FR3053042A1 - Anticorps dirige contre le sous-type b des recepteurs aux endothelines et ses utilisations - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne des anticorps dirigés contre le sous-type B des récepteurs aux endothélines notamment monoclonaux, un fragment ou un dérivé de ceux-ci. La présente invention concerne également l'utilisation thérapeutique, diagnostique ou comme outil de recherche d'un tel anticorps dans le domaine des cancers et notamment du glioblastome.
Description
ANTICORPS DIRIGÉ CONTRE LE SOUS-TYPE B DES RÉCEPTEURS AUX ENDOTHÉLINES
ET SES UTILISATIONS
DESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention appartient au domaine technique des anticorps, de leur utilisation thérapeutique et diagnostique ainsi que de leur utilisation comme outil de recherche.
Plus particulièrement, la présente invention propose des anticorps, avantageusement monoclonaux, spécifiques de la conformation native et fonctionnelle du sous-type B des récepteurs aux endothélines et notamment des récepteurs humains aux endothélines exprimés à la surface des cellules cancéreuses telles que des cellules de glioblastome.
La présente invention concerne également l'utilisation de ces anticorps à des fins thérapeutiques et diagnostiques ainsi qu'à des fins de recherche.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE
Les récepteurs des différentes endothélines (désignées ET1, ET2 et ET3 chez l'homme) appartiennent à la famille des récepteurs à 7 domaines transmembranaires également désignés RCPG pour « Récepteurs Couplés aux Protéines G ». Les récepteurs aux endothélines présentent, chez l'homme, deux principaux sous-types que sont le sous-type A (ETA-R) et le sous-type B (ETB-R). Le fait que ces récepteurs soient classés dans la famille des RCPG leur confère une structure tri-dimensionnelle complexe. Cette caractéristique explique, en partie, la difficulté d'obtenir des anticorps reconnaissant la structure native de ces récepteurs exprimée à la membrane cellulaire. En effet, la difficulté pour obtenir des anticorps monoclonaux spécifiques des RCPG est une conséquence des problèmes liés à l'obtention de ces mêmes récepteurs, sous une forme native et fonctionnelle, en dehors de leur contexte membranaire. L'axe endothéline et ses récepteurs est impliqué dans plusieurs fonctions et dysfonctionnements physiopathologiques. A titre d'exemples non limitatifs, on peut citer l'hypertension artérielle, l'athérosclérose, les maladies coronariennes, les dysfonctionnements rénaux, les maladies cérébrovasculaires, la maladie de Crohn, la fibrose pulmonaire, l'asthme, etc... (Voir la revue de R. Shah, 2007, « Endothelins in health and disease », Eur. J. Int. Med., vol. 18, pages 272-282).
De plus, les récepteurs aux endothélines se sont également avérés être associés au développement de nombreux cancers, en favorisant la prolifération, la survie et la dissémination des cellules cancéreuses ainsi que l'angiogenèse (Bagnato & Rosano, 2008, « The endothelin axis in cancer », Int. J. of Biochem. & Cell Biology, vol. 40, pages 1443-1451). Concernant le sous-type B des récepteurs aux endothélines, ce dernier présente une modification de son niveau d'expression en particulier dans les mélanomes, le cancer du colon, dans le Sarcome de Kaposi, dans les glioblastomes (tumeurs du cerveau), et dans des cas de cancer de la vessie.
Il est également établi que le sous-type B des récepteurs aux endothélines est impliqué dans le défaut de reconnaissance de certaines cellules cancéreuses, en particulier les cellules de cancers de l'ovaire par le système immunitaire, en induisant une forte réduction de l'infiltration lymphocytaire (Buckanovich et al., 2008, « Endothelin B receptor médiates the endothélial barrier to T cell homing to tumors and disables immune therapy », Nature Medecine, vol. 14, pages 28-36).
Ainsi, cibler un conformère d'ETB-R exprimé à la surface des cellules cancéreuses et notamment des cellules de glioblastome apparaît donc particulièrement pertinent en biologie clinique humaine en termes d'outil diagnostique pour le suivi du développement de ces tumeurs et notamment de ces tumeurs cérébrales et de leurs récidives après une intervention chirurgicale mais également pour des applications thérapeutiques en ciblant ces cellules tumorales. Or, dans l'arsenal d'immunothérapie passive des cancers utilisant des anticorps monoclonaux (40 anticorps ont été approuvés à ce jour), aucun ne cible les RCPG.
De façon générale, peu d'anticorps ciblant les récepteurs aux endothélines et en particulier le sous-type ETB-R sont décrits à ce jour. L'article de Kondoh et al, 1990, intitulé « Isolation of anti-endothelin receptor monoclonal antibodies for use in receptor characterization » dans BBRC, vol. 172, pages 503-510 décrit les propriétés de liaison de 4 anticorps monoclonaux (A2, G9, E7 et G10) vis-à-vis de complexes solubilisés de récepteurs aux endothélines présents à la surface de membranes pulmonaires de rats. Les anticorps G9 et G10 sont des immunoglobulines de type G et d'isotype 2a (lgG2a), alors que les anticorps A2 et E7 sont des immunoglobulines IgGl. Si ces quatre anticorps sont bien spécifiques de récepteurs solubilisés aux endothélines, l'article de Kondoh et al ne fournit aucune information quant à la spécificité fine de ces anticorps (ETA-R et/ou ETB-R), quant à la reconnaissance des récepteurs d'origine humaine, ni quant à une éventuelle propriété antagoniste. L'article de Yamaguchi et al, 2004, intitulé « Characterization and application of monoclonal antibodies against human endothelin B receptor expressed in insect cells » dans Biotechnology Letters, vol. 26, pages 293-299, concerne la caractérisation des propriétés de liaison de 5 anticorps monoclonaux de souris obtenus après immunisation protéique avec de ΓΕΤΒ-R humain recombinant produit dans des cellules d'insectes. Quatre d'entre eux présentent une affinité similaire (de l'ordre du nanomolaire) pour ETB-R, alors que le cinquième est 10 fois moins affin. L'analyse épitopique de 3 d'entre eux (N-6, N-3 et N-l) a révélé qu'ils reconnaissent le domaine N-terminal d'ETB-R et plus particulièrement la séquence correspondant aux acides aminés 27-35 du ETB-R pour N-6 ; la séquence correspondant aux acides aminés 27-41 du ETB-R pour N-3 et la séquence correspondant aux acides aminés 71-85 pour N-l. Enfin, ces 5 anticorps sont capables de reconnaître des cellules COS surexprimant ETB-R.
La demande de brevet US 2010/003240 déposée au nom de l'Université de New York et publiée le 7 janvier 2010 concerne des protocoles thérapeutiques et des mélanges pharmaceutiques dans le cadre du traitement et de la prévention des cancers et notamment des mélanomes. A cet effet et plus spécifiquement, l'utilisation d'antagonistes d'ETB-R est revendiquée. Les exemples décrits quant à ces antagonistes concernent uniquement des formes modifiées de l'endothéline-1, mais par extension, l'usage d'anticorps antagonistes d'ETB-R est revendiqué sans qu'aucun exemple particulier de tels anticorps ne soit décrit ou fourni.
La demande de brevet JP 2012111706 au nom de Seikisui Chemical Co Ltd et publiée le 14 juin 2012 concerne un anticorps monoclonal appelé hB07. Il s'agit d'une immunoglobuline de souris d'isotype lgG2a/lambda, qui est spécifique du sous-type B humain des récepteurs aux endothélines. Les auteurs ont montré que l'anticorps hB07 est capable de bloquer, de manière compétitive, la fixation de l'endothéline 1 avec une efficacité (IC50) calculée à 1,7 10"7 M. Cet anticorps dont les séquences ne sont pas décrites présente donc des propriétés antagonistes.
De même, un anticorps monoclonal antagoniste des propriétés pharmacologiques du sous-type B des récepteurs aux endothélines et notamment du sous-type B humain, dénommé Rendomab-Bl a été décrit dans la demande internationale WO 2012/045776 au nom du CEA et publiée le 12 avril 2012.
Enfin, la demande internationale WO 2013/063001 aux noms de Genentech et de Hoffmann-La Roche et publiée le 2 mai 2013 décrit un anticorps thérapeutique conjugué à des molécules cytotoxiques pour le traitement des mélanomes, sans qu'il ne soit fait référence à un conformère préférentiellement exprimé par les cellules tumorales. Cet anticorps nommé 5E9 cible ETB-R humain surexprimé à la surface des mélanomes. Il est à noter que l'anticorps 5E9 croise avec ΙΈΤΒ-R des rongeurs ainsi que le récepteur des primates non humains comme cela est précisé dans la publication d'Asundi et al, 2011, intitulé « An antibody-drug conjugate targeting the endothelin B receptor for the treatment of melanoma » dans Clinical Cancer Research, vol. 17, pages 965-975.
Les inventeurs se sont donc fixé pour but l'obtention d'anticorps aptes à cibler des conformères particuliers du sous-type B du récepteur aux endothélines exprimés à la surface de cellules cancéreuses.
EXPOSÉ DE L'INVENTION
La présente invention permet de résoudre les problèmes techniques tels que précédemment définis et d'atteindre le but que se sont fixé les inventeurs.
En effet, les inventeurs ont développé et utilisé une stratégie d'immunisation et de sélection particulière déjà publiée dans Allard et al, 2011 (« Electroporation-aided DNA immunization generates polyclonal antibodies against the native conformation of human endothelin B receptor », DNA and Cell Biology, vol. 30, pages 727-737). Cette stratégie couplée à une procédure de criblage des hybridomes en ELISA-cell puis par cytométrie de flux privilégie l'obtention d'anticorps monoclonaux spécifiques d'ETB-R dans sa conformation native. Cette approche présente, en outre, l'avantage de ne pas avoir besoin du récepteur d'intérêt extrait et purifié, ce qui constitue toujours aujourd'hui un défi difficile à relever.
Par cette stratégie, les inventeurs ont pu sélectionner différents anticorps monoclonaux dirigés contre le sous-type B des récepteurs aux endothélines et notamment du sous-type B humain, nommé ci-après Rendomab-B49, Rendomab-B41 et Rendomab-B36. Ces anticorps sont non seulement proches quant à leurs séquences nucléotidiques et peptidiques mais aussi quant à leurs propriétés. Ainsi, aucun de ces anticorps ne présente un caractère antagoniste des propriétés pharmacologiques du sous-type B des récepteurs aux endothélines (ETB-R). En d'autres termes, les anticorps selon la présente invention ne sont pas capables d'inhiber ou de bloquer la fixation des ligands endothélines et notamment des ligands ET1, ET2 et ET3 sur ETB-R. Au contraire, les anticorps selon la présente invention sont capables de reconnaître les conformères particuliers du sous-type B du récepteur aux endothélines exprimés à la surface de cellules cancéreuses et notamment des cellules de glioblastomes.
La présente invention concerne un anticorps dirigé contre le sous-type B des récepteurs aux endothélines, un fragment ou dérivé de celui-ci.
Avant d'entrer plus en détail dans la description de l'invention, nous rappelons ou proposons les définitions suivantes.
Les termes « anticorps » et « immunoglobuline » sont équivalents et peuvent être utilisés de façon interchangeable dans la présente invention.
Un anticorps est une glycoprotéine comprenant au moins deux chaînes lourdes (H) et au moins deux chaînes légères (L) reliées entre elles par un ou plusieurs ponts disulfures. Chaque chaîne lourde comprend une région (ou domaine) variable (VH) et une région constante comprenant 3 domaines, habituellement désignés CH1, CH2 et CH3. Chaque chaîne légère comprend une région (ou domaine) variable (VL) et une région constante comprenant un seul domaine, habituellement désigné CL. Les régions variables des chaînes lourdes et des chaînes légères impliquées dans la reconnaissance de l'antigène peuvent encore être subdivisées en 3 régions hypervariables, également appelées « régions déterminant la complémentarité » (CDR), encadrées par 4 régions plus conservées, également appelées régions charpentes (FR). L'organisation de chaque région variable de chaîne lourde (ou de chaîne légère) est, de l'extrémité N-terminale à l'extrémité C-terminale, comme suit : FRI, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 et FR4. Dans le cadre de la présente invention, la définition des CDR et FR qui a été utilisée est celle de l'IMGT (the international ImMunoGeneTics database http://imgt.cines.fr:8104). Les calculs des pourcentages d'identité des séquences CDR mentionnés et revendiqués ci-après sont donc à prendre en compte sur la base de cette annotation.
De plus, le terme « anticorps » inclut, dans le cadre de la présente invention, non seulement des molécules d'anticorps complètes mais aussi des fragments et des dérivés de celui-ci.
Par « fragment d'anticorps », on entend, dans le cadre de la présente invention, aussi bien un fragment monovalent qui présente un seul site de liaison à l'antigène qu'un fragment divalent qui présente deux sites de combinaison à l'antigène. Ainsi, un fragment selon l'invention présente au moins un site de liaison à l'antigène. Parmi ces fragments, on peut citer les fragments Fab, F(ab')2, Fv, et d'autres fragments qui conservent le site de liaison à l'antigène (scFv et diabody). Un fragment Fab est un fragment monovalent constitué de la chaîne légère en entier et d'une partie de la chaîne lourde (Fd) comprenant les domaines VH et CH1 tels que précédemment définis. Un fragment F(ab')2 est un fragment divalent correspondant à l'association de deux fragments Fab reliés par les ponts disulfures présents au niveau de la région charnière des immunoglobulines (« Hinge ») située entre les domaines constants CH1 et CH2. Un fragment Fv est un fragment monovalent uniquement constitué des régions variables VL et VH des chaînes légère et lourde d'un anticorps. Un fragment scFv est un fragment polypeptidique monovalent, uniquement obtenu par génie génétique, correspondant aux domaines variables reliés par un lien peptidique. Un diabody est une molécule d'anticorps recombinante et divalente constituée de deux molécules de scFv tête-bêche en raison d'un lien peptidique trop court pour permettre la formation d'un scFv. Les fragments selon l'invention couvrent également les fragments tels que précédemment cités dont la demi-vie a été augmentée par modification chimique notamment par incorporation dans un liposome ou par introduction d'un poly(alkylene) glycol tel qu'un poly(ethylène) glycol (PEG), cette technique étant appelée « PEGylation » et donnant des fragments tels que Fab-PEG, F(ab')2-PEG ou Fv-PEG. Par voie recombinante, il est également possible de générer des fragments seuls ou fusionnés de l'anticorps selon la présente invention, présentant des propriétés de pénétrabilité des tumeurs solides et de pharmacocinétique plus efficaces et mieux contrôlées. Les fragments d'anticorps utiles dans le cadre de la présente invention peuvent être naturels ou recombinants.
Par « dérivé d'anticorps », on entend, dans le cadre de la présente invention, des fragments d'anticorps obtenus par génie génétique comme des molécules Fv à chaîne unique (scFv) et des anticorps simple domaine (dAb). Le terme inclut aussi des molécules du type anticorps qui peuvent être produites en utilisant des techniques d'exposition sur phage (pour « phage display ») ou d'autres techniques de sélection aléatoires pour des molécules qui se lient au sous-type B des récepteurs aux endothélines ou à des régions spécifiques de ce sous-type.
Ainsi, les « fragments d'anticorps » et « dérivés d'anticorps » couvrent toutes les molécules qui contiennent une structure, avantageusement peptidique, qui fait partie du site de reconnaissance (c'est-à-dire la partie de l'anticorps qui se lie à ou se combine à l'épitope ou à l'antigène) d'un anticorps selon la présente invention. De plus, les fragments et dérivés d'anticorps selon la présente invention sont capables de reconnaître les conformères particuliers du sous-type B du récepteur aux endothélines exprimés à la surface de cellules cancéreuses et notamment des cellules de glioblastomes.
La présente invention concerne un anticorps dirigé contre le sous-type B des récepteurs aux endothélines comprenant : - une région variable de chaîne lourde comprenant un CDR1 (ci-après désigné CDRIh), un CDR2 (ci-après désigné CDR2h) et un CDR3 (ci-après désigné CDR3h) tels que la juxtaposition ordonnée formée par les séquences en acides aminés du CDRIh, du CDR2h et du CDR3h présente au moins 80% d'identité avec la séquence en acides aminés suivante : GYTFISYWIDPDSGGTAREGDYAWFAY (SEQ ID NO: 1) et - une région variable de chaîne légère comprenant un CDR1 (ci-après désigné CDRIl), un CDR2 (ci-après désigné CDR2l) et un CDR3 (ci-après désigné CDR3l) tels que la juxtaposition ordonnée formée par les séquences en acides aminés du CDRIl, du CDR2l et du CDR3l présente au moins 80% d'identité avec la séquence en acides aminés suivante : QSIVHSNGNTYKVSFQGSHVPWT (SEQ ID NO: 2).
Dans le cadre de la présente invention, les séquences en acides aminés sont données conformément au code international à 1 lettre.
Par « juxtaposition ordonnée formée par les séquences en acides aminés du CDRIh, du CDR2h et du CDR3h (ou par les séquences en acides aminés du CDRIl, du CDR2l et du CDR3l) », on entend la séquence en acides aminés (aa) artificielle répondant à la formule suivante : séquence en aa du CDRIh + séquence en aa du CDR2h + séquence en aa du CDR3h (ou séquence en aa du CDRIl + séquence en aa du CDR2l + séquence en aa du CDR3l).
Typiquement, la juxtaposition ordonnée formée par les séquences en acides aminés du CDRIh, du CDR2h et du CDR3h présente au moins 81% d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID NO: 1. De même, la juxtaposition ordonnée formée par les séquences en acides aminés du CDRIl, du CDR2l et du CDR3l présente au moins 85% d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID NO: 2.
Avantageusement, l'anticorps selon la présente invention comprend une région variable de chaîne lourde dont le CDRIh répond à la séquence consensus suivante : GYTFXiSYW (SEQ ID NO: 3) dans laquelle Xi représente n'importe quel acide aminé. Dans un mode de réalisation particulier, Xi est soit I, soit T et la séquence en acides aminés du CDRIh de la région variable de chaîne lourde de l'anticorps selon la présente invention est soit GYTFISYW (SEQ ID NO: 5), soit GYTFTSYW (SEQ ID NO: 7).
Avantageusement encore, l'anticorps selon la présente invention comprend une région variable de chaîne lourde dont le CDR2h répond à la séquence consensus suivante : IDPX2SGGT (SEQID NO: 8) dans laquelle X2 représente n'importe quel acide aminé. Dans un mode de réalisation particulier, X2 est soit D, soit N et la séquence en acides aminés du CDR2h de la région variable de chaîne lourde de l'anticorps selon la présente invention est soit IDPDSGGT (SEQ ID NO: 10), soit IDPNSGGT (SEQ ID NO: 12).
Avantageusement encore, l'anticorps selon la présente invention comprend une région variable de chaîne lourde dont le CDR3h répond à la séquence consensus suivante : X3REGX4X5AWFX6Y (SEQ ID NO: 13) dans laquelle X3, X4, Xs et Χε, identiques ou différents, représentent n'importe quel acide aminé. Dans un mode de réalisation particulier, X3, X4, Xs et Χε, identiques ou différents, sont choisis dans le groupe constitué par A, D, Y, E, F, V et W. Dans un mode de réalisation plus particulier, X3 est soit A, soit V ; X4 est choisi dans le groupe constitué par D, W et E ; X5 est choisi dans le groupe constitué par Y, D et F et Χε est soit A, soit V. Dans un mode de réalisation plus particulier encore, la séquence en acides aminés du CDR3h de la région variable de chaîne lourde de l'anticorps selon la présente invention est choisie dans le groupe constitué par AREGDYAWFAY (SEQ ID NO: 15), VREGWDAWFVY (SEQ ID NO: 17) et AREGEFAWFAY (SEQ ID NO: 19).
Avantageusement, l'anticorps selon la présente invention comprend une région variable de chaîne légère dont le CDRIl répond à la séquence consensus suivante : QX7IVHSNGX8TY (SEQ ID NO: 20) dans laquelle X7 et Xs, identiques ou différents, représentent n'importe quel acide aminé. Dans un mode de réalisation particulier, X7 et Xs, identiques ou différents, sont choisis dans le groupe constitué par N, Y et S. Dans un mode de réalisation plus particulier, X7 est soit N, soit S et Xs est soit N, soit Y. Dans un mode de réalisation plus particulier encore, la séquence en acides aminés du CDRIl de la région variable de chaîne légère de l'anticorps selon la présente invention est soit QSIVHSNGNTY (SEQ ID NO: 22), soit QNIVHSNGYTY (SEQ ID NO: 24).
Avantageusement encore, l'anticorps selon la présente invention comprend une région variable de chaîne légère dont le CDR2l répond à la séquence consensus suivante : KVXg dans laquelle Xg représente n'importe quel acide aminé. Dans un mode de réalisation particulier, Xg est soit S, soit F et la séquence en acides aminés du CDR2i.de la région variable de chaîne légère de l'anticorps selon la présente invention est soit KVS, soit KVF.
Avantageusement encore, l'anticorps selon la présente invention comprend une région variable de chaîne légère dont le CDR3l répond à la séquence consensus suivante : FQGSHVPX10T (SEQID NO: 25) dans laquelle Xio représente n'importe quel acide aminé. Dans un mode de réalisation particulier, Xio est soit W, soit L et la séquence en acides aminés du CDR3l de la région variable de chaîne légère de l'anticorps selon la présente invention est soit FQGSHVPWT (SEQ ID NO: 27), soit FQGSHVPLT (SEQ ID NO: 29).
Avantageusement, l'anticorps selon la présente invention comprend : ii) une région variable de chaîne lourde comprenant : - un CDRIh dont la séquence en acides aminés est GYTFISYW (SEQ ID NO: 5); - un CDR2h dont la séquence en acides aminés est IDPDSGGT (SEQ ID NO: 10) ; et
- un CDR3h dont la séquence en acides aminés est AREGDYAWFAY (SEQ ID NO: 15) ; ou iii) une région variable de chaîne lourde comprenant : - un CDRIh dont la séquence en acides aminés est GYTFTSYW (SEQ ID NO: 7); - un CDR2h dont la séquence en acides aminés est IDPDSGGT (SEQ ID NO: 10) ; et
- un CDR3h dont la séquence en acides aminés est VREGWDAWFVY (SEQ ID NO: 17) ; ou
Mil) une région variable de chaîne lourde comprenant : - un CDRIh dont la séquence en acides aminés est GYTFTSYW (SEQID NO: 7); - un CDR2h dont la séquence en acides aminés IDPNSGGT (SEQ ID NO: 12) ; et - un CDR3h dont la séquence en acides aminés est AREGEFAWFAY (SEQ ID NO: 19).
Plus particulièrement, l'anticorps selon l'invention comprend une région variable de chaîne lourde dont la séquence en acides aminés présente au moins 80% d'identité avec la séquence suivante : QVQLQQPGAALVKPGASVKLSCKASGYTFISYWMLWVKQRPGRGLEWIGRIDP DSGGTKYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREGDYAWFAYWGQGTLVPVSA (SEQ ID NO: 31).
Ainsi, l'anticorps selon l'invention comprend une région variable de chaîne lourde dont la séquence en acides aminés présente au moins 80% d'identité et peut présenter au moins 81%, au moins 82%, au moins 83%, au moins 84%, au moins 85%, au moins 86%, au moins 87%, au moins 88%, au moins 89%, voire au moins 90% d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID NO: 31.
Plus particulièrement encore, l'anticorps selon l'invention comprend une région variable de chaîne lourde dont la séquence en acides aminés correspond à i.e. consiste en la séquence en acides aminés SEQ ID NO: 31 (cas de Rendomab-B49).
En variante (cas de Rendomab-B41), l'anticorps selon l'invention comprend une région variable de chaîne lourde dont la séquence en acides aminés correspond à i.e. consiste en la séquence en acides aminés suivante : QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGRGLEWIGRID PDSGGTKYNEKFKSKATLTVDKPSNTANMQLSSLTSEDSAVYYCVREGWDAWFVYWGQGTLLTVS A (SEQ ID NO: 33).
Dans une autre variante (cas de Rendomab-B36), l'anticorps selon l'invention comprend une région variable de chaîne lourde dont la séquence en acides aminés correspond à i.e. consiste en la séquence en acides aminés suivante : QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWIHWVNQRPGRGLEWIGRIDP NSGGTKYNEKFKSKATLTVDKTSSTAYMQFSSLTSEDSAVYYCAREGEFAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQID NO: 35).
Avantageusement, l'anticorps selon la présente invention comprend : 12) une région variable de chaîne légère comprenant : - un CDRIl dont la séquence en acides aminés est QSIVHSNGNTY (SEQID NO: 22) ; - un CDR2l dont la séquence en acides aminés est KVS ; - un CDR3l dont la séquence en acides aminés est FQGSHVPWT (SEQ ID NO: 27) ; ou Ü2) une région variable de chaîne légère comprenant : - un CDRIl dont la séquence en acides aminés est QSIVHSNGNTY (SEQ ID NO: 22); - un CDR2l dont la séquence en acides aminés est KVF ; - un CDR3l dont la séquence en acides aminés est FQGSHVPLT (SEQ ID NO: 29) ; ou 1112) une région variable de chaîne légère comprenant : - un CDRIl dont la séquence en acides aminés est QNIVHSNGYTY (SEQ ID NO: 24) ; - un CDR2l dont la séquence en acides aminés est KVS ; - un CDR3l dont la séquence en acides aminés est FQGSHVPLT (SEQ ID NO: 29).
Plus particulièrement, l'anticorps selon l'invention comprend une région variable de chaîne légère dont la séquence en acides aminés présente au moins 80% d'identité avec la séquence suivante : DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYK VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 37).
Ainsi, l'anticorps selon l'invention comprend une région variable de chaîne légère dont la séquence en acides aminés présente au moins 80% d'identité et peut présenter au moins 81%, au moins 82%, au moins 83%, au moins 84%, au moins 85%, au moins 86%, au moins 87%, au moins 88%, au moins 89%, au moins 90%, au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 94% voire au moins 95% d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID NO: 37.
Plus particulièrement encore, l'anticorps selon l'invention comprend une région variable de chaîne légère dont la séquence en acides aminés correspond à i.e. consiste en la séquence en acides aminés SEQ ID NO: 37 (cas de Rendomab-B49).
En variante (cas de Rendomab-B41), l'anticorps selon l'invention comprend une région variable de chaîne légère dont la séquence en acides aminés correspond à i.e. consiste en la séquence en acides aminés suivante : DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYK VFNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELKR (SEQ ID NO: 39).
Dans une autre variante (cas de Rendomab-B36), l'anticorps selon l'invention comprend une région variable de chaîne légère dont la séquence en acides aminés correspond à i.e. consiste en la séquence en acides aminés suivante : DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHSNGYTYLEWYLQKPGQSPKLLIYK VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGSGTKLEIKR (SEQ ID NO: 41).
Avantageusement, l'anticorps selon l'invention comprend une région variable de chaîne légère et une région variable de chaîne lourde telles que précédemment définies.
La chaîne légère de l'anticorps selon l'invention est typiquement une chaîne légère kappa.
La chaîne lourde de l'anticorps selon l'invention est notamment une chaîne lourde gamma 1 ou une chaîne lourde gamma 3.
En particulier, l'anticorps selon la présente invention est une immunoglobuline de type G.
Plus particulièrement, l'anticorps selon la présente invention est une immunoglobuline de type IgGl/kappa ou du type lgG3/kappa. L'anticorps dirigé contre le sous-type B des récepteurs aux endothélines, objet de la présente invention lie sélectivement des segments extracellulaires du ETB-R. Par « anticorps qui lie sélectivement » au moins un domaine ou une région spécifié(e) du ETB-R notamment du ETB-R humain, on entend, dans le cadre de la présente invention, un anticorps qui lie le (ou les) domaine(s) spécifique(s) avec une plus grande affinité que toute autre région du ETB-R. Avantageusement, l'anticorps lie le (ou les) domaine(s) spécifié(s) du ETB-R avec une affinité au moins 2, ou au moins 5, ou au moins 10, ou au moins 50 fois supérieure à celle qu'il présente pour toute autre région du ETB-R. Cette liaison peut être déterminée par des procédés bien connus dans le domaine tels que cytométrie de flux, radio-immuno-dosage (RIA), microscopie confocale, enzymo-immuno-dosage marquage (EIA) par révélation directe ou indirecte de l'anticorps à tester (ELISA). L'anticorps objet de la présente invention peut être obtenu à partir d'un animal immunisé contre le sous-type B des récepteurs aux endothélines ou contre un fragment de ce récepteur comprenant le(s) épitope(s) reconnu(s) par l'anticorps selon la présente invention. L'animal immunisé peut être un quelconque animal habituellement utilisé pour la production d'anticorps tel qu'une souris, un rat, un lapin, une chèvre, un chien, un cheval ou un camélidé tel que chameau ou lama. L'anticorps ainsi obtenu peut être purifié sur une colonne d'affinité sur laquelle le sous-type B des récepteurs aux endothélines ou une des séquences reconnues spécifiquement par l'anticorps selon l'invention a été préalablement immobilisé(e). Cette purification peut également impliquer une chromatographie d'affinité sur protéine A.
Dans le cadre de la présente invention, l'anticorps peut être un anticorps polyclonal polyspécifique ou monospécifique, ou un anticorps monoclonal.
Avantageusement, l'anticorps de la présente invention est monoclonal. Un « anticorps monoclonal » se réfère, par définition habituelle en immunologie, à un anticorps obtenu à partir d'une population d'anticorps substantiellement homogènes i.e. une population d'anticorps identiques, une quantité relativement faible de ces derniers pouvant éventuellement présenter une mutation. Un anticorps monoclonal est obtenu à partir de la prolifération d'un seul clone de cellules tel qu'un hybridome.
Plus particulièrement, l'anticorps selon la présente invention est l'anticorps murin monoclonal obtenu à partir d'un hybridome choisi parmi l'hybridome déposé à la CNCM le 19 mai 2016 sous le numéro CNCM 1-5084 (Rendomab-B49), l'hybridome déposé à la CNCM le 7 juin 2016 sous le numéro CNCM 1-5104 (Rendomab-B41) et l'hybridome déposé à la CNCM le 7 juin 2016 sous le numéro CNCM 1-5103 (Rendomab-B36). La présente invention concerne également de tels hybridomes.
En variante, l'anticorps selon la présente invention peut être un anticorps chimérique i.e. un anticorps qui contient des régions variables ou des régions hypervariables de chaîne(s) lourde(s) et légère(s) dérivées d'un anticorps d'une espèce donnée en combinaison avec les régions constantes de chaîne(s) lourde(s) et légère(s) dérivées d'un anticorps d'une autre espèce hétérologue à la précédente.
Une première variante de la présente invention correspond à un anticorps chimérisé et notamment un anticorps monoclonal chimérisé, c'est-à-dire un anticorps dont les domaines variables issus de l'anticorps murin précédemment décrits sont associés à des domaines constants d'origine humaine. Il convient de rappeler que plusieurs anticorps thérapeutiques en usage chez l'homme sont des anticorps chimérisés.
Une seconde variante particulièrement intéressante peut être un anticorps humanisé et notamment un anticorps monoclonal humanisé. En effet, il est préférable d'utiliser un anticorps humanisé, si ce dernier doit être administré de manière répétée à un sujet humain.
Dans le cas d'un anticorps monoclonal humanisé selon la présente invention, ce dernier pourra être préparé par insertion des CDR d'un anticorps murin et notamment de l'anticorps murin issu d'un hybridome choisi parmi l'hybridome déposé à la CNCM le 19 mai 2016 sous le numéro CNCM 1-5084 (Rendomab-B49), l'hybridome déposé à la CNCM le 7 juin 2016 sous le numéro CNCM 1-5104 (Rendomab-B41) et l'hybridome déposé à la CNCM le 7 juin 2016 sous le numéro CNCM 1-5103 (Rendomab-B36) au sein d'un anticorps humain, quel que soit son isotype (IgG, IgA, IgM). Les anticorps humanisés peuvent être fabriqués en utilisant les techniques et les approches décrites dans l'article de Verhoeyen et al, 1988, intitulé « Reshaping human antibodies: Grafting an antilysozyme activity », dans Science, vol. 239, pages 1534-1536 et dans le brevet US 4,816,567 au nom de Genentech et publié le 28 mars 1989.
Les anticorps peuvent aussi être des anticorps humains dans le sens où ils ont la séquence d'acides aminés d'anticorps humains anti-ETB-R via des procédés de préparation connus dans le domaine qui ne nécessitent pas la vaccination d'humains. Par exemple, de tels anticorps peuvent être obtenus par immunisation génique/rappels d'immunisation cellulaires de souris transgéniques qui sont disponibles et qui contiennent par essence des gènes d'immunoglobulines humaines (voir l'article de Vaughan et al, 1998, intitulé « Human antibodies by design » dans Nature Biotechnol. vol. 16, pages 535-539). En variante, de tels anticorps peuvent être obtenus par le clonage des ADNc codant à partir de lymphocytes B humains dirigés contre ETB-R.
La présente invention concerne également un polynucléotide isolé choisi parmi les différents polynucléotides ci-après : a) un polynucléotide codant un anticorps tel que précédemment défini ; β) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide tel que défini au point (a) ; γ) un polynucléotide d'au moins 18 nucléotides, capable de s'hybrider dans des conditions de forte stringence aux polynucléotides tels que définis aux points (a) et (β).
Par « polynucléotide », on entend, dans le cadre de la présente invention un acide nucléique, une séquence nucléique, une séquence d'acide nucléique, un oligonucléotide, une séquence polynucléotidique, une séquence nucléotidique, un ADN simple-brin, un ADN double-brin ou un ARN. Un polynucléotide selon la présente invention peut comprendre des nucléotides naturels et des nucléotides non naturels.
Le polynucléotide selon l'invention ne correspond pas à une séquence nucléotidique dans son état naturel i.e. dans son environnement chromosomique naturel. Au contraire, le polynucléotide selon l'invention a été isolé et éventuellement purifié, son environnement a, par conséquent, été modifié. Le polynucléotide selon l'invention peut également être obtenu par recombinaison génétique ou par synthèse chimique.
Les conditions de forte stringence correspondent à des conditions de température et de force ionique qui permettent de maintenir une hybridation entre deux séquences nucléotidiques complémentaires. L'homme du métier saura déterminer les conditions de forte stringence les mieux adaptées notamment en fonction de la taille des séquences nucléotidiques et ce, en se référant à l'enseignement de Sambrook et al, 1989 (Molecular cloning, Noland C. ed., New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Le polynucléotide selon la présente invention comprend au moins une séquence nucléotidique codant le CDRIh choisie entre les séquences nucléotidiques suivantes : GGC TAC ACC TTC ATC AGC TAC TGG (SEQ ID NO: 4) et GGC TAC ACC TTC ACC AGC TAC TGG (SEQ ID NO: 6).
Avantageusement, le polynucléotide selon la présente invention comprend au moins une séquence nucléotidique codant le CDR2h choisie entre les séquences nucléotidiques suivantes :
ATT GAT CCT GAT AGNi GGT GGT ACT avec Ni représentant soit C, soit T (SEQ ID NO: 9) et ATT GAT CCT AAT AGT GGT GGC ACT (SEQ ID NO: 11).
Avantageusement encore, le polynucléotide selon la présente invention comprend au moins une séquence nucléotidique codant le CDR3h choisie entre les séquences nucléotidiques suivantes : G CA AGA G AA GGG GAT TAC GCC TGG TTT G CT TAC (SEQ ID NO: 14) ; GTA AGA G AA GGG TGG GAC GCC TGG TTT GTT TAC (SEQ ID NO: 16) et G CA AGA GAG GGG G AA TTC GCC TGG TTT G CT TAC (SEQ ID NO: 18).
Typiquement, le polynucléotide selon la présente invention comprend au moins une séquence nucléotidique codant le CDRIl choisie entre les séquences nucléotidiques suivantes : CAG AGC ATT GTA CAT AGT AAT GGA AAC ACC TAT (SEQ ID NO: 21) et CAG AAC ATT GTC CAT AGT AAT GGA TAC ACC TAT (SEQ ID NO: 23).
En particulier, le polynucléotide selon la présente invention comprend au moins une séquence nucléotidique codant le CDR2l choisie entre les séquences nucléotidiques suivantes :
AAA GTTTCC AAA GTT TTC
Plus particulièrement, le polynucléotide selon la présente invention comprend au moins une séquence nucléotidique codant le CDR3l choisie entre les séquences nucléotidiques suivantes : TTT CAA GGT TC A CAT GTT CCG TGG ACG (SEQ ID NO: 26) et TTT CAA GGT TCA CAT GTT CCN2 CTC ACG avec N2 représentant soit G, soit T (SEQ ID NO: 28).
Avantageusement, le polynucléotide selon la présente invention comprend au moins trois séquences nucléotidiques correspondant à l'un des groupes suivants : (ii') les séquences nucléotidiques SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9 avec Ni représentant C et SEQ ID NO: 14 ; (iii') les séquences nucléotidiques SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 avec Ni représentant T et SEQ ID NO: 16 ; et (iiii') les séquences nucléotidiques SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11 avec Ni représentant T et SEQ ID NO: 18.
Il est clair que, pour chacun des groupes, les trois séquences ci-dessus listées doivent être organisées les unes par rapport aux autres de façon à ce que le polypeptide obtenu suite à la traduction du polynucléotide selon l'invention comprenne 3 séquences peptidiques correspondant au CDRIh, au CDR2h et au CDR3h.
Plus particulièrement, le polynucléotide selon la présente invention comprend au moins une séquence nucléotidique présentant au moins 80% d'identité avec la séquence nucléotidique suivante : CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGCGCTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAG TGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCATCAGCTACTGGATGCTCTGGGTGAAGCAG AGGCCTGGACGAGGCCTTGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGATAGCGGTGGTACTAAGTAC AATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCA GCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAAGAGAAGGGGATTACGCC TGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCCCTGTCTCTGCA (SEQ ID NO: 30).
Ainsi, le polynucléotide selon la présente invention comprend au moins une séquence nucléotidique présentant au moins 80% d'identité et peut présenter au moins 81%, au moins 82%, au moins 83%, au moins 84%, au moins 85%, au moins 86%, au moins 87%, au moins 88%, au moins 89%, voire au moins 90% d'identité avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 30.
Plus particulièrement encore, le polynucléotide selon la présente invention comprend une séquence nucléotidique correspondant à la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 30 (cas de Rendomab-B49). Ainsi, la séquence nucléotidique codant la région variable de chaîne lourde de Rendomab-B49 comprend ou consiste en la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 30.
En variante (cas de Rendomab-B41), le polynucléotide selon la présente invention comprend la séquence nucléotidique suivante : CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTTCA GTGAAGCTGTCCTGCAAGG CTT CTG G CT AC ACCTT C ACC AG CT ACTG G ATG C ACTG G GTG A AG C A GAGGCCTGGACGAGGCCTTGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGATAGTGGTGGTACTAAATAC A ATG AG A AGTTC A AG AG CA AG G CCAC ACT G ACT GT AG AC AAACCCT CC AACAC AG CC AACAT GC AGCTCAGCAGCCTGACATCTGAAGACTCTGCGGTCTATTATTGTGTAAGAGAAGGGTGGGACGC CTGGTTTGTTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGCTCACTGTCTCTGCA (SEQID NO: 32).
Ainsi, la séquence nucléotidique codant la région variable de chaîne lourde de Rendomab-B41 comprend ou consiste en la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 32.
Dans une autre variante (cas de Rendomab-B36), le polynucléotide selon la présente invention comprend la séquence nucléotidique suivante : CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAG TGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATACACTGGGTAAATCAG AGGCCTGGACGAGGCCTTGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTAATAGTGGTGGCACTAAGTACA ATGAGAAGTTCAAGAGTAAGGCCACACTGACTGTAGACAAAACCTCCAGCACAGCCTACATGCA GTTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAAGAGAGGGGGAATTCGCC TGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO: 34).
Ainsi, la séquence nucléotidique codant la région variable de chaîne lourde de Rendomab-B36 comprend ou consiste en la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 34.
Avantageusement, le polynucléotide selon la présente invention comprend au moins trois séquences nucléotidiques correspondant à l'un des groupes suivants :
(12') les séquences nucléotidiques SEQ ID NO: 21, AAAGTTTCC et SEQ ID NO: 26; (Ü2') les séquences nucléotidiques SEQ ID NO: 21, AAAGTTTTC et SEQ ID NO: 28 avec N2 représentant G ; et (1112') les séquences nucléotidiques SEQ ID NO: 23, AAAGTTTCC et SEQ ID NO: 28 avec N2 représentant T.
Il est clair que, pour chacun des groupes, les trois séquences ci-dessus listées doivent être organisées les unes par rapport aux autres de façon à ce que le polypeptide obtenu suite à la traduction du polynucléotide selon l'invention comprenne 3 séquences peptidiques correspondant au CDRIl, au CDR2l et au CDR3l.
Plus particulièrement, le polynucléotide selon la présente invention comprend au moins une séquence nucléotidique présentant au moins 80% d'identité avec la séquence nucléotidique suivante : G AT GTTTTG AT G ACCC AAACT CC ACT CT CCCT G CCT GT CAGTCTT GG AG AT CA AG CCTCC AT CT CTT G C AG ATCT AGTC AG AG C ATT GT AC AT AGT A AT G G A AAC ACCT ATTT AG AAT GGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTG G G GTCCCAGACAG GTTCAGTGG CAGTG G ATCAG G G ACAG ATTT CACACTCAAG AT CAGCAG AGT GGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTGGACGTTCGGTG GAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA (SEQID NO: 36).
Ainsi, le polynucléotide selon la présente invention comprend au moins une séquence nucléotidique présentant au moins 81%, au moins 82%, au moins 83%, au moins 84%, au moins 85%, au moins 86%, au moins 87%, au moins 88%, au moins 89%, au moins 90%, au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 94% voire au moins 95% d'identité avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 36.
Plus particulièrement encore, le polynucléotide selon la présente invention comprend une séquence nucléotidique correspondant à la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 36 (cas de Rendomab-B49). Ainsi, la séquence nucléotidique codant la région variable de chaîne légère de Rendomab-B49 comprend ou consiste en la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 36.
En variante (cas de Rendomab-B41), le polynucléotide selon la présente invention comprend la séquence nucléotidique suivante :
G AT GTTTTG AT G ACCCAAACT CCACT CT CCCTGCCT GT CAGTCTT GG AG AT CA AGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAAT GGTACTT G CAG AAACCAG GCCAGT CT CC AAAG CTCCTG ATCT ACAAAGTTTT C AACCG ΑΤΠΤ CT G GGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGT GGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGGTG CTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG (SEQ ID NO: 38).
Ainsi, la séquence nucléotidique codant la région variable de chaîne légère de Rendomab-B41 comprend ou consiste en la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 38.
Dans une autre variante (cas de Rendomab-B36), le polynucléotide selon la présente invention comprend la séquence nucléotidique suivante : G AT GTTTTG AT G ACCCAAACT CCACT CT CCCTGCCT GT CAGTCTT GG AG AT CA AGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAACATTGTCCATAGTAATGGATACACCTATTTAGAAT GGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTG GGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGT GGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCTCTCACGTTCGGCT CG G G G AC A AAGTT G G AAAT AAAACG G (SEQ ID NO: 40).
Ainsi, la séquence nucléotidique codant la région variable de chaîne légère de Rendomab-B36 comprend ou consiste en la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 40.
Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides aminés (ou entre deux séquences nucléotidiques), on entend, dans le cadre de la présente invention, un pourcentage de résidus d'acides aminés (ou de nucléotides) identiques entre les deux séquences comparées, ce pourcentage étant obtenu après mise en œuvre du meilleur alignement (alignement optimum) entre les deux séquences. L'homme du métier connaît différentes techniques permettant d'obtenir un tel pourcentage d'identité et impliquant des algorithmes d'homologie ou des programmes d'ordinateur tels que le programme BLAST.
Le pourcentage d'identité est statistique et les différences entre les deux séquences sont réparties aléatoirement le long de ces séquences. Les différences entre les deux séquences peuvent consister en différents types de modifications des séquences : des délétions, des substitutions ou des additions de résidus d'acides aminés (ou de nucléotides).
Dans un 1er mode de réalisation, les modifications mises en oeuvre dans les séquences résultent en des substitutions entre acides aminés équivalents i.e. des acides aminés présentant des homologies structurales ou ne modifiant pas substantiellement l'activité biologique des anticorps correspondants.
Dans un 2nd mode de réalisation, les modifications mises en oeuvre dans les séquences résultent en des substitutions par des acides aminés non équivalents i.e. des acides aminés ne présentant pas d'homologie structurale. Ces modifications sont susceptibles d'améliorer les propriétés biologiques de l'anticorps i.e. affinité et/ou spécificité améliorées, spectre de reconnaissance élargi, augmentation de la stabilité, réduction de l'immunogénicité etc...
Appliquées aux deux modes de réalisation précédemment exposés, ces modifications, insertions ou délétions peuvent cibler un CDR essentiel ou non aux propriétés de l'anticorps selon l'invention.
Appliquées aux deux modes de réalisation précédemment exposés, ces modifications, insertions ou délétions peuvent également cibler une région FR, sachant que de telles régions, au sein des domaines variables des anticorps, peuvent selon les anticorps également jouer un rôle dans l'expression des propriétés de l'anticorps selon l'invention.
La présente invention concerne également un vecteur de clonage et/ou d'expression contenant au moins un polynucléotide selon la présente invention. Un tel vecteur est notamment utile pour transformer un organisme hôte et exprimer dans ce dernier un anticorps selon la présente invention.
Le vecteur selon la présente invention comprend en outre un (ou plusieurs) élément(s) qui permet(tent) l'expression du polynucléotide selon la présente invention et/ou la sécrétion du produit résultant de la traduction du polynucléotide selon la présente invention. Parmi ces éléments, on peut citer un promoteur constitutif ou inducible, un signal d'initiation de la transcription ou un signal de terminaison de la transcription, une séquence d'initiation de la traduction ou un signal de fin de traduction.
Avantageusement, le vecteur selon la présente invention comprend, liés entre eux de façon opérationnelle, un promoteur, un polynucléotide de l'invention et un élément terminateur. On entend par « liés entre eux de façon opérationnelle » selon l'invention, des éléments liés entre eux de façon à ce que le fonctionnement d'un des éléments soit affecté par celui d'un autre. A titre d'exemple, un promoteur est lié de façon opérationnelle à une séquence codante lorsqu'il est capable d'affecter l'expression de cette dernière. Les éléments régulateurs de la transcription, de la traduction et de la maturation des peptides que le vecteur peut comprendre sont connus de l'homme du métier et ce dernier est capable de les choisir en fonction de l'organisme hôte dans lequel l'expression ou le clonage doivent être réalisés.
Le vecteur selon la présente invention est avantageusement choisi parmi un plasmide, un cosmide, un bactériophage et un virus tel qu'un baculovirus. En particulier, le vecteur de l'invention est un vecteur à réplication autonome comportant des éléments permettant son maintien et sa réplication dans l'organisme hôte comme une origine de réplication. En outre, le vecteur peut comporter des éléments permettant sa sélection dans l'organisme hôte comme, par exemple, un gène de résistance à un antibiotique ou un gène de sélection qui assure la complémentation avec le gène respectif délété au niveau du génome de l'organisme hôte. De tels vecteurs de clonage et/ou d'expression sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature. L'invention concerne également un organisme hôte transformé par ou comprenant un polynucléotide selon la présente invention ou un vecteur selon la présente invention.
Par « organisme hôte », on entend tout organisme, isolé, uni- ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, dans lequel un polynucléotide de l'invention est introduit pour la production d'un anticorps selon la présente invention. L'homme du métier connaît différentes méthodes pour introduire de façon efficace un polynucléotide dans un organisme hôte et ce, afin que, dans l'organisme hôte, l'anticorps codé par ledit polynucléotide soit produit. A titre d'exemple et de façon non exhaustive, cette méthode peut être une électroporation, une lipofection, une transformation biologique d'un végétal en utilisant Agrobacterium tumefasciens, un choc thermique ou un procédé chimique.
Avantageusement, l'organisme hôte est un microorganisme tel qu'une levure, une bactérie ou un champignon. La transformation de tels microorganismes permet de produire l'anticorps de l'invention à échelle semi-industrielle ou industrielle.
En variante, l'organisme hôte est une cellule animale telle qu'une cellule de mammifère, une cellule végétale, une cellule d'insectes, un animal à l'exception d'un humain, ou une plante.
De tels organismes hôtes peuvent être utilisés pour produire un anticorps selon la présente invention. En effet, un procédé pour produire un anticorps selon la présente invention comprend les étapes consistant à : a) mettre en culture un organisme hôte selon la présente invention et notamment un organisme hôte unicellulaire dans un milieu de culture et dans des conditions appropriées ; b) récupérer ledit anticorps à partir du milieu de culture dudit organisme hôte cultivé ou à partir dudit organisme hôte cultivé. L'anticorps selon la présente invention est également modifiable afin de a) générer un anticorps marqué par un isotope radioactif, par une pro-drogue, une enzyme ou une toxine, et b) modifier la spécificité et/ou l'affinité de liaison, et/ou la stabilité, et/ou l'immunogénicité dudit anticorps assurant le ciblage des cellules qui surexpriment le ETB-R, notamment des cellules cancéreuses telles que des mélanomes, des glioblastomes etc.... L'anticorps selon la présente invention est également modifiable afin de le coupler chimiquement ou génétiquement à une molécule peptidique ; une molécule protéique ; une molécule nucléique telle qu'un ADN, un ARN, un ARNi, un aptamère, un PNA ou un LNA; une molécule lipidique; une molécule glucidique ou une molécule chimique.
La présente invention concerne donc un composé comprenant un anticorps selon la présente invention conjugué à un élément choisi dans le groupe constitué par un groupement cytotoxique, un groupement facilement détectable ou un groupement effecteur.
Par « groupement cytotoxique », on entend un groupement directement ou indirectement toxique pour les cellules ciblées par l'anticorps selon la présente invention. Par « directement cytotoxique », on entend un groupement qui est en lui-même cytotoxique. Par « indirectement cytotoxique », on entend un groupement qui, bien que non cytotoxique en lui-même, peut induire une cytotoxicité, par exemple par son action sur une autre molécule ou par une action supplémentaire sur lui.
Dans une lère forme de mise en oeuvre, le groupement cytotoxique est un agent chimiothérapeutique cytotoxique. L'homme du métier connaît différents agents chimiothérapeutiques cytotoxiques utilisables dans le cadre de la présente invention. L'activité de ces agents peut être augmentée sous irradiation. A titre d'exemples illustratifs et non limitatifs, on peut citer les agents alkylants comme la méchloréthamine ou le chlorambucile ; le méthotrexate ; la 5-fluoro-uracile ; la Vinblastine ; la gemcitabine ; la fludarabine ; la nicotinamide ; la doxorubicine ; la mitomycine ; la L-asparaginase ; le cisplatine ; le taxol et ses analogues/dérivés.
Dans une 2ème forme de mise en oeuvre, le groupement cytotoxique est un groupement (poly)peptidique cytotoxique tel que la ricine, l'abrine, l'exotoxine de Pseudomonas, le TNFa et l'interleukine 2.
Dans une 3ème forme de mise en oeuvre, le groupement cytotoxique est un agent chimiothérapeutique indirectement cytotoxique. Un tel agent également appelé pro-drogue n'est pas ou peu cytotoxique en tant que tel mais est apte à donner, notamment suite à une réaction enzymatique ou à une irradiation, une substance cytotoxique (ou drogue) notamment telle que définie dans la lère forme de mise en oeuvre. A titre d'exemples illustratifs et non limitatifs, on peut citer la méthotrexate-alanine ; la mitomycine phosphate, la 5-fluorocytosine ; la photofrine et la capécitabine.
Dans une 4ème forme de mise en oeuvre, le groupement cytotoxique est un groupement (poly)peptidique indirectement cytotoxique. Par groupement poly(peptidique) indirectement cytotoxique, on entend un polypeptide qui présente une activité enzymatique et peut convertir une pro-drogue relativement non toxique notamment telle que définie dans la 3ème forme de mise en oeuvre en une substance cytotoxique notamment telle que définie dans la lère forme de mise en oeuvre. Parmi de tels groupements (poly)peptidiques indirectement cytotoxiques, on peut citer une peptidase telle qu'une carboxypeptidase, une aminopeptidase ou une endopeptidase ; une phosphatase ; une sulfatase ; une amidase ; une kinase ; une glycosidase ; une désaminase ; une réductase ; et une oxydase.
Dans une 5ème forme de mise en œuvre, le groupement cytotoxique est une molécule d'acide nucléique qui est directement ou indirectement cytotoxique telle qu'un oligonucléotide anti-sens ou un aptamère. L'homme du métier connaît différentes techniques permettant de conjuguer de tels groupements à un anticorps selon la présente invention une fois ce dernier obtenu ou produit.
Ces techniques permettent un couplage covalent entre un anticorps selon l'invention et un groupement cytotoxique en mettant à profit des groupes chimiques particuliers portés par l'anticorps selon l'invention et par le groupement cytotoxique. Parmi ces groupes chimiques particuliers, on peut citer un groupe thiol, un groupe ester, un groupe amino, un groupe acide et tout élément chimique susceptible d'être mis en œuvre dans la « click-chemistry ».
En variante et notamment lorsque le groupement cytotoxique est un groupement de nature peptidique, cette conjugaison peut consister à produire le composé selon l'invention sous forme d'un composé de fusion par les techniques de recombinaison génétique, dans lesquelles un polynucléotide comprend des régions respectives codant l'anticorps selon la présente invention et le groupement cytotoxique, adjacentes l'une à l'autre, juxtaposées ou séparées par une région codant un lieur peptidique qui ne détruit pas les propriétés souhaitées du composé hybride final.
Qu'elle que soit la technique utilisée pour conjuguer un anticorps selon la présente invention avec un groupement cytotoxique, la seule contrainte à respecter dans le cadre de cette conjugaison est que l'anticorps conjugué conserve sa spécificité de liaison pour ETB-R et son absence de caractère antagoniste, propriétés associées à celles du groupement cytotoxique.
Par « groupement facilement détectable », on entend, dans le cadre de la présente invention, un groupement qui peut être détecté par mise en œuvre d'une technique de détection appropriée avantageusement non invasive telle que la microscopie, la scintigraphie, la tomographie par émission de positon (TEP) et l'imagerie par résonance magnétique (IRM). Un composé selon l'invention comprenant un tel groupement facilement détectable est particulièrement adapté au domaine de l'imagerie et du diagnostic. Il permet notamment d'identifier et localiser des sites au niveau desquels le ETB-R est surexprimé du fait de la spécificité de liaison au ETB-R de l'anticorps présent dans ce composé.
Dans une lère forme de mise en œuvre, le groupement facilement détectable peut être une enzyme ou une molécule capable de générer un signal détectable et éventuellement quantifiable dans des conditions particulières comme lors de la mise en présence d'un substrat adapté. A titre d'exemples illustratifs et non limitatifs, on peut citer la biotine, la digoxygénine, la 5-bromodeoxyuridine, une phosphatase alcaline, une peroxydase, une acétylcholine estérase (AChE), une glucose amylase et une lysozyme.
Dans une 2ème forme de mise en œuvre, le groupement facilement détectable peut être un marqueur fluorescent, chimiofluorescent ou bioluminescent tels que la fluorescéine et ses dérivés, la rhodamine et ses dérivés, la GFP (pour « Green Fluorescent Protein ») et ses dérivés et l'umbelliférone ; le luminol ; la luciférase et la luciférine.
Dans une 3ème forme de mise en œuvre, le groupement facilement détectable peut être un marqueur ou isotope radioactif tel que l'iode-123, l'iode-125, l'iode-126, l'iode-133, l'indium-111, l'indium-113m, le brome-77, le gallium-67, le gallium-68, le ruthénium-95, le ruthénium-97, le technetium-99m, le fluor-19, le fluor-18, le carbone-13, l'azote-15, l'oxygène-17, le scandium-47, le tellurium-122m, le thulium-165 et l'yttrium-199. Il convient de remarquer que certains atomes radioactifs utilisés comme groupements facilement détectables peuvent aussi constituer des groupements cytotoxiques du fait de la quantité de radioactivité qu'ils peuvent délivrer.
Tout ce qui a été précédemment expliqué pour la conjugaison de l'anticorps selon l'invention avec les groupements cytotoxiques s'applique mutatis mutandis à la conjugaison de l'anticorps selon l'invention avec les groupements facilement détectables. La conjugaison de l'anticorps selon l'invention avec les groupements facilement détectables, peut également être réalisée en relation avec des nano-objets, et ce afin de densifier leur concentration, et donc d'améliorer le signal émis, le contraste ou la toxicité.
Dans le cas où ce groupement facilement détectable est un marqueur radioactif, ce dernier peut être introduit dans la séquence peptidique de l'anticorps selon l'invention. Cette introduction peut avoir lieu lors de la synthèse de l'anticorps en utilisant un ou plusieurs acides aminés marqués. En variante, cette introduction peut avoir lieu suite à cette synthèse en fixant le marqueur radioactif sur des résidus de la séquence peptidique de l'anticorps synthétisée. Par exemple, l'yttrium-90 peut être fixé via un résidu lysine. En variante encore, le marqueur radioactif peut être indirectement fixé à l'anticorps par des moyens connus. Par exemple, de l'EDTA ou un autre agent chélateur peut être fixé à l'anticorps selon l'invention et utilisé pour fixer l'indium-111.
La présente invention concerne l'utilisation d'un composé comprenant un anticorps et un groupement facilement détectable comme un outil de diagnostic, de pronostic et de suivi in vivo très efficace en matière d'imagerie médicale. Le format d'anticorps est choisi de manière à générer le meilleur rapport signal sur bruit et la meilleure pharmaco-cinétique.
En d'autres termes, la présente invention concerne un procédé pour détecter et quantifier in vivo ou in vitro l'expression ou la surexpression du sous-type B des récepteurs aux endothélines, consistant à : ai) mettre en contact un échantillon biologique avec un composé selon la présente invention ; bi) détecter l'éventuel complexe entre ledit composé et ledit sous-type B des récepteurs aux endothélines.
Un tel procédé peut être mis en oeuvre pour détecter, diagnostiquer, prognostiquer ou suivre un état dans lequel le sous-type B des récepteurs aux endothélines est surexprimé et notamment pour détecter, diagnostiquer, prognostiquer ou suivre un état cancéreux (présence, taille et évolution des tumeurs cancéreuses). Dans le cas d'un procédé pour diagnostiquer un cancer tel qu'un glioblastome, ce dernier comprend les étapes consistant à : ai') mettre en contact un échantillon biologique du sujet avec un composé selon la présente invention ; bi') détecter le signal émis par le groupement facilement détectable et ci') déterminer la présence ou l'absence d'un cancer chez ledit sujet sur la base du signal détecté à l'étape (bi').
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de diagnostic selon l'invention est un procédé réalisé in vitro pour lequel l'échantillon biologique tel qu'une biopsie a été prélevé chez le sujet avant la mise en œuvre de l'étape (ai'). En variante, ce procédé peut correspondre à un procédé d'imagerie in vivo dans lequel une quantité efficace du composé selon l'invention a été préalablement administrée au sujet. Par « quantité efficace », on entend une quantité de composé selon la présente invention suffisante pour l'imagerie de cancers. Cette quantité varie en fonction du mode d'administration, de la formulation administrée, de l'excipient et du cancer à diagnostiquer. Toutefois, déterminer cette quantité efficace est un travail de routine pour l'homme du métier.
Par « groupement effecteur », on entend, dans le cadre de la présente invention, un groupement capable de reconnaître spécifiquement un marqueur cancéreux, ou qui permette le recrutement (i) d'une cellule effectrice du système immunitaire i.e. des cellules NK, des cellules T cytotoxiques, des macrophages ou (ii) du système du complément. Par « groupement capable de reconnaître spécifiquement un marqueur cancéreux », on entend, dans le cadre de la présente invention, un ligand d'un marqueur cancéreux ; un anticorps identique ou différent à un anticorps selon la présente invention ; une protéine ; un peptide ; ou une molécule nucléique telle qu'un ADN, un ARN, un ARNi, un aptamère, un PNA ou un LNA. Par « marqueur cancéreux », on envisage aussi bien un ETB-R qu'un autre marqueur membranaire.
Dans une lère forme de mise en œuvre, le groupement effecteur reconnaît un marqueur cancéreux, identique à ou différent de ETB-R, exprimé à la surface des cellules cancéreuses, assurant ainsi une meilleure spécificité de reconnaissance et donc un ciblage accru des cellules cancéreuses.
Dans une 2nde forme de mise en oeuvre, le groupement effecteur présente une spécificité de reconnaissance pour un marqueur spécifiquement présent à la surface de cellules effectrices du système immunitaire i.e. cellules NK, macrophages ou cellules T cytotoxiques. Un tel recrutement assure la lyse ciblée des cellules cancéreuses reconnues par l'anticorps de la présente invention.
Dans une 3lème forme de mise en œuvre, le groupement effecteur présente une spécificité de reconnaissance pour le système du complément et, en particulier, pour la protéine Cl ou sa forme tronquée Clq, qui initie la cascade des événements moléculaires qui aboutissent à la mort de la cellule ciblée. Un tel recrutement assure la lyse ciblée des cellules cancéreuses reconnues par l'anticorps de la présente invention.
Dans une 4ième forme de mise en œuvre, le groupement effecteur présente une spécificité de reconnaissance pour le système du complément et, en particulier, pour la protéine C3 ou sa forme tronquée C3b, assurant ainsi le recrutement de cellules effectrices du système immunitaire, cellules qui induisent la mort de la cellule ciblée. Un tel recrutement assure la lyse ciblée des cellules cancéreuses reconnues par l'anticorps de la présente invention.
La présente invention concerne un anticorps selon la présente invention, un polynucléotide selon la présente invention ou un composé selon la présente invention pour utilisation comme médicament.
Ainsi, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant, en tant que principe actif, un anticorps selon la présente invention, ou un polynucléotide selon la présente invention ou un composé selon la présente invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Par « véhicule pharmaceutiquement acceptable », on entend selon la présente invention, toute substance qui est ajoutée à un anticorps, un polynucléotide ou un composé selon la présente invention pour favoriser son transport, éviter sa dégradation substantielle dans ladite composition et/ou augmenter sa demi-vie. Avantageusement, un tel véhicule pharmaceutiquement acceptable est stérile et apyrogène. Il est choisi en fonction du type d'application de la composition pharmaceutique de l'invention et notamment en fonction de son mode d'administration.
Ainsi, la composition pharmaceutique selon l'invention est constituée par au moins un anticorps, ou un polynucléotide ou un composé selon la présente invention sous forme libre ou sous forme d'un sel d'addition avec un acide pharmaceutiquement acceptable, à l'état pur ou sous forme d'une composition dans laquelle il est associé à tout autre produit pharmaceutiquement compatible. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être employées par voie systémique ; par voie parentérale, par exemple intraveineuse, intraartérielle, intrapéritonéale, intrathécale, intraventriculaire, intrasternale, intracrânienne, intramusculaire ou sous-cutanée ; par voie topique ; par voie orale ; par voie rectale ; par voie intranasale ou par inhalation. A titre de compositions solides pour administration orale, on peut utiliser des comprimés, des pilules, des poudres, etc... où l'anticorps, le polynucléotide ou le composé selon l'invention sont mélangés à un ou plusieurs diluants inertes classiquement utilisés, et éventuellement à d'autres substances telles que, par exemple, un lubrifiant, un colorant, un enrobage etc.... A titre de compositions liquides pour administration orale ou oculaire, on peut utiliser des suspensions, des solutions, des émulsions, des sirops pharmaceutiquement acceptables contenant des diluants inertes classiquement utilisés, et éventuellement d'autres substances comme des produits mouillants, édulcorants, épaississants, etc....
Les compositions stériles pour administration parentérale peuvent être des solutions aqueuses ou non, des suspensions ou des émulsions. Comme solvant ou véhicule, on peut employer l'eau, le propylène-glycol, des huiles végétales ou d'autres solvants organiques convenables. Ces compositions peuvent également contenir des adjuvants, comme des agents mouillants, isotonisants, émulsifiants, etc....
Les compositions pour l'administration topique peuvent être par exemple des crèmes, lotions, collutoires, gouttes nasales ou oculaires ou aérosol.
Le niveau de dose quotidien de l'anticorps, du polynucléotide ou du composé selon la présente invention est habituellement de 1 à 1000 mg par adulte (c'est-à-dire d'environ 0,015 à 15 mg/kg), administrés en doses uniques ou fractionnées. Ces doses ne sont données qu'à titre illustratif. Le médecin, dans tous les cas, saura déterminer la dose réelle la plus adaptée à un patient individuel donné et cette dernière varie selon l'âge, le poids et la réponse du patient.
La présente invention concerne un anticorps selon la présente invention, un polynucléotide selon la présente invention, un composé selon la présente invention ou une composition pharmaceutique selon la présente invention pour utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'un trouble ou d'une pathologie impliquant un dysfonctionnement, direct ou en association avec une autre voie physiologique, de l'axe comprenant une endothéline et au moins un de ses récepteurs tel que, notamment, le sous-type B des récepteurs aux endothélines.
Avantageusement, un tel trouble ou une telle pathologie est un cancer. A titre de cancers, on peut citer un mélanome, un cancer du côlon, un Sarcome de Kaposi, un glioblastome, un cancer des ovaires et un cancer de la vessie. Typiquement, ce trouble est un mélanome ou un glioblastome.
En d'autres termes encore, la présente invention concerne un procédé pour traiter et/ou prévenir un trouble ou une pathologie impliquant un dysfonctionnement, direct ou en association avec une autre voie physiologique, de l'axe comprenant une endothéline et au moins un de ses récepteurs tel que, notamment, le sous-type B des récepteurs aux endothélines chez un patient souffrant ou susceptible de souffrir d'un tel trouble ou d'une telle pathologie. Ce procédé consiste à administrer audit patient une quantité efficace d'un anticorps selon la présente invention, d'un polynucléotide selon la présente invention, d'un composé selon la présente invention ou d'une composition pharmaceutique selon la présente invention.
Enfin, la présente invention concerne l'utilisation d'un anticorps selon la présente invention ou d'un composé selon la présente invention comme un outil de recherche particulièrement adapté à l'étude des voies de signalisation associées à l'axe endothéline/récepteurs aux endothélines, ainsi que pour progresser dans la compréhension des caractéristiques structurales et fonctionnelles de cette famille de récepteurs. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous donnés à titre illustratif et non limitatif, en référence aux figures annexées.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
La Figure 1 présente les courbes de liaison du Rendomab-B49 sur des cellules CHO surexprimant ETB-R avec (carrés) ou sans (points) pré incubation des cellules en présence de 80 nM d'endothéline 1. Dans les deux cas, une affinité de l'ordre du nanomolaire a été mesurée. Aucune liaison du Rendomab-B49 sur des cellules CHO sauvages (CHO WT) n'est observée (petits triangles).
La Figure 2 présente des images obtenues en microscopie confocale sur des neurosphères issues d'une biopsie d'un patient atteint d'un glioblastome de haut grade en présence de 1 pg/mL de Rendomab-Bl marqué (Figure 2A) ou de 1 pg/mL de Rendomab-B49 marqué (Figure 2B). Seuls les noyaux des cellules marqués au DAPI sont visualisés à la Figure 2A.
La Figure 3 présente des images obtenues en microscopie confocale sur des cellules tumorales issues d'une biopsie d'un patient atteint d'un glioblastome de bas grade en présence de DAPI (Figure 3A) ou de 1 pg/mLde Rendomab-B49 (Figure 3B).
La Figure 4 présente des images obtenues en microscopie confocale sur des cellules tumorales issues d'une biopsie d'un patient atteint d'un glioblastome en présence de 1 pg/mL de Rendomab-B36.
La Figure 5 présente les séquences nucléiques et déduites en acides aminés des domaines variables de la chaîne légère (VL) (Figure 5A) et de la chaîne lourde (VH) (Figure 5B) de l'anticorps murin IgGl/kappa Rendomab-B49 spécifique pour le récepteur B des endothélines. Les boucles hypervariables (CDR) sont indiquées en gras dans les séquences déduites en acides aminés.
La Figure 6 présente les séquences nucléiques et déduites en acides aminés des domaines variables de la chaîne légère (VL) (Figure 6A) et de la chaîne lourde (VH) (Figure 6B) de l'anticorps murin IgGl/kappa Rendomab-B41 spécifique pour le récepteur B des endothélines. Les boucles hypervariables (CDR) sont indiquées en gras dans les séquences déduites en acides aminés.
La Figure 7 présente les séquences nucléiques et déduites en acides aminés des domaines variables de la chaîne légère (VL) (Figure 7A) et de la chaîne lourde (VH) (Figure 7B) de l'anticorps murin lgG3/kappa Rendomab-B36 spécifique pour le récepteur B des endothélines. Les boucles hypervariables (CDR) sont indiquées en gras dans les séquences déduites en acides aminés.
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS I. Matériels et méthodes. 1.1. Immunisation.
La stratégie d'immunisation dite « immunisation génique » développée dans le laboratoire des inventeurs consiste à combiner des injections d'ADN avec des rappels protéiques sous la forme d'injection de cellules surexprimant ETB-R (Allard et al, 2011, « Electroporation-aided DNA immunization generates polyclonal antibodies against the native conformation of human endothelin B receptor », DNA and Cell Biology, vol. 30, pages 727-737).
Brièvement, trois injections, dans le muscle tibial de souris, de 50 pg d'ADN plasmidique pcDNA3/ETB-R, ont été réalisées avec une périodicité de 14 jours. Chaque injection d'ADN a été suivie d'une électrostimulation selon les caractéristiques suivantes : 8 impulsions de 20 ms chacune, 80 Volts, 1 Hz. Trois rappels d'immunisation ont ensuite été effectués, par injection par voie intrapéritonéale de 2.106 cellules COS surexprimant transitoirement ETB-R.
Les meilleures souris répondeuses ont été sacrifiées afin de procéder à la fusion cellulaire des cellules lymphoïdes de leurs rates avec le myélome murin NS-1. I. 2. Criblage des hybridomes.
Les hybridomes obtenus ont, tout d'abord, été criblés par ELISA sur des cellules CHO exprimant de manière stable ETB-R, avec pour contrôle négatif des cellules CHO exprimant le récepteur non pertinent NK1 (CHO-WT).
Les hybridomes retenus ont ensuite été criblés en cytométrie de flux (appareil Guava, Millipore). Trois hybridomes nommés « Rendomab-B49 », « Rendomab-B41 » et « Rendomab-B36 » ont finalement été retenus à l'issue de ces deux cribles. Les anticorps sécrétés ont ensuite été produits à partir de tumeurs liquides (ascites) induites chez la souris par injection par voie intrapéritonéale des hybridomes sélectionnés. II. Caractérisation biochimique.
Après purification du Rendomab-B49, du Rendomab-B41 et du Rendomab-B36, il a été procédé à la caractérisation de leurs propriétés biochimiques. L'isotypage des chaînes lourde et légère du Rendomab-B49 a été réalisé à l'aide du kit « Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping » de chez Piercell s'agit d'une immunoglobuline de type G, d'isotype 1 pour la chaîne lourde et kappa pour la chaîne légère. Le Rendomab-B49 est donc une immunoglobuline de type IgGl/kappa. Le Rendomab-B41 et le Rendomab-B36 sont, quant à eux, une immunoglobuline de type IgGl/kappa et une immunoglobuline de type lgG3/kappa.
Après purification du Rendomab-B49, sa spécificité de liaison a été établie par cytométrie de flux (Facs Calibur, Becton Dickinson BD Bioscience), par marquage indirect à l'aide d'un anticorps secondaire anti-souris fluorescent commercial (Life Technologie : Alexa Fluor®488 F(ab')2 fragment of goat anti-mouse IgG (H+L) *2 mg/mL*).
Les cellules CHO-ETBR ont été séparées en 2 groupes. L'un des groupes a été préalablement incubé en milieu de culture pendant 2 h à 37°C en présence d'endothéline 1 à une concentration finale de 80 nM de manière à internaliser le récepteur ETBR dans le but de démontrer la spécificité de reconnaissance du Rendomab-B49 pour ETB-R.
Puis, les cellules ont été aliquotées en tube falcon de 15 ml (300 000 cellules/tube) en présence d'une concentration croissante (gamme de concentrations de 0,04 nM à 800 nM de deux en deux) d'anticorps Rendomab-B49. Après 2 h d'incubation à 4°C, les cellules sont lavées trois fois en tampon PBS puis sont incubées pendant 1 h à 4°C avec l'anticorps secondaire à une concentration finale de 4 pg/ml. Les cellules sont ensuite lavées 3 fois en tampon PBS puis sont analysées au FACs Calibur après avoir compté 30 000 cellules. III. Propriétés de liaison sur cellules de glioblastome.
Il 1.1. Protocole.
Les cellules sont cultivées soit en neurosphères (culture en suspension) soit en adhérence sur des lamelles de verre recouvertes de poly D Lysine/Laminine. Les cellules sont ensuite fixées par une solution de paraformaldéhyde à 4% pendant 15 min à température ambiante, puis lavées 2 fois avec du PBS (SigmaAldrich). Les sites non spécifiques sont bloqués et les cellules sont perméabilisées par une solution de PBS + 5% de sérum d'âne + 0,1% de Triton, pendant 30 min. L'anticorps primaire Rendomab-B49, dilué dans la solution précédente à 1 pg/ml est mis en contact avec les cellules pendant la nuit à 8°C. Après 2 rinçages au PBS, les cellules sont incubées avec un anticorps secondaire commercial à une concentration finale de 4 pg/ml soit couplé à l'Alexa 488 (Life Technologie : Alexa Fluor®488 F(ab')2 fragment of goat anti-mouse IgG (H+L) *2 mg/mL*) soit couplé à l'Alexa 680 (Life Technologie Alexa Fluor®680 F(ab')2 fragment of goat anti-mouse IgG (H+L) *2 mg/mL*) pendant 2 h selon les indications du fournisseur, puis rincées 2 fois au PBS.
Les cellules sont brièvement incubées avec une solution de DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole) à 1 pg/ml pour visualiser les noyaux, puis après lavage PBS, les coverslips sont montées entre lame et lamelle avec du milieu de montage ad hoc pour observation. Les photos sont prises avec un microscope Zeiss muni d'un module apotome avec un grossissement de 400.
Il 1.2. Résultats. L'affinité (10 nM) et la spécificité exclusive du Rendomab-B49 pour le sous-type B humain de récepteur des endothélines sont illustrées Figure 1. En effet, on note l'absence de fixation du Rendomab-B49 sur les cellules CHO-WT montrant que la fixation observée sur les cellules CHO-ETBR n'est pas due à une protéine membranaire des cellules CHO.
De plus, la pré incubation des cellules CHO-ETBR 2 h à 37°C en présence de 80 nM d'endothéline 1 entraîne l'internalisation des ETB-R, ce qui se traduit par une chute de plus de 80% de la liaison du Rendomab-B49 dans ces conditions démontrant ainsi la spécificité de fixation du Rendomab-B49 pour ETB-R. La constante de dissociation apparente Ko du Rendomab-B49 est déterminée en prenant la valeur de la concentration donnant une MFI égale à 50% de la valeur de la MFI au plateau (40 unités arbitraire de fluorescence). Cette concentration est calculée à 10 nM de rendomab B49 donnant une MFI égale à 20 ua.
Des expériences de fixation sur des cellules tumorales isolées à partir de biopsies de patients atteints d'un glioblastome.
Sur la Figure 2, il y a une absence de marquage de neurosphères isolées à partir d'une tumeur de glioblastome de haut grade avec l'anticorps Rendomab-Bl (Figure 2A) alors que l'on observe, sur ces mêmes cellules, un très fort marquage fluorescent avec l'anticorps Rendomab-B49 (Figure 2B).
De même, la Figure 3 montre un fort marquage fluorescent par l'anticorps Rendomab-B49 (Figure 3B) de cellules tumorales isolées à partir d'une tumeur de glioblastome de bas grade, ces cellules étant également marquées au DAPI (Figure 3A).
Des résultats comparables sont obtenus avec les anticorps Rendomab-B41 et Rendomab-B36. A cet effet, la Figure 4 présente un fort marquage fluorescent par l'anticorps Rendomab-B36 de cellules tumorales isolées à partir d'une tumeur de glioblastome. IV. Clonaee moléculaire.
Le clonage des précurseurs nucléiques codant la chaîne lourde et la chaîne légère du Rendomab-Bl, a été réalisé à l'aide des kits: « Gene-Elute/ARN totaux » (Sigma) et « RACE-PCR » (Invitrogen).
Les séquences nucléiques et déduites en acides aminés des domaines variables de la chaîne légère (VL) et de la chaîne lourde (VH) du Rendomab-B49, du Rendomab-B41 et du Rendomab-B36 sont présentées aux Figures 5 à 7 respectivement. V. Cartographie épitopique.
La cartographie de l'épitope reconnu par le Rendomab-B49, le Rendomab-B41 et le Rendomab-B36 à la surface d'ETB-R a été réalisée par la technique « Pep-scan » en collaboration et selon les protocoles développés au sein de l'UMR 3145 « SysDiag » CNRS/BioRad située à Montpellier (Dr. Claude Granier). La séquence du sous-type B des récepteurs aux endothélines humain présente la séquence en acides aminés suivantes : MQPPPSLCGRALVALVLACGLSRIWGEERGFPPDRATPLLQTAEIMTPPTKTLW PKGSNASLARSLAPAEVPKGDRTAGSPPRTISPPPCQGPIEIKETFKYINTVVSCLVFVLGIIGNSTLLRIIY KNKCMRNGPNIUASLALGDLLHIVIDIPINVYKLLAEDWPFGAEMCKLVPFIQKASVGITVLSLCALSID RYRAVASWSRIKGIGVPKWTAVEIVLIWVVSVVLAVPEAIGFDIITMDYKGSYLRICLLHPVQKTAFMQ FYKTAKDWWLFSFYFCLPLAITAFFYTLMTCEMLRKKSGMQIALNDHLKQRREVAKTVFCLVLVFALC WLPLHLSRILKLTLYNQNDPNRCELLSFLLVLDYIGINMASLNSCINPIALYLVSKRFKNCFKSCLCCWCQ SFEEKQSLEEKQSCLKFKANDHGYDNFRSSNKYSSS (SEQID NO: 42).
Pour ce faire, 144 peptides de 12 acides aminés décalés d'un acide aminé chacun ont été utilisés. Ces peptides correspondent à l'ensemble des séquences d'ETB-R exposées du côté extra-cytoplasmique de la membrane.
Claims (20)
- REVENDICATIONS 1) Anticorps dirigé contre le sous-type B des récepteurs aux endothélines comprenant : - une région variable de chaîne lourde comprenant un CDR1 (ci-après désigné CDRIh), un CDR2 (ci-après désigné CDR2h) et un CDR3 (ci-après désigné CDR3h) tels que la juxtaposition ordonnée formée par les séquences en acides aminés du CDRIh, du CDR2h et du CDR3h présente au moins 80% d'identité avec la séquence en acides aminés suivante : GYTFISYWIDPDSGGTAREGDYAWFAY (SEQ ID NO: 1) et - une région variable de chaîne légère comprenant un CDR1 (ci-après désigné CDRIl), un CDR2 (ci-après désigné CDR2l) et un CDR3 (ci-après désigné CDR3l) tels que la juxtaposition ordonnée formée par les séquences en acides aminés du CDRIl, du CDR2l et du CDR3l présente au moins 80% d'identité avec la séquence en acides aminés suivante : QSIVHSNGNTYKVSFQGSHVPWT (SEQ ID NO: 2), un fragment ou un dérivé de celui-ci.
- 2) Anticorps selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit anticorps comprend : ii) une région variable de chaîne lourde comprenant : - un CDRIh dont la séquence en acides aminés est GYTFISYW (SEQ ID NO: 5); - un CDR2h dont la séquence en acides aminés est IDPDSGGT (SEQ ID NO: 10) ; et - un CDR3h dont la séquence en acides aminés est AREGDYAWFAY (SEQ ID NO: 15) ; ou iii) une région variable de chaîne lourde comprenant : - un CDRIh dont la séquence en acides aminés est GYTFTSYW (SEQ ID NO: 7); - un CDR2h dont la séquence en acides aminés est IDPDSGGT (SEQID NO: 10) ; et - un CDR3h dont la séquence en acides aminés est VREGWDAWFVY (SEQ ID NO: 17) ; ou iiii) une région variable de chaîne lourde comprenant : - un CDRIh dont la séquence en acides aminés est GYTFTSYW (SEQ ID NO: 7); - un CDR2h dont la séquence en acides aminés IDPNSGGT (SEQ ID NO: 12) ; et - un CDR3h dont la séquence en acides aminés est AREGEFAWFAY (SEQ ID NO: 19).
- 3) Anticorps selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit anticorps comprend une région variable de chaîne lourde dont la séquence en acides aminés présentant au moins 80% d'identité avec la séquence suivante : QVQLQQPGAALVKPGASVKLSCKASGYTFISYWMLWVKQRPGRGLEWIGRIDPDSGG TKYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREGDYAWFAYWGQGTLVPVSA (SEQ ID NO: 31).
- 4) Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit anticorps comprend : 12) une région variable de chaîne légère comprenant : - un CDRIl dont la séquence en acides aminés est QSIVHSNGNTY (SEQ ID NO: 22); - un CDR2l dont la séquence en acides aminés est KVS ; - un CDR3l dont la séquence en acides aminés est FQGSHVPWT (SEQ ID NO: 27); ou Ü2) une région variable de chaîne légère comprenant : - un CDRIl dont la séquence en acides aminés est QSIVHSNGNTY (SEQID NO: 22); - un CDR2l dont la séquence en acides aminés est KVF ; - un CDR3l dont la séquence en acides aminés est FQGSHVPLT (SEQ ID NO: 29); ou iiÎ2) une région variable de chaîne légère comprenant : - un CDRIl dont la séquence en acides aminés est QNIVHSNGYTY (SEQ ID NO: 24) ; - un CDR2l dont la séquence en acides aminés est KVS ; - un CDR3l dont la séquence en acides aminés est FQGSHVPLT (SEQ ID NO: 29).
- 5) Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit anticorps comprend une région variable de chaîne légère dont la séquence en acides aminés présentant au moins 80% d'identité avec la séquence suivante : DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 37).
- 6) Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit anticorps est une immunoglobuline de type IgGl/kappa ou de type lgG3/kappa.
- 7) Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit anticorps est monoclonal.
- 8) Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit anticorps est l'anticorps murin monoclonal obtenu à partir d'un hybridome choisi parmi l'hybridome déposé à la CNCM le 19 mai 2016 sous le numéro CNCM 1-5084, l'hybridome déposé à la CNCM le 7 juin 2016 sous le numéro CNCM 1-5104 et l'hybridome déposé à la CNCM le 7 juin 2016 sous le numéro CNCM 1-5103.
- 9) Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit anticorps est un anticorps chimérisé.
- 10) Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit anticorps est un anticorps humanisé.
- 11) Hybridome choisi parmi l'hybridome déposé à la CNCM le 19 mai 2016 sous le numéro CNCM 1-5084, l'hybridome déposé à la CNCM le 7 juin 2016 sous le numéro CNCM 1-5104 et l'hybridome déposé à la CNCM le 7 juin 2016 sous le numéro CNCM 1-5103.
- 12) Polynucléotide isolé choisi parmi les différents polynucléotides ci- après : a) un polynucléotide codant un anticorps tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 10 ; β) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide tel que défini au point (a) ; γ) un polynucléotide d'au moins 18 nucléotides, capable de s'hybrider dans des conditions de forte stringence aux polynucléotides tels que définis aux points (a) et (β).
- 13) Vecteur de clonage et/ou d'expression contenant au moins un polynucléotide selon la revendication 12.
- 14) Organisme hôte transformé par ou comprenant un polynucléotide selon la revendication 12 ou un vecteur selon la revendication 13.
- 15) Composé comprenant un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 conjugué avec un élément choisi dans le groupe constitué par un groupement cytotoxique, un groupement facilement détectable, ou un groupement effecteur.
- 16) Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, polynucléotide selon la revendication 12 ou composé selon la revendication 15 pour utilisation comme médicament.
- 17) Composition pharmaceutique comprenant, en tant que principe actif, un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, un polynucléotide selon la revendication 12 ou un composé selon la revendication 15 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
- 18) Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, polynucléotide selon la revendication 12, composé selon la revendication 15 ou composition pharmaceutique selon la revendication 17, pour utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'un trouble ou d'une pathologie impliquant un dysfonctionnement, direct ou en association avec une autre voie physiologique, de l'axe comprenant une endothéline et au moins un de ses récepteurs tel que, notamment, le sous-type B des récepteurs aux endothélines.
- 19) Anticorps, polynucléotide, composé ou composition pharmaceutique pour utilisation selon la revendication 18, caractérisé en ce que ledit trouble ou ladite pathologie est un cancer.
- 20) Procédé pour diagnostiquer un cancer tel qu'un glioblastome in vitro comprenant les étapes consistant à : ai') mettre en contact un échantillon biologique prélevé chez un sujet avec un composé selon la revendication 15 ; bi') détecter le signal émis par le groupement facilement détectable et ci') déterminer la présence ou l'absence d'un cancer chez ledit sujet sur la base du signal détecté à l'étape (bi').
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