FR3071505A1 - Capsules bactericides ou bacteriostatiques ou antifongiques comprenant des cellules vivantes et leurs utilisations - Google Patents

Capsules bactericides ou bacteriostatiques ou antifongiques comprenant des cellules vivantes et leurs utilisations Download PDF

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Abstract

La présente invention concerne une composition comprenant une phase continue aqueuse et au moins une capsule, ladite capsule comprenant un cœur, liquide ou au moins en partie gélifié ou au moins en partie thixotrope, et au moins une enveloppe externe encapsulant totalement ledit cœur à sa périphérie, dans laquelle ladite capsule comprend au moins une cellule vivante, et dans laquelle ladite phase aqueuse continue comprend au moins un polymère antimicrobien et/ou antifongique.

Description

CAPSULES BACTERICIDES OU BACTÉRIOSTATIQUES OU ANTIFONGIQUES COMPRENANT DES CELLULES VIVANTES ET LEURS UTILISATIONS
La présente invention a pour objet une composition comprenant des capsules bactéricides ou bactériostatiques comprenant des cellules vivantes ainsi que leurs utilisations, notamment dans des kits.
Les demandes internationales WO 2016/062836 et WO 2013/113855 décrivent des capsules comprenant un cœur liquide et au moins une enveloppe externe encapsulant totalement le cœur liquide à sa périphérie, lesdites capsules comprenant des cellules vivantes, respectivement, végétales et eucaryotes de mammifères. L'encapsulation de cellules vivantes et la culture en capsules de ces cellules vivantes, en particulier des micro-algues, présentent certains avantages par rapport aux procédés classiques. En particulier, les cellules encapsulées sont protégées des contraintes mécaniques, telles que le cisaillement, diminuant ainsi la mort cellulaire au cours du procédé de culture des cellules. On obtient ainsi des objets « solides >> plus facilement manipulables, à l’échelle de procédés industriels de type mélange, brassage, filtrage, lavage et décantage, et il est également plus facile de manipuler ces objets, et donc la biomasse qu’ils encapsulent, pour faciliter la caractérisation différentielle des échantillons.
Pour des raisons évidentes, la culture de cellules vivantes, qui plus est pour des finalités industrielles d’ordre alimentaire, pharmaceutique ou cosmétique, requiert de travailler dans des conditions sans contaminations. Toutefois, travailler dans une enceinte stérile est coûteux et contraignant.
Dans le cas d’une contamination de la phase continue dans laquelle sont conservées les capsules susmentionnées, ces dernières s’avèrent avantageuses en ce qu’elles permettent de limiter le passage d’organismes cellulaires non désirés à travers l’enveloppe externe. Toutefois, il demeure nécessaire de mettre en œuvre des moyens pour lutter contre les contaminations, notamment bactériennes, au niveau de la phase continue en tant que telle. De tels moyens sont connus. A ce titre, on peut citer les molécules ayant des propriétés bactériostatiques ou bactéricides, telles que les antibiotiques, le chlore, l’alcool à 70°, l’azoture de sodium, les conservateurs, l’argent, le formaldéhyde ou l’oxyde d’éthylène ; ou encore des moyens physiques comme les radiations ionisantes (rayons gamma) et non-ionisantes (UV), la chaleur ou la filtration à 0,2 pm.
Cependant, mis à part les antibiotiques, aucun moyen parmi ceux cités cidessus n’est compatible avec la culture de cellules vivantes en capsules. En effet, ces moyens ne permettent pas de tuer spécifiquement les cellules contaminantes à l’extérieur des capsules sans impacter le contenu des capsules. L’utilisation de particules d’argent suffisamment grosses pour ne pas pénétrer dans la capsule est exclue car il a été montré qu’un agent cytotoxique, l’ion argent, est libéré par de telles particules et diffuse sans problème dans les capsules. Quant aux antibiotiques, ils posent des problèmes environnementaux et de développement de résistance et, pour des raisons évidentes, sont incompatibles avec certains domaines industriels tels que l’alimentaire ou la cosmétique. Egalement, les conservateurs, notamment en cosmétique, sont de plus en plus critiqués car suspectés d’être cancérogènes et/ou de perturber le système hormonal. Par ailleurs, la filtration de la phase continue à 0,2 pm impose une étape préliminaire d’isolement des capsules et, en tant que telle, est bien trop lente pour satisfaire aux exigences industrielles. Enfin, le lavage des capsules pour se débarrasser des contaminants présents en phase continue ne permet pas de lutter efficacement contre les contaminations. Par exemple, dans le cas des bactéries, il reste toujours des bactéries adsorbées sur la surface des capsules ce qui anéantit les efforts de lavage. Il devient alors très difficile de garantir la propreté microbiologique de la composition correspondante dans des conditions normales d'utilisation et sur une échelle de temps raisonnable qui peut s'étendre de plusieurs semaines à plusieurs mois.
La présence de bactéries dans la phase continue peut en outre être préjudiciable à la croissance des cellules vivantes, et donc aux rendements de production attendus, notamment dans le cas où les cellules vivantes d’intérêt ont un cycle de division lent. En effet, les bactéries consomment alors une partie significative des nutriments du milieu de culture présent en phase continue qui n’est donc plus à disposition des cellules vivantes pour assurer leur développement.
Pour contourner ce problème de contamination, la culture d’algues, notamment de microalgues, est aujourd’hui réalisée en milieu autotrophe (notamment photosynthèse), ce qui a pour inconvénient de présenter des rendements faibles.
Il demeure donc un besoin de mettre au point un moyen de prévenir et/ou lutter efficacement contre les contaminations en phase continue sans impacter le contenu des capsules, et notamment les cellules vivantes encapsulées, et en particulier sans altérer la croissance desdites cellules, et qui soit aisé à mettre en oeuvre et peu onéreux de manière à demeurer compatible à une échelle industrielle.
La présente invention a donc pour but de fournir un moyen permettant de lutter efficacement contre les contaminations en phase continue mais sans altérer le contenu des capsules, et en particulier les cellules vivantes qu’elles contiennent.
La présente invention a donc pour but de fournir un moyen simple et peu onéreux permettant de lutter efficacement contre les contaminations en phase continue tout en maintenant intact le contenu des capsules.
En particulier, la présente invention a pour but de fournir un moyen de prévenir et/ou de lutter efficacement contre les contaminations en phase continue sans impacter le contenu des capsules, et notamment les cellules vivantes encapsulées, pour améliorer la croissance desdites cellules vivantes, et donc les rendements de production, ce qui est un aspect particulièrement important dans le domaine industriel.
Ainsi, la présente invention concerne une composition comprenant une phase continue aqueuse et au moins une capsule, ladite capsule comprenant un cœur, liquide ou au moins en partie gélifié ou au moins en partie thixotrope, et au moins une enveloppe externe encapsulant totalement ledit cœur à sa périphérie, dans laquelle au moins une capsule comprend au moins une cellule vivante, et dans laquelle ladite phase aqueuse continue comprend au moins un polymère antimicrobien et/ou antifongique.
Avantageusement, l’enveloppe externe comprend (ou est formée d j au moins un polyélectrolyte à l’état gélifié.
Contre toute attente, les inventeurs ont observé que la mise en œuvre en phase continue d’un polymère antimicrobien et/ou antifongique permet de prévenir/lutter efficacement contre les contaminations en phase continue sans impacter négativement le contenu des capsules, en particulier les cellules vivantes présentes dans les capsules.
La présente invention a également pour objet un procédé de culture de cellules vivantes, notamment de cellules végétales, ainsi qu’un procédé de production de composés d’intérêts produits par lesdites cellules vivantes, si nécessaire après élicitation.
Avantageusement, une composition selon l’invention est donc dénuée de conservateur chimique, à l’image par exemple du phénoxyéthanol ou du pentylène glycol, et/ou d’antibiotique, à l’image par exemple de l'ampicilline ou de la pénicilline.
Phase continue aqueuse
Les compositions selon l’invention comprennent une phase continue aqueuse dans laquelle sont contenues les capsules et contenant en outre au moins un polymère antimicrobien et/ou antifongique.
Selon l’invention, la phase continue présente un pH compatible avec la survie du microorganisme encapsulé et les propriétés antimicrobiennes et/ou antifongiques du/des polymère(s) antimicrobien(s) et/ou antifongique(s) mis en oeuvre.
De préférence, la phase continue ne comprend pas de conservateur, par exemple parabens ou phénoxyéthanol, ni d’antibiotique.
Selon un mode de réalisation, la phase continue aqueuse comprend un milieu de culture. En particulier, selon l’invention, la phase continue aqueuse peut jouer le rôle de milieu de culture.
De préférence, la phase continue est un milieu de culture adapté qui présente l’avantage de prévenir le gonflement et la destruction des capsules.
Selon un mode de réalisation, un milieu de culture adapté selon l’invention présente une osmolarité satisfaisante, comparable à celle des milieux classiquement utilisés. L’osmolarité est le nombre de moles de soluté dissoutes par litre de solvant. Cette grandeur est directement reliée à la pression osmotique. Or un milieu avec une osmolarité trop forte (hypertonique) ou trop faible (hypotonique) provoque chez les cellules des phénomènes d’osmose qui affectent sa physiologie.
En fonction des cellules présentes, l’homme du métier est apte à sélectionner le milieu de culture approprié.
Selon un mode de réalisation préféré, la phase continue aqueuse comprend un milieu de culture, nommé MC2, qui est par exemple choisi parmi le milieu de culture d'Erdschreiber, le milieu F/2, le milieu TAP, de l’eau de mer reconstituée, le milieu DM (diatomée), le milieu Minimum, et l’un quelconque de leurs mélanges.
Avantageusement, la phase continue aqueuse comprend un milieu de culture, nommé MC2, tel que décrit ci-dessus adapté de manière à supprimer les chélatants du calcium et/ou ajouter une faible quantité d’au moins un sel de calcium, par exemple de chlorure de calcium (1 mM). De tels milieux présentent alors une compatibilité améliorée avec l’enveloppe externe des capsules selon l’invention.
Au vu de ce qui précède, la présente invention est particulièrement avantageuse en ce qu’elle autorise la culture des cellules vivantes en milieu hétérotrophe (i.e. catabolisation d'un substrat carboné), ce qui conduit à une amélioration substantielle de la vitesse des cycles de division et/ou des rendements de production par rapport à une culture de cellules vivantes en milieu autotrophe.
L’osmolarité du milieu de culture MC2 est de préférence comprise entre 10 mOsm et 1 000 mOsm.
Le milieu de culture d’Erdschreiber est une solution comprenant NaCI (11,4 g/L), Tris (5,90 g/L), NH4CI (2,92 g/L), KCI (0,73 g/L), K2HPO4.2H2O (72 mg/L), FeSO4.2H2O (1,9 mg/L), H2SO4 (0,04 mg/L), MgSO4 (7,65 g/L), CaCI2 (1,43 g/L), NaNO3 (2 mg/L), Na2HPO4 (0,2 mg/L), un extrait de sol (24,36 mL/L) et de l’eau (QSP 1 L). Un extrait de sol désigne le filtrat obtenu par filtration d’un mélange de terre et d’eau.
Le milieu F/2, commercialement disponible (notamment à l’Ecole des Sciences Biologiques de l’Université du Texas, ou chez Varicon Aqua), est une solution comprenant NaNO3 (8,82.10-4 mol/L), NaH2PO4O.H2O (3,62.10-5 mol/L), Na2SiO3.9H2O (1,06.10-4 mol/L), FeCI3.6H2O (1,17.10-5 mol/L), Na2EDTA.2H2O (1,17.10-5 mol/L), CuSO4.5H2O (3,93.10-8 mol/L), Na2Mo04.2H20 (2,60.10-8 mol/L), ZnSO4.7H2O (7,65.10-8 mol/L), CoCI2.6H20 (4,20.10-8 mol/L), MnCI2.4H2O (9,10.10-7 mol/L), thiamine HCl (2,96.10-7 mol/L), biotine (2,05.10-9 mol/L), cyanocobalamine (3,69.10-10 mol/L) et de l’eau (QSP 1 L).
Le milieu TAP, commercialement disponible, (notamment chez LifeTech), est un mélange de tampon Beijerincks (2x) (50 mL), de tampon phosphate 1M pH 7 (1 mL), de Solution trace (1 mL), d’acide acétique (1 mL) et d’eau (QSP 1 L). Les compositions des tampons Beijerincks (2x) et phosphate 1M pH 7 et de la Solution trace sont décrites dans les exemples ci-après. Le pH du milieu TAP est de 7,3. L’osmolarité du milieu TAP est de 60 mOsm.
L’eau de mer reconstituée est une solution comprenant NaCI (11,7 g/L), Tris (6,05 g/L), NH4CI (3,00 g/L), KCI (0,75 g/L), K2HPO4.2H2O (74,4 mg/L), FeSO4.2H2O (2 mg/L), H2SO4 (0,05 mg/L), MgSO4 (7,85 g/L), CaCI2 (1,47 g/L) et de l’eau (QSP 1 L). Le pH de l’eau de mer reconstituée varie de 7,5 à 8,4. L’osmolarité de l’eau de mer reconstituée est de 676 mOsm.
Le milieu DM (diatomée) est une solution comprenant Ca(NO3)2 (20 g/L), KH2PO4 (12,4 g/L), MgSO4.7H2O (25 g/L), NaHCO3 (15,9 g/L), FeNaEDTA (2,25 g/L), Na2EDTA (2,25 g/L), H3BO3 (2,48 g/L), MnCI2.4H2O (1,39 g/L), (NH4)6Mo7024.4H20 (1 g/L), cyanocobalamine (0,04 g/L), thiamine HCl (0,04 g/L), biotine (0,04 g/L), NaSiO3.9H2O (57 g/L) et de l’eau (QSP 1 L).
Le milieu Minimum est un mélange de tampon Beijerincks (2x) (50 mL), de tampon phosphate (2x) (50 mL), de Solution trace (1 mL) et d’eau (QSP 1 L). Les compositions des tampons Beijerincks (2x) et phosphate (2x) et de la Solution trace sont décrites dans les exemples ci-après. L’osmolarité du milieu Minimum est de 37 mOsm.
Selon un mode de réalisation particulier, la phase aqueuse continue peut se présenter sous la forme d’une émulsion huile-dans-eau, ladite émulsion comprenant une phase aqueuse continue et une phase grasse dispersée sous forme de gouttes (G1), la taille des gouttes (G1) étant inférieure à 500 pm, de préférence inférieure à 400 pm, en particulier inférieure à 300 pm, mieux inférieure à 200 pm, en particulier inférieure à 100 pm, voire inférieure à 20 pm, et mieux inférieure à 10 pm. Préférentiellement, la taille des gouttes (G1) est inférieure à la taille des particules selon l’invention. Avantageusement, la taille des gouttes (G1) est comprise entre 0,1 pm et 200 pm, de préférence entre 0,25 pm et 100 pm, en particulier entre 0,5 pm et 50 pm, de préférence entre 1 pm et 20 pm, et mieux entre 1 pm et 10 pm, voire entre 3 pm et 5 pm.
Optionnellement, les gouttes (G1) comprennent une écorce résultant d’une réaction de coacervation interfaciale, notamment entre au moins un polymère anionique et au moins un polymère cationique, comme décrit par exemple dans WO 2012/120043.
Polymère antimicrobien et/ou antifongique
Comme indiqué ci-dessus, la phase aqueuse continue des compositions de l’invention comprennent au moins un polymère antimicrobien et/ou antifongique.
Par « antimicrobien >> au sens de la présente invention, on entend notamment désigner un polymère ayant un effet bactéricide (mort du germe) ou bactériostatique (le germe ne peut ni grandir ni se reproduire ; en d’autres termes, empêche la multiplication des germes sans les tuer).
Ce polymère antimicrobien et/ou antifongique permet donc de tuer ou d’empêcher le développement spécifiquement des contaminants à l’extérieur des capsules sans impacter le contenu desdites capsules.
De préférence, le polymère antimicrobien et/ou antifongique (ou polymère ayant une activité antimicrobienne et/ou antifongique) est présent dans la phase continue majoritairement sous une forme libre.
En effet, une adhésion du polymère antimicrobien et/ou antifongique avec l’alginate gélifié formant l’enveloppe externe des capsules peut être observée. Dans un tel cas, l’homme du métier saura ajuster la teneur minimale en polymère(s) antimicrobien(s) et/ou antifongique(s) pour assurer sa présence dans la phase continue sous une forme majoritairement libre. En d’autres termes, le polymère antimicrobien et/ou antifongique doit être mis dans une quantité suffisante de manière à ce que la concentration en polymère antimicrobien et/ou antifongique libre dans la phase continue assure l’effet antimicrobien et/ou antifongique recherché. Ainsi, de préférence, le polymère antimicrobien et/ou antifongique est mis en excès.
Outre l’absence d’interaction délétère vis-à-vis des cellules vivantes encapsulées, l'utilisation de polymères comme agents antimicrobiens et/ou antifongiques dans la présente invention présente plusieurs avantages, car ces produits présentent habituellement une activité à long terme, une toxicité résiduelle limitée, sont chimiquement stables, non volatils et ne pénètrent pas dans la peau.
La détermination de l’activité antimicrobienne et/ou antifongique d’un polymère relève des compétences générales de l’homme du métier. On peut à ce titre faire référence à la méthode d’évaluation de l’activité antimicrobienne d’un polymère décrite dans l’article de Materials 2016, 9, 599 (doi:10.3390/ma9070599) ou encore à celle décrite dans WO 97/30082.
Les polymères antimicrobiens et/ou antifongiques sont choisis parmi les polymères non aptes à pénétrer à l’intérieur des capsules, de manière à préserver l’intégrité du contenu des capsules, et en particulier la survie des cellules vivantes encapsulées. Cette incapacité à pénétrer dans les capsules peut résulter d’une taille (ou poids moléculaire) minimale supérieure au diamètre moyen des pores de l’enveloppe gélifiée des capsules selon l’invention (on peut aussi parler du diamètre de coupure) et/ou de sa polarité telle que des liaisons faibles, en particulier liaisons électrostatiques, avec le polyélectrolyte constituant l’enveloppe externe des capsules sont créées.
Ainsi, un polymère antimicrobien et/ou antifongique selon l’invention présente un poids moléculaire supérieur à 10 000 Da, de préférence supérieur à 100 000 Da, et/ou est un polymère cationique.
De préférence, le polymère antimicrobien et/ou antifongique a un poids moléculaire compris entre 10 000 Da et 300 000 Da, de préférence entre 100 000 Da et 200 000 Da.
De préférence, le polymère antimicrobien et/ou antifongique est un polymère cationique.
Le caractère cationique du polymère antimicrobien et/ou antifongique assure la création de liaisons faibles, en particulier de liaisons électrostatiques, avec le polyélectrolyte constituant l’enveloppe externe des capsules ; le polymère antimicrobien et/ou antifongique ne peut donc pas diffuser à travers l’enveloppe externe. C’est pourquoi il peut exercer son activité bactériostatique et/ou antifongique dans la phase continue exclusivement.
Selon un mode de réalisation, le polymère antimicrobien et/ou antifongique est un polymère cationique ayant une unité répétitive comprenant au moins une fonction amine.
Les polymères antimicrobiens et/ou antifongiques selon l’invention peuvent être d’origine naturelle ou synthétique, de préférence d’origine naturelle.
La sélection de polymères antimicrobiens et/ou antifongiques selon l’invention relève des connaissances générales de l’homme du métier.
En tenant compte des critères susmentionnés en termes de poids moléculaires et/ou de polarité, le polymère antimicrobien et/ou antifongique peut être choisi parmi les polymères antimicrobiens et/ou antifongiques décrits ci-après.
Plus particulièrement, les polymères antimicrobiens et/ou antifongiques selon l’invention peuvent être choisis parmi (i) les polymères biocides, qui sont des polymères à activité antimicrobienne et/ou antifongique intrinsèque ; (ii) les biocides polymériques, qui sont basés sur un squelette polymérique sur lequel sont fixées des molécules biocides ; et (iii) des polymères libérant des biocides (i.e. « biocide9 releasing polymers »), qui sont des polymères chargés de molécules biocides ; et leurs mélanges.
De préférence, les polymères antimicrobiens et/ou antifongiques selon l’invention sont choisis parmi les polymères biocides, en particulier compte tenu de leur propriété particulièrement satisfaisante en termes de non-toxicité.
Polymères biocides
Les polymères biocides, à savoir à activité antimicrobienne et/ou antifongique intrinsèque, sont habituellement basés sur des polycations capables de tuer les microbes par action sur leur membrane cellulaire chargée négativement. Les groupes cationiques présents au niveau de ces polymères sont l’ammonium quaternaire, le phosphonium quaternaire, le guanidinium ou le sulfonium tertiaire.
Les polymères biocides peuvent être choisis parmi le chitosan ; la polylysine ; les polymères cationiques contenant des sels de phosphonium quaternaire (QPS) ou des sels d’ammonium quaternaire (QAS) tels que le poly((2-méthacryloxyéthyl)triéthylammonium), le poly(p-vinylbenzyltétraméthylènesulfonium tétrafluoroborate), le tributyl(4-vinylbenzyl)phosphonium (QPM), le chlorure de [2(acryloyloxy)éthyl]triméthylammonium (ATC) ; les polymères antimicrobiens et/ou antifongiques zwitterioniques (ou amphiphiles) tels que les ammonium éthyl méthacrylate homopolymères (AEMPs) ; les poly(éthylèneamines) ; les poly(éthylèneimines) ; les poly(vinylamines) ; la polyarginine ; la polyornithine ; la polyaniline ; l’androctonine telle que décrite dans WO 97/30082 ; un de leurs dérivés ; et leurs mélanges, de préférence la polylysine.
Biocides polymériques
Les biocides polymériques sont préparés par la fixation de plusieurs molécules biocides connues à un polymère.
Les biocides polymériques sont constitués d’un squelette polymérique dans lesquels des molécules biocides (par exemple des antibiotiques) sont fixées pour fournir une activité antimicrobienne et/ou antifongique. Dans certains cas, en modifiant la structure de polymères non antimicrobiens et/ou non antifongiques, il est possible d'induire une activité antimicrobienne et/ou antifongique.
A titre illustratif, on peut citer le Ν,Ν,Ν-triméthyl chitosan (TMC), les dérivés de chitosan-sulfonamide, le dodecenyl phthaloyl chitosan succinylé, et leurs mélanges.
Polymères libérant des biocides
Les polymères libérant des biocides sont basés sur des matrices polymériques chargées de molécules biocides, qui peuvent être piégées en utilisant différentes méthodes, ou des polymères contenant des biocides attachés par des liaisons clivables.
Pour des raisons évidentes, les biocides libérés ne doivent pas être aptes à pénétrer dans les capsules. Cette sélection relève des connaissances générales de l’homme du métier à la lumière de l’enseignement de la présente description.
Selon un mode particulièrement avantageux, le polymère antimicrobien et/ou antifongique est la polylysine, notamment la poly-L-lysine ou la poly-D-lysine, ou leurs mélanges, ou l’un de ses dérivés. Préférentiellement, le polymère antimicrobien et/ou antifongique est la poly-L-lysine.
On peut notamment citer la poly-L-lysine P5899 commercialisée par SigmaAldrich (Mw >300 kDa).
A titre de dérivés de la polylysine (PLL), on peut citer le complexe électrostatique entre la polylysine et la gomme arabique qui présente l’avantage de prévenir la turbidité de la phase aqueuse et/ou la sédimentation de la PLL dans ladite phase aqueuse ; ou encore les hydrogels de polylysine greffés avec des groupes méthacrylamide.
Selon l’invention, le polymère antimicrobien et/ou antifongique doit être mis en oeuvre dans la phase aqueuse continue dans une quantité suffisante de manière à ce que la concentration en polymère antimicrobien et/ou antifongique libre dans la phase continue assure l’effet antimicrobien et/ou antifongique recherché et cela, même en présence d’une réaction entre ledit polymère antimicrobien et/ou antifongique et l’enveloppe externe, optionnellement gélifiée, des capsules. Cette quantité suffisante relève des connaissances générales de l’homme du métier à la lumière de l’enseignement de la présente description
Par « quantité suffisante », notamment dans le cas d’un polymère antimicrobien et/ou antifongique cationique, on entend au sens de la présente invention une teneur en polymère(s) antimicrobien(s) et/ou antifongique(s) cationique(s) dans la phase continue supérieure à 10-4 %, de préférence supérieure ou égale à 10-3 %, par rapport au poids total de ladite phase continue.
Selon un mode de réalisation préféré, la composition selon l’invention comprend une teneur supérieure à 104%, de préférence supérieure ou égale à 10 3%, en poids de polymère(s) antimicrobien(s) et/ou antifongique(s), notamment de polymère(s) cationique(s) antimicrobien(s) et/ou antifongique(s), par rapport au poids total de la phase continue.
Selon un mode de réalisation, la phase continue aqueuse selon l’invention peut comprendre en outre au moins un antibiotique.
Pour des raisons évidentes, l’antibiotique ne doit pas être apte à pénétrer dans les capsules et/ou ne doit pas être délétère pour le milieu encapsulé, en particulier les cellules vivantes encapsulées. La sélection de tels antibiotiques relève des connaissances générales de l’homme du métier à la lumière de l’enseignement de la présente description. A titre illustratif, on peut citer l’ampicilline, non délétère pour les micro-algues.
La présence de cet antibiotique en combinaison avec le polymère antibactérien et/ou antifongique peut permettre d’obtenir un effet synergique par rapport à l’utilisation du polymère antibactérien et/ou antifongique seul.
Parmi les antibiotiques, on peut citer par exemple les composés suivants : novobiocine, ceftazidime, ampicilline, ticarcilline, carbenicilline, piperacilline, cefotaxime, chloramphenicol, rifampine, norfloxacine, et leurs mélanges.
Capsules
Les capsules selon l’invention, de type cœur/écorce (ou core/shell), comprennent au moins une cellule vivante.
Cellules vivantes
Les cellules présentes dans les capsules de l’invention peuvent être de tout type.
On peut notamment citer les cellules procaryotes, les cellules eucaryotes, et leur mélange. Ainsi, selon un mode de réalisation, dans une composition selon l’invention, la ou les cellules vivantes sont choisies parmi les cellules procaryotes ou eucaryotes.
Selon un mode de réalisation, la ou les cellules vivantes sont choisies parmi les cellules animales ou végétales, et sont de préférence choisies parmi les cellules végétales.
Les cellules encapsulées selon l’invention peuvent être des cellules animales (en particulier de mammifères) ou végétales, en particulier des algues et microalgues, des bactéries, des protistes, des champignons ou des archéobactéries (archées), et les mélanges de celles-ci.
On peut également mentionner les probiotiques.
Les cellules présentes dans les capsules de l’invention peuvent être des cellules adhérentes ou non adhérentes.
Au vu de ce qui précède, les cellules présentes dans la phase interne des capsules sont sous une forme vivante. Elles ne sont donc pas des cellules sous un état lyophilisé, ou sous forme de lysat, mort ou inactivé.
De préférence, les cellules sont des cellules végétales.
Avantageusement, les cellules présentes dans la phase interne des capsules sont en suspension dans la phase interne.
Par « en suspension >> dans la phase interne, on entend que les cellules n’adhèrent pas à la membrane externe, optionnellement gélifiée, des capsules, et ne sont pas en contact prolongé avec ladite membrane. Les cellules vivantes sont ainsi totalement baignées dans le milieu constituant la phase interne et sont libres de se déplacer selon les trois dimensions.
En particulier, les cellules vivantes utilisées selon l’invention sont des cellules aptes à produire une molécule d’intérêt, le cas échéant par élicitation.
Selon un mode de réalisation, les capsules de l’invention comprennent au moins une cellule d’algue (aussi appelée cellule algale), de préférence une cellule de micro-algue.
Selon une variante, les capsules de l’invention comprennent plusieurs cellules d’algue, d’une même espèce ou d’espèces différentes.
Les algues sont des êtres vivants capables de photosynthèse dont le cycle de vie se déroule généralement en milieu aquatique. Chez les algues, on trouve des procaryotes (cyanobactéries) ou des eucaryotes (plusieurs ensembles très divers).
Le terme « micro-algues >> désigne des algues microscopiques. Ce sont des êtres unicellulaires ou pluricellulaires indifférenciés, photosynthétiques, eucaryotes ou procaryotes.
A titre d’algue utilisable dans les capsules de l’invention, on peut citer une algue verte, une algue rouge, une algue brune, et leur mélange.
Selon un mode de réalisation, il s’agit d’une algue procaryote.
Selon un autre mode de réalisation, il s’agit d’une algue eucaryote.
L’algue est de préférence du genre Chlamydomonas, comme Chlamydomonas reinhardtii, ou du genre Peridinium, comme Peridinium cinctum.
D’autres algues convenables à la mise en oeuvre de l’invention peuvent être choisies dans le groupe constitué de Alexandrium minutum, Amphiprora hyalina, Anabaena cylindrica, Arthrospira platensis, Chattonella verruculosa, Chlorella vulgaris, Chlorella protothecoides, Chysochromulina breviturrita, Chrysochromulina kappa, Dunaliella salina, Dunaliella minuta, Emiliania huxleyi (Haptophyta), Gymnodinium catenatum, Gymnodinium nagasakiense, Haematococcus pluvialis, Isochrysis galbana, Noctiluca scintillans, Odontella aurita, Oryza sativa, Ostreococcus lucimarinus, Pavlova utheri, Porphyridium cruentum, Spirodela oligorrhiza, Spirulina maxima, Tetraselmis tetrathele, Thalassiosira pseudonana, et leurs mélanges.
Selon un mode de réalisation, le cœur des capsules est monophasique ou comporte une goutte intermédiaire d’une phase intermédiaire, la phase intermédiaire étant placée au contact de l’enveloppe externe, et au moins une goutte interne d’une phase interne disposée dans la goutte intermédiaire, au moins une des phases parmi la phase intermédiaire et/ou la phase interne comprend au moins une cellule vivante.
Selon un mode de réalisation, la capsule de l’invention est une capsule dite « simple >>, signifiant que le cœur est constitué d’une seule phase. Une capsule « simple >> est par exemple une capsule telle que décrite dans la demande internationale WO 2010/063937.
Selon un mode de réalisation, lorsque le cœur des capsules est monophasique, la ou les cellules vivantes sont présentes dans le cœur des capsules.
Selon un mode de réalisation, lorsque les capsules comprennent une phase intermédiaire, la ou les cellules vivantes sont présentes dans le cœur et/ou dans ladite phase intermédiaire.
Enveloppe externe
Selon l’invention, l’enveloppe externe des capsules selon l’invention peut être de tout type connu de l’homme du métier, sous réserve que sa composition ne soit pas préjudiciable à la survie / croissance des cellules vivantes encapsulées et empêche l’entrée du/des polymère(s) antimicrobien(s) et/ou antifongique(s) dans lesdites capsules.
Egalement, la nature de l’enveloppe externe est avantageusement compatible avec le(s) domaine(s) d’application envisagé(s), et notamment avec le domaine cosmétique.
Selon l’invention, l’enveloppe externe des capsules comprend typiquement au moins un polyélectrolyte à l’état gélifié. Cette enveloppe externe peut être également nommée « enveloppe gélifiée >>.
On entend par « enveloppe gélifiée >> une phase externe entourant au moins partiellement une phase interne, et comprenant un composé à l’état gélifié ou sous forme de gel. De préférence, l’enveloppe gélifiée est une phase aqueuse, et typiquement un hydrogel d’un polyélectrolyte à l’état gélifié. L’enveloppe gélifiée peut également être désignée par les termes « membrane >> ou « écorce >>.
De préférence, l’enveloppe gélifiée a une épaisseur inférieure à 500 pm, avantageusement supérieure à 10 pm. L’enveloppe gélifiée est généralement formée par une monocouche d’un matériau homogène.
L’enveloppe gélifiée comprend de préférence un gel contenant de l’eau et un polyélectrolyte avantageusement choisi parmi les protéines, les polysaccharides naturels et les polyélectrolytes réactifs aux ions multivalents.
Par « polyélectrolyte réactif aux ions polyvalents >>, on entend, au sens de la présente invention, un polyélectrolyte susceptible de passer d’un état liquide dans une solution aqueuse à un état gélifié sous l’effet d’un contact avec une solution gélifiante contenant des ions multivalents tels que des ions d’un métal alcalinoterreux choisis par exemple parmi les ions calcium, les ions baryum, les ions magnésium.
Dans l’état liquide, les chaînes individuelles de polyélectrolyte sont sensiblement libres de s’écouler les unes par rapport aux autres. Une solution aqueuse de 2% en masse de polyélectrolyte présente alors un comportement purement visqueux aux gradients de cisaillement caractéristiques du procédé de mise en forme. La viscosité de cette solution à cisaillement nul est entre 50 mPa.s et 10 000 mPa.s avantageusement entre 3 000 mPa.s et 7 000 mPa.s. Cette viscosité aux gradients de cisaillements caractéristiques des écoulements mises en jeu lors de la fabrication des capsules est par exemple mesurée à l’aide d’un rhéomètre à contrainte, ou déformation, imposée à la température de fabrication, 25°C par exemple. Pour les mesures, on utilisera une géométrie cône-plan de diamètre compris de 10 à 50 mm, et un angle du cône de 2° maximum.
Les chaînes individuelles de polyélectrolyte dans l’état liquide présentent avantageusement une masse molaire supérieure à 65 000 g/moles.
Dans l’état gélifié, les chaînes individuelles de polyélectrolyte forment, avec les ions multivalents, un réseau tridimensionnel cohérent qui retient le cœur liquide et empêche son écoulement. Les chaînes individuelles sont retenues les unes par rapport aux autres et ne peuvent pas s’écouler librement les unes par rapport aux autres. Dans cet état, la viscosité du gel formé est infinie. De plus, le gel a un seuil de contrainte à l’écoulement. Ce seuil de contrainte est supérieur à 0,05 Pa. Le gel possède également un module d’élasticité non-nul et supérieur à 35 kPa.
Le gel tridimensionnel de polyélectrolyte contenu dans l’enveloppe emprisonne de l’eau et l’agent tensioactif lorsqu’il est présent. La teneur massique du polyélectrolyte dans l’enveloppe est par exemple comprise de 0,5% à 5% par rapport à la masse totale de l’enveloppe.
Le polyélectrolyte est de préférence un polymère biocompatible inoffensif pour le corps humain. Il est par exemple produit biologiquement.
Avantageusement, il est choisi parmi les polysaccharides, les polyélectrolytes de synthèse à base d’acrylates (polyacrylate de sodium, de lithium, de potassium ou d’ammonium, ou polyacrylamide), les polyélectrolytes de synthèse à base de sulfonates (polystyrène sulfonate) de sodium, par exemple). Plus particulièrement, le polyélectrolyte est choisi parmi les alginates d’alcalino-terreux, tel qu’un alginate de sodium ou un alginate de potassium, une gellane ou une pectine.
Selon un mode de réalisation de l’invention, le polyélectrolyte est un alginate de sodium.
Les alginates sont produits à partir d’algues brunes appelées « laminaires », désignées par le terme anglais « sea weed >>.
De tels alginates présentent avantageusement une teneur en a-L-guluronate supérieure à environ 50%, de préférence supérieure à 55%, voire supérieure à 60%.
L’enveloppe gélifiée peut contenir en outre au moins un agent tensioactif.
L’agent tensioactif est avantageusement un tensioactif anionique, un tensioactif nonionique, un tensioactif cationique ou un mélange de ceux-ci. La masse moléculaire de l’agent tensioactif est comprise entre 150 g/mol et 10 000 g/mol, avantageusement entre 250 g/mol et 1 500 g/mol.
Selon un mode de réalisation de l’invention, l’agent tensioactif est le laurylsulfate de sodium (SLS ou SDS).
La teneur massique en agent tensioactif dans l’enveloppe est supérieure à 0,001% et est avantageusement supérieure à 0,1%.
Selon un mode de réalisation, une capsule selon l’invention est une capsule qui comprend un cœur liquide ou au moins en partie gélifié ou au moins en partie thixotrope et une enveloppe externe, optionnellement gélifiée, encapsulant totalement ledit cœur liquide, ledit cœur étant monophasique.
Un tel type de particules correspond alors à une capsule simple comprenant deux phases distinctes, une phase interne liquide ou au moins en partie gélifié ou au moins en partie thixotrope et une phase externe, optionnellement à l’état gélifié, entourant la phase interne. Avantageusement, le rapport du volume du cœur au volume de l’enveloppe externe, optionnellement gélifiée, est compris entre 1 et 50, de préférence entre 1 et 10, et mieux entre 1 et 2.
Selon un mode de réalisation particulier, une capsule selon l’invention est une capsule qui comprend un cœur liquide ou au moins en partie gélifié ou au moins en partie thixotrope et une enveloppe externe, optionnellement gélifiée, encapsulant totalement ledit cœur, ledit cœur comportant une goutte intermédiaire d’une phase intermédiaire, la phase intermédiaire étant placée au contact de l’enveloppe externe, optionnellement gélifiée, et au moins une, de préférence une unique, goutte interne d’une phase interne disposée dans la goutte intermédiaire. Avantageusement, le rapport du volume du cœur au volume de l’enveloppe externe, optionnellement gélifiée, est supérieur à 2, avantageusement est inférieur à 50, et de préférence est compris entre 5 et 10. La phase intermédiaire est par exemple réalisée à base d’une solution aqueuse ou huileuse. Avantageusement, lorsque la phase intermédiaire est aqueuse, la phase interne est huileuse, et à l’inverse lorsque la phase intermédiaire est huileuse, la phase interne est aqueuse.
Un tel type de capsule correspond alors à une capsule complexe signifiant que le cœur liquide, visqueux ou thixotrope, comporte une unique goutte intermédiaire d’une phase intermédiaire, la phase intermédiaire étant placée au contact de l’enveloppe externe, optionnellement gélifiée, et au moins une, de préférence une unique, goutte interne d’une phase interne disposée dans la goutte intermédiaire.
Selon une variante, le cœur comprend une phase intermédiaire continue au sein de laquelle se trouve une pluralité de gouttes de phase(s) interne(s).
Selon un mode de réalisation, une capsule selon l’invention comprend un cœur liquide ou au moins en partie gélifié ou au moins en partie thixotrope et une enveloppe externe, optionnellement gélifiée, encapsulant totalement ledit cœur, ledit cœur comportant une goutte intermédiaire d’une phase huileuse, la phase huileuse étant placée au contact de l’enveloppe externe, optionnellement gélifiée, et au moins une goutte interne d’une phase aqueuse disposée dans la goutte intermédiaire.
Selon un autre mode de réalisation, une capsule selon l’invention comprend un cœur liquide ou au moins en partie gélifié ou au moins en partie thixotrope et une enveloppe externe, optionnellement gélifiée, encapsulant totalement ledit cœur, ledit cœur comportant une goutte intermédiaire d’une phase aqueuse, la phase aqueuse étant placée au contact de l’enveloppe externe, optionnellement gélifiée, et au moins une, de préférence une unique, goutte interne d’une phase huileuse disposée dans la goutte intermédiaire.
Pour des raisons évidentes, dans les deux modes de réalisation ci-dessus, les cellules vivantes sont nécessairement situées dans le cœur au niveau de la phase aqueuse.
Avantageusement, la phase intermédiaire comprend en outre au moins un agent gélifiant, notamment tel que défini ci-dessous. L’agent gélifiant contribue notamment à améliorer la suspension de la/les goutte(s) interne(s) disposée(s) dans la goutte intermédiaire des capsules de l’invention selon ce mode de réalisation. En d’autres termes, l’agent gélifiant permet de prévenir/éviter les phénomènes de crémage ou de sédimentation de la/les goutte(s) interne(s) disposée(s) dans la goutte intermédiaire des capsules de l’invention selon ce mode de réalisation.
Lorsque l’agent gélifiant est en phase aqueuse comprenant les cellules vivantes, l’homme du métier saura ajuster la nature et/ou quantité en agent(s) gélifiant(s) de manière à assurer la suspensivité souhaitée sans porter préjudice à la survie ou croissance desdites cellules vivantes.
De préférence, dans un mode de réalisation de type « capsule complexe >> tel que décrit précédemment, la phase comprenant les cellules vivantes est liquide.
Par « liquide >> au sens de la présente invention, on entend une phase, le échéant un gel, pouvant s'écouler sous son propre poids à température ambiante et pression atmosphérique.
Selon un mode de réalisation, une phase comprenant les cellules vivantes selon l’invention a une viscosité allant de 1 mPa.s à 500 000 mPa.s, de préférence de 10 mPa.s à 300 000 mPa.s, mieux de 400 mPa.s à 200 000 mPa.s, et plus particulièrement de 2 000 mPa.s à 150 000 mPa.s, telle que mesurée à 25°C.
La viscosité est mesurée à température ambiante, par exemple T=25°C ± 2°C, et à pression ambiante, par exemple 1013 hPa, par la méthode décrite dans WO2016/096995.
Selon un mode de réalisation, la phase intermédiaire de la capsule de l’invention comprend au moins une cellule vivante C1 et la phase interne comprend au moins une cellule vivante C2, C1 et C2 étant différentes l’une de l’autre. Avantageusement, C1 et C2 sont bénéfiques l’une vis-à-vis de l’autre (symbiose).
Selon un mode de réalisation, la phase intermédiaire ou la phase interne de la capsule de l’invention comprend au moins une cellule vivante, l’autre phase comprend au moins une phase grasse. Ce mode de réalisation est avantageux en ce qu’il permet d’apporter facilement du gras qui peut être utile pour la croissance des cellules vivantes encapsulées et/ou le screening de cellules vivantes, par exemple pour une identification aisée de cellules aptes à dégrader le pétrole.
La phase interne des capsules de l’invention est typiquement apte à la survie de la ou des cellules vivantes, notamment végétales, comprise(s) dans ladite phase interne.
De préférence, la phase interne comprend une solution tampon apte à la survie des cellules vivantes.
A titre de tampon utilisable, on peut utiliser tout tampon connu en soi pour être adapté à la survie de cellules vivantes.
La phase interne a de préférence un pH compris de 5 à 10, plus préférentiellement compris de 6 à 9.
Pour des raisons évidentes, la phase interne ne comprend pas de conservateur, par exemple parabens ou phénoxyéthanol.
Selon un mode de réalisation particulièrement adapté à la culture de cellules vivantes, la phase interne comprend des nutriments aptes à la prolifération de la ou des cellules vivantes.
De préférence, la phase interne comprend un milieu de culture appelé MC1 dans le cadre de la présente invention.
Par « milieu de culture », on entend une solution comprenant des nutriments aptes à la prolifération de la ou des cellules vivantes et jouant le rôle de tampon pH.
L’osmolarité du milieu de culture MC1 est de préférence comprise entre 10 mOsm et 1 000 mOsm.
Le milieu de culture MC1 est par exemple choisi parmi le milieu de culture d'Erdschreiber, le milieu F/2, le milieu TAP, de l’eau de mer reconstituée, le milieu DM (diatomée), le milieu Minimum, et l’un quelconque de leurs mélanges.
Selon un mode de réalisation, le cœur des capsules comprend un milieu de culture MC1, identique ou différent du milieu de culture MC2 défini plus haut.
Selon un mode de réalisation, la taille des capsules est inférieure à 5 mm, de préférence comprise entre 50 qm et 3 mm.
La culture de cellules vivantes en capsule impose d'avoir une diffusion optimale des nutriments présents dans la phase continue jusqu'au centre des capsules. Ainsi, il est préférable de travailler avec des capsules faisant quelques centaines de microns plutôt que quelques millimètres.
Lors de l’encapsulation des cellules vivantes (i.e. avant tout procédé de culture des cellules végétales), la phase interne (ou cœur) peut typiquement comprendre de 103 à 109, de préférence de 104 à 108, plus préférentiellement de 105 à 108, par exemple de 106 à 5.106 cellules vivantes, par millilitre de phase interne.
En fonction de la taille des capsules, la phase interne comprend typiquement de 1 à 107, préférentiellement de 5 à 106, de 30 à 5.105, de 50 à 105, de 75 à 5.104, de 100 à 104, de 150 à 104, voire de 200 à 103 cellules vivantes, par capsule.
Le comptage des cellules vivantes de la phase interne est préférentiellement réalisé avant l’encapsulation, ou bien après l’ouverture des capsules.
Le comptage des cellules vivantes peut être fait par la méthode de comptage Malassez. La cellule de Malassez est une lame de verre qui permet de compter le nombre de cellules en suspension dans une solution. Sur cette lame de verre, un quadrillage de 25 rectangles a été gravé, contenant eux-mêmes 20 petits carrés. Pour dénombrer les cellules, on dépose sur la cellule de Malassez entre 10 qL et 15 qL de phase interne comprenant des cellules en suspension. Après sédimentation, on compte le nombre de cellules dans 10 rectangles (quadrillés). Le volume d'un rectangle quadrillé étant de 0,01 qL, on multiplie ce nombre par 10 000 pour obtenir le nombre de cellules par millilitre de phase interne.
Alternativement, le comptage des cellules peut être fait par mesure d’absorbance. D’après la loi de Beer-Lambert, pour une longueur d’onde λ donnée, l’absorbance d’une solution est proportionnelle à sa concentration et à la longueur du trajet optique (distance sur laquelle la lumière traverse la solution). On peut donc mesurer la concentration en cellules de la phase interne en se basant sur une méthode de mesure d'absorbance (encore appelée densité optique). Il suffit pour cela de mesurer les densités optiques de phases internes contenant une quantité connue de cellules, ce qui permet de construire une courbe-étalon en fonction de la concentration cellulaire.
A titre d’exemple, la phase interne comprend un million de cellules vivantes par millilitre de phase interne avant tout procédé de culture, ce qui correspond à environ 60 cellules vivantes par capsule de 500 μιτι de diamètre.
Après un procédé de culture tel que décrit ci-après, la phase interne comprend typiquement de 50 millions à 40 milliards, de préférence de 100 millions à 30 milliards, et mieux de 150 millions à 20 milliards, de cellules vivantes par millilitre de phase interne.
Les capsules de l’invention sont typiquement préparées par un procédé comprenant les étapes suivantes :
- la mise en contact d’une première solution comprenant au moins une cellule vivante et d’une deuxième solution liquide comprenant au moins un composé A apte à former l’enveloppe, notamment au moins un polyélectrolyte à l’état liquide,
- la formation d’une goutte double comprenant une phase interne formée de la première solution et une phase externe liquide formée de la deuxième solution liquide,
- l’immersion de la goutte double dans une solution, contenant optionnellement un réactif B propre à assurer la formation de l’enveloppe, notamment une solution gélifiante contenant un réactif propre à gélifier le polyélectrolyte de la phase externe liquide (ou deuxième solution), ce par quoi on obtient la phase externe gélifiée, et
- la récupération des capsules formées.
Dans le cadre de la présente description, on entend par « goutte double >> une goutte constituée d’une phase interne et d’une phase externe liquide, encapsulant totalement ladite phase interne à sa périphérie. La production de ce type de goutte est généralement effectuée par co-extrusion concentrique de deux solutions, selon un mode hydrodynamique de dripping ou de jetting, tel que décrit dans les demandes WO 2010/063937 et FR2964017.
Lorsque la goutte double entre en contact de la solution gélifiante, le réactif propre à gélifier le polyélectrolyte présent dans la solution gélifiante forme alors des liaisons entre les différentes chaînes de polyélectrolyte présentes dans la phase externe liquide. Le polyélectrolyte à l’état liquide passe alors à l’état gélifié, provoquant ainsi la gélification de la phase externe liquide.
Sans vouloir être lié à une théorie particulière, lors du passage à l’état gélifié du polyélectrolyte, les chaînes individuelles de polyélectrolyte présentes dans la phase externe liquide se raccordent les unes aux autres pour former un réseau réticulé, aussi appelé hydrogel, qui emprisonne de l’eau contenue dans la phase externe.
Une phase externe gélifiée, propre à retenir la phase interne de première solution est ainsi formée. Cette phase externe gélifiée présente une tenue mécanique propre, c’est-à-dire qu’elle est capable d’entourer totalement la phase interne et de retenir la ou les cellules végétales présentes dans cette phase interne pour les retenir au cœur de la capsule gélifiée.
Les capsules selon l’invention séjournent dans la solution gélifiante le temps que la phase externe soit complètement gélifiée. Elles sont ensuite collectées et éventuellement plongées dans une solution aqueuse de rinçage, généralement essentiellement constituée d’eau et/ou de milieu de culture.
La taille des différentes phases formant initialement les gouttes doubles, et in fine les capsules, est généralement contrôlée par l’utilisation de deux pousseseringues indépendants (à l’échelle du laboratoire) ou de deux pompes (à l’échelle industrielle), qui fournissent respectivement la première solution et la deuxième solution liquide mentionnées ci-dessus.
Le débit Q, du pousse-seringue associé à la première solution contrôle le diamètre de la phase interne de la capsule finale obtenue.
Le débit Qo du pousse-seringue associé à la deuxième solution liquide contrôle l’épaisseur de la phase externe, optionnellement gélifiée, de la capsule finale obtenue.
Le réglage relatif et indépendant des débits Q, et Qo permet de commander l’épaisseur de la phase externe, optionnellement gélifiée, indépendamment du diamètre extérieur de la capsule, et de moduler le rapport volumique entre la phase interne et la phase externe.
Les capsules comprenant une phase intermédiaire sont généralement obtenues par co-extrusion concentrique de trois solutions, au moyen d’une triple enveloppe : un premier flux constitue la phase interne, un deuxième flux constitue la phase intermédiaire et un troisième flux constitue la phase externe. La production de telles capsules, dites « complexes », est notamment décrite dans la demande internationale WO 2012/089820.
A la sortie de la triple enveloppe, les trois flux entrent en contact et se forme alors une goutte multi-composante, qui est ensuite gélifiée lorsqu’elle est plongée dans une solution gélifiante, de la même manière que dans le procédé de préparation de capsules « simples >> décrit ci-dessus.
La phase interne et/ou la phase intermédiaire peut comprendre au moins une cellule vivante, de préférence une cellule végétale, notamment une cellule d’algue. Selon un mode de réalisation, la phase intermédiaire peut comprendre au moins une cellule vivante, de préférence une cellule végétale, notamment une cellule d’algue, qui peut être identique ou différente des cellules vivantes présentes dans la phase interne.
La phase intermédiaire, lorsqu’elle est présente et qu’elle comprend des cellules vivantes, est de préférence apte à la survie desdites cellules vivantes. Elle comprend avantageusement un milieu de culture apte à la culture desdites cellules, typiquement un des milieux de culture MC1 mentionnés ci-dessus pour la phase interne.
La phase intermédiaire, lorsqu’elle est présente et qu’elle comprend des cellules vivantes, comprend typiquement de 1 à 107, préférentiellement de 5 à 106, de 30 à 5.105, de 50 à 105, de 75 à 5.104, de 100 à 104, de 150 à 104, voire de 200 à 103 cellules vivantes, par capsule.
Selon un mode de réalisation, la composition de l’invention comprend au moins deux populations différentes de capsules qui diffèrent l’une de l’autre par la nature des actifs encapsulés, en particulier des cellules vivantes mises en oeuvre.
Une telle composition peut donc comprendre une population de capsules (C) telles que définies ci-dessus et comprenant au moins une cellule vivante C1 et une population de capsules (C’) telles que définies ci-dessus et comprenant au moins une cellule vivante C2, les cellules C1 et C2 étant différentes.
La présente invention concerne également un kit comprenant deux compositions séparées (A) et (B), dans lequel :
- la composition (A) est une composition telle que définie ci-dessus, et
- la composition (B) comprend un agent dépolymérisant.
Dans le cadre de la présente description, on entend par « compositions séparées >> des compositions distinctes, par exemple placées dans des compartiments différents. Ainsi, les compositions (A) et (B) sont disposées dans un même kit, mais ne peuvent pas entrer en contact dans le kit. Les compositions (A) et (B) sont donc des entités distinctes.
Dans le cadre de la présente description, on entend par « agent dépolymérisant >> un composé propre à fragiliser et/ou à rompre l’enveloppe externe, optionnellement gélifiée, de la capsule pour permettre la libération du cœur dans la phase continue.
La composition (B) peut également être désignée par l’expression « solution dépolymérisante >> ou « composition dépolymérisante >>.
Selon l’invention, l’agent dépolymérisant est choisi parmi des agents pas ou peu préjudiciables à la croissance, voire même la survie, des cellules vivantes encapsulées. Une telle sélection relève des connaissances générales de l'homme du métier.
De préférence, l’agent dépolymérisant de la composition (B) est choisi parmi les agents chélatants du calcium, les sels aptes à s’échanger avec le calcium, les enzymes aptes à dégrader les protéines ou les polysaccharides, et leurs mélanges.
Selon un mode de réalisation, l’agent dépolymérisant est un agent chélatant du calcium. Ces composés sont propres à former des complexes métalliques très stables. Ils sont propres à être liés à des cations métalliques sous forme d’une de ses bases conjuguées.
Parmi ces composés chélatants, on peut citer l’EDTA ou acide éthylène diamine tétra-acétique, l’EGTA ou acide éthylène glycol tétra-acétique, les éthers couronnes tels que le 1,13-diaza-21-couronne-7 ou le 1,10-diaza-18-couronne-6, les cryptands, ou encore les acides tels que l’acide citrique, l’acide acrylique, l’acide polyacrylique, l’acide phytique, acide phosphorique, acide tartrique, acide malique, ou plus généralement un polyacide, leurs sels inorganiques, tel qu’un sel de sodium ou de potassium, ou leurs esters, et leurs mélanges.
Selon une variante, l’agent dépolymérisant est un polymère ou un copolymère comportant au moins un monomère possédant une fonction acide libre après polymérisation. L’agent dépolymérisant est par exemple choisi parmi les polymères ou copolymères d’acide acrylique, d’acide méthacrylique, d’acide crotonique et d’acide maléique, leurs sels ou leurs esters.
L’agent dépolymérisant peut également être un sel apte à s’échanger avec les ions susceptibles de former le gel de l’enveloppe.
Selon une variante, l’agent dépolymérisant est choisi parmi les cations monovalents d’anions monovalents.
Selon un mode de réalisation de l’invention, l’agent dépolymérisant est l’acide citrique ou un de ses sels.
L’agent dépolymérisant est par exemple le citrate de sodium dihydraté.
La concentration massique en composé chélatant est notamment supérieure à 0,5% et est par exemple comprise de 2% à 30% par rapport à la masse totale de la composition (B).
De préférence, lorsque l’enveloppe externe, optionnellement gélifiée, des capsules de la composition (A) contient une protéine ou un polysaccharide naturel, l’agent dépolymérisant est une enzyme apte à dégrader les protéines ou les polysaccharides.
Parmi les enzymes aptes à dégrader les protéines, on peut citer l’Aquabeautine, la papaïne et la pepsine.
Parmi les enzymes aptes à dégrader les polysaccharides, on peut citer les endocellulases, les exoglucanases, les exoglycosidases qui dégradent par hydrolyse enzymatique les fibres de cellulose.
La mise en contact et le mélange des compositions (A) et (B) déclenchent la dépolymérisation de l’enveloppe externe, optionnellement gélifiée, de la capsule par l’agent dépolymérisant. Les liaisons interchaînes à l’origine du réseau tridimensionnel constituant l’enveloppe se rompent progressivement. L’enveloppe passe alors de l’état gélifié à l’état liquide, libérant ainsi le cœur de la capsule dans la phase continue.
Le temps de mélange des compositions (A) et (B) requis pour obtenir un produit final homogène, exempt de résidus d’enveloppe de capsules est directement déterminé par la cinétique de dépolymérisation. Afin de permettre au consommateur d’obtenir le produit final en un temps raisonnable, le temps de mélange est inférieur à une heure, avantageusement compris de 1 seconde à 30 min, et préférentiellement compris de 5 secondes à 10 min.
Le temps de mélange dépend de divers paramètres, notamment des viscosités des compositions (A) et (B), de l’efficacité d’action de l’agent dépolymérisant vis-à-vis de l’enveloppe externe, optionnellement gélifiée, des capsules, mais aussi des caractéristiques des capsules (taille, composition, épaisseur de l’enveloppe, etc).
Selon un mode de réalisation, le polyélectrolyte de la capsule de la composition (A) est choisi parmi les polyélectrolytes réactifs aux ions calcium, tels qu’un alginate de sodium, et l’agent dépolymérisant de la composition (B) est choisi parmi les agents chélatants du calcium et les sels aptes à s’échanger avec le calcium, tels que l’EDTA.
Avantageusement, la composition (B) du kit selon l’invention a une viscosité comprise de 1 mPa.s à 100 Pa.s, avantageusement comprise de 1 mPa.s à 60 Pa.s.
La texture de la composition (B) est choisie en fonction de la texture que l’on désire obtenir pour le produit final.
La composition (B) est notamment sous forme d’une solution liquide, d’un gel, d’une crème, d’une mousse ou d’une émulsion. Son aspect visuel détermine en partie l’aspect visuel du produit final.
Avantageusement, la composition (B) contient un pourcentage massique d’eau d’au moins 60%, avantageusement compris de 70% à 95%, préférentiellement compris de 75% à 95%, par rapport à la masse totale de ladite composition.
L’invention concerne également une application des compositions (A) et (B) du kit selon l’invention.
L’invention concerne donc également le kit tel que défini ci-dessus pour son utilisation pour une application simultanée ou séparée dans le temps, notamment sur la peau, des compositions (A) et (B) telles que définies ci-dessus.
Le kit de l’invention permet donc d’appliquer les compositions (A) et (B) telles que définies ci-dessus de façon simultanée, c’est-à-dire ensemble, ou l’une après l’autre.
Egalement, la présente invention concerne un procédé de culture de cellules vivantes comprenant une étape de mise en culture d’au moins une composition selon l’invention.
A ce titre, une composition selon l’invention est telle que le cœur des capsules comprend un milieu de culture MC1 et/ou la phase continue aqueuse comprend un milieu de culture MC2 tels que décrits précédemment.
En fonction des cellules vivantes mises en culture, l’homme du métier est apte à sélectionner les milieux de culture MC1 et/ou MC2 appropriés, ainsi que les conditions de température et de luminosité appropriées à la prolifération des cellules vivantes.
A la fin du procédé de culture, la récolte des capsules se fait typiquement par élimination du milieu de culture MC2 par filtration des capsules, ou par toute autre technique de récupération des capsules.
Pour filtrer les capsules, on utilise typiquement un tamis présentant une taille d’ouverture inférieure au diamètre moyen des capsules de l’invention, qui sont sensiblement sphériques.
L'encapsulation de cellules vivantes, notamment de cellules végétales, en particulier d’algues, et la culture en capsules de ces cellules vivantes, présente en outre les avantages suivants par rapport aux procédés classiques :
les cellules vivantes encapsulées sont protégées des contraintes mécaniques, telles que le cisaillement, diminuant ainsi la mort cellulaire au cours du procédé de culture des cellules ;
les cellules vivantes encapsulées sont partiellement protégées du milieu extérieur, car la membrane de la capsule présente une perméabilité sélective (en particulier, les bactéries ne peuvent pas pénétrer dans la capsule), ce qui permet avantageusement d’éviter d’éventuelles contaminations et donc de réduire la mort cellulaire ;
la taille des capsules (plusieurs centaines de micromètres) et leurs propriétés mécaniques les rendent plus faciles à manipuler que les cellules en tant que telles, notamment pour des changements de milieu de culture MC2 ou lors de la récolte ; et un traitement postérieur à la croissance et éventuellement à l’élicitation peut être mis en œuvre afin d’imperméabiliser les capsules, isolant ainsi leur contenu pour en faciliter la conservation jusqu’à leur utilisation.
La présente invention concerne encore un procédé de production d’un composé d’intérêt, ledit procédé comprenant :
- une étape de mise en culture d’au moins une composition selon l’invention, où la cellule vivante est apte à produire ledit composé d’intérêt,
- éventuellement, une étape d’élicitation des cellules vivantes comprises dans ladite capsule, et
- une étape de récupération du composé d’intérêt.
Dans le cadre de la présente description, on entend par « élicitation >> la stimulation de la production de composés d’intérêt par une cellule vivante, ladite stimulation étant provoquée par la mise en conditions particulières, qu'elles soient physico-chimiques, résultant d'une modulation de la température, de la pression ou de l'éclairement, ou encore qu’elles reposent sur la présence d’une molécule particulière, dite « molécule élicitante >>. On provoque ainsi artificiellement la production de composés d’intérêt par les cellules vivantes encapsulées.
Ainsi, après une première étape de mise en culture, l’étape d’élicitation des cellules vivantes comprend typiquement :
- une étape de mise en culture des capsules en lots séparés dans des conditions différentes,
- une étape de détection et de quantification du composé d’intérêt produit, et
- éventuellement la sélection des individus présentant les meilleurs phénotypes.
L’étape d’élicitation des cellules vivantes consiste par exemple à mettre en culture les capsules de l’invention dans un milieu de culture MC2 différent du milieu de culture MC1, ou dans un milieu de culture comprenant une molécule élicitante, ou dans le même milieu MC1 avec une modification des conditions de culture (température, lumière, etc.).
Les capsules selon l’invention peuvent être mises en culture en conditions élicitantes bien connues de l’homme du métier, comme par l’ajout au milieu de culture MC2 d’acide salicylique, d'éthylène, de jasmonate ou de chitosan (cf. par exemple la demande internationale WO 2003/077881).
Les composés d’intérêt produits par le procédé de production de l’invention sont typiquement soumis à un ou plusieurs traitements, tels que purification, concentration, séchage, stérilisation et/ou extraction. Ces composés sont ensuite destinés à être incorporés dans une composition cosmétique, agro-alimentaire ou pharmaceutique.
A titre de composé d’intérêt, les capsules de l’invention permettent notamment de produire des lipides présentant un intérêt en cosmétique, comme par exemple des acides gras, tels que l’acide linoléique, l’acide alpha linoléique, l'acide gamma linoléique, l'acide palmitique, l'acide stéarique, l'acide eicosapentanoïque, l'acide docosahexanoïque, l'acide arachidonique ; des dérivés d’acide gras, tels que des céramides ; ou encore des stérols, tels que le brassicastérol, le campestériol, le stigmastérol et le sitostérol.
La récupération du composé d’intérêt relève des connaissances générales de l’homme du métier et est notamment décrite dans WO 2016/062836.
La présente invention concerne encore l’utilisation d’une composition selon l’invention, pour la production de cellules vivantes et/ou la production de composés d’intérêt.
Les expressions « compris entre ... et ...>>, « compris de ... à ... >> et « allant de ... à ... >> doivent se comprendre bornes incluses, sauf si le contraire est spécifié.
Les exemples ci-après illustrent l’invention sans en limiter la portée.
EXEMPLES
Exemple 1 : Préparation de capsules selon l’invention
1. Préparation des solutions pour la fabrication de capsules
L'intégralité du matériel (tubes, connecteurs, cristallisoir, etc.) utilisé est autoclavé. Pour les éléments du dispositif fluidique ne résistant pas aux hautes températures, on procède à un rinçage avec de l'éthanol à 70%. Le procédé d'encapsulation décrit ci-après est réalisé en conditions stériles, sous une hotte à flux laminaire. Tous les liquides sont également stérilisés. L'autoclavage est une méthode simple de stérilisation de liquides. Le bain de calcium est autoclavé. Pour les solutions de polymères (alginate et cellulose), si ces dernières sont portées à 120°C pendant 20 min, leurs propriétés rhéologiques sont altérées à un point qui rend l'encapsulation impossible. Leur stérilisation est donc effectuée par filtration à 0,2 pm (mais étape longue compte-tenu de la viscosité de la solution d’alginate) ou par pasteurisation à 65°C pendant 60 minutes (plus long mais température moins élevée que l'autoclavage, ce qui altère moins les propriétés rhéologiques des polymères).
- Bain de calcium BF (solution gélifiante) : CaCI2 (90 mM) et quelques gouttes d'une solution de Tween 20 10%m/v et de l’eau osmosée.
- Phase externe OF (membrane) : solution d’alginate (1,7%) et du SDS 0,5 mM dans HEPES (50 mM) et de l’eau osmosée.
- Phase interne IF (cœur) : mélange 50/50 d’une solution à 1% de cellulose + HEPES 50 mM + eau et milieu de culture RCCM + Chlamydomonas reinhardtii
Milieu de culture RCCM :
Pour anticiper des problèmes de milieux de culture non compatibles avec les capsules d’alginate, on part d’un milieu de culture connu (i.e. le milieu TAP) dans lequel des composés sont supprimés, tels que les chélatants du calcium, d'autres sont ajoutés, tels que du chlorure de calcium (1 mM), et d’autres sont substitués, à l’image du tampon TRIS qui est remplacé par l'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique (HEPES) + 2,7 mM de phosphate (pour maintenir la division cellulaire).
Préparation
On mélange ensemble 50 mL de Beijerincks (2x), 1 mL de Phosphate 1M pH7 Butter, 1 mL de Hutner's trace éléments, 1 mL d’acide acétique, 10 mL de la solution de CaCI2 et 5,96 g d'HEPES sont mélangés, et le volume est ajusté à 1 L avec de l'eau distillé. Le pH est ensuite ajusté à 7,1-7,4 avec une solution de NaOH à 8 M. La solution est filtrée à 0,2 pm et conservée à 4°C.
Composition
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Toutes les phases subissent préalablement à leur utilisation une étape de filtration à 5 pm (sauf milieu de culture RCCM). Cette étape de filtration permet d’éviter la présence de particules ou d’agrégats solides conduisant au bouchage des buses utilisées pour la production, mais est aussi utilisée pour stériliser les phases.
Les microalgues sont ensuite encapsulées.
2. Fabrication de capsules
Le procédé de fabrication de capsules est basé sur la co-extrusion concentrique de deux solutions, notamment décrite dans WO 2010/063937 et FR2964017, pour former des gouttes doubles.
Débit IF : 130 mL/h.
Débit OF : 70 mL/h.
Un dispositif piézo-électrique (Preloaded piezo actuator, 15 pm, de chez PI) est ensuite mis sous tension, et la fréquence d'excitation est ajustée (typiquement autour de 1,6 kHz). Une électrode est mise sous tension, typiquement à 1000 V afin de charger les gouttes. Les répulsions induites amènent les gouttes à s'éloigner, ce qui transforme le jet en cône et réduit la coalescence en vol. Cela permet d'obtenir une population de gouttes, et donc de capsules, très monodisperses. Les capsules terminent ensuite leur chute dans le bain de calcium.
Une fois la collecte terminée, les capsules sont laissées quelques minutes dans le bain de calcium, puis sont filtrées grâce à un tamis cellulaire (maille 100 pm). Les capsules sont ensuite lavées avec le milieu de culture RCCM.
Ce système permet d'encapsuler des microalgues sans effet délétère, et de les cultiver dans ce véhicule. Il est possible d'atteindre des concentrations très importantes (3460 millions de cellules par ml_ dans la capsule), sans impact majeur sur la viabilité de la culture.
Néanmoins, des micro-organismes contaminants peuvent aussi en profiter. Le problème des contaminations est donc réel, a fortiori si le milieu de culture n'impose pas une forte pression de sélection ou si les cellules d'intérêt ont un temps de doublement long, ce qui est le cas de Chlamydomonas reinhardtii qui est 600 fois plus long que celui d'une bactérie comme Escherichia coli (i.e. 25 heures contre 20 minutes).
Exemple 2 : challenge-test comparatif
De nombreux moyens physiques de décontamination existent : radiations ionisantes (rayons gamma) et non ionisantes (UV), chaleur, filtration à 0,2 pm.
Malheureusement, mis à part les antibiotiques, aucun des moyens suscités n'est compatible avec la culture de cellules vivantes, le cas échéant en capsules, la plupart pour des raisons évidentes de compatibilité. En effet, il est crucial de pouvoir tuer spécifiquement les cellules à l'extérieur des capsules sans impacter le contenu des capsules.
L'utilisation de particules d'argent suffisamment grosses pour ne pas pénétrer dans la capsule est exclue, car il a été montré que l'agent cytotoxique est l'ion argent libéré par de telles particules (Zong Ming Xiu, Nano Letters, 12(8) :42714275, 2012). Cet ion diffuse sans problème dans les capsules et serait préjudiciable à la survie de Chlamydomonas reinhardtii.
L'utilisation d'antibiotiques pose des problèmes environnementaux et de développement de résistances ; et les prescriptions en la matière sont plutôt à la baisse de la consommation (C Lee Ventola., P & T : a peer-reviewed journal for formulary management, 40(5) :344-52, 2015).
Des tentatives de lavage des capsules pour se débarrasser des contaminations présentes dans la phase continue ont été réalisées. Malheureusement, il reste toujours des bactéries adsorbées sur la surface des capsules, ce qui anéantit les efforts du lavage.
Un protocole de challenge-test entre un polymère antibactérien selon l’invention, i.e. la poly-L-lysine (Sigma-Aldrich, P5899, Mw >300kDa) (PLL) et l’ampicilline (A0166, Sigma) a été mis en place et décrit ci-après.
On dispose de quatre flasques en verre contenant 10 mL du milieu de culture RCCM décrit en exemple 1.
La composition des quatre flasques est présentée dans le tableau ci-dessous.
F1 F2 F3 F4
Milieu de culture RCCM (10 mL) OK OK OK OK
PLL (en %) 0 10'3% 0 10'3%
Ampicilline (en pg/mL) 0 0 10 0
Puis, 1 pL d'une suspension de E. coli YFP est ajouté dans chaque flasque F1 à F3 et 1 pL d'une suspension de Chlamydomonas reinhardtii est ajouté dans la flasque F4.
Le développement des bactéries E. coli YFP ou Chlamydomonas reinhardtii induira une turbidité du milieu de culture RCCM.
Les flasques sont ensuite mises à l'incubateur pendant une semaine à 25 °C. Après quoi, les flasques sont observées.
Résultats
Comme attendu, une turbidité importante est observée en flasque F1, caractérisant un développement important des bactéries E. coli YFP se développent dans la flasque contrôle F1.
En revanche, il n'y a pas de croissance dans la flasque contenant de l'ampiciline (flasque F3), ni dans celle contenant la PLL (flasque F2), ce qui illustre l'effet antimicrobien, notamment bactériostatique, de la PLL.
Cet effet impacte aussi Chlamydomonas reinhardtii (flasque F4). Il est donc crucial que la PLL ne pénètre pas dans les capsules.
Exemple 3 : Composition selon l’invention
Des capsules selon l’exemple 1 sont placées dans le milieu de culture RCCM additionné de 10-3 % de PLL.
Les cellules Chlamydomonas reinhardtii croissent sans problème dans ce milieu, comme montré en figure 1, et en l’absence totale de contamination bactérienne dans le milieu de culture pendant une période de temps supérieure à 1 mois à température ambiante.
La Figure 1 représente la courbe de croissance de Chlamydomonas reinhardtii WTS24- en capsule, dans du milieu de culture RCCM additionné de 10-3 % de poly-L-lysine (Sigma-Aldrich, P5899, Mw >300kDa) (PLL).
Le temps de division des microalgues dans ce contexte a été calculé et comparé à celui de ce même système de culture mais sans PLL.
Ce temps vaut 13,9 h ± 1,4 h. Ce temps n'est donc pas significativement différent de celui obtenu pour des microalgues dans du RCCM sans PLL.
Cela confirme que la PLL ne pénètre pas dans les capsules et n’a aucun impact délétère sur la croissance des microalgues en capsule.
Une composition selon l’invention constitue donc un moyen innovant de décontaminer exclusivement la phase continue dans laquelle baigne les capsules, sans impacter le contenu de celles-ci. Cela permet de compléter, voire remplacer, l'utilisation classique d'antibiotiques.
Cela ouvre également un nouveau champ pour le domaine cosmétique, à savoir celui des produits cosmétiques contenant des microalgues vivantes en capsule.

Claims (18)

  1. REVENDICATIONS
    1. Composition comprenant une phase continue aqueuse et au moins une capsule, ladite capsule comprenant un cœur, liquide ou au moins en partie gélifié ou au moins en partie thixotrope, et au moins une enveloppe externe encapsulant totalement ledit cœur à sa périphérie, dans laquelle ladite capsule comprend au moins une cellule vivante, et dans laquelle ladite phase aqueuse continue comprend au moins un polymère antimicrobien et/ou antifongique.
  2. 2. Composition selon la revendication 1, dans laquelle le polymère antimicrobien et/ou antifongique est un polymère cationique, de préférence ayant une unité répétitive comprenant au moins une fonction amine.
  3. 3. Composition selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle le polymère antimicrobien et/ou antifongique est choisi dans le groupe constitué des polymères biocides, des biocides polymériques, des polymères libérant des biocides et de leurs mélanges.
  4. 4. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le polymère antimicrobien et/ou antifongique est la polylysine, notamment la poly-L-lysine ou la poly-D-lysine, ou l’un de ses dérivés.
  5. 5. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle le polymère antimicrobien et/ou antifongique a un poids moléculaire supérieur à 10 000 Da, de préférence supérieur à 100 000 Da, et mieux compris entre 10 000 Da et 300 000 Da, et de préférence entre 100 000 Da et 200 000 Da.
  6. 6. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, comprenant une teneur supérieure à 104%, de préférence supérieure ou égale à 10 3%, en poids de polymère(s) antimicrobien(s) et/ou antifongique(s) par rapport au poids total de la phase continue.
  7. 7. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle la ou les cellules vivantes sont choisies parmi les cellules procaryotes, les cellules eucaryotes, et leur mélange.
  8. 8. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle la ou les cellules vivantes sont choisies parmi les cellules animales ou végétales, et sont de préférence choisies parmi les cellules végétales.
  9. 9. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle le cœur des capsules est monophasique ou comporte une goutte intermédiaire d’une phase intermédiaire, la phase intermédiaire étant placée au contact de l’enveloppe externe, et au moins une goutte interne d’une phase interne disposée dans la goutte intermédiaire, et dans laquelle au moins une des phases parmi la phase intermédiaire et/ou la phase interne comprend au moins une cellule vivante.
  10. 10. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle le cœur des capsules comprend un milieu de culture MC1.
  11. 11. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, dans laquelle la taille des capsules est inférieure à 5 mm, de préférence comprise entre 50 pm et 3 mm.
  12. 12. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 11, dans laquelle la phase continue aqueuse comprend un milieu de culture MC2.
  13. 13. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 12, dans laquelle l’enveloppe externe comprend au moins un polyélectrolyte à l’état gélifié.
  14. 14. Kit comprenant au moins deux compositions séparées (A) et (B), dans lequel :
    - la composition (A) est une composition telle que définie selon l’une quelconque des revendications 1 à 13, et
    - la composition (B) comprend au moins un agent dépolymérisant.
  15. 15. Kit selon la revendication 14, dans lequel l’agent dépolymérisant de la composition (B) est choisi parmi les agents chélatants du calcium, les sels aptes à s’échanger avec le calcium, les enzymes aptes à dégrader les protéines ou les polysaccharides, et leurs mélanges.
  16. 16. Procédé de culture de cellules vivantes comprenant une étape de mise en culture d’au moins une composition selon l’une des revendications 1 à 13.
  17. 17. Procédé de production d’un composé d’intérêt, ledit procédé comprenant :
    - une étape de mise en culture d’au moins une composition selon l’une des revendications 1 à 13 où la cellule vivante est apte à produire ledit composé d’intérêt,
    - éventuellement, une étape d’élicitation des cellules vivantes comprises dans ladite capsule, et
    - une étape de récupération du composé d’intérêt.
  18. 18. Utilisation d’une composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 13, pour la production de cellules vivantes et/ou la production de composés d’intérêt.
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