FR3024448A1 - Procede industriel pour la synthese de composes calixareniques - Google Patents

Abstract

Procédé de fabrication d'un calix-[z]-arène dans lequel : - on approvisionne un calix-[z]-arène avec R1=R2=R3=R4=X1=X2=X3=X4=H, - étape (a) : - on traite ce calix-[z]-arène avec un agent d'alkylation transmettant le reste R4, pour obtenir un mélange réactionnel comportant le calix-[z]-arène monoalkylé avec R1 = R2 = R3 = X1 = X2 = X3 = X4 = H, - on soumet ce mélange réactionnel à une séparation suffisante pour éliminer la plus grande partie de l'agent d'alkylation n'ayant pas réagi ; - étape (b) : on soumet ce mélange réactionnel à une réaction qui substitue chacune des positions X1 = X2 = X3 = H par une amine tertiaire (R5)2N-CH2- en présence d'une amine secondaire (R5)2NH pour former un mélange réactionnel comportant un calix-[z]-arène avec R1 = R2 = R3 = H, X1 = X2 = X3 = -CH2-N(R5)2 , X4 = H ; - étape (c) : - on traite ce mélange réactionnel avec un deuxième agent d'alkylation, - on soumet ce mélange réactionnel à une cyanation pour former un mélange réactionnel comportant un calix-[z]-arène avec R1 = R2 = R3 = H, X1 = X2 = X3 = -CH2-CN, X4 = H ; - on isole le calix-[z]-arène avec R1 = R2 = R3 = H, X1 = X2 = X3 = -CH2-CN, X4 = H ; - étape (d) : on soumet ledit calix-[z]-arène à une hydrolyse basique pour obtenir le calix-[z]-arène cible.

Description

PROCEDE INDUSTRIEL POUR LA SYNTHESE DE COMPOSES CALIXARENIQUES DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION L'invention concerne le domaine de la chimie organique, à savoir la synthèse de composés calixaréniques. Plus particulièrement, elle concerne un nouveau procédé de synthèse de composés calixaréniques qui peut être mis en oeuvre de manière industrielle pour la synthèse à plus grande échelle.

ETAT DE LA TECHNIQUE On connaît, par exemple du document US 2011/0144314, les composés calixaréniques décrits par la formule (I) ci-dessous : X4 (I) où p est 1, 3, 5 ou 6 ; où R1, R2, R3 et R4 peuvent être un atome H ou une chaîne alkyle (linéaire ou branché) de Ci à 012 ; où X1, X2 et X3 peuvent être un groupement -(CH2),- CO2Na (où m est un nombre entier compris entre 0 et 10). Certaines molécules de cette famille de calix-[z]-arènes (où z désigne le nombre d'anneaux benzéniques) forment des micelles bien définies en solution aqueuse dans certaines conditions lorsque par exemple : n = 4, R1, R2, R3 = H, R4 = chaîne heptyle ou supérieure et m = 1. Ces micelles formées à partir de composés calixaréniques anioniques peuvent complexer diverses molécules hydrophobes. De nombreuses publications explorent la formation de micelles par les composés calixaréniques et les éventuelles applications techniques de ce phénomène comme par exemple l'encapsulation d'ADN [Rodik,R.V. et al., « Virus-Sized DNA Nanoparticles for Gene Delivery Based on Micelles of Cationic Calixarenes », Chem. Eur. J. 17, 5526-5538 (2011)]. Ainsi, les demandes de brevet EP 2 307 116 Al et US 2011/0144314 (Centre National de la Recherche Scientifique et Université Claude Bernard de Lyon) décrivent l'utilisation de certains composés calixaréniques de type C4Cn_CO2Na de formule générale (II) comme détergents pour l'extraction, la solubilisation et la stabilisation de protéines membranaires en solution aqueuse. (II) où R est une chaîne alkyle de formule C,1-12,+1 et n un nombre entier entre 1 et 16 représentant le nombre de carbones constituant la chaîne alkyle Les protéines membranaires sont des cibles d'intérêt pour le développement de nouveaux médicaments. L'étude de leur structure, et notamment leur cristallisation, nécessite le maintien temporaire de ces macromolécules amphiphiles dans un système aqueux sans altérer leur structure quaternaire. L'utilisation d'autres calix-[z]-arènes dans ce but est décrite dans WO 2010/116055 (Centre National de la Recherche Scientifique). En comparaison aux détergents commerciaux (voir notamment : R.M.Garavito et S. Ferguson-Miller, « Detergents as Tools in Membrane Bioechmistty », publié dans J.Biol.

Chem. 2001, vol.276, p.32403-32406; voir M. Caffrey, « Membrane Protein Crystallisation », publié dans J.Structural Biology, vol.142 (2003), p.108-132 ; voir G. Privé, « Detergents for the stabilization and crystallization of membrane proteins», publié dans Methods, vol.41, p.388-397 (2007)), les composés calixaréniques permettent de maintenir les protéines membranaires extraites en solution aqueuse dans un état structural proche de leur état natif. Les micelles formées reconstituent autour des protéines un environnement structural similaire à celui de la membrane cellulaire. L'usage des détergents calixaréniques permet la cristallisation des protéines membranaires dans un état natif et l'étude structurale par des techniques de diffraction de rayons X. Cependant, la résolution de structures de protéines membranaires par cristallographie reste un procédé long et fastidieux. Le préalable nécessaire est la disponibilité d'un cristal ; ce travail nécessite souvent de nombreux essais de cristallisation. Il est donc souhaitable de disposer de détergents calixaréniques à bas coût, en plus grande quantité et d'un meilleur niveau de pureté pour fiabiliser les expérimentations.

Actuellement, les procédés de synthèse connus de ces détergents (voir par exemple : K. Suwinska et al., « Trianionic calix[4]arene monoalkyl derivatives : synthesis, solid-state structures and self-assembly properties » , publié dans New J.Chem. vol.32, p.1988-1998 (2008), C.D.Gutsche et al., "Calixarenes. 4. The synthesis, characterization, and properties of the calixarenes from p-tert-butylphenol", J.Am.Chem.Soc, 1981, 103, p.3782-3792 ; C.D.Gutsche. & J.A. Levine, "Calixarenes. 6. Synthesis of a functionalizable calix-[4]-arene in a conformational rigid cone conformation", J.Am.Chem.Soc., 1982, 104, p.2652-2653) impliquent plusieurs étapes inappropriées pour effectuer une production à grande échelle en raison des faibles cinétiques de réaction, des difficultés de mise en solution des intermédiaires ou encore des difficultés de traitement des milieu réactionnels (formation de mousses, démixtion de phases délicates,...). La synthèse fait également intervenir des réactifs couteux et/ou toxiques. Dans l'état de la technique, un des points critiques concerne l'étape d'alkylation (a) du procédé dont le rendement de synthèse est médiocre en raison des difficultés de séparation du produit d'intérêt dans le mélange réactionnel qui contient des molécules de polarité très proches. Si la purification par chromatographie d'un mélange de molécules difficilement séparable est envisageable pour de petites quantités de produit par des techniques de laboratoire, elle représente un facteur de coût très significatif à plus grande échelle. Compte tenu de la demande croissante en composés calixaréniques, et sachant que les techniques de séparation actuellement utilisées pour la préparation de petites quantités peuvent difficilement être transposées à plus grande échelle, il est nécessaire de disposer d'un procédé de préparation moins coûteux de ces molécules calixaréniques avec une bonne pureté.

La présente invention cherche à résoudre ce problème. Elle présente un nouveau procédé adapté pour la production à plus grande échelle (typiquement supérieure à 20 g de produit final) de composés calixaréniques connus à un coût acceptable.

Objet de l'invention Un premier objet de l'invention est un procédé de fabrication d'un calix-[z]-arène (dit « calix-[z]-arène cible ») de structure X3 où : = X2 = X3 = -CH2-CO2X (avec X = H ou Na ou K), X4 = H , R1= R2= R3= H, R4 = alkyl et de préférence un alkyle linéaire en Ci à 024 (et encore plus préférentiellement en 02 à 016), p est un nombre entier compris entre 1 et 5, de préférence impair, et de préférence égal à 1 ou 3, sachant que z est égal à (3 + p), dans lequel procédé : - on approvisionne un calix-[z]-arène dit « initial » avec R1 = R2 = R3 = R4 = H et = X2= X3= X4 = H, - dans une première étape (a) : - on traite ledit calix-[z]-arène initial avec un excès d'un premier agent d'alkylation apte à transmettre le reste R4, en présence d'une faible base qui est de préférence un hydrogénocarbonate d'un élément alcalin, et de préférence NaHCO3, pour obtenir un premier mélange réactionnel (dit « mélange réactionnel de l'étape (a) ») comportant le calix-[4-arène dit « monoalkylé » avec R1 = R2 = R3 = H et X1 = X2 = X3 = X4 = H, et R4 est le reste alkyle introduit par ledit premier agent d'alkylation, - on soumet ledit mélange réactionnel de l'étape (a) à une séparation suffisante pour éliminer la plus grande partie de l'agent d'alkylation n'ayant pas réagi, mais insuffisante pour isoler ledit calix-[z]-arène monoalkylé des autres calix-[z]-arènes présents dans ledit mélange réactionnel de l'étape (a), le résultat de cette séparation étant appelé le « mélange réactionnel de l'étape (a) sommairement purifié » ; - dans une deuxième étape (b), on soumet ledit mélange réactionnel de l'étape (a) sommairement purifié à une réaction (typiquement une réaction de Mannich) apte à substituer chacune des positions X1 = X2 = X3 = H par une amine tertiaire de type (R5)2N-CH2- (où R5 est un groupement alkyle, et de préférence méthyle (plus préféré) ou éthyle), en milieu acide en présence d'un aldéhyde (de préférence formaldéhyde) et d'une amine (de préférence secondaire (R5)2NH (où R5 est un groupement alkyle, et de préférence méthyle (plus préféré) ou éthyle)), pour former un deuxième mélange réactionnel (dit « mélange réactionnel de l'étape (b) ») comportant un calix-[z]-arène avec R1 = R2 = R3 = H et X1 = X2 = X3 = -CH2-N(R5)2 et où R4 est le groupement alkyl introduit à l'étape (a) par ledit premier agent d'alkylation, et X4 = H ; - dans une troisième étape (c) : - on traite ledit mélange réactionnel de l'étape (b) d'abord avec un deuxième agent d'alkylation, de préférence le iodure de méthyle, - puis on soumet ledit mélange réactionnel à une réaction de cyanation pour former un troisième mélange réactionnel (dit « mélange réactionnel de l'étape (c) ») comportant un calix-[z]-arène avec R1 = R2 = R3 = H et X1 = X2 = X3 = -CH2-CN et où R4 est le groupement alkyl introduit à l'étape (a) par ledit agent d'alkylation, et X4 = H ; - on soumet ledit mélange réactionnel de l'étape (c) à une séparation pour isoler le calix-[z]-arène avec R1 = R2 = R3 = H et X1 = X2 = X3 = -CH2-CN et où R4 est le groupement alkyl introduit à l'étape (a) par ledit premier agent d'alkylation, et X4 = H ; - dans une quatrième étape (d) on soumet ledit calix-[z]-arène isolé à l'étape (c) à une hydrolyse basique pour obtenir le calix-[z]-arène cible avec X =H.

Dans une cinquième étape (e), on transforme ledit calix-[z]-arène cible avec X = H en sel carboxylate, qui est soluble dans l'eau : ainsi on peut préparer une solution aqueuse dudit ledit calix-[z]-arène cible susceptible d'être utilisée directement pour l'extraction et solubilisation de protéines membranaires.

Selon un mode de réalisation avantageux, on détermine les quantités de réactifs de ladite amine secondaire de type (R5)2NH et dudit aldéhyde à partir d'un spectre RMN 1H du mélange réactionnel de l'étape (a) sommairement purifié. A l'étape (b) ladite amine secondaire est avantageusement de la diéthylamine, et ledit aldéhyde est avantageusement du formaldéhyde. Dans un autre mode de réalisation avantageux, qui peut être combiné avec les précédents, on utilise à l'étape (b) une quantité d'acide acétique correspondant 8 à 12 équivalents de réactif par position réactive de calix[z]arène pour acidifier le milieu, et une quantité de diméthylamine correspondant à 2 à 4 équivalents de réactif par position réactive de calix[z]arène, et une quantité de formaldéhyde correspondant à 2 à 4 équivalents de réactif par position réactive de calix[z]arène. De manière préférentielle, on utilise à l'étape (a) un excédent dudit premier agent d'alkylation, et de préférence on utilise au moins 1,3 et de préférence au moins 1,4 équivalents dudit premier agent d'alkylation. Dans un autre mode de réalisation avantageux, qui peut être combiné avec les précédents, à l'étape (c) après l'ajout dudit deuxième agent d'alkylation on laisse réagir à une température comprise entre 50°C et 100°C, de préférence entre 65°C et 95°C (en encore plus préférentiellement entre 70°C et 90°C) pendant une durée d'au moins 12 h, de préférence d'au moins 24 h et encore plus préférentiellement d'au moins 36 h. De manière avantageuse on utilise à l'étape (c) une quantité du deuxième agent d'alkylation correspondant à 1,0 à 1,2 équivalents par fonction amine tertiaire, et/ou un cyanure d'un élément alcalin avec une quantité de cyanure correspondant à 1,5 à 2,5 équivalents par fonction amine tertiaire. A l'étape (a) lequel ledit mélange réactionnel sommairement purifié comprend avantageusement moins de 5% molaires, de préférence moins de 2% molaires, et encore plus préférentiellement moins de 0,5% molaires, dudit premier agent d'alkylation.

Le procédé selon l'invention est utilisé avantageusement pour la préparation de calix-[4- arènes cible caractérisés par z = 4, et dans lesquels R4 est un reste alkyle linéaire en C2 à 016 et de préférence en C4 à 016.

Figures La figure 1 montre un spectre RMN 1H (200 MHz) typique dans le CDCI3 à une concentration de 40 mg/mL du mélange récupéré après purification lors de l'étape l'alkylation (a) du H4C4OH par du iododécane, contenant le composé H4C4OH non réagi, les produits alkyles MonoC4C10 et BisC4C10.

La figure 2 montre le spectre RMN 1H (200 MHz) du composé Cyano-C4C10 en solution dans le CDCI3 obtenu avec le procédé de synthèse mis en place sur un mélange de composés lors des étapes (b) et (c). La figure 3 montre le spectre RMN 1H (200 MHz) du produit C4C1O_CO2H en solution dans le CDCI3 après purification sur colonne préparative HPLC C18. La figure 4 montre le chromatogramme du produit 04010_CO2Na après basification de la forme acide carboxylique à pH 8 et lyophilisation de la solution.

Description Nous donnons ici une description générale du procédé selon l'invention en utilisant un exemple très simple, à savoir la préparation des composés calixaréniques de type C4Cn_CO2Na dont la structure correspond à la molécule (II) avec n=1 dans laquelle X1, X2 et X3 sont des groupements -CH2CO2Na, dans laquelle R1, R2 et R3 sont des groupes OH, et dans laquelle R4 est une chaîne alkyle. Dans une deuxième section, nous décrivons la méthodologie pour la caractérisation d'un mélange de produits par RMN 1 H lors de l'étape d'alkylation (a) et l'usage de ce mélange de composés pour simplifier la procédure de synthèse des composés C4Cn_CO2Na. Enfin, nous présenterons un mode opératoire générale pour la synthèse des composés.

Les molécules calixaréniques sont conventionnellement désignées de différentes manières ; l'une des informations principales étant le nombre de cycles phénoliques. Ainsi on parle de calix-[z]-arènes, où z désigne le nombre d'unités phénoliques avec leur pont - CH2-. Nous utilisons ici la nomenclature abrégée C4Cn_CO2Na pour désigner les molécules calixaréniques : le code « C4 » désigne une molécule calixarénique composée de quatre unités phénoliques, le code « Cn » désigne le nombre de carbones n sur la chaîne aliphatique C,1-12,+1 sur l'anneau inférieur et le code CO2Na indique la présence de groupements carboxylate -CH2-0O2 sur la couronne supérieure sous la forme du sel de sodium. 1. Présentation générale du procédé selon l'invention Selon l'invention, la synthèse des détergents calixaréniques est réaliséee selon la séquence réactionnelle décrite ci-dessous à partir de la matière première 1 appelée H4C4OH : Le procédé de synthèse des détergents C4Cn_CO2Na est effectué à partir du composé 1 H4C4OH dont la préparation se fait, de manière connue par l'homme du métier, en 2 étapes (voir C.D. Gutsche et al, "Calixarenes. 18. Syntheses procedures for p-tert- 15 butylcalix[4]arene" , J. Org. Chem., (1986) vol. 51, p. 742-745 ; C.D. Gutsche et al, "Calixarenes 12 : The synthesis of functionalized calixarenes", Tetrahedron, (1986), vol. 42, p. 1633-1640). La synthèse de ce composé 1 est maintenant bien maitrisée à grande échelle (> 300 g) et ne nécessite pas d'étapes de purifications par chromatographie flash mais peut se faire simplement par des procédés de précipitation/cristallisation. 5 : X = H, C4Cn_CO2H 4, Cyano-C4Cn OH OH HO 2) NaCN, 80°C EtOH/H20 OH OH HO (e) 6 : X = Na, C4Cn_CO2Na DMF, 40°C OH OH OH HO 1, H4C4OH (b) 0 OHM ,O OH 01-1 HO H TH F/H20 O HÂH 3, DMAM-C4Cn R 2, MonoC4Cn R = chaîne alkyle (c) 1) DMSO/Mel CN CN (d) KOH, X02C 002X 002x NC (a) RI, NaHCO3 20 Selon l'état de la technique, l'introduction sélective d'une chaîne alkyle sur l'une des fonctions phénols du composé (1) est réalisée avec un excès d'iodure d'alkyle RI en présence de fluorure de césium (voir : L.C. Groenen et al. « Synthesis of monoalkylated calix[4]arenes via direct alkylation." Tetrahedron, vol. 47, p. 8379-8384 (1991) ; C.

Mbemba et al. "Calix[n]arenes as components for the construction of micellar systems: synthesis and self-assembly properties of 5,11,17-Triedimethylamino)methyll-25- monoalkoxy-26,27,28-trihydroxycalix[4]arene derivatives.", J Incl Phenom Macrocycl Chem, vol. 61, p. 29-40 (2008).

Le procédé de la présente invention améliore l'état de la technique : (i) en remplaçant le CsF par de l'hydrogénocarbonate de sodium NaHCO3, bon marché et non toxique, (ii) en diminuant le nombre d'équivalents de l'agent d'alkylation (de manière préférée, un iodoalcane RI) de 10 à 1,5 et (iii) en prolongeant le temps de réaction à 5 jours. Selon l'invention, le réactif iodure d'alkyle peut être remplacé par un autre agent d'alkylation, et en particulier par le bromure d'alkyle correspondant. La demanderesse a constaté que l'utilisation d'un hydrogénocarbonate d'un métal alcalin (préféré : Na, envisageable également : K ou Cs) favorise la formation d'un calixarène monoalkylé (MonoC4Cn) visé au détriment du calixarène bisalkylé (BisC4Cn), alors qu'un carbonate (tel que le Na2CO3) conduit à un taux plus élevé de calixarène bisalkylé. L'étape d'alkylation (étape (a)) est représentée par le schéma réactionnel 1 ci-dessous. Elle conduit à un mélange de produits composé du produit de départ H4C4OH (1) non réagi, et des produits d'alkylation MonoC4Cn et BisC4Cn.

A cette étape, on obtient typiquement un taux de conversion d'environ 90-95% du composé H4C4OH et un rendement de synthèse de 70-90% pour le composé MonoC4Cn et de 5-10% pour le composé BisC4Cn.

Schéma réactionnel 1 : Etape (a) Alkylation du composé (1) avec un iodure d'alkyle RI OH OH OH HO H4C4OH non réagi OH 011-1 OH HO 1, H4C4OH DMF, NaHCO3 RI, 40°C OH OH OH RO 2, MonoC4Cn 7* OR OH OH RO BisC4Cn où R est une chaîne alkyle et n un nombre entier compris entre n = 1 et 16 correspondant au nombre d'atomes de carbone constituant la chaîne aliphatique linéaire R. Cette étape (a), même effectuée dans les conditions améliorées selon l'invention, conduit à un mélange de différentes molécules calixaréniques, comme le procédé selon l'état de la technique. Ces molécules calixaréniques disposent de polarités très proches mais différentes de la polarité de l'agent d'alkylation en excès. En effet, les molécules calixaréniques de ce mélange (H4C4OH, MonoC4Cn (2) et BisC4Cn) présentent en chromatographie sur couche mince (CCM) des rapports frontaux Rf très proches, ce qui complique leur séparation par chromatographie flash. A titre d'exemple, la réaction d'alkylation avec du iodoheptane conduit aux composés calixaréniques H4C4OH, MonoC4C7 et BisC4C7 qui ont respectivement les rapports frontaux 0.505, 0.536 et 0.67 sur CCM avec l'éluant CH2Cl2/Cyclohexane (1:1). L'une des idées clés de la présente invention est de renoncer à isoler la molécule cible (2) du mélange de molécules calixaréniques, mais d'utiliser pour la prochaine étape de la synthèse directement le mélange de molécules calixaréniques issu de l'étape d'alkylation (étape (a), après avoir éliminé le reste de l'agent d'alkylation qui avait été utilisé en excès.

Plus précisément, selon l'invention, on se contente à ce stade d'une séparation sommaire qui ne vise pas à obtenir le composé d'intérêt MonoC4Cn (2) parfaitement pur mais d'éliminer rapidement l'agent d'alkylation sur un gel de silice en éluant avec du cyclohexane puis d'isoler l'intégralité des fractions contenant le produit d'intérêt après élution avec un éluant CH2Cl2/Cyclohexane (1:1), même si ces fractions sont impures et contaminées par le produit de départ H4C4OH (1) non réagi ou bien le produit BisC4Cn. Ce mélange de composés sera séparé avantageusement à un stade plus avancé de la synthèse lorsque les produits formés de ce mélange selon la séquence réactionnelle auront une bien meilleure différence de polarité entre eux.

La détermination de la composition massique du mélange peut être effectuée par une analyse de spectrométrie RMN (Résonance Magnétique Nucléaire) du proton. Ceci sera décrit en plus grand détail ci-dessous.

Ainsi, selon l'invention, on détermine précisément au stade de l'alkylation les proportions molaires des composés constituants le mélange pour adapter en conséquence les quantités de réactifs du procédé de synthèse multi-étapes avec ce mélange au lieu d'un composé pur.

La fonctionnalisation de la partie supérieure de la couronne calixarénique suit la même méthodologie de synthèse que l'état de la technique ayant été développé par Gutsche et ses collaborateurs. L'étape suivante (b) représentée sur le schéma réactionnel 2 ci-dessous est une réaction de Mannich qui consiste à introduire des fonctions dimethylamino methyl (DMAM) sur les positions aromatiques du calix-[4]-arène en para des fonctions phénols. Cette réaction est effectué sur le mélange obtenu à l'étape (a) après l'avoir séparé de l'excès de RI et isolé majoritairement le produit MonoC4Cn.

Schéma réactionnel 2 : Etape (b) Réaction de Mannich sur le mélange obtenu à l'étape (a) après élimination de l'agent d'alkykation Me2N Me2N NMe2 NMe2 t OH OH OH HO DMAM-C4OH Me2N Me2N NMe2 101 OH OH OH 0, R 3, DMAM-MonoC4Cn OH 011-1 OH HO 0 1, H4C4OH HÂH Me2NH CH3CO2H THF 2, MonoC4Cn Me2N^ NMe2 ,O OH OHR R BisC4Cn ,0 OH 01-1 Q DMAM-BisC4Cn Selon l'invention, on détermine préalablement la quantité molaire de positions réactives (i.e. le nombre de carbones en position para des fonctions phénoliques libres non substituées) du mélange obtenu à l'étape (a) afin d'ajuster les quantités de réactifs. Ce calcul est réalisé à partir des proportions molaires du mélange de l'étape (a) calculées grâce à l'analyse RMN 1H et sera expliqué en plus grand détail ci-dessous. A ce stade du procédé, on forme une masse de produit quantitative par rapport aux proportions du mélange engagée lors de la réaction. A titre d'exemple, un mélange contenant 3,3 g de H4C4OH (M = 424.5 g/mol ; 7.73 mmol), 33.2 g de MonoC4C10 (M = 564.8 g/mol ; 58.56 mmol) et 4.96 g de BisC4C10 (M = 705.0 g/mol ; 7.04 mmol) conduira à une masse d'environ 54 g, soit 5.0 g de DMAM-C4OH (M = 652.9 g/mol), 43.1 g de DMAM-MonoC4C10 (M = 819.2 g/mol) et 5.9 g de DMAM-BisC4C10 (M = 819.2 g/mol).

Selon l'invention, étant donné le rendement quantitatif de transformation de chacune des espèces du mélange, le mélange réactionnel obtenu après traitement est engagée directement sans phase de purification à l'étape de cyanation (c) qui est représentée sur le schéma réactionnel 3 ci-de-dessous. Elle intègre deux réactions séparées, effectuées successivement dans le même récipient (approche appelée en anglais « one-pot reaction »). Me2N Me2N Schéma réactionnel 3 : Etape (c) Cyanation du mélange obtenu de l'étape (b) NMe2 NMe2 NC NC. CN CN Me2N 40 OH OH OH HO DMAM-C4OH NMe2 71* OH OH OH 0,R 3, DMAM-MonoC4Cn Me2N NMe2 0 OH OH 0,R DMAM-BisC4Cn 140 OH 01-I OH HO Cyano-C4OH NC CN 71110 OH OH OH 0,R 4, Cyano-MonoC4Cn Cyano-BisC4Cn NC 1) DMSO, Mel 2) NaCN, 80°C Le procédé de cette étape emploie un équivalent d'iodomethane Mel par fonction amine tertiaire Me2NCH2- présentes sur la couronne supérieure du calix-[4]-arène, puis deux équivalents d'ions cyanures par fonction ammonium quaternaire Me3N+CH2- formée in situ dans le milieu réactionnel.

Les présents inventeurs ont trouvé que c'est à ce stade de la synthèse multi-étapes que le mélange réactionnel (Cyano-C4OH, Cyano-MonoC4Cn et Cyano-BisC4Cn) est le plus facile à séparer par des techniques de chromatographie, grâce à la différence de polarité des composés suite à l'introduction des fonctions nitriles sur la couronne supérieure du calixarènes. Selon ce procédé, on peut ainsi isoler efficacement 15-20 g du composé (4) Cyano-MonoC4Cn selon la longueur de la chaîne aliphatique et avec une excellente pureté (>95%) malgré la mise en réaction d'un mélange de composés lors des étapes (b) et (c). Le composé (4) Cyano-MonoC4Cn purifié subit ensuite une réaction d'hydrolyse en milieu basique avec une solution d'ions hydroxydes (NaOH ou du KOH) dont la concentration est typiquement comprise entre 1M et 3M. Cette étape appelée ici étape (d), connue en tant que telle, est représentée par le schéma réactionnel 4 ci-dessous. Schéma réactionnel 4 : Etape (d) Hydrolyse basique du Cyano-MonoC4Cn NC NC CN HO2C CO2H EtoH, reflux KOH/H20 3M 4, Cyano-C4n La purification de l'acide carboxylique (5) C4Cn_CO2H sur colonne HPLC préparative permet d'obtenir un échantillon d'une pureté supérieure ou égale à 97% après concentration des fractions pures et lyophilisation. L'intermédiaire calixarène triacides (5) C4Cn_CO2H correspondant à l'acide libre n'est pas utilisable dans l'état pour des tests d'extraction de protéines membranaires. Sous cette forme, le composé est insoluble dans l'eau à cause des fonctions acide carboxylique qui lui confèrent des propriétés comparables à un acide gras. Pour le rendre soluble, il faut déprotonner les fonctions acide carboxylique de manière à conditionner le composé sous sa forme basique conjuguée (c'est-à-dire de sel carboxylate de Na ou de K) qui est responsable de son caractère détergent et lui permettra de former des micelles en solution aqueuse. Ainsi, la dernière étape du procédé appelée ici étape (e) représentée sur le schéma 5 consiste à transformer l'acide carboxylique 5 C4Cn_CO2H en sel carboxylate de sodium 6 C4Cn_CO2Na puis de lyophiliser la solution ajustée à pH 8. 1.1 OH OH OH O. OH OH OH 0,R 5, C4n_CO2H30 Schéma réactionnel 5 : Etape (e) Transformation de l'acide carboxylique 5 C4Cn CO2H en sel carboxylate de sodium 6 C4Cn CO2Na 71110 OH OH OHR 6, C4n_CO2Na NaO2C Na02C CO2Na EtOH/H20 NaOH 1M HO2C I-102C CO2H 4W OH OH OH 0, 5, C4n_CO2H Le sel carboxylate de sodium 6 C4Cn_CO2Na est soluble dans l'eau jusqu'à 40 % w/v. Le produit lyophilisé est stocké à l'abri de l'humidité et peut être utilisé tel quel pour la préparation de solutions destinées à l'extraction/purification de protéines membranaires ou bien tout autre application en biochimie nécessitant l'usage d'un détergent.

Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre pour la synthèse de composés de type calix-[z]-arènes dont la couronne inférieure comporte un groupe éther (-OR) et trois groupes hydroxyle. Le procédé peut être utilisé pour des calix-[z]-arènes avec z compris entre 4 et 8, mais il donne les meilleures résultats pour z = 4 ; pour des valeurs supérieures (par exemple z = 6) le rendement de la forme monoalkylée diminue et le procédé forme des quantités plus importantes de produits bisalkylés. Après avoir décrit de manière générale le procédé dans son intégralité, nous décrivons par la suite certains aspects critiques. 2. Description détaillée de certains aspects critiques du procédé selon l'invention 2.1 Isolation et caractérisation quantitative du produit monoalkylé (2) MonoC4Cn du mélange issue de l'étape (a) Comme indiqué précédemment, au lieu d'isoler l'intermédiaire (2) MonoC4Cn parfaitement pur du mélange réactionnel issue de l'étape (a) des autres composés calixaréniques, à savoir le produit de départ (1) H4C4OH n'ayant pas réagi et du produit secondaire BisC4Cn résultant d'une double alkylation de la couronne inférieure du calix- [4]-arène, on se contente dans le procédé selon l'invention d'éliminer essentiellement l'excès de l'agent d'alkylation (qui est de préférence un iodoalcane).

En effet, la séparation dudit mélange réactionnel ne peut se faire que par chromatographie flash sur gel de silice et on constate que les composés calixaréniques H4C4OH, Mono-C4Cn et BisC4Cn du mélange ont des polarités très proches d'après les rapports frontaux RF observés sur plaque CCM ; de ce fait, la séparation est très compliquée, surtout en grande quantité. En revanche, l'agent d'alkylation (en l'occurrence RI) dispose d'une polarité bien différente de celle des molécules calixaréniques. A ce stade du procédé, une séparation sommaire et rapide par chromatographie flash sur gel de silice en utilisant un débit élevé mais un faible pouvoir de séparation est suffisante pour éliminer l'agent d'alkylation mais insuffisante pour séparer entre elles les molécules calixaréniques du mélange. Néanmoins, un tel procédé est apte à traiter des quantités importantes de mélange réactionnel et isoler un mélange de produits enrichi par le produit souhaité ; et par conséquent parfaitement compatible avec les restrictions d'une production industrielle de détergents calixaréniques C4Cn_CO2Na étant donné la demande croissante de produit nécessaire pour purifier les protéines membranaires et conduire à leur cristallisation. Selon un mode de réalisation, cette séparation peut être réalisée par chromatographie flash sur gel de silice en utilisant de la silice comme phase stationnaire et un mélange CH2Cl2/Cyclohexane comme solvant.

A titre d'exemple, on peut procéder de la manière suivante : Le brut réactionnel issu de l'étape (a) après traitement (résidu sec) est solubilisé avec le minimum de CH2Cl2 puis adsorbé sur une quantité de silice équivalente à la masse dudit résidu sec (dépôt solide). Le dépôt solide est transféré dans une colonne vide d'une contenance nominale de 120 g et on purifie en une fois avec un dispositif de chromatographie flash automatisée PuriFlash 4100 de marque Interchim. A titre d'exemple, on peut utiliser une colonne Chromabond IR-SI de 800g de silice irrégulière conditionnée avec du cyclohexane pour purifier un brut réactionnel de 50-60 g.

Le dépôt solide est chromatographié à un débit d'élution de 160 mL/min un gradient CH2Cl2/Cyclohexane (0:10 -> 4:6). Chaque fraction est analysée par CCM avec un éluant CH2Cl2/Cyclohexane (1:1) de manière à rassembler toutes les fractions (même impures) contenant le produit calixarénique monoalkylé (2) MonoC4Cn. Dans l'éluant CH2Cl2/Cyclohexane (1:1), le produit présente typiquement une valeur RF qui varie de 0,35 (pour une chaîne alkyle R = méthyle) jusqu'à environ 0,63 (R = hexadécyle). Avantageusement, on utilise un éluant plus polaire pour l'élution de composés à chaîne plus courte de manière à obtenir un RF autour de 0,4-0,5. On obtient après concentration du solvant des fractions rassemblées un solide composé d'un mélange des molécules calixaréniques MonoC4Cn, BisC4Cn et H4C4OH. La masse numérique y de solide sera utilisée dans la partie suivante pour effectuer le calcul des proportions massiques du mélange. 2.2 Analyse du mélange obtenu à l'issue de l'étape d'alkylation (a) par spectroscopie RMN du proton Le mélange obtenu après purification à l'étape d'alkylation (a) est mis en solution dans du CDCI3 (20 mg pour 500 pL de solvant deutéré) puis analysé par spectrométrie RMN 1 H . La figure 1 montre un spectre RMN 1H typique du mélange à partir duquel on peut caractériser précisément les ratios molaires des molécules à partir des intégrations des fonctions phénols des molécules calixaréniques qui vont présenter des déplacements chimiques différents.

Les conformations structurales adoptées par les composés calixaréniques dans le CDCI3 du mélange après purification lors de l'étape l'alkylation du H4C4OH sont représentées ci-dessous. *1 OH OH OH HO H4C4OH OH, OH OHb C'H2'+1 conformation "cone" MonoC4Cn *1 OH OH O. C,H2',1 .O 1-12n+1Cn conformation "cone" conformation "1,3-alternée" conformation "1,2-alternée" BisC4Cn Le composé H4C4OH affiche sur le spectre un singulet à 10.3 ppm correspondant à 4H. Le composé MonoC4Cn adopte exclusivement une conformation cône et affiche sur le spectre 2 singulets à 9.6 et 9.9 ppm correspondant respectivement à 2H et 1H, c'est-à- dire les protons Hb et Ha (voir la figure 1). Enfin, le composé BisC4Cn affiche sur le spectre 3 singulets à 8.1, 8.3 et 9 ppm correspondant tous à 2H mais différentes conformations de la molécule à savoir respectivement les conformations 1,3-alternée, cône et 1,2-alternée. Les proportions pour chacune des conformations peuvent varier suivant la longueur de la chaîne aliphatique R greffée sur le calix-[4]-arène. Ainsi, à partir des intégrations de ces signaux et la masse de mélange y pesée, on peut calculer les masses de chacun des composés dans le mélange ainsi que leurs quantités de matière à l'aide du développement mathématique ci-dessous.

Dans ce qui suit, l'indice 0 fait référence au produit non alkyle H4C4OH, l'indice 1 au produit monoalkylé MonoC4Cn et l'indice 2 au produit bisalkylé BisC4Cn. La notation i signifie « intégration ». Pour déterminer les proportions des composés dans le mélange, on utilise les intégrations des pics citées plus haut sur le spectre RMN 1H. On néglige la présence éventuelle de traces de solvant ; la masse de ces traces est négligeable par rapport à la masse totale de produits calixaréniques. Pour la résolution mathématique, il faut modifier les valeurs d'intégration selon le nombre de protons associés au signal et additionner également les intégrations des conformations correspondants à une même molécule. Pour le composé H4C4OH, l'intégration modifiée io est égale à l'intégration du singulet à 10.3 ppm divisée par 4. Pour le composé MonoC4Cn, l'intégration modifiée il est directement égale à l'intégration du singulet à 9.9 ppm sans modification de la valeur. Pour le composé BisC4Cn, l'intégration modifiée i2 est égale à la somme divisée par 2 des intégrations des singulets situés 9.1, 8.3 et 8.2 ppm.

La méthode de calcul utilisé dépend du nombre de composés calixaréniques récupérés dans le mélange après la purification lors de l'étape d'alkylation. En effet, dans certains cas, il sera possible de séparer lors de la purification par chromatographie flash le composé de bisalkylation BisC4Cn.

Dans le cas d'un mélange de deux composés (dans l'exemple présenté ci-dessous : les composés H4C4OH et MonoC4Cn), on a no/ni= x (équation I), où x est le rapport des intégrations modifiées io/ii et mo-Frni=y (équation II), où y correspond à la masse du mélange isolée.

L'équation (I) peut s'écrire : (mo.M1)/(Mo.m1)=x puis sous la forme mo=(x.m1.M0)/M1 (équation III). En combinant (II) et (III), on peut écrire : m1+Rx.M0)/M1lm1=y (équation IV). A partir de l'équation (IV), on isole et calcule la valeur du terme m1 puis on calcule mo à partir de l'équation (II) et de la valeur m1 calculée. Dans le cas d'un mélange de trois composés (dans l'exemple présenté ci-dessous : les composés H4C4OH, MonoC4Cn et BisC4Cn), on pose les équations suivantes pour calculer le terme mo (pris par défaut dans l'exemple) : no/ni=x (I'), où x est le rapport des intégrations modifiées io/ii no/n2=x' (II'), où x' est le rapport des intégrations modifiées io/i2 mo-Frni-Fm2=y (III'), où y correspond à la masse du mélange isolée. Pour les rapports de quantité de matière, on met au numérateur les mêmes indices de manière à pouvoir calculer par la suite le terme m ayant l'indice des numérateurs (dans l'exemple ici 0). L'équation (I') peut s'écrire : (mo.M1)/(Mo.m1)=x puis sous la forme mi=Mi/(Mo.x).mo (IV'), et l'équation (II') peut s'écrire: (mo.M2)/(Mo.m2)=x' puis sous la forme m2=M2/(Mo.xlmo (V'). En combinant les équations (III'), (IV') et (V'), on peut écrire : mo-F[M1i(Mo.M.mo-F[M2/(Mo.x')].mo=y (VI'). A partir de l'équation (VI'), on isole et calcule la valeur du terme mo. Comme précédemment, on calcule m1 ou m2 puis utilise l'équation (III') pour déterminer le terme manquant. De cette manière, on peut déterminer à la fois les masses des composés présents dans le mélange ainsi que leurs quantités de matière.

Calcul des quantités de réactifs à utiliser lors de la réaction de Mannich à l'étape (b) Lors de la réaction de Mannich, on ajuste en conséquence les quantités des réactifs Me2NH, formaldéhyde et acide acétique selon la composition du mélange H4C4OH, MonoC4Cn et BisC4Cn. Pour se faire, le nombre d'équivalents de réactifs est adapté à la quantité de matière de positions réactives nR sur les molécules calixarènes. Celles-ci correspondent aux positions en para des fonctions phénoliques non substituées. On peut calculer cette quantité de matière de la manière suivante : nR = (4.no)+ (3.n1)+(2.n2) avec no, la quantité de matière de H4C4OH dans le mélange n1, la quantité de matière de MonoC4Cn dans le mélange n2, la quantité de matière de BisC4Cn dans le mélange A partir de ce nombre de moles total de positions réactives nR dans le mélange, on ajoute, de préférence dans l'ordre indiqué, en agitant le milieu réactionnel : - Une quantité de matière d'acide acétique glacial 100% équivalente à 10.nR, soit 10 équivalents de réactif par position réactive de calix-[4]-arène, - Une quantité de matière de diméthylamine à 40% w/v dans l'eau équivalente à 3.nR, soit 3 équivalents de réactif par position réactive de calix-[4]-arène, - Une quantité de matière de formaldéhyde à 35% w/v dans l'eau équivalente à 3.nR, soit 3 équivalents de réactif par position réactive de calix-[4]-arène. Il faut bien prendre en considération la teneur en solution des réactifs Me2NH et HCHO lors du calcul des volumes. La réaction est réalisée sur plusieurs jours à température ambiante dans un milieu inerte pour s'assurer de la complète transformation des positions réactives et l'introduction des fonctions amine tertiaire. Après traitement du milieu réactionnel, il est récupéré une masse quantitative par rapport à la composition du mélange de départ. 2.3 Réaction de cyanation à l'étape (c) et séparation de l'intermédiaire CyanoC4Cn Pour la réalisation de cette étape, on utilise les valeurs de la composition du mélange engagé lors de la réaction de Mannich à l'étape (b) en considérant la transformation quantitative pour chaque composé calixarénique dans le mélange.

Le résidu solide séché issu de l'étape (b) après traitement est mis en solution avec du DMSO à une concentration de 0,125 M (soit 8 mL/mmol de molécules calixarènes). La formation in situ des fonctions ammonium quaternaire est réalisée par l'addition sur une période de 15 minutes d'une quantité de matière d'iodométhane Mel équivalente à nR (soit un équivalent de Mel par fonction amine tertiaire) puis le chauffage à 40°C du milieu réactionnel sous agitation pour entièrement solubiliser le solide. Une fois seulement la dissolution complète du solide, une quantité d'ions cyanures NaCN équivalente à 2.nR est ajouté en une fois au milieu réactionnel. Comme indiqué précédemment, selon un aspect essentiel de l'invention, la séparation en phase normale du mélange de produits calixaréniques par chromatographie flash est la plus efficace lors de l'étape (c) de cyanation. A ce stade, la différence de polarités entre les molécules calixaréniques est meilleure suite à l'introduction des fonctions nitriles polaires. Cette caractéristique est mise à profit pour purifier de manière préparative des lots de 15-20 g du composé (4) Cyano-C4Cn plutôt qu'à n'importe quelle autre étape du procédé. Le système de chromatographie flash automatisée PuriFlash 4100 chez Interchim peut être utilisé une colonne Chromabond IR-SI de 1600g de silice irrégulière conditionnée dans du CH2Cl2 pour purifier un brut réactionnel de 40-50 g. Le dépôt solide est 20 chromatographié à un débit d'élution de 160 mL/min avec un gradient AcOEt/Cyclohexane adapté selon la longueur n de la chaîne aliphatique sur le calix-[4]- arène (n 0:10 -> 35:65 -> 1:1 ; n k10, 0:10 -> 4:6 -> 6:4). Le rendement de la réaction doit être de 45-60%. Le composé (4) Cyano-C4Cn est parfaitement caractérisé par RMN 1H ainsi que spectrométrie de masse par ionisation 25 électrospray et détection en mode positif. Selon le temps de séchage et la puissance du vide appliquée pour sécher le produit pur (4) Cyano-C4Cn, celui-ci peut se retrouver en complexe d'inclusion avec une molécule d'acétonitrile que l'on détecte sur le spectre RMN 1H du composé (4) en solution dans CDCI3 d'après le singulet à 2.1 ppm. 30 2.4 Purification sur colonne HPLC préparative du composé (5) C4Cn CO2H et conditionnement sous forme de sel carboxylate de sodium En comparaison à l'état de la technique, la présente invention établit la purification de l'acide carboxylique (5) C4Cn_CO2H sur une colonne préparative HPLC UPTISPHERE STRATEGY C18-3 d'Interchim (250 mm x 50 mm, granulométrie 10 pM) de phase 35 stationnaire silice greffée C18 à l'aide du système PuriFlash 4100 (Interchim ®) et permet d'obtenir des échantillons d'une pureté supérieure ou égale à 97% après concentration des fractions pures et lyophilisation (voir figure 4). Lors de l'étape (d) après le traitement du milieu réactionnel, on réalise une solution à 50% w/v du résidu dans Me0H qui est purifié en plusieurs runs d'injection avec le couple d'éluants ACN HPLC grade (A) et H2O MilliQ (B) et la méthode ci-dessous : o Gradient d'élution : ^ X % de A pendant 14 minutes ^ X à 100% de A en 1 minute ^ 100% de A pendant 5 minutes ^ 100 à X % de A en 1 minute ^ X % de A pendant 5 minutes n= 1,X= 40;n= 3,X= 63 ;n= 5,X= 68;n= 7,X= 73 ;n= 9,X= 80; n= 10, X = 85; n= 12, X = 92 o Injection 9 mL environ d'une solution à 50% w/v de brut réactionnel sur une valve d'injection avec une boucle de 10 mL o Détection 230 nm o Débit 120 mL/min o Collecteur : fractions de 32 mL, tubes Pour chaque run d'injection, on effectue l'analyse de chaque fraction du pic principal par HPLC sur une colonne analytique Interchim US10C183-250/046 avec la méthode suivante : A : ACN + 0,1% TFA, B : H2O + 0,1% TFA, élution isocratique X% de A ; injection 50pL débit 1 mL/min, colonne thermostaté 25°C, détection 230 nm, « run » de 30 min. Les fractions d'une pureté k 97% d'après l'auto-intégration sont rassemblées puis concentrées pour éliminer le solvant. La suspension restante est lyophilisée et conduit à une poudre fine blanche parfaitement caractérisé par RMN 1H (voir figure 4). Les analyses sont effectuées en solution dans le d6-DMSO pour les composés C4Cn_CO2H ayant une chaîne alkyle n 5 et dans le CDCI3 pour ceux ayant une chaîne alkyle n > 5. Le rendement de la réaction est de 70-85%. 3. Exemple d'un mode opératoire complet du procédé Pour exécuter l'étape (a), on a solubilisé 30 g (70,7 mmol) du composé (1) dans 100 mL de DMF et a ajouté à 40°C sous agitation 6,3 g (soit 1,05 équivalents) de NaHCO3 sous gaz protecteur, puis on a ajouté 1,5 équivalents de l'iodure d'alkyle. On a laissé réagir pendant 5 jours et versé ensuite le mélange dans de l'eau à température ambiante. On a extrait la phase aqueuse avec du CH2Cl2 et on a lavé les phases organiques avec de l'eau puis de la saumure. Les phases organiques sont rassemblées puis séchées sur MgSO4. La suspension est filtrée puis le gâteau lavé avec du CH2Cl2. Le filtrat est concentré à l'évaporateur jusqu'à l'obtention d'un résidu huileux qui peut former une pâte jaune. Pour exécuter l'étape (b), on a solubilisé le résidu obtenu à l'issue de l'étape (a) dans du CH2Cl2 et ajouté de la silice pour chromatographie ; l'élimination de l'agent d'alkylation par chromatographie a été effectuée comme décrit ci-dessus dans la section 2.1. Ensuite on a enregistré un spectre 1H RMN du mélange isolé ; la figure 1 montre un tel spectre pour R = C10H21. A partir de ce spectre, on a calculé les masses de composés calixaréniques présents dans le mélange et leurs quantités de matière comme indiqué ci-dessus dans la section 2.2. On a ensuite calculé les quantités des réactifs pour la réaction comme indiqué ci-dessus dans la section 2.3 puis ajouté l'acide acétique glacial et les autres réactifs comme décrit ci-dessus. On a laissé réagir pendant 5 jours et évaporé le solvant. Puis on a ajouté très lentement une solution de Na2CO3 à 10% (15 mL/mmol de produit) en agitant. On a extrait la phase aqueuse avec du CH2Cl2. Cette phase organique a été séchée puis filtrée et le solvant a été évaporé. Le produit a été gardé à l'abri de l'humidité ou réutilisé tout de suite dans l'étape (c). Pour exécuter l'étape (c), on a ajouté une quantité de DMSO équivalente à 8 mL/mmol de produit et effectué un bullage d'argon dans le milieu réactionnel. On a ajouté la quantité équivalente d'iodométhane, comme décrit ci-dessus dans la section 2.4, on a porté la température à 40°C pour obtenir une solution homogène, puis on a ajouté la solution de NaCN ; la solution s'est décoloré et est devenu jaune-orange. On a porté la température à 80°C et a laissé réagir pendant 2 jours à cette température. Le milieu réactionnel est refroidi puis versé dans une phase aqueuse comportant un volume d'eau d'environ cinq fois le volume de DMSO et un volume de HCI 2N équivalent à environ deux fois l'équivalent de NaCN. Les précautions bien connues de l'homme du métier ont été prises à cause du dégagement de HCN très toxique. La phase aqueuse a été extraite avec du CH2Cl2 et ces phases organiques ont été lavées avec de l'eau puis de la saumure. Les phases organiques rassemblées ont été séchées sur MgSO4 puis filtrées et le solvant a été évaporé ; on a obtenu un solide de couleur marron-brun. Ce solide a été dissout dans du CH2Cl2 puis on a ajouté de la silice et purifié le mélange comme décrit ci-dessus dans la section 2.5 pour obtenir une fraction pure du composé (4). La figure 2 montre le spectre 1H RMN de ce composé. Pour exécuter l'étape (d), on a dissout le composé (4) dans l'éthanol (7 mL/mmol de produit) et ajouté une solution de potasse (3,5 mL/mmol de produit correspondant à 12 équivalents). Le mélange réactionnel a été chauffé pendant 2 à 3 jours à 110°C puis versé dans un mélange de glace et de HCI 1N correspondant à environ 2 équivalents de la potasse. On a agité puis extrait avec du CH2Cl2 ; les phases CH2Cl2 ont été séchées et le solvant a été évaporé. Pour la purification, le solide a été dissout dans du méthanol. La purification a été faite sur une colonne préparative HPLC de type Uptisphere Strategy C18-3 de la société Interchim (250 mm x 50 mm, granulométrie 10 pm) avec le système PURIFLASH 4100 de la société Interchim. On a finalement obtenu une poudre fine blanche (rendement de l'ordre de 70 à 85%) qui a été caractérisée par 1H NMR, spectrométrie de masse et HPLC. La figure 3 montre ce spectre pour le composé appelé C4C1O_CO2H avec R4 = décyle. Cette synthèse a été effectué avec différents chaînes aliphatiques R, et nous indiquons ici les valeurs de Rf des composés C4n_CO2H (composé 5) dans l'éluant méthanol / CH2Cl2 (3 : 97) + 1% acide acétique (v/v) en fonction de la longueur n de la chaîne aliphatique du reste R : n = 1 , Rf = 0,098 ; n = 3 , Rf = 0,105 ; n = 5 , Rf = 0,118 ; n = 7 , Rf = 0,118 ; n = 8 , Rf = 0,138 ; n = 9 , Rf = 0,151 ; n = 10 , Rf = 0,145 ; n = 11 , Rf = 0,151 ; n= 12, Rf = 0,151 ; n= 16, Rf = 0,151. Pour exécuter l'étape (e), on a solubilisé le composé (5) dans de l'éthanol (6 mL/mmol de produit) et neutralisé cette solution avec une solution de NaOH à 1 M jusqu'à un pH de 7. On a évaporé l'éthanol et ajouté de l'eau (environ 6 mL/mmol de produit), puis on a ajouté goutte par goutte ladite solution de NaOH, en contrôlant avec une électrode pH, de manière à ajuster le pH de la solution à 8. La quantité totale de NaOH ajoutée était de l'ordre de 3 à 4 équivalents, cela dépend des composés en fonction de leur chaîne aliphatique R. On a filtré la solution, éliminé l'eau en évaporant plusieurs fois avec de l'éthanol, jusqu'à l'obtention d'un produit sec (poudre de couleur crème) avec un rendement compris entre 90 et 100%. On peut également enlever l'eau par lyophilisation. La pureté du produit a été contrôlée par HPLC (supérieure à 97%). La poudre est soluble dans l'eau (jusqu'à typiquement 40% massiques) et peut être utilisée pour des essais biochimiques. La figure 4 montre le chromatogramme du composé pur appelé C4C1O_CO2Na avec R4 = décyle. On donne ci-dessous les caractéristiques des principaux pics : temps de Pic n° rétention Type largeur aire hauteur . aire [min] [ ] [ ] EB .192, 1.6816 -1 _1 EB 5.

53 LB ..)41') 6 4 LB 4 4 7 PV 8 1 92VV 9 11. VV ' VB 11 PT 12 ' 4 VB 13 4 PB .i114/-1 14 EV 1.0879D 1. 4. 16 8.917

Claims (9)

1. REVENDICATIONS1. Procédé de fabrication d'un calix-[z]-arène (dit « calix-[z]-arène cible ») de structure X3 où : X1 = X2 = X3 = -CH2-CO2X (avec X = H ou Na ou K), X4 = H, R1= R2= R3= H, R4 = alkyl et de préférence un alkyle linéaire en Ci à 024 (et encore plus préférentiellement en 02 à 016), p est un nombre entier compris entre 1 et 5, de préférence impair, et de préférence égal à 1 ou 3, sachant que z est égal à (3 + p), dans lequel procédé : - on approvisionne un calix-[z]-arène dit « initial » avec R1 = R2 = R3 = R4 = H et X1 = X2= X3= X4 = H, - dans une première étape (a) : - on traite ledit calix-[z]-arène initial avec un excès d'un premier agent d'alkylation apte à transmettre le reste R4, en présence d'une faible base qui est de préférence un hydrogénocarbonate d'un élément alcalin, et de préférence NaHCO3, pour obtenir un premier mélange réactionnel (dit « mélange réactionnel de l'étape (a) ») comportant le calix-[4-arène dit « monoalkylé » avec R1 = R2 = R3 = H et X1 = X2 = X3 = X4 = H, et R4 est le reste alkyle introduit par ledit premier agent d'alkylation, - on soumet ledit mélange réactionnel de l'étape (a) à une séparation suffisante pour éliminer la plus grande partie de l'agent d'alkylation n'ayant pas réagi,mais insuffisante pour isoler ledit calix-[z]-arène monoalkylé des autres calix-[z]-arènes présents dans ledit mélange réactionnel de l'étape (a), le résultat de cette séparation étant appelé le « mélange réactionnel de l'étape (a) sommairement purifié » ; - dans une deuxième étape (b), on soumet ledit mélange réactionnel de l'étape (a) sommairement purifié à une réaction apte à substituer chacune des positions X1 = X2 = X3 = H par une amine tertiaire de type (R5)2N-CH2- (où R5 est un groupement alkyle, et de préférence méthyle (plus préféré) ou éthyle), en milieu acide en présence d'un aldéhyde (de préférence formaldéhyde) et d'une amine (de préférence secondaire (R5)2NH (où R5 est un groupement alkyle, et de préférence méthyle (plus préféré) ou éthyle)), pour former un deuxième mélange réactionnel (dit « mélange réactionnel de l'étape (b) ») comportant un calix-[z]- arène avec R1 = R2 = R3 = H et X1 = X2 = X3 = -CH2-N(R5)2 et où R4 est le groupement alkyl introduit à l'étape (a) par ledit premier agent d'alkylation, et X4 =H; - dans une troisième étape (c) : - on traite ledit mélange réactionnel de l'étape (b) d'abord avec un deuxième agent d'alkylation, de préférence le iodure de méthyle, - puis on soumet ledit mélange réactionnel à une réaction de cyanation pour former un troisième mélange réactionnel (dit « mélange réactionnel de l'étape (c) ») comportant un calix-[z]-arène avec R1 = R2 = R3 = H et X1 = X2 = X3 = -CH2-CN et où R4 est le groupement alkyl introduit à l'étape (a) par ledit agent d'alkylation, et X4 = H ; - on soumet ledit mélange réactionnel de l'étape (c) à une séparation pour isoler le calix-[z]-arène avec R1 = R2 = R3 = H et X1 = X2 = X3 = -CH2-CN et où R4 est le groupement alkyl introduit à l'étape (a) par ledit premier agent d'alkylation, et X4 = H ; - dans une quatrième étape (d) on soumet ledit calix-[z]-arène isolé à l'étape (c) à une hydrolyse basique pour obtenir le calix-[z]-arène cible avec X =H. 30
2. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on transforme dans une cinquième étape (e) ledit calix-[z]-arène cible avec X =H en sel carboxylate.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel on détermine les quantités de 35 réactifs de ladite amine secondaire de type (R5)2NH et dudit aldéhyde à partir d'un spectre RMN 1H du mélange réactionnel de l'étape (a) sommairement purifié.
4. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel à l'étape (b) ladite amine secondaire est de la diéthylamine, et ledit aldéhyde est du formaldéhyde.
5. 5. Procédé selon la revendication 4 dépendante de la revendication 3, dans lequel on utilise à l'étape (b) - une quantité d'acide acétique correspondant 8 à 12 équivalents de réactif par position réactive de calix[z]arène pour acidifier le milieu, et - une quantité de diméthylamine correspondant à 2 à 4 équivalents de réactif par position réactive de calix[z]arène, et - une quantité de formaldéhyde correspondant à 2 à 4 équivalents de réactif par position réactive de calix[z]arène.
6. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel on utilise à l'étape (a) un excédent dudit premier agent d'alkylation, et de préférence on utilise au moins 1,3 et de préférence au moins 1,4 équivalents dudit premier agent d'alkylation.
7. 7 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel à l'étape (c) après l'ajout dudit deuxième agent d'alkylation on laisse réagir à une température comprise entre 50°C et 100°C, de préférence entre 65°C et 95°C (en encore plus préférentiellement entre 70°C et 90°C) pendant une durée d'au moins 12 h, de préférence d'au moins 24 h et encore plus préférentiellement d'au moins 36 h.
8. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel on utilise à l'étape (c) une quantité du deuxième agent d'alkylation correspondant à 1,0 à 1,2 équivalents par fonction amine tertiaire.
9. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel on utilise à l'étape (c) un cyanure d'un élément alcalin avec une quantité de cyanure correspondant à 1,5 à 2,5 équivalents par fonction amine tertiaire.10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel ledit mélange réactionnel de l'étape (a) sommairement purifié comprend moins de 5% molaires, de préférence moins de 2% molaires, et encore plus préférentiellement moins de 0,5% molaires, dudit premier agent d'alkylation. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 dans lequel le calix-[4- arène cible est caractérisé par z = 4, et R4 est un reste alkyle linéaire en 02 à 016 et de préférence en C4 à 016.