、授乳期間内にSCCによってソートし、グループAABB頭を割り当てる等。
・授乳期間、SCC、PSCC、XMAST、ECMについての均等化グループ（＝エネルギー補正された牛乳。牛乳の脂肪分とタンパク質含有量に基づいて生産量を標準化する式。生産量と乳成分とが異なるウシ／ウシの群れを比較する為に使用される。例えば、脂肪とタンパク質が少ない非常に生産量の多いウシを、脂肪とタンパク質が多く生産量が少ないウシと比較することを可能にする）等。
合計で、100頭のウシが選ばれ、50頭のウシは1つのPTSO／PTO錠剤で処置する為に選ばれ、及び50頭のウシは処置されずに比較（対照）の為に使用された。
6週間後、PTSO／PTS処置されたグループ（323K）における平均SCCは、対照グループ（523K）よりも38％低く、SCCの200K未満のウシ（24頭の処置されたウシ 対 15頭の対照グループのウシ）及びSCCの100K未満のウシ（13頭の処置されたウシ 対 7頭の対照グループのウシ）が有意に多かった。
実施例5.8
オランダの3つの農場において、乳腺炎を示す高められた体細胞数の上昇（＞200,000細胞／ml）を有する18頭のウシが選択され、3.84gのPTSOと0.96gのPTSとを含む錠剤が与えられた。体細胞数は、30日の定期的な間隔で3回測定された。処置前、18頭のウシは、600,000細胞／ml超である平均体細胞数を有していた。最初の測定によって、平均体細胞数は、300,000細胞／ml未満であり、50％以上改善された。2回目の測定日では、グループについての平均値は、ウシが感染していると見なされる200,000細胞／mlの閾値を下回っていた。3回目の測定は、平均値が100,000細胞／ml未満に低下したことを示した。高い体細胞数を有する正式にラベル付けされているこれらのウシは、現在、プレミアムを要求することができる牛乳を生産している。
実施例5.9
別の顧客の酪農場において行われた2回目の試験において、3.84gのPTSOと0.96gのPTSとを含む錠剤を用いての処置の結果が、標準的な抗生物質乾乳牛処置（dry cow treatment）（対照ウシ）を受けたウシと比較された。実施例5.8のように、両方のグループは、初期の高い体細胞数を有するウシで構成されていた。9頭のウシがPTSO/PTS錠剤を投与する為に選択され、及び11頭のウシが対照として研究する為に選択された（表19を参照）。参加ウシの体細胞数は、合計3つのデータコレクションについて定期的に測定された。処置後の最初の測定日（MPR1）で、対照グループのウシの36％と比較して、PTSO/PTS処置されたウシの89パーセントが150,000細胞／ml未満の体細胞数を示した。4回目の測定では、PTSO/PTSで処置された全てのウシの牛は、慣用的な処理されたウシのわずか29％と比較して、150,000細胞／ml未満の体細胞数に低下していた。
Figure 2023518928000041
実施例5.10
4つの農場で、高められた検査結果を有するウシの体細胞数における変化が経時的に測定された。処置前に、選択された農場1のウシ（n=11頭）は3,500,000細胞／ml超の平均体細胞数を有し、選択された農場2のウシ（n=8頭）は約600,000細胞／mlの平均体細胞数を有し、選択された農場3のウシ（n=16頭）は、約893,000細胞／mlの平均体細胞数を有し、及び、選択された農場4のウシ（n=12頭）は、2,288,000細胞／mlの平均体細胞数を有した。細胞数は、毎月の乳製品登録中に測定された。3.84gのPTSOと0.96gのPTSを含む錠剤（ウシ1頭当たり1個）を用いた処置は、MPR0とMPR1との間で行われ。選択されたウシの平均体細胞数は、MPR1によって全ての農場で有意に減少した。MPR3までに、選択された全てのウシの78％が、250,000細胞／ml未満の体細胞数であった。全てのウシについての平均SCCは、処置後4か月で、200,000細胞／ml未満であり、試験期間を通じて（すなわち、処置後少なくとも6か月まで）、200,000細胞／ml未満のままであった。
実施例5.11
伝統的な乾乳牛療法（DCT：Dry Cow Therapy）に代わる効果的な方法
ウォーターフォード工科大学（Waterford Institute of Technology）で実施された独立した研究において、PTSO／PTSが代替のドライオフ処置として試験された。17頭のウシがPTSO／PTS錠剤で処置され、一方、16頭のウシが伝統的なドライオフ処置を受けた。該PTSO／PTS錠剤は、3.84gのPTSOと0.96グラムのPTSとを含み、そして、ドライオフの3週間前に投与された。対照グループは、ドライオフ療法の為に使用される通常の抗生物質を含む慣用的な処置を同じ日に受けた。これら2つのドライオフ法を比較すると、PTSO／PTSで処置されたウシの23.5％が感染したのに対して、伝統的な方法で処置されたウシでは60％であった。ウシは3つのグループに分けられた：すなわち、低体細胞数のウシ（＜200,000）、中体細胞数のウシ（200,000～400,000）、及び高体細胞数のウシ（＞400,000）。これらのウシがドライオフ前のこれらのウシの体細胞数に基づいて分類される場合に、PTSO／PTS処置は低SCCウシの92.9％（14頭中、13頭）で成功しており、一方、ブランケットDCTは、この集団の50％（12頭のウシからの6頭）の処置において成功しただけであった。中体細胞数のグループの結果は、低体細胞数のウシと同様であった。高細胞数のウシの場合、PTSO／PTS錠剤は50％（1/2）のウシで効果的な乾乳牛療法であり、及び同様に、ブランケットDCTは50％（2頭中、1頭）のウシで効果があった。これは、9,993,400細胞／mlの体細胞数を有したが、外れ値のPTSO／PTS処置されたウシを含んでいた。このウシは、146％の減少を示し、分娩時1,560,000細胞／mlの体細胞数を有し、その後の12週間にわたって更なる処置を行うことなしに数が減少し続けた。
実施例5.12
PTSO／PTS錠剤を評価する為に、外部の第三者クリニックによって研究が行われた。5つの農場の合計16匹の動物が、3.84gのPTSOと0.96gのPTSとを含む錠剤の投与後の高細胞数における変化について監視された。14匹の動物が該研究を完了した。平均44で、細胞数の平均45％（685,000～378,000）の減少が実証された。
加えて、個々のクォーターにおける病原体の検出及び持続性の評価が行われた。6つの農場からの19頭のウシから細胞数の上昇を伴う20クォーターがサンプリングされ、そして培養された。1日目には、様々な病原体（ストレプトコッカス・ウベリス、黄色ブドウ球菌、大腸菌等）が12クォーターで検出され、及び8クォーターでは病原体が検出されなかった。検出された病原体を有する12クォーターのうち、42日目に、病原体が4クォーターのみで検出され、病原体が8クォーターでは検出されなかった。これは、病原体の67％の減少に相当する。
実施例5.12
オーバーバイエルン州（Upper Bavaria）で実施された、無症候性乳腺炎に対する実際の研究において、乳腺炎を有する合計14頭のウシが、3.84gのPTSOと0.96gのPTSを含む錠剤の投与前後の細胞数の展開に関する変化について提示された。その上、病原体の存在と数は、選択された乳房クォーターにおいて様々な時間間隔で処置後に調べられた。
研究設計
細胞数は乳房の健康の為の重要な指標であり、5つの農場の14匹の動物の乳房の健康に対する、3.84gのPTSOと0.96グラムのPTSとを含む錠剤の効果を研究する為に測定される。最後のMPRで又は第2～最後のMPRで、細胞数が細胞／mlの限界を超える場合に、ウシが選択された。研究グループの各ウシの乳が、錠剤を与える前にサンプリングされた。処置後、ウシは適切な時間間隔でサンプリングされ、そして、サンプルが、体細胞数と乳房における感染されたクォーターについて分析された。その上、微生物の病原性標本が同定され、そして、数が、適切な時間間隔の後に決定された。
結果及び議論
表20において、処置後の様々な時間間隔で、測定の結果が、体細胞数、検出された病原体に関して提示されている。処置前に、細胞数は250,000／ml超であり、感染が存在することを強く示しており、ほとんどのウシで数が増加していた。処置が、MPR-0とMRP+1との間で行われた。処置後、tが0での感染から、1日目に病原体が検出された10クォーターから、14／15日目には7クォーターまで、病原体の減少が観察された。病原体は依然として観察され（3クォーターの減少、30%に相当）、42／43／44日目には元の病原体がまだ3クォーターで検出されたが、これは最初に感染したクォーターの7クォーターの減少（70%）に相当する。しかしながら、実験の時間間隔で7頭のウシが他の病原性細菌に感染され、そして、これらのウシは再処置されなければならなかった（結果は示されていない）。全てのウシにおいて、体細胞数が処置後7日目に減少した。SCCは炎症レベルの為の、一般的に認められている尺度である故に、この処置は炎症に対して明らかな抑制効果を示した。興味深いことに、SCC数は、処置後、7日目に既に有意に減少しており、36～55日後には、細胞数が平均45%（685,000から378,000細胞／mlへ）減少したことが実証された。
しかしながら、ほとんどの場合、病原体は依然として検出可能であった。その上、バイオフィルムの塊は2日目から高い割合で乳房から出ていたが、完全に除去された。これは、バイオフィルムが炎症の原因であり、乳房中にまだ存在していた浮遊細胞でないことを強く示した。浮遊細胞の数は時間とともに減少し、やがて検出できなくなり、この減少は、免疫系の作用の反応によってのみ引き起こされる可能性がある。このことは、細胞を殺すこと無しに、バイオフィルムを除去し、炎症を制御するのに十分であり、そして、免疫系が感染を制御する役割を果たしていることを実証する。
Figure 2023518928000042
その上、個々のクォーターにおける、病原体（病原体）の検出又は病原体の持続性の評価が行われた。6つの農場からの19頭のウシの細胞数の上昇を伴う20クォーターが検査された（牛乳サンプル、培養的アプローチ）。1日目に、様々な病原体（ストレプトコッカス・ウベリス、黄色ブドウ球菌、大腸菌等）が12クォーターで検出され、8クォーターで病原体が検出されなかった。1日目に病原体が検出された12クォーターのうち、42日目に病原体が検出されたのは4クォーターのみで、8クォーターでは全く検出されなかった。これは、病原体の67%の減少に相当する。
この実験から、PTSO／PTSが腸によって吸収され、そして、乳腺に輸送されることが明らかである。その後、PTSO／PTSは、バイオフィルムの放出が起こるほど十分に高い濃度で、該バイオフィルム（それは、細菌がその中に隠れるところの一種の「要塞」（fortress）と見なすことができる）に入る。該バイオフィルムの溶解と剥離プロセスが起こる正確なメカニズムは不明であるけれども、化合物がそのような効果を引き起こすことは驚くべきことである。
実施例6．プロトセカ（Prototheca）
乳房炎の非常に致命的な変種は、バイオフィルムを形成する微細藻類プロトセカ属（Prototheca spp）によって引き起こされる（Concalves et al.，2015，Dairy Sci 98 （6）：3613～3621．Valessa et al，Cienc．Rural vol．49 no.2 Santa Maria Feb 28，2019）。プロトセカ・ゾフィ（Prototheca zopfii）によって引き起こされる乳房炎は、様々な国において報告されており、及び世界中で増加しており、及びこれらの微細藻類の日常的な治療に対する固有の耐性の為に深刻な問題となっている（Pieper et al.，2012．J．Dairy Sci．95：5635～5644）。この耐性は、マクロファージに感染し且つ生存し、乳腺組織に侵入する能力に関連付けられており、牛乳中のプロトセカ・ゾフィの定期的な発生による持続感染症の原因となる（Marques et al.，2006，J．Dairy Sci．89：4202～4204）。
プロトセカ属の伝染は、搾乳中に、抗生物質を用いた定期的且つ集中的な処置中（Pieper et al.，2012）及びウシの搾乳前準備の間の衛生状態が欠如中に、感染されたウシと健康なウシとの間で生じる。その上、プロトセカ・ゾフィは、糞便の中で生き残り、そして、あらゆる環境を汚染する。酪農環境において、表面、例えば、ステンレス鋼、ガラス、ゴム及びポリプロピレン、が微生物によって汚染される。引き続き、微生物は、これらの表面上で増殖し、そしてバイオフィルムを生成しうる（Davies，2003．Nat．Rev．Drug Discov．2：114～122）。
プロトセカ属によって引き起こされる乳腺炎の、抗生物質を用いた処置は、プロトセカ属による感染の一時的な改善のみをイン・ビボ（in vivo）でもたらし、原因物質は除去されない（Costa et al.，1996．Mycopathologia 133：85～88）。それ故に、プロトセカ・ゾフィに感染したウシを処分することは、疾病を減らす為の唯一の制御手段ではないにしても、推奨される手段のうちの1つである。
範囲：オーバーバイエルン（Upper Bavaria）で実施された（亜）臨床型乳腺炎の実地研究において、乳腺炎を有する合計14頭の牛が、4.8gのPTSOと1.2gのPTSを含む錠剤の投与前後の細胞数の展開に関する変化について提示された。その上、プロトセカの存在及び数は、選択された乳房クォーターにおいて様々な時間間隔で処置後に調べられた。
研究設計
細胞数は乳房の健康の為の重要な指標であり、44頭の動物の乳房の健康に対する、PTSO／PTS錠剤製品の効果を研究する為に測定される。乳中の最後のMPRで、細胞数が250,000細胞／mlの限界を超える場合に、ウシが選択され、乳中に微細藻類プロトセカが示された。以降、PTSO／PTS錠が投与された。処置後、ウシは、毎月1回サンプルが採取され、そして、実験終了時に細胞数と乳房内の微細藻類プロトセカの存在について分析された。
結果及び議論
下記の表21において、時間内の体細胞数及び実験の終了時のプロトセカの存在に関する測定結果が示されている。
Figure 2023518928000043
Figure 2023518928000044
処置前に、細胞数は250,000細胞／ml超であり、感染が存在し、及びほとんどのウシで数が増加していることを強く示していた。全てのウシにおいて、体細胞数は、処置後7日目に減少した。SCCは感染の結果としての炎症のレベルの尺度である故に、該処置は炎症に対して明らかな抑制効果を示した。興味深いことに、SCC数は、該処置後、7日目に既に有意に減少しており、36～55日後には細胞数が平均45%（685,000から378,000細胞／mlへ）減少したことが実証された。
その上、個々のクォーターにおける、病原体（病原体）の検出又は病原体の持続性の評価が行われた。6つの農場からの19頭のウシの細胞数の上昇を伴う20クォーターが検査された（牛乳サンプル、培養的アプローチ）。1日目に、様々な病原体（ストレプトコッカス・ウベリス、黄色ブドウ球菌、大腸菌等）が12クォーターで検出され、8クォーターで病原体が検出されなかった。1日目に病原体が検出された12クォーターのうち、42日目に病原体が検出されたのは4クォーターのみで、8クォーターでは全く検出されなかった。これは、病原体の67%の減少に相当する。
微細藻類プロトセカによる乳房の感染は、藻類がほとんどの抗生物質に対して非感受性であるために、一般的にウシの淘汰を結果として生じる。予想外に、PTSO／PTSは感染を完全に解決することを実証し、淘汰は必要なかった。
実施例7．趾皮膚炎
慢性感染症の別のカテゴリーは、バイオフィルム形成微生物によって感染される傷である。該傷が一旦感染すると、微生物は該傷に付着したままのバイオフィルムを形成し始める。微生物のEPS（細胞外高分子物質）の生成は、バイオフィルムが数時間以内に複雑な三次元構造を形成する為に役立つ。これらの複雑な構造は、傷における防御メカニズムに耐性がある。抗生物質が細菌を攻撃する為に施与される場合に、該抗生物質は、バイオフィルムを部分的に根絶するだけで、該傷及びその下の組織は感染したままである。これらのバイオフィルムは、慢性感染症及び治癒していない傷につながることが知られている。米国においては、バイオフィルムに基づく新たな感染症が毎年約1,600万件、診断されている。従って、バイオフィルムは、創傷治癒の主要な障害を構成する。病原性微生物に感染するそのような傷の例は、細菌、例えば、グラム陽性菌、例えば黄色ブドウ球菌；連鎖球菌；グラム陰性菌、例えばトレポネマ種、大腸菌、エルシアニア・ペスティス（Yersiania pestis）、緑膿菌；酵母／真菌、例えばカンジダ種（アルビカンス）、クラドスポリジウム・ヘルバラム（Cladosporidium herbarum）、トリコスポラム（Trichosporum）、ロドスポリジウム（Rhodosporidium）、マラセチア（Malassezia）、である
ウシの乳生産に悪影響を及ぼす創傷感染の一つの例が趾皮膚炎である（Schlafer et al，2008 Veterinary Microbiology 128，Issues 1～2：118～125）。趾皮膚炎（同義語は、毛のかかとのいぼ（hairy heel warts）、ストロベリーの腐蹄病（strawberry foot rot）、モルテッラーロ病（mortellaro disease）、イタリアの腐蹄病（Italian foot rot）、趾乳頭腫症（papillomatous digital dermatitis））は、ウシに跛行を引き起こす感染症である。趾皮膚炎の病変は、バルブ（bulbs)の間の潰瘍性又は増殖性の塊である（Beninger，2018 et al，Vet Res 49：111）。趾皮膚炎の費用は、65頭のウシの農場で年間1頭当たり75ドルである（Bruijnis et al.，2010，J．of Dairy Science Volume 93，Issue 6，2419-2432）。費用は、早期淘汰（prematureculling）、乳の損失、及び繁殖力の低下に基づく。
指皮膚炎は、好気性又は嫌気性細菌（Beninger，2018 et al，Vet Res 49：111）、特にトレポネマ属（Treponema spp）によって引き起こされる（Demirkan et al．2018J．of Dairy Science vol 101 （11） p．10317～10326）。一般的に、感染は、爪の周りの皮膚に侵入するトレポネマ属によって開始される。トレポネマ属は、嫌気性グラム陰性菌であり、スピロヘータに属する。これらの微生物は、ウシの爪の近くの皮膚、特に趾間裂の爪、の間から侵入することができる。これらの皮膚炎の病変から発生するバイオフィルムは、異種の微生物群衆を構成する。
トレポネマのような細菌は、ウシの糞中又は反芻動物の糞中に存在し、趾皮膚炎の原因と考えられている。免疫系が正常に機能しているウシは、趾皮膚炎に対する感受性が低くなる。ハウジング（Housing）、衛生、換気、栄養がまた重要である。
ホルマリンフットバス（Formalin foot baths）は、趾皮膚炎に対する予防効果があり、及びしばしば適用される。しかしながら、ホルマリンは、ウシ及び酪農業者の健康に良くないことが知られている。趾皮膚炎が爪にある場合は、該爪は、トリミング後に完全に乾燥され、そして洗浄され、2週間に1回フットバスで爪を消毒する必要がある。その上、感染した皮膚は通常、その後抗生物質を含むスプレーで処置され、そして、この方法において、肯定的な結果が達成されうる。しかしながら、しばしば創傷内に、微生物細胞が休眠状態で存在するところのバイオフィルムの薄い層又は斑点が形成される。細菌集団の一部のみが（抗生物質）処置によって殺され、一方、残りの細胞は該処置が終了した後に増殖し始める。その上、通常、感染は局所的なバイオフィルムが形成されるところの真皮中の皮膚の奥深くまで浸透し、且つ抗生物質の大きな分子はほとんど効果を有しない。その上、選択圧は、組織及び生体層における細胞休眠以外の抗生物質耐性の他の形態に適用される。これらの理由から、ほとんどの処置法及び戦略は、趾皮膚炎を改善する効果がほとんどないか又はまったくない。
研究設計
実験は3つの個々の農場において実行され、傷及び怪我を処置する為に開発された2つのスプレー（スプレー#1とスプレー#2-PTSO）の効果を調べた。スプレー#2-PTSOがまたPTSO（3.2%のPTSO w/w）を含むことを除いて、両方のスプレーは同じ組成を有する。0.35mlが、処置毎に傷口上にスプレーされる。
13の農場におけるウシは、趾皮膚炎の存在に基づいて選択される。趾皮膚炎を有するこれらのウシが選択され、そして、歩行とそのMスコアが採点された。趾皮膚炎感染症を分類する為に、6つのクラスが記述された（Dopfer et al，1997）（Berry et al.，2012）。Mスコアの説明は以下の通りである：M0，健康；M1（初期段階）、小さな赤み及び敏感だが活動的な炎症、最小の損傷0～2cm；M2、イチゴのような赤色で及び非常に敏感な損傷で、上皮の縁が白く、毛が直立しているため、2cmを超える非常に活発な炎症；M3（治癒段階）、かさぶたで覆われた潰瘍性病変；M4，慢性潰瘍への変化；M4.1，M4とM1との組み合わせ、腫れた爪裂を伴う慢性期。運動スコア（locomotion scores）は以下の通り定義される：1，跛行ではなく、背筋を伸ばして歩く；2，やや跛行、やや腰を曲げて歩く；3，立っているときも歩いているときも、ひどく跛行し、お辞儀をする；4，立ったり歩いたりすると、ひどく跛行し、後ろに曲がる；5，強い跛行と立っているときにお辞儀をし、もう足で立たなくなり、横になることを好む。
M2病変が処置される場合に、治癒が下記のように起こる。中間段階（M3）は、治癒された段階（M0）に至るか、又は中間段階（M3）は、腫れた爪間裂（M4.1）を伴う慢性期に変わる。M4.1は、効果的な処置の後、M4からM3を経由して治癒する。例えば、図4を参照。
傷をスコア付けした後、選択されたウシは下記の通り5つのグループにランダムに分配される：グループ1：処置なし（対照）；グループ2：スプレー#1を用いた処置；グループ3：スプレー#2-PTSOを用いた処置；グループ４：スプレー#1を用いて処置し、且つ4．8ｇのPTSOと1．2ｇのPTSを含む錠剤を投与；グループ5：スプレー#2-PTSOを用いた処置、並びに4．8gのPTSOと1.2グラムのPTSを含む錠剤の投与並びにスプレー#1又はスプレー#2-PTSOのいずれかで処置された。爪は、2週間後にMスコアと運動で採点された。可能であれば、それぞれの爪が再び持ち上げられて、写真が撮り直された。
データ処理
ウシのスコアが、グループ1とグループ3との間、グループ2とグループ3との間で比較された。フィッシャーの正確確率検定（Fisher's Exact Test）が適用されて、統計的有意性を計算した。M1、M2、M4及びM4.1は「治癒していない」と見なされた。M3は「治癒中」、及びM0は「治癒された」として示されている。該試験では、「治癒中」と「治癒された」が一緒にされた。
結果
処置グループごとのMスコアが、下記の表22に示されている。M4スコアを有する処置されたウシのほとんどは、いずれかのスプレーで処置される前に1又は2の運動スコアを有する。これらのウシは全て、処置後に、運動の為の1をスコア付けされ、皮膚は供給者を処置した後であった。グループ5のウシは運動の為の3をスコア付けされたが、処置直後は、運動の為の2をスコア付けされ、従って、迅速な改善が観察された。趾皮膚炎における結果は、Mスコアによって決定された。M1、M2及びM4.1の活動性（痛みを伴う）病変を有する全てのウシは、M3に移された。
4.8gのPTSOと1.2gのPTSを含む錠剤とスプレー#1との両方で処置されたウシは、該処置後にM4スコアの93%がM3に移行し、及び残りがM0に移行したことを示した。スプレー#2-PTSOが使用された場合に、t=0のM2スコアがM3に移行した。M4スコアを有するウシは、該処置後にM0（23%）、M3（56%）、又はM4のまま（21%）移行した。スプレー#2-PTSOを使用することによって有意な改善が観察され、一方、PTSO／PTS錠剤を用いた追加の処置は、追加の効果を示した。
対照グループはより高いMスコアを示した。なぜならば、これは、このグループが処置を受けておらず、状況が予想通りに悪化したためである。ほとんどのウシは、慢性グループ（M4）に留まった。
Figure 2023518928000045
グループ1：対照；グループ2：スプレー#1；グループ3：スプレー#2-PTSO；グループ4：PTSO／PTS錠剤に加えて、スプレー#1；グループ5：PTSO／PTS錠剤に加えて、スプレー#2-PTSO。Aは処置前の特定のMスコアを有するウシの数を示し、及びBは処置後の特定のスコアを有するウシの数を示す。
統計分析が実施され、フィッシャーの正確確率検定の結果、グループ2とグループ3とを比較すると、P値は0.037（すなわち、PTSO有りのスプレー及びPTSO無しのスプレー）、グループ1とグループ3（すなわち、対照 対PTSO有りのスプレー）とを比較すると、P値は0.010であった。
爪の健康状態は両方のスプレーで改善されたが、統計的なP値は、PTSOを含むスプレーがPTSOを含まない同様のスプレーよりも改善された効果を示したことを実証する（p＝0.032）。スプレー#1で処置されたウシは、該処置がPTSO／PTS錠剤と組み合わされた場合により良い結果を示した。本実施例は、PTSOの局所投与が趾皮膚炎のようなバイオフィルム関連の慢性創傷の処置の為に有用であることを示す。
スプレー#2-PTSOで処置されたウシについて、慢性病変（M4，M4.1）についてよりも感染ステージM1及びM2に大きな影響が観察された。この処置を延長することによって、更なる改善が達成される可能性が非常に高い。運動スコア4の牛の1頭が処置を受け、処置前に3本足で歩き、残りの足の爪は指の皮膚炎に強くかかっており、使用できなかった。処置後、ウシは4本の爪で歩き去り、運動スコアは2であり、該処置による鎮痛効果を明確に示した。
実施例8．乳房裂皮膚炎
バイオフィルム関連の慢性創傷の別の例は、乳房裂皮膚炎（UCD：Udder Cleft Dermatitis）である（Sorge et al，2019．J．Dairy Sci．102：11470～11475；Waller et al，2014，J．Dairy Sci．97：310－318）。UCDは、乳房と腹壁との間、又はは乳房の前4分の1の間の前方接合部に位置する皮膚病変である。病変は外観及び大きさにおいて変わり、肥厚された皮膚、痂皮（crusts）、膿、及び出血しやすい傷が一般的な所見である。乳房裂皮膚炎は、その解剖学的位置と、罹患したウシが疾病の一般的な兆候を示すことはめったにないという事実との為に、検出が困難である可能性がある。UCDの有病率に関する研究はほとんど発表されておらず、ほとんどの研究には、主に問題のある群れとして分類されている1つ又は幾つかの群れしか含まれていない。これらの研究における群内有病率は、0～22%で変動した。しかしながら、最近のオランダの研究において、20頭のウシの群が含まれており、そのうちの3つはUCDを有しておらず、一方、他の群の群内感染率は2.5～13%で変動した（Amersfort et al.，2012）。UCDの病因は不明であるが、幾つかの要因、例えば、乳房構造及び乳房浮腫、が役割を果たすことが示唆されている。ウシの要因、例えば、出産回数及びDIM（days in milk：牛乳の日数）、がまた、UCDに関連付けられている（Beattie and Taylor，2000，J．Brit.Cattle Vet．Assoc．8，377～380）。
病変は、後肢の指間裂の足底側面で最も一般的に識別される。トレポネマ属は、多数の活動性病変に日常的に存在する。病変は触れると痛みを伴い、及び臨床的な跛行を結果として生じる可能性がある。伝染性は一般的にウシの群の風土病感染をもたらし（Plummer et al 2017，Vet Clin North Am Food Anim Pract 33（2）：165-181）、大きな経済的損失の原因となる。
研究設計：
慢性UCDの明らかな特徴を有する2頭のウシが選択され、そして、実施例7に記載されたスプレーで処置された。ウシ1（3076）は、0日目と7日目においてスプレー#2-PTSOで処置された。ウシ2（2934）は、t=0にスプレー#1で、7日目にスプレー#2-PTSOで処置された。下記の表23及び表24は、該処置の結果を示す。
Figure 2023518928000046
Figure 2023518928000047
ウシ1は、0日目と7日目にスプレー#2-PTSOで処置され、そして、炎症の軽減がすぐに観察された。ウシ2934が0日目にスプレー#1で処置された場合、進行は観察されなかった。7日目にスプレー#2で処置された後、感染の減少とそれに続く創傷治癒に関して明らかな改善が観察された。これらの実験は数百頭のウシで繰り返され、スプレー#2-PTSOによるUCDの慢性的な、ぬるぬるした傷の改善及び治癒が観察された。

Claims (23)

  1. バイオフィルム関連障害の処置において使用する為の、下記の式Iに従う化合物、又は前記式Iに従う化合物を含む組成物、ここで、前記組成物はジアリルチオスルフィナートを実質的に有しない
    Figure 2023518928000048
     ここで、R1及びR2は独立して、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルケニル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキルから選択される。
  2. 前記化合物がプロピルプロパンチオスルホナート（PTSO）である、請求項１に記載の使用の為の、前記化合物又は前記組成物。
  3. 請求項１に記載の使用の為の、前記化合物又は前記組成物、ここで、前記組成物が、下記の式IIに従う化合物をさらに含み、好ましくは、前記式IIに従う化合物は、プロピルプロパンチオスルフィナート（PTS）である
    Figure 2023518928000049
     ここで、R3及びR4は独立して、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルケニル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキルから選択される、但し、式IIは下記でない。
    Figure 2023518928000050
  4. バイオフィルム関連障害の処置において使用する為の、下記の式IIに従う化合物、ここで、好ましくは、前記化合物がプロピルプロパンチオスルフィナート（PTS）である、又は前記式IIに従う化合物を含む組成物、ここで、前記組成物はジアリルチオスルフィナートを実質的に有しない
    Figure 2023518928000051
     ここで、R3及びR4は独立して、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルケニル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキルから選択される、但し、式IIは下記でない。
    Figure 2023518928000052
  5. 請求項１～４のいずれか１項に記載の使用の為の、前記化合物又は前記組成物、ここで、前記組成物が、下記の式IIIを有する化合物をさらに含み、
    Figure 2023518928000053
     ここで、nは、1、2又は3であり、並びにR1及びR2は独立して、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルケニル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキルから選択される、但し、式IIIは下記でない。
    Figure 2023518928000054
  6. 前記使用が、抗菌剤、好ましくは抗真菌剤又は抗生物質から選択される抗菌剤、の投与をさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の使用の為の、前記化合物又は前記組成物。
  7. 前記使用が、抗炎症剤の投与をさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の使用の為の、前記化合物又は前記組成物。
  8. 前記処置が、バイオフィルムの形成若しくは成長の減少の為のものであり及び／又はバイオフィルムの分解若しくは低減の為のものである、請求項１～７のいずれか１項に記載の使用の為の、前記化合物又は前記組成物。
  9. 前記バイオフィルム関連障害が、慢性感染症及び／又は持続感染症である、請求項１～８のいずれか１項に記載の使用の為の、前記化合物又は前記組成物。
  10. 前記バイオフィルム関連障害が、趾皮膚炎又は慢性創傷感染症である、請求項１～９のいずれか１項に記載の使用の為の、前記化合物又は前記組成物。
  11. 前記バイオフィルム関連障害が乳腺の感染症であり、好ましくは、前記バイオフィルム関連障害が乳腺炎である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の使用の為の、前記化合物又は前記組成物。
  12. 前記処置が哺乳動物の為のものである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の使用の為の、前記化合物又は前記組成物。
  13. 前記処置が、反芻動物、好ましくはウシ、の為のものである、請求項１～１２のいずれか１項に記載の使用の為の、前記化合物又は前記組成物。
  14. 前記組成物が、ジアリルチオスルフィナートを実質的に有しない、請求項１～１３のいずれか１項に記載の使用の為の、前記化合物又は前記組成物。
  15. 前記バイオフィルムが、細菌、酵母、真菌、微細藻類、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の使用の為の、前記化合物又は前記組成物。
  16. 個体におけるバイオフィルム関連障害を処置する方法であって、該方法は、それを必要とする個体に、下記の式Iに従う化合物を含む組成物を投与することを含み、ここで、好ましくは、前記化合物がプロピルプロパンチオスルホナート（PTSO）であり、前記組成物はジアリルチオスルフィナートを実質的に有しない、前記方法
    Figure 2023518928000055
     ここで、R1及びR2は独立して、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルケニル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキルから選択される。
  17. 下記の式Iに従う化合物を含む組成物で少なくとも部分的に被覆された表面を有する物品であって、好ましくは、前記物品が、清掃用製品、医療用器具又は外科用器具であり、ここで、前記組成物はジアリルチオスルフィナートを実質的に有しない、前記物品
    Figure 2023518928000056
     ここで、R1及びR2は独立して、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルケニル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキルから選択される。
  18. 表面におけるバイオフィルムの形成若しくは成長を防止若しくは減少する為の、又は表面におけるバイオフィルムを分解若しくは低減する為のイン・ビトロ方法であって、前記方法は、組成物を前記表面に施与して、表面におけるバイオフィルムの形成若しくは成長を防止若しくは減少すること又は表面におけるバイオフィルムを分解若しくは低減することを含み、前記組成物が、下記の式Iに従う化合物を含み、ここで、前記組成物はジアリルチオスルフィナートを実質的に有しない、前記方法
    Figure 2023518928000057
     ここで、R1及びR2は独立して、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルケニル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキルから選択される。
  19. 下記の式Iに従う化合物を含む組成物であって、前記組成物が医薬組成物又は機能性食品であり、ここで、前記組成物はジアリルチオスルフィナートを実質的に有しない、前記組成物
    Figure 2023518928000058
     ここで、R1及びR2は独立して、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルケニル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキルから選択される。
  20. 前記化合物が、プロピルプロパンチオスルホナート（PTSO）である、請求項１６～１９のいずれか１項に記載の物品、方法又は組成物。
  21. 前記組成物が、抗菌剤、好ましくは抗真菌剤又は抗生物質から選択される抗菌剤、を更に含む、請求項１６～２０のいずれか１項に記載の物品、方法又は組成物。
  22. 前記組成物が、抗炎症剤を更に含む、請求項１６～２１のいずれか１項に記載の物品、方法又は組成物。
  23. 前記組成物が下記の式IIに従う化合物を更に含む及び／又は前記組成物が下記の式IIIを有する化合物を更に含む、請求項１６～２２のいずれか１項に記載の物品、方法又は組成物
    Figure 2023518928000059
     ここで、R3及びR4は独立して、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルケニル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキルから選択される、但し、式IIは下記でない
    Figure 2023518928000060
    Figure 2023518928000061
     ここで、nは、1、2又は3であり、並びにR1及びR2は独立して、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルケニル、置換されていてもよい直鎖又は分岐のアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキルから選択される、但し、式IIIは下記でない。
    Figure 2023518928000062
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