CN101213292A - 调节生物膜生长的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于促进微生物生物膜的分散或防止微生物生物膜形成的方法，其包括：将生物膜暴露于有效量的一氧化氮或有效量的至少一种产生或释放一氧化氮的试剂；使用有效量的一氧化氮或有效量的至少一种产生或释放一氧化氮的试剂处理易于形成生物膜的表面或介质；将有效量的一氧化氮或有效量的至少一种产生或释放一氧化氮的试剂结合易于形成生物膜的表面或介质；或者诱导一种或多种活性氧或氮在所述生物膜的微生物中或者在能够形成生物膜的微生物中积累。本发明还涉及用于维持、或增强、或维持并增强生物膜功能的方法，其包括将生物膜暴露于至少一种一氧化氮清除剂、至少一种抗氧化剂、或至少一种一氧化氮清除剂和至少一种抗氧化剂。本发明还涉及用于促进微生物生物膜的分散或防止微生物生物膜形成，维持或提高、或维持并提高生物膜功能的组合物。

Description

调节生物膜生长的方法和组合物
发明领域
本发明涉及用于在微生物中调节细胞程序性死亡的方法和组合物，并且还涉及用于促进或抑制微生物由生物膜分散的方法和组合物。
发明背景
生物膜是三维的微生物生长形式，其包括细菌群落以及细菌群落产生的细胞外基质。生物膜普遍存在于环境中并且可以形成在存在水的固体表面上，或者可以形成于混悬液中，例如是絮状物或颗粒形式。生物膜造成严重的工业损害，例如在的流体处理中造成污垢或腐蚀并且会促使管线和容器中的油变酸，所述流体处理例如配水和水处理系统、纸浆造纸系统、热交换系统和冷却塔。从公共卫生的角度来看，生物膜还是水系统中重要的病原体来源，所述水系统例如饮水系统、贮水池以及管道。生物膜还与人类中的许多慢性感染相关，例如中耳炎(在耳表面的生物膜)、细菌性心内膜炎(心脏和心脏瓣膜表面上的生物膜)、囊性纤维化(肺表面上的生物膜)以及肾结石，并且易于在诸如可植入医疗用具等医疗器械上形成生物膜。
然而，虽然生物膜在许多情况下具有显著的有害作用，但是生物膜还可以是有益的。例如，在废水处理系统中，悬浮絮状物生物膜或者在膜表面上与表面缔合的生物膜据说促进诸如脱氮作用中的营养物去除。
因此，明显亟需能够清除有害生物膜的有效策略和能够提高有益生物膜活性的有效策略。
生物膜基本上是多细胞微生物群落，其形成和生长取决于成员生物体的不同的多细胞性状，例如细胞-细胞信号传导。当信号分子达到足够的浓度时，胞外信号系统，例如群体感应，被细菌用于评价细胞密度并引起基因表达和表型的变化。这与导致诱导例如毒力因子和/或防御机制的差异基因表达相关，并且还与细胞分化相关，因而与生物膜结合的细胞和自由生活(浮游的)细胞有高度区别。
当细胞膜中的细胞分化并且细胞膜成熟时，降低的代谢速率、防御机制的细胞表达以及抗微生物剂渗透细胞膜的能力降低导致提高的抗微生物抗性并且使生物膜尤其难以根除。当前的生物膜控制策略通常瞄准生物膜生长的早期阶段并且涉及使用有毒的抗微生物剂。然而，由于其向环境中释放，所以这样的有毒试剂其自身具有下游问题。亟需用于生物膜控制的改进的策略。
最近发现，生物膜中的铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)细胞在生物膜生命周期的正常过程中经历细胞程序性死亡和溶解(Webb et al，2003，Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilmdevelopment(铜绿色假单胞菌生物膜生长中的细胞死亡)，J.Bact.185：4585-4592)。据认为铜绿色假单胞菌生物膜中的细胞程序性死亡是原噬菌体介导的，并且在促进存活细胞的亚群从生物膜分化和分散中起作用。
本发明是基于发明人的如下发现，生物膜中细胞程序性死亡的现象与生物膜的生物中的活性氧和活性氮(RONS)的积累相关，并且能够使用一氧化氮产生剂诱导细胞程序性死亡的过程以及细胞由生物膜向浮游细胞的分散。增加体内一氧化氮浓度的能力使得能够通过促进细胞程序性死亡来调节并控制生物膜的生长过程，并且增加细胞对抗微生物剂的敏感性，从而提供用于抑制和/或逆转生物膜生长的途径。
发明概述
本发明涉及用于促进微生物由生物膜分散的方法，所述方法包括将所述生物膜暴露于有效量的一氧化氮或有效量的至少一种产生或释放一氧化氮的试剂。
本发明还涉及用于促进微生物由生物膜分散的方法，所述方法包括诱导一种或多种活性氧和活性氮在微生物中的积累。
本发明还涉及用于抑制生物膜形成和/或生长的方法，所述方法包括使用有效量的一氧化氮或有效量的至少一种产生或释放一氧化氮的试剂处理易于形成生物膜的表面或其它介质。
因此，根据本发明的第一方面，提供用于促进微生物生物膜的分散或防止微生物生物膜形成的方法，所述方法包括：
将所述生物膜暴露于有效量的一氧化氮或有效量的至少一种产生或释放一氧化氮的试剂；
使用有效量的一氧化氮或有效量的至少一种产生或释放一氧化氮的试剂处理易于形成生物膜的表面或介质；
将有效量的一氧化氮或有效量的至少一种产生或释放一氧化氮的试剂结合易于形成生物膜的表面或介质；或者
在所述生物膜的微生物中或者在能够形成生物膜的微生物中诱导一种或多种活性氧或氮的积累。
所述至少一种产生或释放一氧化氮的试剂可以包括一种或多种一氧化氮供体。所述一种或多种一氧化氮供体可以选自硝普钠、S-亚硝基-L-谷胱甘肽、S-亚硝基-N-乙酰青霉胺或其组合。
通常，以无毒的浓度提供一氧化氮供体。例如，所述浓度可以在纳摩尔、微摩尔或毫摩尔范围，例如从约1nM至约10mM、或者从约10nM至约5μM。
生物膜可以是与表面缔合的或悬浮的。悬浮的生物膜可以是絮状物或颗粒形式。
存在于生物膜中的微生物或者能够形成生物膜的微生物可以是单一物种或者是多个物种。
所述生物膜中的微生物或者能够形成生物膜的微生物可以包括细菌或真菌或者可以包括上述二者，并且可以包括下列物种中的一种或多种，例如：念珠菌属(Candida spp.)、Hormoconis spp.、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas spp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、志贺杆菌属(Shigella spp.)、分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、埃希杆菌属(Escherichia spp.)、沙门菌属(Salmonella spp.)、军团菌属(Legionella spp.)、嗜血杆菌属(Haemophilus spp.)、芽胞杆菌属(Bacillus spp.)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio spp.)、希瓦氏菌属(Shewanella spp.)、地杆菌属(Geobacterspp.)、克雷白杆菌属(Klebsiella spp.)、变形杆菌属(Proteus spp.)、气单胞菌属(Aeromonas spp.)、节杆菌属(Arthrobacter spp.)、微球菌属(Micrococcus spp.)、沙雷菌属(Serratia spp.)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas spp.)、梭形杆菌属(Fusobacterium spp.)以及弧菌属(Vibrio spp.)，这些物种中有代表性的实例是白色念珠菌(Candidaalbicans)、铜绿色假单胞菌(P.aeruginosa)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、大肠埃希杆菌(Escherichia coli)、藓样芽胞杆菌(Bacillus lichenifoirmis)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、核粒梭形杆菌(Fusobacterium nucleatum)以及霍乱弧菌(Vibrio Cholerae)。
所述方法还可以包括将至少一种抗微生物剂结合所述表面或介质，或者将所述生物膜中的微生物或能够形成生物膜的微生物暴露于至少一种抗微生物剂中来处理所述表面或介质。例如，抗生素可以是氨基葡糖苷，例如妥布霉素，表面活性剂可以是十二烷基硫酸钠，并且氧化应激诱导剂可以是过氧化氢、次氯酸、氯或氯胺。
在通过本发明的方法处理的生物膜微生物或者能够形成生物膜的微生物中累积的活性氧和活性氮可以包括过亚硝酸根、一氧化氮、过氧化氢和超氧化物自由基。
在一实施方案中，所述活性氧和活性氮是过亚硝酸根。
可以通过将生物膜暴露于有效量的一氧化氮或有效量的至少一种产生或释放一氧化氮的试剂来实现活性氧和活性氮的积累。
本发明的用于促进生物膜分散或防止生物膜形成的方法可以包括在所述生物膜中的微生物中诱导导致分散的分化事件，或者所述方法可以包括防止在微生物中诱导导致生物膜形成的分化事件。本发明的方法或者可以或还可以包括提高微生物对抗微生物剂的敏感性。
本发明还涉及用于处理和/或防止与生物膜生长相关的状态的方法，其包括对对象给予有效量的一氧化氮或有效量的至少一种产生或释放一氧化氮的试剂。
因此，本发明的用于促进生物膜分散或防止生物膜形成的方法可以包括对对象给予有效量的一氧化氮或有效量的至少一种产生或释放一氧化氮的试剂，以处理或防止所述对象中与生物膜相关的状态，任选地同时给予至少一种抗微生物剂。
可以将所述试剂和/或所述抗微生物剂涂覆到或者浸入或结合到合适的医疗装置的表面，所述医疗装置例如是导管、支架、假体或其它外科或可植入的装置。
本发明还涉及用于促进微生物从生物膜的分散或用于抑制生物膜形成合和/或生长的组合物。
因此，根据本发明的另一方面，提供用于促进微生物生物膜的分散或防止微生物生物膜形成的组合物，所述组合物包含一氧化氮、至少一种产生或释放一氧化氮的试剂、或者一氧化氮和至少一种产生或释放一氧化氮的试剂，以及合适的载体。
所述至少一种产生或释放一氧化氮的试剂可以包括一种或多种一氧化氮供体。所述一种或多种一氧化氮供体可以选自硝普钠、S-亚硝基-L-谷胱甘肽、S-亚硝基-N-乙酰青霉胺或其组合。
在一实施方案中，所述一氧化氮供体是硝普钠。
在具体实施方案中，所述组合物可以是防污组合物、医疗装置或其组件、用于医疗装置的涂层或药物组合物。
所述组合物还可以包含至少一种抗微生物剂。所述抗微生物剂可以是任何抗微生物剂，例如抗生素、表面活性剂或氧化应激诱导剂。例如，抗生素可以是氨基葡糖苷，例如妥布霉素，表面活性剂可以是十二烷基硫酸钠，并且氧化应激诱导剂可以是过氧化氢、次氯酸、氯或氯胺。
本发明的用于促进微生物生物膜分散或防止微生物生物膜形成的组合物可以：在所述生物膜中的微生物中诱导导致分散的分化事件，或者防止在微生物中诱导导致生物膜形成的分化事件；提高所述微生物对抗微生物剂的敏感性；或者可以提供这些效果的组合。
本发明还涉及用于处理和/或防止与生物膜生长相关的状态的组合物。
因此，本发明的用于促进微生物生物膜分散或防止微生物生物膜形成的组合物可以适于处理或防止对象的与生物膜相关的状态，并且可以任选地包含至少一种抗微生物剂。
本发明还涉及用于维持和/或增强生物膜功能的方法，其包括将所述生物膜暴露于至少一种一氧化氮清除剂和/或至少一种抗氧化剂。
因此，根据本发明的另一方面，提供用于维持和/或增强生物膜功能的方法，所述方法包括将所述生物膜暴露于至少一种一氧化氮清除剂、至少一种抗氧化剂、或者至少一种一氧化氮清除剂和至少一种抗氧化剂。
在一实施方案中，所述一氧化氮清除剂为2-苯基-4，4，5，5-四甲基-咪唑啉-1-氧基-3-氧化物。
抗氧化剂可以选自：硫氧还蛋白、过氧化物歧化酶、谷胱甘肽和抗坏血酸。
所述方法可以包括在所述生物膜中的微生物中抑制导致分散的分化事件。
根据本发明的另一方面，提供用于维持或提高、或者维持并提高生物膜功能的组合物，所述组合物包含至少一种一氧化氮清除剂和/或至少一种抗氧化剂，以及合适的载体。
所述组合物可以在所述生物膜中的微生物中抑制导致分散的分化事件。
定义
本文使用的术语“生物膜”指任何三维的、基质包围的、显示多细胞特性的微生物群落。因此，本文使用的术语生物膜包括与表面缔合的生物膜以及混悬液中的生物膜，例如絮状物或颗粒。生物膜可以包括单一的微生物物种或者可以是混合的物种综合体，并且可以包括细菌、真菌、藻类、原生动物或其它微生物。
本文使用的术语“表面”既包括生物表面也包括非生物表面。生物表面通常既包括生物体的内表面(例如组织和膜)也包括外表面(例如皮肤、种子、植物叶子)，包括细菌的膜和细胞壁。生物表面还包括其它天然表面，例如木材或纤维。非生物表面可以是任何组成的任何人造表面，其支持生物膜的建立和生长。这样的表面可以存在于工厂和工业设备中。此外，为了本发明的目的，表面可以多孔的(例如膜)或非多孔、刚性的或挠性的。
本文使用的术语“分散”由于其涉及生物膜，所以指细胞从包括其它细胞在内的(例如，彼此，生物膜)表面脱离的过程以及回归这些细胞的浮游表型或行为。
本文使用的术语“细胞程序性死亡”指生物膜中在特定阶段发生的生长事件，且其引起自溶、细胞分化和具有特定表型的细胞亚群的生长。
本文使用的术语“暴露”指给予或导致接触。微生物或生物膜可以直接或间接暴露于活性剂。通常，直接暴露是指将试剂给予待处理的微生物或生物膜或使所述微生物或生物膜自身与所述试剂接触。通常，间接暴露是指对微生物给予活性剂的前体、或给予能够单独产生或能够与其它化合物或分子反应而产生活性剂的化合物或分子，或者使微生物或生物膜与其接触。类似地，本文使用的术语“处理(treat)”或“处理(treating)”及其变体指给予或导致接触。
本文使用的术语“有效量”其意思包括无毒的但足以提供期望效果的试剂的量或浓度。所需的准确量/浓度将取决于下列因素而变化，例如待处理的微生物的种类，待处理的生物膜的范围、严重性和/或年龄，所述膜是否是表面缔合的或悬浮的，给予的具体试剂以及给予的方式等等。因此，不可能具体给出准确的“有效量”。然而，对于任何给定的情况，本领域普通技术人员仅仅通过进行常规实验就可以确定合适的“有效量”。
本文使用的术语“无毒的”由于其涉及物质的浓度或量，因而，指物质对细胞没有直接毒性效应的浓度或量，该浓度或量不会杀死单个的自由生活细胞，但是可以作为引发诱导生物膜中分化过程的信号，所述分化过程涉及细胞程序性死亡响应，因此可以导致细胞亚群的死亡、分散细胞的产生以及生物膜的分散。例如，关于一氧化氮供体，无毒浓度或无毒量可以包含100mM的一氧化氮供体或更少。
本文使用的术语“功能”由于其涉及生物膜，因而可以通过任意一个或过多个下列参数进行评价：生物膜中微生物的活力、生物膜中微生物的活性、生物膜中微生物的密度、生物膜的寿命以及生物膜执行特定功能的效率，例如在废水系统中的生物膜的情况下，该功能为营养物的去除。因此，在本发明的上下文中，“维持”生物膜功能指防止或至少充分减少细胞程序性死亡和分散的进展过程，从而微生物活力、微生物活性、生物膜寿命和/或生物膜功能不会显著降低、“提高”生物膜功能指与不使用本发明处理的生物膜相比，提高或改善任意一个或多个上述参数。
本文使用的术语“抑制”由于其涉及生物膜，因而，指完全或部分抑制生物膜的形成和/或生长，并且其范围还包括与生物膜形成和/或生长相关的生物膜生长或进展的逆转。此外，抑制可以是永久的或暂时的。在暂时抑制方面，可以在足以产生期望效果的时间内抑制生物膜形成和/或生长。
在本说明书的上下文中，术语“包括(comprising)”指“主要包括，但不必须只包括”，此外，词语“包括(comprising)”的变体，例如“包括(comprise)”和“包括(comprises)”  具有相应变化的意思。
附图简要说明
现在仅仅通过示例性的方式，通过参考以下附图描述本发明。
图1.铜绿色假单胞菌生物膜中细胞死亡和分散事件与小集落结构中活性氧和活性氮的积累关联。(A)共聚焦显微照片显示使用BacLight LIVE/DEAD染料染色的第7天的生物膜(在单独的小图中还分别显示了活细胞和死亡细胞的显微照片)。白色箭头指出生物膜中的中空结构。黑色箭头指出生物膜中的死亡细胞。标尺，50μm。(B)第7天的生物膜中小集落的共聚焦显微照片。使用检测特定RONS的荧光染料对生物膜染色。左侧一列是相差图像，右侧一列是荧光图像，其显示了在XY(俯视)视图和XZ(侧视)视图中RONS的积累。标尺，50μm。图像是至少三个独立实验的代表。
图2.在生物膜上给予SNP的影响以及铜绿色假单胞菌的浮游生长。在存在硝普钠(SNP)的96孔板中，PAO1细胞生长24小时。通过荧光测量定量浮游生长并且通过结晶紫染色定量生物膜形成。对照，不添加SNP。
图3.产生或释放一氧化氮的试剂对铜绿色假单胞菌由生物膜向浮游生长转变的影响。在存在一氧化氮供体、硝普钠(SNP)、S-亚硝基-L-谷胱甘肽(GSNO)、或S-亚硝基-N-乙酰青霉胺(SNAP)、或SNP和一氧化氮清除剂2-苯基-4，4，5，5-四甲基-咪唑啉-1-氧基-3-氧化物(PTIO)下，PAO1细胞在含有载玻片的培养皿中生长24小时。通过测量上清液的光密度(OD600nm)将浮游生长定量(浅色柱)并且使用染色后载玻片的数字显微照片的图像分析，通过测量表面覆盖度定量生物膜生长(黑色柱)。
图4.SNP处理对铜绿色假单胞菌对抗微生物剂敏感性的影响。在存在或不存在500nM SNP下，PAO1细胞在含有载玻片的培养皿中生长24小时。使用抗微生物溶液处理载玻片上的生物膜30分钟，使用LIVE/DEAD染料染色以便进行光学显微镜分析，并使用数字图像分析定量(表面覆盖度百分比)。(A)在存在SNP(浅灰色柱)或不存在SNP(深灰色柱)的情况下，载玻片上的生物膜对抗微生物剂妥布霉素(Tb)、过氧化氢(H2O2)、十二烷基硫酸钠(SDS)和次氯酸(HOCl)的敏感性。(B)处理后，相同载玻片的共聚焦荧光显微照片。
图5.SNP处理对预建立的铜绿色假单胞菌生物膜对抗微生物剂敏感性的影响。在添加500nM SNP之前，铜绿色假单胞菌PAO1在含有载玻片的培养皿中生长24小时。生物膜再生长24小时，然后使用抗微生物溶液处理30分钟，使用LIVE/DEAD染料染色以便进行光学显微镜分析，并使用数字图像分析定量(表面覆盖度百分比)。(A)在存在SNP(浅灰色柱)或不存在SNP(深灰色柱)的情况下，载玻片上的生物膜对妥布霉素(Tb)、过氧化氢(H2O2)和紫外光(UV)的敏感性。(B)处理后，相同载玻片的共聚焦荧光显微照片。
图6.使用SNP和抗微生物剂组合处理浮游铜绿色假单胞菌细胞。使用抗微生物剂妥布霉素(Tb)或过氧化氢(H2O2)处理浮游细胞2小时。进行菌落形成单位的平板计数(logCFU/mL)以便评价细菌的活力。
图7.SNP暴露对来自废水处理污泥反应器的絮状生物膜分散的影响。未使用10nM SNP处理(A)或使用10nM SNP处理(B)的第13天混合物种絮状生物膜的共聚焦荧光显微照片。
图8.使用粘质沙雷菌穿刺的饮用水生物膜-在暴露于0、100nM或500nM SNP18小时后，SNP对生物膜的影响：(A)在寡营养琼脂上活力计数(R2A，重复三次)；(B)富营养琼脂上活力计数(LB10，重复三次)；(C)使用显微镜分析的表面覆盖度百分比(BacLight，重复两次)。
图9.循环配水系统的串连AR中，在uPVC取样管中生长3个月的使用粘质沙雷菌穿刺的生物膜。在使用不同浓度的游离氯处理10分钟前将生物膜暴露于0、100nM或500nM SNP18小时的影响：(A)富营养琼脂上活力计数(LB10，重复三次)；(B)使用显微镜分析的表面覆盖度百分比(BacLight，重复两次)。
图10.SNP对粘质沙雷菌生物膜分散的影响。
图11.SNAP对粘质沙雷菌生物膜分散的影响。
图12.SNP对霍乱弧菌生物膜分散的影响。
图13.SNAP对霍乱弧菌生物膜分散的影响。
图14.SNP处理增强四环素(6μg/mL)对霍乱弧菌生物膜的抗微生物活性。
图15.GSNO对霍乱弧菌生物膜分散的影响。
图16.SNP对大肠埃希杆菌生物膜分散的影响。
图17.SNP对藓样芽胞杆菌生物膜分散的影响。
图18.SNP对白色念珠菌生物膜分散的影响。
图19.SNP处理对表皮葡萄球菌生物膜形成的抑制。
图20.SNP处理对核粒梭形杆菌对玻璃表面黏附的抑制。
发明的详细描述
铜绿色假单胞菌是普遍存在的、土壤和水传播的、易于形成单一物种和多物种生物膜的机会致病菌。铜绿色假单胞菌还成为了用于研究生物膜形成和生长的模式微生物。最近关于铜绿色假单胞菌生物膜的研究已经鉴别了来自小集落内部的分散细胞，以及能够导致分离和脱落事件的细胞的细胞程序性死亡(Sauer et al.2002，Pseudomonasaeruginosa displays multiple phenotypes during development as a biofilm(铜绿色假单胞菌在作为生物膜生长过程中显示多种表型)，J.Bad，184：1140-1154；Webb et al.2003，Cell death in Pseudomonas aeruginosabiofilm development(铜绿色假单胞菌生物膜生长中的细胞死亡)，J，Badt.185：4585-4592)。随后，在形成生物膜的其它模式细菌中(Mai-Prochnow et al.2004，Biofilm development and cell death in themarine bacterium Pseudoalteromonas tunicate(海洋细菌被囊交替假单胞菌中的生物膜生长和细胞死亡)，Appl.Environ.Microbiol.70：3232-3238)、在混合物种口腔生物膜中(Hope et al.2002，Determiningthe spatial distribution of viable and non viable bacteria in hydratedmicrocosm dental plaques by viability profiling(通过描绘活力来确定含水微观牙菌斑中的存活和非存活细菌的空间分布)，J.Appl.Microbiol.1993：448-455)、以及在废水处理过程中混合物种颗粒生物膜中(Meyeret al.2003，Microscale structure and function of anaerobic-aerobicgranules containing glycogen accumulating organisms(含有积累糖原微生物的厌氧-好氧颗粒的显微结构和功能)，FEMS Microbiol.Ecol.45：253-261)也报道了细胞程序性死亡，从而暗示细胞程序性死亡是细菌生物膜生长的普遍特征。通过增强或抑制的方式，利用引发生物膜细胞的细胞死亡和脱落的机理将会带来用于在医疗、工业以及生物处理等广泛的范围内控制生物膜的新技术。
使用用于检测并分析生物膜中活性氧和活性氮(RONS)的基于荧光染料的体系，本发明发现在铜绿色假单胞菌生物膜中积累RONS过亚硝酸根(ONOO-)。
过亚硝酸根是具有较宽生物效应的有效的氧化剂。其能够与大量其它生物分子反应并引起细胞损伤。过亚硝酸根的直接前体是一氧化氮，一氧化氮是生物体系中广泛分布的细胞间和细胞内信号分子。一氧化氮迅速与包括氧衍生的基团在内的大量化合物反应。在一种这样的反应中，一氧化氮迅速与超氧化物反应以生成过亚硝酸根：
NO+O2 -→ONOO-。
发明人发现，使用低无毒浓度的一氧化氮供体化合物处理生物膜诱导细胞程序性死亡和细胞从生物膜分散，这造成浮游细胞与生物膜细胞之比的升高以及生物膜的表面覆盖度的降低。因此，本文首次公开了这样的证据，能够使用低无毒浓度的一氧化氮来控制生物膜细胞的行为过程。相反地，毒性浓度的一氧化氮不会实现细胞由生物膜的分散，反而会促进生物膜的生长。
因此，本发明一方面涉及用于促进微生物由生物膜分散的方法，所述方法包括将所述生物膜暴露于有效量的一氧化氮或有效量的至少一种产生或释放一氧化氮的试剂。本发明还涉及在微生物中诱导细胞程序性死亡的方法，其中将所述生物膜暴露于有效量的一氧化氮或有效量的至少一种产生或释放一氧化氮的试剂，并且还涉及抑制生物膜形成和/或生长的方法，其中使用有效量的一氧化氮或有效量的至少一种产生或释放一氧化氮的试剂处理易于形成生物膜的表面。
本发明人还发现，使用一氧化氮供体进行的处理提高了生物膜和浮游细胞对多种抗微生物剂的敏感性。因此，本发明还提供用于提高微生物对抗微生物剂敏感性的方法和组合物。
本领域技术人员应当理解，可以直接使用一氧化氮以实现期望的效果，或者可以使用任何能够产生或释放一氧化氮的试剂。所述试剂可以在待处理微生物的外部产生或释放一氧化氮，或者更通常地在体内产生或释放一氧化氮。本文使用诸如硝普钠等一氧化氮供体举例说明本发明的方法，但是本领域技术人员可以理解本发明并不限于此。
适于本发明使用的一氧化氮供体的实例包括，但不限于硝普钠SNP)、S-亚硝基-L-谷胱甘肽(GSNO)、GSNO单乙基酯、S-亚硝基-N-乙酰青霉胺(SNAP)、葡萄糖-SNAP、L-精氨酸、N，N’-二亚硝基-N，N’-二甲基苯二胺(BNN3)、N，N’-二亚硝基苯二胺-N，N’-二乙酸(BNN5)、BNN5-Na、BNN5甲酯、2-水杨酸-3-硝基氧甲苯基酯(B-NOD)、dephostatin、3，4-dephostatin、二乙胺NONOate、二乙胺NONOate/AM、S，S’-二亚硝基二硫酚、S-亚硝基卡托普利、NG-羟基-L-精氨酸单乙酸盐、Angeli盐、1-羟基-2-氧-3-(3-氨丙基)-3-异丙基-1-三氮烯(NOC-5)、1-羟基-2-氧-3-(N-3-甲基-氨丙基)-3-甲基-1-三氮烯(NOC-7)、6-(2-羟基-1-甲基-2-亚硝基肼基)-N-甲基-1-hyxanamine(NOC-9)、1-羟基-2-氧-3-(N-乙基-2-氨乙基)-3-乙基-1-三氮烯(NOC-12)、2，2’-(羟基亚硝基亚肼基)双-乙胺(NOC-18)、(±)-(E)-甲基-2-[(E)-肟基]-5-硝基-6-甲氧基-3-己烯酰胺(NOR-1)、(±)-(E)-4-乙基-2-[(E)-肟基-5-硝基-3-己烯酰胺(NOR-3)、(±)-N-[(E)-4-乙基-2-[(Z)-肟基]-5-硝基-3-己烯-1-基]-3-吡啶酰胺(NOR-4)、4-苯基-3-N-氧化噁二唑腈、PROLI/NO(L-脯氨酸的甲醇钠的甲醇溶液)、3-morphorlinosydnonimine(SIN-1)、S-亚硝基-N-戊酰青霉胺(SNVP)、精胺NONOate、亚硝酸乙酯和链脲霉素。
通常，可以在Feelisch，M.和Stamler，J.S.编辑的“一氧化氮研究中的方法(Methods in Nitric Oxide Research)”，John Wiley&Sons，NewYork，1996，71-115页中找到用于本发明目的的包括S-亚硝基、O-亚硝基、C-亚硝基和N-亚硝基化合物及其硝基衍生物以及金属NO复合体在内，但并不排除其它产生NO的化合物的一氧化氮供体，以参考的方式将上述公开的内容并入本文。本领域技术人员已知多种其它一氧化氮供体，并且本发明并不受到所使用的具体供体的限制。事实上，可以根据个案选择用于本发明具体应用的合适供体。
通常使用低无毒浓度的产生或释放一氧化氮的试剂。所述浓度可以是纳摩尔、微摩尔或毫摩尔级的。在具体实施方案中，浓度可以是约1nM至约100mM、约10nM至约50mM、约25nM至约50mM、约50nM至约25mM、约100nM至约10mM、约200nM至约1mM、约1nM至约10mM、约10nM至50μM、约10nM至25μM、约10nM至10μM、约10nM至5μM、约10nM至1μM、或约10nM至500nM。实现期望效果的最适合的浓度将取决于众多因素并且本领域技术人员可以使用常规实验加以确定。这样的因素包括，但不限于所使用的具体试剂，给予试剂的方法或途径，生物膜的性质、结构和年龄，待处理微生物的种类等等。
本发明还提供用于促进微生物从生物膜分散、用于诱导微生物中细胞程序性死亡、用于抑制生物膜形成和/或生长、以及用于提高微生物对抗微生物剂敏感性的组合物。通常，所述组合物为进行本发明方法提供手段。
上述的本发明方法和组合物能够应用在很多环境和情况中。下面是这些方法和组合物在某些常见领域中应用的简要讨论。然而，本领域技术人员容易理解，这些方法和组合物将潜在地适用于在生物膜生长是问题的任何环境或情况下，或者在期望抑制微生物生长的任何环境或情况下。
应用本发明方法和组合物的一领域是在海洋、咸水和淡水防污涂料或涂层中，例如在处理舰船外壳、水产养殖设备、渔网或其它水中结构中。所述方法和组合物还用于多种工业和家庭应用，其包括但不限于供水贮水池和给水管、排水管(家庭或工业范围)、处理设备，例如冷却塔、水处理厂、乳制品加工厂、食品加工厂、化学品制造工厂、药物或生物药物制造工厂、油管和炼油设备、以及纸浆造纸厂。
还可以将本发明的组合物用于涂覆包括可植入医疗装置在内的医疗装置，其包括但不限于静脉导管，泌尿导管，支架，诸如人工关节、心脏、心瓣膜或其它器官等假体、起搏器、外科板和钉、以及隐形眼镜。还可以涂覆其它医疗设备，例如导管和透析设备。本发明的方法和组合物还用于传染病的处理。例如，可以使用本发明的方法和组合物处理与生物膜形成相关的多种细菌感染，例如囊性纤维化、中耳炎、细菌性心内膜炎、肾结石、军团病、尿路感染、肺部感染、牙菌斑、龋齿以及与外科手术或烧伤相关的感染。因此，本发明的组合物可以被组方为药物组合物或成为例如外科敷料、漱口剂、牙膏或盐水的组分。
可以在将物体/物品用于或暴露于含有形成生物膜的微生物的环境之前很久，就将本发明组合物应用于或涂覆到或结合感兴趣的物体/物品的表面，或者可以在即将将物体/物品用于或暴露于含有形成生物膜的微生物的环境时，将本发明组合物应用于或涂覆到或结合感兴趣的物体/物品的表面。
本发明的组合物可以是任何合适的形式。例如，可以将本发明的组合物配制为涂料、蜡、其它涂层、乳液、溶液、凝胶、混悬液、珠、粉末、颗粒、片剂、薄片或喷雾剂。技术人员将认识到，合适的制剂将取决于具体的应用和计划的输送途径。
通常，本发明的组合物还包括载体、稀释剂或赋形剂。本领域技术人员已知合适的载体、稀释剂或赋形剂。稀释剂、佐剂和赋形剂必须是以和组合物中其它成分相容的方式“可接受的”，并且在药物组合物的情况下，对其受体是无害的。
载体可以是液体或固体。在液体载体的情况下，液体可以是水溶剂或非水溶剂。通常，在防污和其它工业应用中，诸如涂料或其它表面涂层形式的组合物使用能够在时间和/或空间上控释活性剂的载体。本领域技术人员已知多种实现控释生物活性剂的方法并且所述方法可以包括例如将活性剂封装在合适的聚合物或基于聚合物的产品中。聚合物可以是无机聚合物或有机聚合物，例如聚烯烃、聚醚、聚酯、聚酰胺、聚脲或多肽。本领域技术人员已知用于提供控释的合适的聚合物，例如美国专利第6,610,282号公开的内容，以参考的方式将其公开内容并入本文。
通常，聚合物自身的性质以及环境因素(例如pH、温度等)决定了物质的释放速率。控释系统能够缓慢并连续高达数年地输送物质。本领域技术人应当理解，大量的控释系统能够用于输送本发明的试剂。仅仅作为实例，释放可以是扩散控制的、化学控制的或溶剂活化的。
在扩散控制系统中，对于整体释放速率来说，包在聚合物基质中的试剂的扩散是确定速率的因素。一种类型的扩散控制系统使用贮存装置，其中所述试剂形成被惰性扩散障碍物围绕的核。这些系统包括膜、胶囊、微囊、脂质体以及中空纤维。或者，所述装置可以是整体装置，其中所述活性剂分散或溶解在惰性聚合物中。经由聚合物基质的扩散是限速步骤，并且聚合物的选择及其对待释放试剂的扩散和分配系数的影响部分地决定释放速率。
在通常的化学控制系统中，聚合物随着时间的流逝而降解并释放与逐渐腐蚀成比例的量的试剂。使用可生物消蚀的或悬垂的链能够实现化学控制。在可生物消蚀的系统中，所述试剂理想地以与整体扩散系统相同的方式在聚合物中均匀分布。当围绕所述试剂的聚合物消蚀时，所述试剂脱逸。在悬垂链系统中，通过允许通过本领域已知的任何期望并可实施的物理或化学方法进行释放的化学作用，所述试剂可以与聚合物共价结合，例如通过由于水或酶导致的键断裂。
在通常的溶剂活化控制系统中，将活性剂(其可以是一氧化氮、产生或释放一氧化氮的试剂、或一氧化氮清除剂或抗氧化剂)溶于或分散在聚合物基质中，并且所述活性剂不能扩散通过该基质。将渗透压用作释放所述试剂的驱动力。在一种类型的溶剂控制系统中，当环境流体(例如水)渗透基质时，聚合物(例如水凝胶)膨胀并且其玻璃转化温度低于环境(宿主)温度。因此，膨胀的聚合物处于橡胶态并且使含在其中的活性剂扩散通过密封剂。
能够以基于本领域技术人员公知的不同合成方法以若干一般途径实现生物活性剂与聚合物的化学键合，所述合成方法包括：在预先形成的聚合物上进行反应；在天然存在的聚合物上进行反应；含有活性成分的乙烯基单体的聚合；以及逐步增长聚合。当生物活性剂与聚合物化学键合时，不得不通过化学反应-通常是酶、水解、热或光化学反应来使所述键断裂。多种化学和物理变量能够影响键断裂的速率以及随后的化学附着材料由聚合物的释放，所述变量包括不稳定键的性质、间隔基团的长度、分子量、亲水性、相邻基团效应、环境因素以及物理形式和尺寸。
在防污应用中，本领域已知自抛光防污涂层。这样的涂层通常基于异丁烯酸三丁基锡、异丁烯酸甲酯，以及软化膜单体，例如丙烯酸-2-乙基己酯。有机锡聚合物通常起涂料粘合剂的作用。这样的涂料还可以包含有毒的添加剂，例如氧化亚铜或三有机锡化合物。此外，还可以存在诸如颜料、触变剂等通常的涂料添加剂。在通常的碱性海水中，聚合有机锡粘合剂逐渐被水解，并且三丁基锡以活性防污剂的形式被释放。所形成的水解的聚合物是水溶性的或者是水膨胀的，并且被移动的海水容易地从表面腐蚀掉，暴露涂料的新鲜表面。
对于药物应用，本领已知大量合适的控释系统。例如，可以使用贮器或基质装置形式的聚合胶粒或微囊(微粒、微球或纳米颗粒)，或者含有亲水和/或可沥滤添加剂的聚合物可以含有所述试剂，所述聚合物例如第二聚合物、表面活性剂或增塑剂等，以便得到多孔装置，或者释放药物的装置可以是渗透压“控制”的(贮器或基质装置)。还可以使用大的笼状分子，例如C60富勒烯(‘巴基球’)或超支化(星形爆发)树枝聚合物。
本领域技术人员容易理解，上述输送系统和方法仅仅是可以用于本发明的合适的方法和系统的实例。可以使用任何其它合适载体和输送系统以便实现本发明实施方案中期望的试剂应用方法。
药物可接受的稀释剂的实例是除盐水或蒸馏水；盐水；基于植物的油，例如花生油、红花油、橄榄油、棉子油、玉米油、芝麻油、例如花生油、红花油、橄榄油、棉子油、玉米油、芝麻油、落花生油或椰子油；硅酮油，包括聚硅氧烷、例如聚甲基硅氧烷、聚苯基硅氧烷以及聚甲苯基硅氧烷；挥发性硅酮；矿物油，例如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物。例如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级烷醇，例如乙醇或异丙醇；低级芳醇；低级聚烯基二醇或低级烯基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，例如棕榈酸异丙酯、十四酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；角叉菜胶；西黄蓍胶或阿拉伯胶以及矿脂。通常，所述载体将占组合物的1％至99.9％重量比。
对于药物应用，可以将组合物组方用于任何途径的输送，例如口服、局部、腔内、膀胱内、肌内、动脉、静脉、鼻内、肺内或皮下。
由于本发明人发现一氧化氮和产生或释放一氧化氮的试剂导致微生物对抗微生物剂敏感性的增加，所以可以将本发明的方法与至少一种抗微生物剂组合使用。可以使用任何合适的抗微生物剂，例如抗生素、去污剂、表面活性剂、诱导氧化应激的试剂、细菌素和抗微生物酶、肽以及噬菌体。所述抗微生物剂可以是天然的或合成的。事实上，可以根据个案为本发明的具体应用选择使用的抗微生物剂，并且本领域技术人员应当理解，本发明的范围不受具体抗微生物剂的性质和特性的限制。仅仅是示例，合适的抗生素包括，但不限于β-内酰胺、单青霉烯类、羧基青霉烯类、氨基糖苷类、喹诺酮类、大环内酯类、林可酰胺类、四环素类、链阳性菌素、糖肽类、哌嗪利福霉素类、磺胺类、氯霉素、萘啶酸、含吡咯的化合物以及肽类抗生素。抗微生物酶包括。但不限于脂肪酶、链霉蛋白酶、裂合酶(例如海藻酸裂合酶)以及多种其它的蛋白水解酶和核酸酶。
本领域技术人员应当理解，根据本发明的方法，可以同时、或以任意顺序依次地或在不同时间给予组合的每一组分，以便提供期望的效果。或者，将组分一起组方在单一计量单位中作为组合产品。因此，本发明的组合物，除了一氧化氮和/或产生或释放一氧化氮的试剂以外，还可以包含至少一种抗微生物剂。
如本文所述，本发明人还发现，使用一氧化氮清除剂逆转了所观察到的使用一氧化氮供体SNP对生物膜以及浮游生长的影响，从而为在有益情况下抑制细胞程序性死亡和抑制细胞由生物膜分散以及维持和/或提高生物膜的活性提供途径。
因此，本发明涉及维持和/或增强生物膜功能的方法，其中将所述生物膜暴露于至少一种一氧化氮清除剂和/或至少一种抗氧化剂。本发明还涉及抑制微生物中细胞程序性死亡的方法，其中将所述生物膜暴露于至少一种一氧化氮清除剂和/或至少一种抗氧化剂。本发明还提供用于实现上述方法的组合物。
因此，本发明的方法和组合物使得能够通过使用一氧化氮清除分子和RONS淬灭分子控制生物膜的寿命、活力、密度、活性和/或效力。适于维持和/或增强生物膜功能或抑制细胞程序性死亡的试剂包括一氧化氮清除剂，例如2-苯基-4，4，5，5-四甲基-咪唑啉-1-氧基-3-氧化物(PTIO)、羧基-PTIO、N-(二硫代羧基)肌氨酸(DTCS)、N-甲基-D-葡糖胺二硫代氨基甲酸酯(MGD)、(+)-芸香苷水合物和血红蛋白，并且还包括抗氧化剂，例如硫氧还蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和抗坏血酸。本领域技术人员容易理解，本领域大量已知的其它一氧化氮清除剂和抗氧化剂同等地适用于本发明，并且本发明并不受到所使用的具体试剂的限制。事实上，可以根据个案选择用于本发明具体应用的合适试剂。可以如上所述配制含有这样试剂的组合物。
本领域技术人员应当理解，涉及生物膜调节的本发明的方法和组合物适用于单一物种或混合物种的生物膜。本发明涉及的细菌物种可以是能够形成生物膜或有助于生物膜的任何物种。目标微生物物种可以包括真菌以及革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，所述真菌包括酵母和丝状真菌。本发明感兴趣的生物膜包括选自但不限于以下的微生物：念珠菌属(Candida spp.)(包括白色念珠菌(C.albicans))，Hormoconisspp.(包括H.resinae)，假单胞菌属(Pseudomonas spp.)，例如铜绿色假单胞菌(P.aeruginosa)，交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas spp.)，例如被囊交替假单胞菌(P.tunicata)，葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)，例如金黄色葡萄球菌(S.aureus)(包括耐甲氧西林和耐万古霉素金黄色葡萄球菌)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)，链球菌属(Streptococcusspp.)，例如变异链球菌(S.mutansl)、茸毛链球菌(S.sobrinus)，志贺杆菌属(Shigella spp.)，例如弗氏志贺菌(S.flexeri)、志贺痢疾杆菌(S.dysenteria)，分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)，例如结核分歧杆菌(M.tuberculosis)，肠球菌属(Enterococcus spp.)，例如粪肠球菌(E.faecalis)，埃希杆菌属(Escherichia spp.)，例如大肠埃希杆菌(E.coli)，沙门菌属(Salmonella spp.)，例如鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)、伤寒沙门菌(S.typhi)和肠炎沙门菌(S.enteritidis)，军团菌属(Legionella spp.)，例如嗜肺军团菌(Lpneumophila)，嗜血杆菌属(Haemophilus spp.)，例如流感嗜血杆菌(H.influenzae)、芽胞杆菌属(Bacillus spp.)，例如藓样芽胞杆菌(B.licheniformis)，硫酸盐还原和铁还原细菌(例如脱硫弧菌属(Desulfovibrio spp.)，包括寻常脱硫弧菌(D.vulgaris)和脱硫脱硫弧菌(D.desulfuricans)，希瓦氏菌属(Shewanella spp.)，包括腐败希瓦氏菌(S.putrefaciens)，地杆菌属(Geobacter spp.)，包括金属还原地杆菌(G.metallireducens)，克雷白杆菌属(Klebsiella spp.)，例如肺炎克雷白杆菌(K.pneumoniae)，变形杆菌属(Proteus spp.)，例如奇异变形杆菌(P.mirabilis)，气单胞菌属(Aeromonas spp.)，节杆菌属(Arthrobacter spp.)，微球菌属(Micrococcus spp.)，沙雷菌属(Serratia spp.)，例如粘质沙雷菌(S.marcescens)，卟啉单胞菌属(Porphyromonas spp.)，例如龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)，梭形杆菌属(Fusobacterium spp.)，例如核粒梭形杆菌(F.nucleatum)以及弧菌属(Vibrio spp.)，例如霍乱弧菌(V.Cholerae)。微生物物种可以好氧的、厌氧的、兼性的、耐氧的、恐氧的或微需氧的。或者，本领域技术人员应当理解，在本发明的某些应用中，待处理生物膜的混合群落中的具体物种是未确定的并且对于本发明的应用并非是关键的。
通过参考以下具体实施例，将更加详细地描述本发明，不应以任何方式将这些实施例理解为是对本发明范围的限制。
实施例
对于实施例1至3中描述的生物膜研究，使用由MarieAllesen-Holm慷慨捐赠的铜绿色假单胞菌菌株PAO1和含有插入染色体中的绿色荧光蛋白(GFP)的铜绿色假单胞菌菌株PAO1-GFP。在37℃下，在Luria Bertani(LB)培养基中进行常规过夜振荡培养。在如其它文献(Webb et al.2003，Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilmdevelopment(铜绿色假单胞菌生物膜生长中的细胞死亡)，J.Bacterid.185：4585-4592)所述的改进的M9基本培养基中，进行生物膜和浮游实验，含有5mM葡萄糖的改进的M9基本培养基用于连续培养实验而含有20mM葡萄糖的改进的M9基本培养基用于间歇实验。
实施例1.生物膜中细胞死亡和分散与成熟小集落中过亚硝酸根积累相关
如前所述(Moller et al.1998，In situ gene expression inmixed-culture biofilms：evidence of metabolic interactions betweencommunity members(混合培养生物膜中的原位基因表达：群落成员之间代谢相互作用的证据)，Appl Environ.Microbiol.64：721-732)，在室温下于连续培养器(通道尺寸，1×4×40mm)中培养铜绿色假单胞菌PAO1用于生物膜产生。使用0.5mL过夜细胞培养物接种通道并且在室温下无流动地孵育1小时。然后以0.2mm.s-1的流动细胞平均流速开始流动，该流动对应于雷诺数为0.02的层流。
为了研究生物膜生长期间的细胞死亡，使用LIVE/DEAD BacLight细菌活力试剂盒(Molecular Probes)对生物膜染色，其中使用SYTO9对活细胞进行特异性染色，并且使用碘丙锭对死细胞进行特异性染色。将染料的储液在改进的M9培养基中稀释为3μL·mL-1并将其注射入液流通路中。使用带有异硫氰酸荧光素和若丹明异氰酸四甲酯滤光器的共聚焦激光扫描显微镜(Olympus)，分别将SYTO9染色的活细胞和碘丙锭染色的死亡细胞显像。观察到，在7天后，铜绿色假单胞菌生物膜经历可高度重现模式的细胞死亡和分散，以及这些事件导致在生物膜中形成中空菌落(图1A-白色箭头指向中空结构；黑色箭头指向死亡细胞)。
为了研究特定活性氧和活性氮(RONS)的作用以及检测在死亡和分散期间在生物膜结构中积累的特定RONS，在液流通路中注射一系列活性荧光染料，每一活性荧光染料靶向不同的RONS，并且在进行共聚焦激光扫描显微镜观察之前在黑暗中孵育该一系列活性荧光染料30分钟。所研究的RONS是一氧化氮(NO)、过亚硝酸根(ONOO-)、过氧化氢(H2O2)和超氧化物自由基(O2 -·)。使用100μM的DAFFM-DA(Molecular Probes)，储液为5mM的DMSO溶液，来检测一氧化氮(Kojima et al.1999，Fluorescent indicators for imaging nitric oxideproduction(用于成像一氧化氮产生的荧光指示剂)，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.38：3209-3212)，使用15μM的二氢若丹明123(DHR)(Sigma)，储液为2.5mg·mL-1的乙醇溶液，来检测过亚硝酸根(Crow，1997，Dichlorodihydrofluorescein and dihydrorhodamine 123 aresensitive indicators of peroxynitrite in vitro：implications for intracellularmeasurement of reactive nitrogen and oxygen species(二氯二氢荧光素和二氢若丹明123是体内过亚硝酸根的敏感指示剂：用于活性氮和活性氧的细胞内测量的暗示)，Nitric Oxide，1：145-157)，使用100μM的羧基-H2DCF-DA(Molecular Probes)，储液为10mM的DMSO溶液，来检测过氧化氢，以及使用10μM的二氢溴化乙啶(HEt)(Sigma)，储液为1mg·mL-1的1％DMSO的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液，来检测超氧化物自由基(Bindokas et al.1996，Superoxide production in rathippocampal neurons：selective imaging with hydroethidine(在大鼠的海马神经原中超氧化物的产生：使用二氢溴化乙啶的选择性成像)，J.Neurosci.16：1324-1336)。使储液保持冷冻并进行遮蔽避光。使用前在改进的M9培养基中新鲜制备最终溶液。
如图1B所示，对照图像揭示，生物膜中的细菌显示低水平的自身荧光。使用两种RONS特异性染料检测到阳性荧光：HEt检测超氧化物自由基O2 -·，以及DHR以明显更高的荧光水平检测到过亚硝酸根ONOO-。光场像(左侧图)显示荧光发生在成熟的、经历如图1A所示的死亡和分散事件的小集落中。使用用于检测过氧化氢的H2DCF得到的阴性结果与在铜绿色假单胞菌生物膜中之前报道的过氧化氢酶的过表达相关联(Stewart et al.2000，Effect of catalase on hydrogen peroxidepenetration into Pseudomonas aeruginosa biofilms(过氧化氢酶对过氧化氢穿透进入铜绿色假单胞菌生物膜的影响)，Appl.Environ.Microbiol.66：836-838)。DHR对过亚硝酸根是特异性的并且不能被其它RONS单独氧化(Crow et al.1999)。因为过亚硝酸根是超氧化物和一氧化氮的直接产物，所以令人吃惊的是使用DAFFM没能检测到一氧化氮。然而，一氧化氮极度活泼，并且已知一氧化氮和超氧化物之间的反应以扩散限制方式瞬间进行(Kelm et al.1997，The nitric oxide/superoxideassay.Insights into the biological chemistry of the NO/O2-interaction(一氧化氮/过氧化物测定。对NO/O2-相互作用的生物化学的领悟)，J.Biol.Chem.272：9922-9932)，这可以阻止使用DAFFM检测到一氧化氮。
上述结果表明RONS过亚硝酸根在高细胞密度的生物膜细胞中积累并引发成熟生物膜中小集落中的细胞死亡。
实施例2.一氧化氮调节铜绿色假单胞菌的生物膜生长相对浮游生长
一氧化氮是生物系统中广泛分布的细胞间和细胞内信号分子。它还是过亚硝酸根的重要前体，过亚硝酸根是具有众多生物学作用的有效氧化剂。一氧化氮易于与超氧化物反应以生成过亚硝酸根：
NO+O2 -→ONOO-
因此，发明人研究了一氧化氮供体硝普钠(SNP)对铜绿色假单胞菌的浮游和生物膜生长的影响。SNP在体内释放一氧化氮(Smith et al.2001，Mechanisms of nitric oxide release from nitrovasodilators inaqueous solution：reaction of the nitroprusside ion([Fe(CN)5NO]2 -)withL-ascorbic acid(由硝酸血管舒张剂的水溶液释放一氧化氮的机理：硝普盐离子([Fe(CN)5NO]2 -)与L-抗坏血酸的反应)，J.Inorg Biochem，87：165-173)。
将96孔板中的生物膜用于这些实验。将100μL在改进的M9培养基中1/1000稀释的过夜培养物接种在96孔板(Sarstedt)中并于37℃下以120rpm振荡培养24小时。向培养物中加入浓度为25nM至100mM的SNP。每个处理重复4组。生长过夜后，将上清液转移至新板的孔中。使用PBS洗涤孔2次并使用120μL的结晶紫染色20分钟。然后再使用PBS洗涤3次并在120μL的无水乙醇中稀释。通过测量OD490nm定量生物膜形成，并使用荧光测量定量浮游生长。
如图2所示，在高浓度时(毫摩尔范围内)，与未处理的生物膜对比，观察到生物膜形成的增加和浮游生长的降低(25mM-100mMSNP)。在这些浓度下，SNP对多种细菌物种是有毒的；SNP释放高、有毒浓度的一氧化氮(Joannou et al.1998，Characterization of thebactericidal effects of sodium nitroprusside and other pentacyanonitrosylcomplexes on the food spoilage bacterium Clostridium sporogenes(硝普纳和其它戊氰基亚硝酰基配合物对食物腐败细菌产芽胞梭状芽胞杆菌杀菌效应的表征)，Appl Environ Microbiol，64：3195-3201；Kelley et al.1998，Inducible nitric oxide synthase expression is reduced in cysticfibrosis murine and human airway epithelial cells(囊性纤维化鼠类和人类气管上皮细胞中可诱导一氧化氮合酶表达的降低)，J Clin Invest，102：1200-1207)。在较低浓度时，即在微摩尔和纳摩尔范围内，观察到生物膜形成的降低和浮游生长的增加。使用500nM SNP重复观察到了最大的效应并且将该浓度用于此实施例和实施例3中所述的后续实验。
为了证实在所观察到的事件中一氧化氮的作用，使用两种不同的一氧化氮供体，S-亚硝基-L-谷胱甘肽(GSNO)和S-亚硝基-N-乙酰青霉胺(SNAP)来代替SNP，每一浓度为1μM。如图3所示，类似于SNP，这两种一氧化氮供体也均造成生物膜形成的降低和浮游生长的增加，虽然其程度低于使用SNP观察到的。
这些结果表明，在低浓度时，一氧化氮发出由生物膜向浮游表型转变的信号。
图3还显示一氧化氮清除剂2-苯基-4，4，5，5-四甲基-咪唑啉-1-氧基-3-氧化物(PTIO)的影响。除500nM的SNP外，还向生长中的生物膜加入浓度为1mM的PTIO。PTIO的加入在浮游和生物膜表型中均使SNP影响的降低了40％或更多。
实施例3.暴露于低水平的一氧化氮增加了铜绿色假单胞菌细胞对抗微生物剂的敏感性
已知浮游细胞比生物膜细胞对抗生素的敏感性高多达1000倍(Brooun et al.2000，A dose-response study of antibiotic resistance inPseudomonas aeruginosa biofilms(铜绿色假单胞菌生物膜中抗生素耐药性的剂量-响应研究)，Antimicrob Agents Chemother，44：640-646；Davies，2003，Understanding biofilm resistance to antibacterial agents(理解生物膜对抗微生物剂的抗性)，Nat Rev Drug Discov，2：114-122)。与成熟生物膜斗争的主要困难之一是这种对抗微生物剂降低的敏感性。实施例2中的上述结果表明，一氧化氮促进浮游模式的生长超过抗性更强的生物膜表型。因此，发明人研究了一氧化氮暴露是否还可以恢复对生物膜细胞的抗微生物敏感性。检测了多种抗微生物剂对暴露于低水平一氧化氮的铜绿色假单胞菌生物膜和浮游细胞的影响。
为了测试细胞的敏感性，检测了大范围的抗微生物化合物：抗生素妥布霉素(Sigma)，其不可逆地抑制细菌蛋白的合成，使用的终浓度为100μM；使用0.1％的表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)；以及氧化应激诱导剂过氧化氢(H2O2；浓度为10mM)和次氯酸(HOCl；浓度为8mM)。
在含有显微镜载玻片(76×26mm，Superfrost，Menzel Glaser)的培养皿中培养生物膜。为了避免污染，将载玻片高压灭菌并将培养皿暴露于紫外线下30分钟灭菌。将25mL的在改进的M9培养基中1/1000稀释的PAO1-GFP过夜培养物接种到板中并在37℃下以50rpm振荡培养24小时，使得在载玻片上形成生物膜。测定上清液的OD600nm读数。然后在无菌PBS中冲洗载玻片。对于抗微生物敏感性测定，在加湿舱(humid chamber)中，单独使用改进的M9培养基孵育载玻片(阴性对照)30分钟，或者使用500μL稀释在改进的M9培养基中的抗微生物剂孵育载玻片30分钟，然后再次在PBS中冲洗。在加湿舱中使用250μL如上所述的LIVE/DEAD染料对载玻片上的生物膜染色20分钟。对于每一载玻片随机拍摄7张共聚焦照片并使用成像分析将表面覆盖度百分比进行定量。
联合处理(SNP和抗微生物剂)后可重现性地观察到生物膜细胞数目高达95％的显著下降(图4A和4B)。使用妥布霉素-常用于治疗囊性纤维化患者的抗生素，得到了最高效果。
如图5所示，还研究了SNP提高预建立的铜绿色假单胞菌生物膜敏感性的能力。除了生长的起始24小时不存在SNP以外，如上所述生长生物膜。24小时后，更换培养基并使用含有500mM SNP的培养基代替(在处理生物膜中，对照中不含SNP)。在加入100μM Tb或10mM H2O2处理30分钟之前或暴露于紫外光(19W，254nm，30分钟，距离灯30cm)之前，使生物膜再生长24小时。如上述关于图4所述测定敏感性。如图5所示，在联合处理预建立的生物膜之后，观察到生物膜表面覆盖度和生物膜细胞数目的显著下降。
为了研究SNP和抗微生物剂联合处理对浮游细胞的影响，将PAO1-GFP过夜培养物在含有20mM葡萄糖或不含500nM SNP的改进的M9基本培养基中1/1000稀释。24小时后，在抗微生物溶液中将细胞1/10稀释并在室温下孵育2小时。进行CFU板计数以便评价细菌的活力。当与未处理的铜绿色假单胞菌对比时，对浮游细胞的SNP预处理导致在H2O2和妥布霉素暴露后进一步的2个对数减少(图6)。有趣的是，与未处理的对照相比，虽然使用500nM SNP处理引起浮游培养物的光密度增加(图3)，使用SNP预处理，暴露于妥布霉素或过氧化氢后并没有观察到CFU计数(活力)的等量增加。
并不希望被理论束缚，发明人提出，上述结果表明一氧化氮诱导铜绿色假单胞菌生物膜中的浮游“分散”生理，并且因此提高了其对抗微生物剂的敏感性。
实施例4.一氧化氮诱导絮状生物膜中细胞的分散
根据实施例2所述的表面缔合生物膜的结果，研究了一氧化氮诱导从非表面缔合混合物种生物膜的分散。
在供给乙酸盐的脱氮条件(缺氧)下，以间歇供给模式(1次倾析和供给循环/天)运行4个平行的生物反应器(30mL烧瓶)13天。这些试验的目标是为了证实，外部补充由SNP产生的NO能够影响活性污泥絮状物(生物膜)系统中的污泥絮凝、细胞死亡和分散。
使用于2004年11月18日从St Marys Sewage Treatment Plant(STP)(Sydney，NSW，Australia)收集的活性污泥接种生物反应器。在室温、缺氧条件下运行生物反应器。除了加入1mL SNP/水来实现期望的浓度以外，通过在供给3mL乙酸盐培养基和12mL亚硝酸盐培养基的混合物后向污泥中冲洗/鼓入N2气来维持缺氧条件。以24小时的循环来运行生物反应器，该循环由23.5小时的缺氧反应以及随后的10分钟沉降和倾析15mL上清液组成。
生物反应器的培养基由两种组分构成：碳培养基基础和氮培养基基础。对于每一循环，培养基由1体积的碳培养基基础和4体积的氮培养基基础组成。碳培养基基础包括(每升)6.587g CH3COONa、0.042g CaCl2·2H2O、0.090g MgSO4·7H2O、0.160g MgCl2·6H2O、0.011gKH2PO4、0.026g Na2HPO4·12H2O、0.122g Bacto蛋白胨(DifcoLaboratories，USA)、0.020g Bacto酵母提取物(Difco Laboratories)、0.025g NH4Cl和0.3ml的前述营养液(Bond et al.1999，Identification of some of the maj or groups of bacteria in efficient andnonefficient biological phosphorus removal activated sludge systems(在有效的和无效的生物除磷活性污泥系统中鉴别某些主要细菌群)，ApplEnviron Microbiol，65：4077-84)。使用Milli-Q水配制培养基并高压灭菌。
氮培养基基础包括(每升)8.972g NO2Na并且由反渗透去离子水配制。组合培养基中乙酸盐：NO2 --N之比维持在2.73∶1。
为了研究特定的活性氧和活性氮(RONS)的作用并且为了检测在死亡和分散过程中在生物膜结构中积累的特定的RONS，将一系列活性荧光染料，每一靶向不同的RONS(以实施例1中描绘的浓度)，与由St Marys STP得到的500mL活性污泥混合并在进行共聚焦激光扫描显微镜法之前在黑暗中孵育30分钟。研究的RONS是过氧化氢(H2O2)、一氧化氮(NO)、过亚硝酸根(ONOO-)以及超氧化物(O2 -·)和羟基(OH)基团。使用对照样品(不存在荧光RONS染料)建立用于随后荧光探针的CLSM图像收集水平。如表1所示，使用两种RONS特异性染料检测到了阳性荧光：细胞内过氧化氢H2O2-，以及DHR123以更高水平的荧光检测到了过亚硝酸根ONOO-。
表1.存在于St Marys STP(种)污泥中的RONS的评价
    荧光探针     RONS     观察
    对照      -     -
    Amplex红     细胞外H2O2     +
    DCF     细胞内H2O2     ++
    DHR123     ONOO-     +++
    HEt     O2 -·     -
    DAF-FM     NO     +
    TEMPO-9     HO/O2 -     -
为了研究并观察生物膜生长过程中的污泥絮状物和浮游细胞，使用LIVE/DEAD BacLight细菌活力试剂盒(Molecular Probes)对生物膜染色。在含有取自每一生物反应器的500mL活性污泥的微量离心管中，将染料的储液稀释为1μL mL-1。将样品(20μL)安放在载玻片上，其中使用共聚焦激光扫描显微镜(Olympus)观察细胞。在第13天观察每一生物反应器对絮状物和浮游细胞计数。如图7所示，与未处理的生物膜(图7A，表2)相比，使用SNP处理13天后，观察到细胞从处理的絮状生物膜基本分散(图7B)。
表2.在缺氧条件下孵育13天后，SNP对不同污泥参数的影响。(+少量浮游细胞，＜5个细胞/视野；+++丰富的分散细胞，未计数的，＞500个细胞/视野)。
    [SNP]     浮游细胞
    0(对照)     +
    1μM     ++
    100μM     ++
    10mM     +++
使用浓度为10mM的SNP观察最高水平的分散和絮状物瓦解。然而，由于絮状物的大尺寸(许多情况下＞200μm)，出现在细胞内部的NO的实际浓度可能要低很多。此外，由NO供体释放NO取决于复杂的化学反应，并且释放的NO的有效浓度能够比使用的SNP浓度最多低1至2个对数(Smith and Dasgupta，2001，Mechanisms of nitric oxiderelease from  nitrovasodilators in aqueous solution：reaction of thenitroprusside ion([Fe(CN)5NO]2 -)with L-ascorbic acid(由硝酸血管舒张剂的水溶液释放一氧化氮的机理：硝普盐离子([Fe(CN)5NO]2 -)与L-抗坏血酸的反应)，J.Inorg.Biochem.87：165-173)。
实施例5.一氧化氮诱导混合物种生物膜中细胞的分散
5.1材料与方法
5.1.1模型分布系统
在本研究中使用Storey和Ashbolt(Storey M.V.and Ashbolt N.J.(2001)，“Persistence of two model enteric viruses(B40-8 and MS-2bacteriophages)in water distribution pipe biofilms”(两种模式肠道病毒(B40-8和MS-2噬菌体)在配水管生物膜中存留)，Water Sci Technol.43(12)：133-8)所述的生物膜取样点(BSS)。在两个恒流环状反应器(型号920，BioSurfaces Technologies，Bozeman，Montana)中，于BSS处培育模型饮用水系统和循环水系统生物膜。环状反应器(AR)由旋转的聚碳酸酯内部圆柱体和静止的玻璃外部圆柱体组成，它们由填充有水的环状腔分离。在AR的内部旋转圆柱体的暴露面放置60个不锈钢(SS)和未塑化的聚氯乙稀(uPVC)试样块(15mm×40mm的可获得表面积)，其分别以30L.h1的速率接收饮用水和循环水，使得水力保留时间为2.2分钟。设定环转速以提供类似于配水管平均水力需要的线性速率(0.32L·s-1)。在放置于每一实验装置之前，在1g·L-1次氯酸钠中将生物膜试样块灭菌2小时并使用无菌Milli-Q水洗涤。使生物膜在试样块表面生长90天。此后，停止输入流并将最终浓度约为107CFU·mL-1的抗四环素和氨苄青霉素的粘质沙雷菌添加到AR。使粘质沙雷菌细胞在生物膜中SS上和uPVC试样块表面上稳定2周。通过再次连接饮用水和循环水输入流1周，从系统中除去未定居的细胞。在30℃下孵育24小时后，已经从选择性LB琼脂平板(补充有50μg·mL-1四环素和100μg·mL-1氨苄青霉素)收集了粘质沙雷菌并在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤了三次。
5.1.2实验设计
使用无菌镊子从每一生物膜装置中小心地移去试样块。从每一实验装置中移去SS试样块(饮用水)和uPVC试样块(循环水)并转移至实验室中的生物反应器中用于NO暴露。生物反应器由具有底部入口和顶部出口的、覆盖有铝箔并且含有PP载玻片架(Kartell，Italy)的1L聚丙烯(PP)烧杯组成，所述PP载玻片架被改进以适合所述试样块。将所述架放置于PP台底部上方2cm处，并且使用磁搅拌产生环流以模拟管壁上的水力切应力。使用1g·L-1次氯酸钠对生物反应器灭菌2小时并在接收包含生物膜的试样块之前使用无菌Milli-Q水洗涤。对于由饮用水系统和循环水系统建立的每一类型的生物膜，在3个独立的生物反应器中随机放入试样块，其中将其暴露于高压灭菌的(无菌且脱氯)，pH7.8，含有0、100nM或500nM NO供体硝普钠(SNP)，流速为50mL·h-1的饮用水的恒流中18小时。
然后小心地将测试块转移至含有20mL常规氯处理的25mL玻璃瓶中。通过在1/4强度Ringers溶液中稀释2.4M次氯酸盐溶液新鲜制备一定范围的氯处理，并使用Pocket Colorimeter II(HACH，Loveland，CO)校准。平缓振动(75rpm)10分钟后，通过加入终浓度为100μM的硫代硫酸钠终止反应。对于每一NO/氯组合处理，使用三个试样块进行活力计数并使用两个试样块进行显微镜分析。
5.1.3分析方法
处理试样块以用于活力计数和显微镜分析。
使用LIVE/DEADBacLigh细菌活力试剂盒(Molecular Probes，Oregon，USA)染色生物膜中的细胞。在1/4强度的Ringers溶液中分别将两种染料储液(SYTO9和碘丙锭)稀释至3μL·mL-1的浓度，并使用150μL的染色混合物将试样块染色并使用薄盖玻片(10.5×35mm，ProSciTech，Kirwan，Australia)覆盖。使用落射荧光显微镜(Leica型号DMR)观察试样块，并且使用图像分析系统(ImageJ，NIH)计算生物膜细胞。
对于活力计数，将试样块放置于含有有100μM硫代硫酸钠的25mL 1/4强度Ringers溶液的无菌胃袋(101×152mm)(Seward，UK)中。将袋热封并进行手搓以引发附着的生物膜的分散。将试样块在400W(Branson 2210 Sonicator)下声处理.60秒，然后在胃袋中放置60秒(Seward Stomacher80，Seward，UK)以除去并使剩余生物膜均匀化。然后将匀浆从胃袋中无菌地移出。使用注皿技术在寡营养R2A琼脂(Oxoid，England)和富营养Luria Bertani(LB)琼脂板上进行异养平板计数(HPC)。在30℃下孵育平板并在7天后计数。根据形态鉴别粘质沙雷菌菌落并通过在补充有50μg·mL-1四环素和100μg·mL-1氨苄青霉素的选择性LB琼脂上平板接种菌落进行证实。之前通过HPC的恢复检验声处理和胃袋技术对生物膜除去的功效。
使用显著性水平为95％的变量分析(ANOVA)试验来对比低剂量NO和氯杀菌剂的不同组合对生物膜生长的影响。
5.2结果
5.2.1粘质沙雷菌穿刺的饮用水生物膜
如图8A至8C所示的数据表明，SNP处理以剂量依赖方式有效除去建立在模型饮用水配水系统中的混合物种生物膜以及粘质沙雷菌。从活力测定和显微镜分析(图8)中得到一致的结果。SNP处理并不影响板上不同菌落形态的相对比例，这表明该处理对于混合群落中特定物种没有选择性。最有效的处理浓度为500nM SNP，这与之前使用铜绿色假单胞菌和其它单一物种细菌生物膜观察到的结果相关联。在此实验中，使用2ppm的游离氯处理并且在暴露于常规氯中的所有试样块上均观察到了生物膜的完全除去。
5.2.2粘质沙雷菌穿刺的循环水生物膜
一旦暴露于纳摩尔浓度的NO供体SNP，就以剂量依赖方式降低了由模型循环水配水系统建立的并含有粘质沙雷菌的混合物种生物膜的总计数和粘质沙雷菌的计数。从活力测定和显微镜分析(图9)中得到一致的结果。暴露于500nM SNP的生物膜还显示对游离氯处理的增加的敏感性，例如由活力计数测定的，与对照生物膜相比，1ppm游离氯除去SNP处理的生物膜的有效性高达前者的20倍(图9)。
实施例6.低水平一氧化氮诱导粘质沙雷菌、霍乱弧菌、大肠埃希 杆菌和藓样芽胞杆菌生物膜的分散
在含有玻璃(Superfrost，Menzel Glaser)或聚碳酸酯显微镜载玻片(76×26mm)的培养皿(90mm直径)中培养细菌生物膜。为了防止污染，将载玻片高温灭菌(玻璃)或在1％漂白剂溶液中灭菌30分钟，并将培养皿暴露于紫外光30分钟来灭菌。将细菌的过夜培养物1/1000稀释在25ml新鲜培养基中并在30℃或37℃下，以50rpm振荡培养24小时，使得在载玻片上形成生物膜。24小时后，使用含有不同浓度的SNP、SNAP或GSNO(除了对照不含NO产生剂以外)的新鲜培养基代替所述培养基，并将细胞在合适的温度下，使用50rpm的搅拌再孵育24小时。然后在无菌PBS中洗涤载玻片以除去未附着或松散附着的细胞。
还如上所述测试了SNP增加霍乱弧菌生物膜对抗微生物剂处理的敏感性的能力，不同的是，在生物膜生长的起始24小时后，与抗微生物处理组合加入NO供体。对照包括未处理的对照和单独的抗微生物处理，并且在合适的温度下使用50rpm的搅拌再孵育细胞24小时。然后在无菌PBS中洗涤载玻片以除去未附着或松散附着的细胞。所有处理均进行三个重复。
通过使用BacLight Live-Dead Staining试剂(Molecular Probes Inc，USA)对细胞进行染色并随后进行共聚焦显微镜法来进行对生物膜形成的评价。将每个载玻片中高达15个随机选择的视野在x-y平面成像以用于随后的图像分析。使用分析包ImageJ(http://rsb.info.nih.gov/ij)进行图像分析以确定总表面覆盖度。结果以每视野中可获得的总表面的覆盖百分比来表示。
图10显示了SNP浓度为0至500nM时，粘质沙雷菌生物膜的浓度依赖分散，在SNP浓度为25nM时生物膜覆盖度降低了超过60％。图11显示了SNAP(100nM)也对粘质沙雷菌生物膜的分散有效。
图12和13显示了SNP和SNAP对霍乱弧菌生物膜分散影响的类似结果。
图14显示了SNP增强了四环素(6μg/mL)对霍乱弧菌生物膜的抗微生物活性。所使用的四环素浓度低于该生物的MIC。
图15显示了1μM GSNO对霍乱弧菌生物膜稳定性具有显著的影响，并且图16显示了500nM SNP对大肠埃希杆菌生物膜的稳定性具有显著的影响。
图17显示了SNP对藓样芽胞杆菌生物膜稳定性的强烈影响，100nM SNP使得生物膜表面覆盖度降低了90％。
实施例7.低水平一氧化氮诱导白色念珠菌生物膜的分散
在24孔聚苯乙烯微量滴定板(Sarstedt)中，在酵母蛋白胨葡萄糖培养基(YPD)中，于30℃下，以100rpm的振荡培养细胞。简而言之，将白色念珠菌的过夜培养物1∶100稀释在新鲜培养基中并加入1ml到孔中。使生物膜形成24小时，随后使用新鲜的培养基代替所述培养基，并加入浓度为0nM、25nM、100nM、500nM、1μM和5μM的SNP。再将细胞孵育24小时，此时使用PBS洗涤孔以除去松散的和未附着的细胞，并使用1％结晶紫染色。使用PBS充分洗涤孔并使用Wallac-Victor2酶标仪(Perkin-Elmer)在540nm处测量吸收入生物膜中的结晶紫的量。
以相对未处理对照的百分比表示结果(图18)，并且结果显示在SNP浓度低于1μM时，SNP使白色念珠菌生物膜不稳定，在25nMSNP处理中白色念珠菌生物膜的减少高于60％。
实施例8.低水平一氧化氮抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成
测试NO对表皮葡萄球菌的生物膜形成和生长的影响的方法和材料类似于上述用于粘质沙雷菌、霍乱弧菌、大肠埃希杆菌和藓样芽胞杆菌的那些，使用培养皿中的载玻片培养生物膜。然而，向细胞中连续加入NO供体SNP，而不是在生物膜生长起初的24小时后。结果表明，SNP的加入能够以浓度依赖方式阻止表皮葡萄球菌生物膜的形成(图19)。
实施例9.低水平一氧化氮诱导核粒梭形杆菌生物膜的分散
为了确定NO对厌氧口腔细菌的潜在影响，选择核粒梭形杆菌作为口腔聚生体的模式和关键生物。简而言之，使用过夜培养物接种新鲜的培养基(1∶100)。将细胞培养至0.1的光密度(600nm)，此时向细胞中加入浓度为0nM、100nM、500nM、1μM和10μM的SNP。还向细胞管中加入载玻片，并且使细菌附着4小时。在孵育阶段的终点时，移除载玻片，通过浸入无菌PBS洗涤两次以便除去松散结合的细胞，并使用结晶紫染色。通过数字成像俘获和随后的图像分析对附着细胞进行显微计数。以附着细胞与不暴露于SNP的对照培养物相比的百分比表示结果(图20)，并且结果显示NO产生剂的加入抑制核粒梭形杆菌对表面的附着。
应当理解，虽然为了说明的目的本文描述了本发明的具体实施方案，但是在不偏离由所附权利要求限定的本发明精神和范围的情况下，可以进行多种修改。

Claims (36)

1.用于促进微生物生物膜的分散或防止微生物生物膜形成的方法，所述方法包括：
将所述生物膜暴露于有效量的一氧化氮或有效量的至少一种产生或释放一氧化氮的试剂；
使用有效量的一氧化氮或有效量的至少一种产生或释放一氧化氮的试剂处理易于形成生物膜的表面或介质；
将有效量的一氧化氮或有效量的至少一种产生或释放一氧化氮的试剂结合易于形成生物膜的表面或介质；或者
诱导一种或多种活性氧或氮在所述生物膜的微生物中或者在能够形成生物膜的微生物中积累。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种产生或释放一氧化氮的试剂包括一种或多种一氧化氮供体。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述至少一种一氧化氮供体是硝普钠、S-亚硝基-L-谷胱甘肽、S-亚硝基-N-乙酰青霉胺或其组合。
4.如权利要求1所述的方法，其中存在于所述生物膜中的所述微生物或者能够形成生物膜的所述微生物是单一物种的。
5.如权利要求1所述的方法，其中存在于所述生物膜中的所述微生物或者能够形成生物膜的所述微生物是多物种的。
6.如权利要求1所述的方法，其中存在于所述生物膜中的所述微生物或者能够形成生物膜的所述微生物包括细菌或真菌。
7.如权利要求1所述的方法，其中存在于所述生物膜中的微生物或者能够形成生物膜的微生物包括一个或多个选自下列的物种：念珠菌属(Candida spp.)、Hormoconis spp.、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas spp.)、葡萄球菌属(Staphylococcusspp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、志贺杆菌属(Shigella spp.)、分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、埃希杆菌属(Escherichia spp.)、沙门菌属(Salmonella spp.)、军团菌属(Legionellaspp.)、嗜血杆菌属(Haemophilus spp.)、芽胞杆菌属(Bacillus spp.)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio spp.)、希瓦氏菌属(Shewanella spp.)、地杆菌属(Geobacter spp.)、克雷白杆菌属(Klebsiella spp.)、变形杆菌属(Proteusspp.)、气单胞菌属(Aeromonas spp.)、节杆菌属(Arthrobacter spp.)、微球菌属(Micrococcus spp.)、沙雷菌属(Serratia spp.)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas spp.)、梭形杆菌属(Fusobacterium spp.)以及弧菌属(Vibrio spp.)。
8.如权利要求1所述的方法，其中存在于所述生物膜中的微生物或者能够形成生物膜的微生物包括一个或多个选自下列的物种：铜绿色假单胞菌(P.aeruginosa)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、大肠埃希杆菌(Escherichia coli)、藓样芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、核粒梭形杆菌(Fusobacterium nucleatum)、霍乱弧菌(Vibrio Cholerae)以及白色念珠菌(Candida albicans)。
9.如权利要求1所述的方法，其还包括使用至少一种抗微生物剂处理所述表面或介质、将至少一种抗微生物剂结合所述表面或介质、或者将所述生物膜中的微生物或能够形成生物膜的微生物暴露于至少一种抗微生物剂。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述抗微生物剂选自抗生素、表面活性剂、氧化应激诱导剂或其组合。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种活性氧或氮选自过亚硝酸根、一氧化氮、过氧化氢和超氧化物自由基，或其组合。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括在所述生物膜中的微生物中诱导导致分散的分化事件，或者其中所述方法包括防止微生物中导致生物膜形成的分化事件的诱导。
13.如权利要求1所述的方法，其包括提高微生物对一种或多种抗微生物剂的敏感性。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述有效量包括一氧化氮或至少一种产生或释放一氧化氮的试剂的约1nM至约10mM的浓度。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述有效量包括一氧化氮或至少一种产生或释放一氧化氮的试剂的约10nM至约5μM的浓度。
16.用于促进微生物生物膜的分散或防止微生物生物膜形成的组合物，所述组合物包含一氧化氮、至少一种产生或释放一氧化氮的试剂、或者一氧化氮和至少一种产生或释放一氧化氮的试剂，以及合适的载体。
17.如权利要求16所述的组合物，其中所述至少一种产生或释放一氧化氮的试剂包括一种或多种一氧化氮供体。
18.如权利要求17所述的组合物，其中所述至少一种一氧化氮供体选自硝普钠、S-亚硝基-L-谷胱甘肽、S-亚硝基-N-乙酰青霉胺或其组合。
19.如权利要求16所述的组合物，其还包含至少一种抗微生物剂。
20.如权利要求19所述的组合物，其中所述至少一种抗微生物剂是抗生素、表面活性剂、氧化应激诱导剂或其组合。
21.如权利要求16所述的组合物，其为防污组合物、医疗装置或其组件、用于医疗装置的涂层或药物组合物。
22.如权利要求16所述的组合物，其中所述组合物诱导所述生物膜中的微生物中导致分散的分化事件，或者所述组合物防止微生物中导致生物膜形成的分化事件的诱导。
23.用于维持或增强生物膜功能的方法，所述方法包括将所述生物膜暴露于至少一种一氧化氮清除剂、至少一种抗氧化剂、或至少一种一氧化氮清除剂和至少一种抗氧化剂。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述一氧化氮清除剂为2-苯基-4，4，5，5-四甲基-咪唑啉-1-氧基-3-氧化物。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述抗氧化剂选自硫氧还蛋白、过氧化物歧化酶、谷胱甘肽和抗坏血酸。
26.如权利要求23所述的方法，其包括在所述生物膜中的微生物中抑制导致分散的分化事件。
27.维持或提高、或维持并提高生物膜功能的组合物，所述组合物包含至少一种一氧化氮清除剂和/或至少一种抗氧化剂，以及合适的载体。
28.如权利要求27所述的组合物，其在所述生物膜中的微生物中抑制导致分散的分化事件。
29.如权利要求27所述的组合物，其中所述一氧化氮清除剂为2-苯基-4，4，5，5-四甲基-咪唑啉-1-氧基-3-氧化物。
30.如权利要求27所述的组合物，其中所述抗氧化剂选自硫氧还蛋白、过氧化物歧化酶、谷胱甘肽和抗坏血酸。
31.如权利要求1所述的方法，其包括向对象给予有效量的一氧化氮或有效量的至少一种产生或释放一氧化氮的试剂，用于处理或防止所述对象中与生物膜相关的状态。
32.如权利要求31所述的方法，其还包括对所述对象给予至少一种抗微生物剂。
33.如权利要求1所述的方法，其中所述易于形成生物膜的表面包括医疗装置的表面。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述医疗装置是导管、支架、假体或其它外科或可植入的装置。
35.如权利要求16所述的用于处理或防止对象的与生物膜相关的状态的组合物。
36.如权利要求35所述的组合物，其还包含至少一种抗微生物剂。
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