FR3031456B1 - Extraits de sapin abies alba, compositions et utilisations - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un extrait aqueux de graines d'Abies alba ; l'invention concerne également une composition comprenant l'extrait de l'invention, et l'utilisation cosmétique, dermocosmétique, dermatologique ou nutraceutique de l'extrait ou de la composition de l'invention.
Description
EXTRAITS DE SAPIN ABIESALBA, COMPOSITIONS ET UTILISATIONS
DOMAINE DE L’INVENTION
La présente invention concerne le domaine de la dermatologie, de la dermocosmétique, de la cosmétique, et/ou de la nutraceutique. Plus particulièrement, l’invention s’intéresse à des extraits de sapin et à leur utilisation en tant qu’actifs cosmétique ou dermocosmétique ou principes actifs dermatologique ou nutraceutique.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE
Le sapin des Vosges appartient à la famille des pinacées et est très présent dans tout l’hémisphère nord avec plus de 40 espèces différentes. Egalement connu sous le nom de sapin blanc ou sapin pectine, Abies alba, il est la principale essence résineuse de l'étage montagnard de l'Europe centrale et méridionale. Le sapin des Vosges produit des cônes mâles et femelles en avril et niai. Après la fécondation, les cônes femelles restent sur l'arbre au moins trois ans, temps qu'il faut pour que la graine se développe. Lorsque les gros cônes femelles ne sont plus alimentés par la plante mère, la sécheresse du cône provoque l’ouverture des écailles, en septembre-octobre. Les écailles s'écartent du rachis central du cône libérant ainsi de grosses graines ailées.
La Demanderesse a développé une technologie d’extraction enzymatique d’huiles et d’extraits aqueux à partir de matière végétale (WO 2011/045387) et s’intéresse tout particulièrement aux propriétés des produits extraits issus de ce procédé. Cette technologie combine des avantages technologiques, économiques, règlementaires et environnementaux. En particulier, la Demanderesse a appliqué cette technologie à une source végétale naturelle, le sapin blanc ou Abies alba, et a obtenu des extraits d’intérêt en cosmétique, dermocosmétique, dermatologie et nutraceutique.
Le brevet français FR 1 525 945 décrit l’utilisation dermocosmétique d’extraits de Conifères. Cependant, il s’agit d’extraits obtenus à partir des feuilles ou de la sève de ses arbres qui agissent sur la fermeté et l’acidité de la peau.
Des extraits aqueux de graines d’Abies alba ont été analysés (Alloua et al, Electrophoresis, 1994,15 :1062-1067 ; Mejnartowicz et al, Silvae Genetica, 2003, 52 (1) :15-17). Cependant il n’y est pas décrit la présence de phénols et/ou de sucres réducteurs.
Or, l’industrie cosmétique, comme l’industrie dermatologique, sont toujours à la recherche de nouveaux moyens permettant de protéger la peau, notamment des agressions extérieures, et de lutter contre le vieillissement cutané.
Ainsi, l’invention apporte de nouveaux extraits de sapin, de préférence d’Abies alba ayant des propriétés surprenantes antioxydantes, anti-inflammatoires et dépigmentantes. RÉSUMÉ
Ainsi, dans un premier aspect, l’invention concerne un extrait aqueux de graines de sapin blanc Abies alba. L’extrait aqueux selon l’invention comprend des phénols et des sucres réducteurs ; la teneur en phénols va de 1% à 25%, de préférence de 5% à 20% en poids par- rapport au poids total de l’extrait sec ; la teneur en sucres réducteurs va de 25% à 50%, de préférence de 30% à 45% en poids par rapport au poids total de l’extrait sec. Suivant un mode de réalisation préféré, l’extrait selon l’invention est susceptible d’être obtenu par broyage de graines de sapin blanc Abies alba, avec addition d’eau optionnelle, puis hydrolyse enzymatique. Dans un second aspect, l’invention concerne également une composition comprenant de 0.01 à 5%, de préférence de 0.05 à 3.5%, de préférence de 0.1 à 2%, en poids par rapport au poids total de la composition, d’un extrait aqueux selon l’invention, en association avec au moins un excipient cosmétiquement, dermatologiquement, dermocosmétiquement, ou nutraceutiquement acceptable. Avantageusement, la composition selon l’invention comprend en outre au moins un autre actif en plus de l’extrait de sapin, choisi parmi la vitamine E, l’acide hyaluronique, le coenzyme Q10, l’arbutine, les polyphénols, les flavonoïdes, l’acide kojique, l’acide phytique, l’extrait de mûrier blanc. Suivant un mode de réalisation, la composition est formulée pour être administrée topiquement sur la peau du visage et/ou du corps, de préférence sur la peau du visage et des mains, sous forme de gel, lait, crème, lotion, émulsion. Suivant un autre mode de réalisation, la composition selon l’invention est formulée pour être administrée par voie orale sous fosme de comprimés, gélules, capsules, ampoules, sirops, gouttes.
Dans un troisième aspect, l’invention concerne encore un actif cosmétique ou dermocosmétique, un principe actif dermatologique ou un nutraceutique comprenant un extrait selon l’invention. Dans un quatrième aspect, l’invention concerne l’utilisation de l’extrait selon l’invention en tant qu’agent anti-âge, antioxydant et/ou anti-inflammatoire et/ou dépigmentant. Dans un cinquième aspect, l’invention concerne une méthode de soin non-thérapeutique de la peau pour prévenir et/ou lutter contre le vieillissement, comprenant l’administration d’un extrait ou d’une composition selon l’invention.
DÉFINITIONS
Dans la présente invention, les termes ci-dessous sont définis de la manière suivante :
Le terme « extrait » concerne une préparation liquide, semi-solide ou solide, obtenue par extraction à partir de sapin. De préférence, l’extraction est biologique, très préférentiellement enzymatique. - Le terme « actif » concerne un ingrédient qui possède une activité précise à l’origine de l’efficacité du produit cosmétique. - Le terme « principe actif » concerne une substance entrant dans la composition d’un médicament et lui conférant ses propriétés thérapeutiques.
Le terme « nutraceutique » concerne un produit fabriqué à partir de substances alimentaires, mais rendu disponible sous forme de comprimé, de poudre, de potion ou d'autre formes médicinales habituellement non associées à des aliments, et qui s’est avéré avoir un effet physiologique bénéfique ou protecteur contre les maladies chroniques. Le terme « nutraceutique » fait également référence à l'ingrédient actif présent à l’état naturel dans un aliment qui procure un effet bénéfique pour la santé.
Le terme « antioxydant » concerne un agent qui diminue ou empêche l’oxydation d’autres substances. Un antioxydant peut protéger les cellules contre les effets des espèces réactives d’oxygène.
Le terme « anti-inflammatoire » concerne une substance qui s’oppose ou qui combat une inflammation. Un anti-inflammatoire peut être utilisé dans le traitement local de l’inflammation ou le traitement général des maladies inflammatoires.
Le terme « dépigmentant » concerne un agent destiné à décolorer de petites pigmentations cutanées.
Le terme « anti-âge » concerne un agent possédant la propriété de retarder et/ou de lutter contre les effets du vieillissement de la peau et des tissus.
Précédant une valeur, le terme « environ » signifie plus ou moins 10% de la valeur.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE
Extrait
La présente invention concerne un extrait de sapin, de préférence un extrait d’Abies alba.
Selon un mode préféré de réalisation, l’extrait de l’invention est un extrait issu des graines d’Abies alba. Selon un mode de réalisation, l’extrait de l’invention est un extrait aqueux.
Dans un mode de réalisation, l’extrait de l’invention comprend des phénols. Selon un mode de réalisation, la teneur en phénols va de 1% à 25%, de préférence de 5% à 20%, en poids par rapport au poids total de l’extrait sec.
Dans un mode de réalisation, l’extrait de l’invention comprend des sucres réducteurs. Selon un mode de réalisation, la teneur en sucres réducteurs va de 25% à 50%, de préférence de 30% à 45%, en poids par rapport au poids total de l’extrait sec.
Selon un mode de réalisation de réalisation, l'extrait obtenu selon l’invention comprend de 0,1 à 10% de matière sèche, et peut être concentré par évaporation.
Selon un mode de réalisation, l’extrait de l’invention comprend des phénols et des sucres réducteurs.
Selon un mode particulier de réalisation, l’extrait de l’invention comprend une teneur en phénols allant de 1% à 25%%, de préférence de 5% à 20% en poids par rapport au poids total de l’extrait sec, et une teneur en sucres réducteurs allant de 25% à 50%, de préférence de 30% à 45% en poids par rapport au poids total de l’extrait sec.
Procédé L’extrait selon l’invention peut être obtenu par toute méthode d’extraction connue de l’homme du métier. Toutefois, la Demanderesse privilégie les procédés d’extraction permettant d’obtenir des produits propres, c’est-à-dire exempts de trace de produits chimiques provenant du procédé d’extraction lui-même. Selon un mode de réalisation préféré, l’extrait selon l’invention est obtenu par un procédé d’extraction biologique, de préférence enzymatique.
Ainsi, l’invention concerne également un procédé de préparation de l’extrait de l’invention.
Selon un mode de réalisation, le procédé de l’invention comprend au moins une étape d’hydrolyse enzymatique. Selon un mode de réalisation, l’hydrolyse enzymatique est réalisée par un mélange enzymatique contenant au moins une eellulase, au moins une hémicellulase et au moins une pectinase.
Selon un mode de réalisation, le procédé de l’invention comprend les étapes suivantes : a) addition d’eau à de la matière végétale présentant une taille de particule appropriée, b) addition d’un mélange enzymatique contenant au moins une eellulase, au moins une hémicellulase et au moins une pectinase, le rapport entre l’activité de la pectinase et l’activité de la eellulase étant d’au moins 0.14, de préférence compris entre 0.3 et 2.5, et plus préférentiellement entre 0.35 et 0.45, et le rapport entre l’activité de la pectinase et l’activité de Γhémicellulase étant d’au moins '7.10*'; de préférence compris entre 1.10'2 et 0.5, et plus préférentiellement ente 1.102 et 2.10"2, l'activité de la pectinase étant inférieure à 120 pmol/min/ml, et de préférence inférieure à 100 pmol/min/ml, c) incubation sous agitation de la matière végétale et du mélange enzymatique pour libérer dans le milieu réactionnel des huiles, des molécules hydrophiles d’intérêt dont des phénols, des protéines et des sucres fermentescibles, pendant une durée dépendant des rendements recherchés, d) séparation du milieu réactionnel pour obtenir une phase aqueuse comprenant notamment des phénols, des protéines et des sucres fermentescibles.
Selon un mode de réalisation, le procédé de l’invention comprend en outre une étape de broyage des parties destinées à la préparation de l’extrait. De préférence, selon un mode de réalisation, le procédé de l’invention comprend en outre une étape de broyage des graines.
Selon un mode de réalisation préféré, l'extrait selon Γ invention est préparé selon le procédé décrit dans la demande de brevet WO 2011/045387.
Composition L’invention concerne également une composition comprenant l’extrait de l’invention en tant qu’actif ou principe actif.
Dans un mode de réalisation, la composition de l’invention comprend en outre au moins un excipient approprié.
Selon un mode de réalisation, la composition de l’invention est une composition cosmétique et comprend un excipient cosmétiquement acceptable. Selon un autre mode de réalisation, la composition de l’invention est une composition dermatologique et comprend un excipient dermatologiquement acceptable. Selon un antre mode de réalisation, la composition de l’invention est une composition dermoeosmétique et comprend un excipient dermocosmétiquement acceptable. Selon un autre mode de réalisation, la composition de l’invention est une composition nutraceutique et comprend un excipient nutraceutiquement acceptable. Les excipients acceptables et leurs quantités sont ceux classiquement utilisés dans les domaines considérés et bien connus par l’homme du métier.
Dans un mode de réalisation, la composition de l’invention comprend une teneur en extrait de l’invention allant de 0.01 à 5%, de préférence de 0.05 à 3.5%, de préférence de 0.1 à 2%, en poids par rapport, au poids total de la composition.
Dans un mode de réalisation, la composition de l’invention peut comprendre en outre au moins un actif additionnel connu pour son action antioxydante, anti-inflammatoire et/ou dépigmentante. Selon un mode de réalisation, l’actif additionnel est choisi parmi la vitamine E, l’acide hyaluronique, le coenzyme Q10, l’arbutine, les polyphénols, les flavonoïdes, l’acide kojique, l’acide phytique, l’extrait de mûrier blanc.
La composition selon l’invention peut également contenir les adjuvants habituels dans le domaine de la dermatologie, de la cosmétique ou de la dermocosmétique, tels que les gélifiants, les épaississants, les conservateurs, les solvants, les parfums, les agents chélateurs, les absorbeurs d’odeur, les filtres chimiques ou minéraux, les pigments minéraux, les tensioactifs, les polymères et les matières colorantes. Les quantités de ces différents adjuvants sont celles classiquement utilisées dans les domaines considérés.
Dans un mode de réalisation, la composition de l’invention est administrée topiquement sur le visage et le corps. De préférence, la composition de l’invention est appliquée sur la peau du visage, c’est-à-dire la peau de la face, du cou, du décolleté et/ou du contour des yeux et sur la peau des mains. La composition de l’invention peut alors être sous forme, par exemple, de gel, lait, crème, lotion, émulsion.
Dans un autre mode de réalisation, la composition de l’invention est administrée par voie orale. La composition de l’invention peut alors être sous forme, par exemple, de comprimés, gélules, capsules, ampoules, sirops, gouttes.
Utilisations L’invention concerne également rutilisation de l’extrait selon l’invention tel que décrit ci-dessus ou d’une composition de l’invention telle que décrite ci-dessus, en tant qu’actif ou principe actif pour prévenir et/ou lutter contre l’oxydation de la peau.
La Demanderesse a mis en évidence qu’un extrait de l’invention possède des propriétés antioxydantes (exemple 2). Les cellules de la peau sont sensibles au stress oxydatif. La peau contient une réserve naturelle d’antioxydants qui l’aident à se réparer, cependant à mesure que la peau est soumise à des agressions environnementales, cette réserve s’épuise très vite. Ces agressions génèrent des radicaux libres, lesquels entraînent une réaction en chaîne qui endommage la peau et détruit des composants vitaux des cellules. Les principaux facteurs environnementaux qui contribuent aux défauts cutanés sont la lumière du soleil, le rayonnement infrarouge, la pollution de l’air, les températures trop élevées ou trop basses ainsi que la fumée de cigarette. L’exposition chronique au rayonnement solaire est en majorité responsable du vieillissement prématuré de la peau. La production excessive de ROS, induite par les UV, est un facteur clé du photo-vieillissement. Les ROS sont en effet responsables de lésions oxydatives touchant les acides nucléiques, les protéines et les lipides. La peau dite photovieillie, présente alors des caractéristiques cliniques et histologiques particulières, elle est profondément ridée, tachetée, rougie, déshydratée, rigide et fragilisée. En outre, la production de ROS induite par les autres facteurs environnementaux oxydants participe également au vieillissement cutané.
En plus de ses propriétés antioxydantes, l’extrait de l’invention présente un effet protecteur contre la sénescence cellulaire (exemple 4).
Selon un mode de réalisation, l’extrait de l’invention ou la composition de l’invention peut donc être utile pour retarder et/ou lutter contre le vieillissement de la peau. Selon un mode de réalisation, l’extrait de l’invention ou la composition de l’invention est utile comme anti-âge.
La Demanderesse a également mis en évidence que l’extrait selon l’invention possède des propriétés protectrices contre les UVB (exemple 3). Les UVB et les UVA représentent respectivement 0,3 % et 5,1 % du rayonnement solaire parvenant à la surface de la Terne, Toutefois, en raison de la diminution de la couche d’ozone dans certaines régions du globe, la lumière solaire parvenant à la surface de la terre a tendance à s’enrichir en rayonnements UVB et UVC. La peau est la première cible des rayonnements UV. L'exposition prolongée au rayonnement UV peut avoir des effets aigus et chroniques au niveau cutané. Le coup de soleil (érythème) est l’effet aigu le mieux connu de l'exposition excessive aux UV. A long terme, les UV provoquent des lésions dégénératives dans les cellules cutanées, le tissu fibreux et les vaisseaux sanguins, conduisant à un vieillissement prématuré de la peau, à des photodermatoses (ou dermatoses photoallergiques) et à des kératoses aetiniques (lésions cutanées).
Selon un mode de réalisation, l’extrait de l’invention ou la composition de l’invention peut donc être utile pour protéger la peau des rayons UV. Selon un mode de réalisation particulier, l’extrait de l’invention ou la composition de l’invention est utile pour réduire les photodermatoses et/ou les kératoses aetiniques.
Outre son effet protecteur contre les rayons UV pouvant induire des lésions cutanées, l’extrait de l’invention présente des propriétés anti-inflammatoires, notamment en réduisant la production d’interleukines telles que l’interleukine ILl-α (exemple 3). Cette activité anti-inflammatoire confère à l’extrait selon l’invention ou la composition selon l’invention des propriétés apaisantes.
Selon un mode de réalisation, Γutilisation de l’invention est destinée à réduire et/ou apaiser les irritations et/ou lésions de la peau. Dans un mode de réalisation, la peau est une peau irritée et/ou réactive.
La Demanderesse a également démontré que l’extrait de l’invention possède une activité dépigmentante (exemple 5).
Dans un mode de réalisation, l’utilisation de l’invention est donc destinée à dépigmenter et/ou blanchir la peau.
Le soleil, le vieillissement cutané et l’hérédité sont parmi les principaux facteurs qui influent sur la pigmentation de la peau. Dès l’âge de 30 ans, ils peuvent engendrer un dérèglement du mécanisme de production et de répartition de mélanine, le pigment à l’origine de la couleur de la peau. Cette dernière se répartit alors dans la peau de façon irrégulière, et s’accumule à la surface de l’épiderme. En conséquence, la pigmentation de la peau devient inégale et des taches se forment en surface.
Dans un mode de réalisation, l’utilisation de l’invention est destinée à réduire et/ou supprimer les taches de la peau. Dans un mode particulier de réalisation, les taches de la peau sont des taches de sénescence de la peau. Dans un autre mode de réalisation, les taches de la peau sont induites par les UV.
Dans un autre mode de réalisation, les taches de la peau sont dues au chloasma. Le chloasma, appelé également masque de grossesse ou mélasma, est une maladie se caractérisant par la présence d'un ensemble de taches pigmentaires, de formes irrégulières, qui siègent le plus souvent au visage.
Grâce à ces propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires, et donc apaisantes, et dépigmentantes, l’extrait de l’invention ou la composition de l’invention peut également être utile pour réduire les troubles et/ou les traces laissées par des maladies de peau. Des exemples de maladies de peau dont les troubles et/ou les traces peuvent être réduits selon rutilisation de l’invention sont, sans limitation, l’eczéma, la dermatose, le psoriasis, l’urticaire, l’acné.
Quelle que soit l’utilisation selon l’invention, la peau peut être une peau jeune ou une peau mature.
Nutraceutique L’invention concerne également rutilisation d’un extrait selon l’invention tel que décrit ci-dessus ou d’une composition selon l’invention telle que décrite ci-dessus, en tant que nutraceutique. Selon un mode de réalisation, le nutraceutique ou la composition nutraceutique selon l’invention est utile pour lutter contre l’oxydation. Selon un mode de réalisation, le nutraceutique ou la composition nutraceutique selon l’invention est utile pour lutter contre l’inflammation. Selon un mode de réalisation, le nutraceutique ou la composition nutraceutique selon l’invention est utile pour lutter contre Γ hyperpigmentati on.
Le nutraceutique ou la composition nutraceutique de l’invention est destiné à être administré sous une forme adaptée connue dans l’art. Les formes adaptées connues dans l’art incluent les formes adaptées pour une administration par voie parentérale, entérale, de préférence orale. De préférence, le nutraceutique ou la composition nutraceutique de l’invention est sous forme solide ou liquide pour une administration orale et se présente par exemple, sous forme de poudres, comprimés sécables ou non, pelliculés ou non, de granules, de capsules, de gélules, d’ampoules.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation d’un extrait ou d’une composition de l’invention en tant que complément alimentaire ou pour enrichir une boisson et/ou un produit alimentaire.
Encore un autre aspect de l'invention concerne une méthode non thérapeutique pour prévenir eî/ou lutter contre l’oxydation, la composition nutraceutique étant administrée au moins une fois par- semaine, de préférence au moins une fois par jour. Selon un mode de réalisation, la composition nutraceutique est administrée au moins deux fois par jour.
Selon un mode de réalisation, la composition nutraceutique est administrée au cours des repas. Selon un mode de réalisation, la composition nutraceutique est administrée en dehors des repas.
Selon un mode de réalisation, la composition nutraceutique est administrée avant ou après l’exposition à un agent oxydant. Selon un mode de réalisation, la composition nutraceutique est administrée quotidiennement pendant au moins une semaine, de préférence au moins un mois, en prévention avant une exposition à un agent oxydant. Selon un mode de réalisation, la composition nutraceutique est administrée quotidiennement pendant au moins une semaine, de préférence au moins un mois, après une exposition à un agent oxydant. Méthode de soin L’invention concerne également une méthode de soin cosmétique pour prévenir et/ou lutter contre l’oxydation cutanée, comprenant l’administration d’un extrait de l’invention tel que décrit ci-dessus ou d’une composition de l’invention telle que décrite ci-dessus.
Dans la présente invention, par soin cosmétique, on entend un soin cosmétique non thérapeutique. L’invention concerne également une méthode de soin cosmétique pour prévenir, retarder et/ou lutter contre le vieillissement cutané, comprenant l’administration d’un extrait de l’invention tel que décrit ci-dessus ou d’une composition de l’invention telle que décrite ci-dessus, La méthode de l’invention se rapporte également à une méthode de soin cosmétique anti-âge. L’invention concerne également une méthode de soin cosmétique pour dépigmenter et/ou blanchir la peau, comprenant l’administration d’un extrait de l’invention tel que décrit ci-dessus ou d’une composition de l’invention telle que décrite ci-dessus.
Selon un mode de réalisation, les méthodes de soin cosmétique selon l’invention comprennent l’administration de l’extrait de l’invention ou de la composition de l’invention topiquement sur la peau du visage, des mains et/ou du corps. Il peut s'agir, par exemple d'une simple application sur la peau ou d’une application accompagnée d'un massage de la peau avec la composition de la présente invention. L'application est de préférence réalisée avec une quantité suffisante de la composition afin que toute la surface de la peau à traiter soit traitée. Il peut s'agir par exemple d'une application classique, comme une crème sur la peau. Il peut s'agir par exemple aussi d'une application pour former un masque traitant. L’application peut être réalisée sur peau préalablement mouillée ou sur peau sèche. L'application peut être, par exemple une application quotidienne, hebdomadaire et bimensuelle. Il peut s'agir par exemple d'une application une fois par jour, deux fois par jour ou plus.
Dans un mode avantageux de réalisation des méthodes de soin cosmétique selon l'invention, la composition est administrée le matin en tant que soin de jour et/ou le soir au coucher en tant que soin de nuit.
Selon un mode de réalisation, la composition de l’invention est administrée avant ou après l’exposition à un agent oxydant. Selon un mode de réalisation, la composition de l’invention est administrée quotidiennement pendant au moins une semaine, de préférence au moins un mois, en prévention avant une exposition à un agent oxydant.
Selon un mode de réalisation, la composition de l’invention est administrée quotidiennement pendant au moins une semaine, de préférence au moins un mois, après une exposition à un agent oxydant. Par exemple, la composition est administrée avant et/ou après une exposition de la peau au soleil.
Dans un mode avantageux de réalisation des méthodes de soin cosmétique selon l'invention, la composition est administrée dès les premiers signes de vieillesse.
Dans un mode avantageux de réalisation des méthodes de soin cosmétique selon l'invention, la composition est administrée dès l’apparition de taches pigmentaires. II est bien évident que l'invention s'adresse aux mammifères en général, et plus particulièrement aux êtres humains.
BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 est un histogramme montrant l’absorbance à 517 nm d’une solution de DPPH en présence de concentrations croissantes d’extrait aqueux de graines d’Abies alba.
La Figure 2 est graphe montrant la réduction des radicaux libres d’une solution de DPPH en présence de concentrations croissantes d’extrait aqueux de graines d’Abies alba.
La Figure 3 est un histogramme montrant l’effet protecteur d’un extrait aqueux de graines d’Abies alba 5% ou de la vitamine E 50 μΜ sur des épidermes soumis à des UVB.
La Figure 4 est un histogramme montrant l’activité β-galactosidase associée à la sénescence de fibroblastes humains soumis à un stress dû au peroxyde d’hydrogène en absence de traitement (témoin positif) ou en présence d’extrait aqueux de graines d’Abies alba à une concentration de 0.5%, 0.25% ou 0.1%.
La Figure 5 est un histogramme montrant le pourcentage d’inhibition de la mélanisation par rapport au témoin non traité d’épidermes recons traits mélanisés traités avec un extrait aqueux de graines d’Abies alba à une concentration de 2% ou 5% ou avec de l’acide kojique à 1%.
La Figure 6 est un graphe montrant le pourcentage d’inhibition de la tyrosinase par un extrait aqueux de graines d’Abies alba à différentes dilutions, par rapport à un témoin sans extrait.
EXEMPLES
La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants qui illustrent non-limitativement l’invention. L'extrait aqueux de graines d’Abies alba est préparé selon le procédé décrit dans la demande de brevet WO 2011/045387.
Dans les exemples qui suivent, les termes « extrait aqueux de graines d’Abies alba» se réfèrent à l'extrait aqueux de graines d’Abies alba préparé selon le présent exemple 1.
Exemple 2 : Propriétés antioxydantes d’un extrait aqueux de graines d’Abies alba
1. Test DPPH
Principe
Le potentiel anti-radicalaire d’une substance peut, être testé à l’aide d’une méthode colorimétrique appelée test DPPH, en utilisant des radicaux de substitution tels que le radical l,l-diphényle-2-picrylhydrazil appelé DPPH. A température ambiante et en solution, le radical DPPH présente une coloration violette intense. Son passage à la forme non radicalaire, après saturation de ses couches électroniques s’accompagne d’une disparition de cette coloration suivant l’équation suivante : DPPH° + AH ——> DPPH-H + A°
La diminution de l’intensité de la coloration d’une solution contenant le radical DPPH, appelée solution de DPPH, est suivie par mesure colorimétrique à 517 nm, Elle permet de se rendre compte de la capacité de piégeage des composés étudiés par rapport à celle du DPPH°. La diminution de l’absorbance met ainsi en évidence les propriétés anti-radicalaires des composés étudiés.
Protocole
Un volume de 25 pL d’extrait aqueux de graines & Abies alba ou de solution témoin est injecté dans des tubes à hémolyses protégés de la lumière. Une solution de DPPH à 6.10”5 mol/L est ajoutée pour obtenir un volume final de 1 mL. Après agitation et incubation pendant 30 min à température ambiante et à l’abri de la lumière, l’absorbance de la solution est mesurée à 517 nm. Résultats
Les résultats d’absorbance sont présentés dans la Figure i. On observe une diminution très nette de l’absorbance à 517 nm en présence d’extrait de l’invention. De plus l’effet de l’extrait est dose dépendant, allant jusqu’à réduire plus de 6 fois l’absorbance par rapport au témoin sans extrait.
La réduction des radicaux libres correspondante est présentée dans la Figure 2. La réduction des radicaux libres augmente fortement avec la concentration de l’extrait. A une concentration de 0.75%, la réduction des radicaux libres est d’environ 16%. Lorsque l’extrait est à une concentration de 1.25%, la réduction des radicaux libres monte à environ 37%. La réduction des radicaux libres atteint environ 84% à une concentration en extrait de l’invention de 2.5%.
Ainsi, l’extrait aqueux de graines & Abies alba de l’invention présente une activité anti--radicalaire et antioxydante significativement forte.
2. TestORAC
Principe
Le test OR AC permet de déterminer le potentiel antioxydant d’un extrait aqueux par la méthode de suivi cinétique fluoriinétiique ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity). Cette méthode utilise une sonde fluorescente, la fluorescéine, pour suivre l’activité antioxydante.
Cette méthode consiste donc en la mesure de la protection exercée par l’extrait contre l’oxydation de la fluorescéine provoquée par un générateur de radicaux libres, ici 1’ AAPH (2,2’-azobis-2-methyl-propanimidamide, dihydrochloride) qui produit des radicaux libres de type péroxyle. L’AAPH produit des radicaux libres au cours de la réaction qui endommagent la sonde fluorescente et diminuent l’intensité de la fluorescence. C’est le changement de degré d’intensité de fluorescence qui témoigne des dommages causés par les radicaux libres, et qui permet de mesurer le potentiel de protection antioxydante. Un suivi cinétique est réalisé et se poursuit jusqu’à épuisement de l’activité antioxydante de l’extrait. Les radicaux libres restant détruisent alors la sonde fluorescente jusqu’à l’extinction totale de la fluorescence. Afin de quantifier le potentiel de protection antioxydante de l’extrait, l’aire sous la courbe de celui-ci est comparée à l’aire sous la courbe d’un antioxydant de référence, ici le Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid). Le Trolox est une molécule analogue hydrosoluble de la vitamine E. Les résultats sont donnés en équivalent Trolox.
Protocole
Matériels et réactifs - Fluorimètre (k(excitation)=485nm ; X(émission)~528nm) - Microplaques 96 puits - AAPH (CAS : 1898-66-4 ; MW= 394.32 g.moL) - Sodium Fluorescein (CAS : 518-47-8 ; MW= 376 ,27 g.mol·1) - Trolox (CAS : 53188-07-1 ; MW- 250.29 g.mol·1)
La solution d’AAPH est préparée à une concentration de 34.8 mM dans du tampon phosphate. Les solutions de Trolox et de fluorescéine sont préparées à une concentration de 1 mM dans du tampon phosphate. Toutes les solutions sont conservées à l’abri de la lumière. La solution de travail de fluorescéine est préparée extemporanément à partir de la solution à 1 mM avec du tampon phosphate pour obtenir une concentration finale de 100 îîM. Méthode A 120 pL de solution de travail de fluorescéine à 100 nM sont ajoutés 20 pL d’extrait aqueux de graines d’Abies alba de concentration connue. La cinétique est alors déclenchée avec l’ajout de 60 pL de solution d’AAPH (temps 0) pour un volume réactionnel total de 200 pL. Une mesure de fluorescence est effectuée tontes les minutes pendant 60 min à une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et d’émission de 528 nm. Chaque échantillon est préparé en triplicate et le résultat correspond à la moyenne des 3 valeurs relevées. Si une valeur d’absorbances s’écarte de plus de 10% des autres valeurs, il convient de ne pas la considérer pour le calcul de la fluorescence moyenne,
Des témoins négatif et positif pour lesquels l’extrait de l’invention est remplacé en volume équivalent respectivement par du tampon phosphate et par une solution de Trolox. L’aire sous la courbe (AUC) de chaque concentration d’échantillon, extrait ou témoin, est calculée selon la formule (1) :
où fn est la fluorescence au temps n et /0 est la fluorescence au temps 0. L’aire sous la courbe nette (net AUC) est alors calculée selon la formule (2) :
Afin d’obtenir un résultat en équivalent Trolox, une droite d’étalonnage à partir de la solution de Trolox de différentes concentrations (de 0 à 100 μΜ) pour lesquelles Faire sous la courbe nette sont mesurées, est réalisée, La régression linéaire correspondant à cette droite permet de déterminer le net AUC de l’extrait, c’est-à-dire son potentiel antioxydant, exprimé en pmol équivalent Trolox. Résultats
Les résultats du test ORAC d’un extrait aqueux de graines d’Abies alba préparé selon l’exemple 1 indiquent un potentiel antioxydant très élevé (données non illustrées). L’extrait de l’invention possède donc des propriétés antioxydantes.
Exemple 3 : Propriétés anti-inflammatoires d’un aqueux extrait de graines d’Abies alba
Principe L’effet protecteur d’un extrait aqueux de graines d’Abies alba vis à vis des UVB est testé sur des épidermes humains reconstitués (RHE), par évaluation de la cytotoxicité des UVB (test colorimétrique MTT) et dosage d’un marqueur de l’inflammation, l’interleukine-1 alpha (IL-la).
Protocole
Le produit à tester à différentes concentrations est déposé en traitement préventif à l’aide d’une micropipette à la surface des épidermes humains reconstitués (RHE) et étalé avec
un petit pinceau stérile. Les épidermes sont alors incubés pendant 24h. Les épidermes sont ensuite exposés aux UVB (excepté les épidermes destinés aux témoins négatifs). Après irradiation, une deuxième application des échantillons et contrôle en traitement curatif est effectuée dans les mêmes conditions que le traitement préventif. L’effet protecteur du produit est déterminé par le ratio entre la concentration de l’interleukine IL-la et le taux de mortalité mesuré par le test MTT.
Les séries suivantes sont mises en œuvre en triplicate : - 1 série témoin négatif absolu (non irradiée), - 1 série témoin négatif absolu (irradiée mais non traitée), - 1 série substance à l'essai (5%), et - 1 série témoin positif (Vit E : 50 μΜ).
Le dosage de l’IL-Ια est réalisé sur les milieux de culture prélevés conformément au protocole décrit dans le coffret de dosage fourni par R&D Systems (Quanîiquine Colorimétrie ELIS A, ref DLA50).
La prolifération cellulaire est évaluée par un test colorimétrique MTT. Le sel jaune de tétrazolium MTT (bromure de 3-(4,5~dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tétrazolium), lorsqu’il est réduit par la succinate déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes actives, forme un produit formazan bleu-violet. Le milieu passe alors du jaune au bleu-violacé. L’intensité de cette coloration est proportionnelle au nombre de cellules vivantes présentes lors du test. L’absorbance est mesurée à 540 nm. Résultats
Les ratios IL-Ια/ΜΊΤ sont présentés dans le Tableau 1,
Tableau 1 : Ratio JL-la/MTT de cellules soumises à différents traitements
Le témoin absolu irradié présente un ratio IL-lo/MTT très important par rapport au témoin non irradié. Ce résultat valide le système réactif. Lorsque les épidermes sont traités avec la substance d’essai (extrait aqueux de graines d’Abies alba), on observe une diminution importante du ratio par rapport au témoin irradié. L’effet protecteur vis-à-vis des UVB est calculé en tenant compte du ratio IL-la/MTT du témoin non irradié. Les résultats sont présentés dans la Figure 3. L’extrait aqueux de graines de sapin expose un effet protecteur particulièrement important de 50%, tandis que le témoin vitamine E connu pour ses propriétés anti-inflammatoires présente un effet protecteur de 41%.
Ainsi l’extrait aqueux de graines d’Abies alba présente un effet apaisant significatif.
Exemple 4 : Effet protecteur d’un extrait aqueux de graines d’Abies alba sur la sénescence des cellules
Principe
Les fîbroblastes humains à faible passage en culture, soumis à un stress dû au peroxyde d’hydrogène à une dose sub-cytotoxique, présentent un phénotype similaire à celui des cellules sénescentes, c’est-à-dire ayant épuisé leur potentiel à se diviser dans les conditions de culture de laboratoire. Ce phénomène est appelé sénescence induite prématurément par stress (SIPS) et se caractérise, en particulier, par une modification de la morphologie des fibroblastes, un arrêt irréversible de la prolifération en phase G1 et une augmentation du nombre de cellules présentant l’activité β-galactosidase associée à la sénescence (AS β-gal). Une baisse de l’activité AS β-gal d’une culture de fibroblastes humains prématurément vieillis ayant été traitée avec le produit à tester peut donc être considérée comme un marqueur de la protection des cellules.
Protocole
Les fîbroblastes humains sont traités avec de l’extrait aqueux de graines de sapin de l’invention pendant 48 heures. Ils sont ensuite soumis au stress par ajout de peroxyde d’hydrogène (H2O2). 72 heures après l’induction du stress, les cellules sont incubées avec la solution de coloration puis les cellules bleues, i.e. les cellules positives pour F activité β-galactosidase associée à la sénescence (AS β-gal), sont dénombrées. Le témoin négatif correspond aux mêmes cellules ne subissant aucun traitement, tandis que le témoin positif de sénescence correspond aux cellules exposées au stress mais non traitées avec l’extrait de l’invention.
La quantité de cellules positives pour l’activité AS β-gal associée à la sénescence (cellules bleues) par rapport au nombre total de cellules représente l’activité du produit. Une quantité élevée de cellules bleues correspond à un nombre important de cellules sénescentes, tandis qu’une faible quantité correspond à peu de cellules sénescentes, et donc à un effet protecteur du produit. Résultats
Les résultats présentés dans la Figure 4 montrent que sans traitement, les cellules soumises au stress entrent de manière importante en sénescence (témoin positif) par rapport aux cellules non soumises au stress (témoin négatif). Traitées avec un extrait de l’invention à une concentration de 0.50%, la sénescence des cellules diminue fortement : environ -62% de cellules positives pour l’activité AS β-gal par rapport au témoin positif. L’extrait de l’invention a donc un effet protecteur significatif de la sénescence sur les cellules prématurément vieillies.
Exemple 5 : Activité dépigmentante d’un extrait aqueux de graines à’Abies alba 1. Test de blanchiment sur des épidermes reconstruits
Principe L’objectif de cette étude est d’évaluer l’activité dépigmentante d’un extrait aqueux de graines $ Abies alba après application topique journalière pendant 4 jours de l’extrait sur des épidermes reconstruits pigmentés (phototype IV) âgés de 11 jours. Après post-incubation pendant 72 heures, le dosage de la mélanine est réalisé dans les tissus afin de mesurer l’inhibition de la synthèse de mélanine.
Protocole
Pendant 4 jours (JH à J14), 25 pL d’extrait de l’invention, de milieu de croissance (contrôle négatif) ou d’acide kojique 1% (contrôle positif) sont déposés à l’aide d’une mieropipette à la surface du stratum comeum d’épidermes reconstruits mélanisés âgés de 11 jours (STERLAB, 0,5 cm2). Les cultures sont incubées à 37°C, 5% CO2 dans une étuve. A la fin de la période de post-incubation (J17), la mélanine est dosée. Pour cela, le produit est éliminé à la surface des tissus et ces derniers sont découpés à l’aide d’un scalpel. Ils sont alors plongés dans une solution de NaOH 0.1 N, dans un bain-marie à 50°C pendant 30 min. La densité optique (DO) à 405 nm est ensuite mesurée avec 200 pL d’extrait. Les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport au témoin non traité (contrôle négatif). Résultats L’extrait aqueux de l’invention présente une inhibition de la mélanisation atteignant 18% à une concentration de 5%. Les résultats sont présentés dans la Figure 5, L’extrait de sapin blanc présente donc des propriétés de dépigmentation non négligeables. 2. Etude de l’activité anti-tyrosinase
Principe
La tyrosinase est une enzyme clé qui catalyse les deux premières étapes de la voie de synthèse de la mélanine. L’activité de cette enzyme peut être déterminée par mesure de l’oxydation de la L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine) en dopachrome, un intermédiaire de synthèse de la mélanine, en utilisant une tyrosinase de champignon. Une inhibition de la production de dopachrome correspond donc à une inhibition de la tyrosinase et à une inhibition de la synthèse de mélanine.
Protocole
Matériel
Tyrosinase from Mushroom > 1000 U/mg (ref Sigma T3824)
Tampon Phosphate de sodium. pH 7.2 (ref Sigma 32048)
Tyrosine (ref Sigma T2900000)
Acide kojique (ref Sigma K3125) Méthode L’extrait est dilué dans du tampon phosphate de sodium pH 7.2 (dilutions finales 1/2.5 à 1/160) puis est incubé avec la tyrosinase (9 U/puits) pendant 5 minutes à 35°C dans des plaques 96 puits. La tyrosine (2 mM) est ensuite ajoutée au mélange et la réaction est suivie par lecture de la DO à 492 nm pendant 5 minutes (apparition du dopachrome) à l'aide d'un spectrophotomètre à lecteur de microplaques (Optima Fluostar, BMG Labîech). Un témoin négatif est réalisé sans addition d'extrait (tampon) et un témoin positif (acide kojique) est également testé,
Le calcul du pourcentage d’inhibition de l'activité tyrosinase par les extraits est effectué en rapportant la DO de l'extrait à la DO du témoin négatif (sans extrait). La dilution de l'extrait qui inhibe 50% de l'activité tyrosinase (ICso) est calculée à partir des équations des courbes dose-réponse. Résultats
Le calcul de la concentration de l’extrait qui inhibe 50% de l’activité tyrosinase est obtenu à partir de l’équation de la courbe présentée dans la Figure 6. Cette équation est : y = 21.0 ln(x) + 126.72. L’extrait de l’invention présente une IC50 pour l’activité tyrosinase de 2.6%, soit une dilution de 1/38.7. L’extrait présente donc une activité anti-tyrosinase et par conséquent une activité inhibitrice de la synthèse de la mélanine.
Claims (10)
- REVENDICATIONS1. Extrait aqueux de graines de sapin blanc Ahies alba, caractérisé en ce qu’il comprend des phénols et des sucres réducteurs.
- 2. Extrait aqueux selon îa revendication 1, dans lequel la teneur en phénols va de 1% à 25%, de préférence de 5% à 20% en poids par rapport au poids total de l’extrait sec, et dans lequel la teneur en sucres réducteurs va de 25% à 50%, de préférence de 30% à 45% en poids par rapport au poids total de l’extrait sec.
- 3» Extrait aqueux selon l’une quelconque des revendications précédentes, susceptible d’être obtenu par broyage des parties destinées à la préparation de l’extrait, de préférence les graines, puis hydrolyse enzymatique.
- 4. Composition comprenant un extrait aqueux selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, en association avec au moins un excipient cosmétiquement, dermatologiquement, dermocosmétiquement, ou nutraceutiquement acceptable.
- 5. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que la teneur en extrait aqueux dans la composition va de 0.01 à 5%, de préférence de 0.05 à 3.5%, 4e préférence de 0.1 à 2%, en poids par rapport au poids total de la composition.
- 6. Composition selon l’une des revendications 4 ou 5, comprenant en outre au moins un autre actif en plus de l’extrait de sapin, choisi parmi la vitamine E, l’acide hyaluronique, le coenzyme Q10, l’arbutine, les polyphénols, les flavonoïdes, l’acide kojique, l’acide phytique, l’extrait de mûrier blanc.
- 7. Composition selon l’une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisée en ce qu’elle est formulée pour être administrée topiquement sur la peau du visage et/ou du corps, de préférence sur la peau du visage et des mains, sous forme de gel, lait, crème, lotion, émulsion ou en ce qu’elle est formulée pour être administrée par voie orale sous forme de comprimés, gélules, capsules, ampoules, sirops, gouttes.
- 8. Actif cosmétique ou derrnocosmétique, principe actif dermatologique ou nutraceutique caractérisé en ce qu’il comprend un extrait seion l’une quelconque des revendications 1 à 3 ou une composition selon l’une quelconque des revendieatiôns.4 à 7.
- 9. Utilisation d’un extrait selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 ou d’une composition selon l’une quelconque des revendications 4 à 7, en tant qu’agent anti-âge, antioxydant et/ou anti-inflammatoire et/ou dépigmentant.
- 10. Méthode de soin non-thérapeutique de la peau pour prévenir et/ou lutter contre le vieillissement, comprenant l’administration d’un extrait tel que défini selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 en tant qu’actif ou principe actif ou d’une composition cosmétique telle que définie selon l’une quelconque des revendications 4 à 7.
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