FR3020069A1 - Procede et milieu liquide de transport et conservation de bacteries - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un milieu liquide et un procédé permettant le transport et la conservation de prélèvements contenant des bactéries anaérobies et/ou aérobies en air ambiant apte à préserver la viabilité des dites bactéries en vue de leur culture et isolement ultérieur.
Description
Procédé et milieu liquide de transport et conservation de bactéries. La présente invention concerne un procédé de transport et conservation d'échantillon de bactéries pouvant être des bactéries anaérobies et/ou aérobies, notamment d'échantillon de prélèvements cliniques contenant des bactéries anaérobies, permettant la préservation de la bactérie en vue de sa culture et/ou isolement ultérieure dans le cadre d'un test de détection et quantification desdites bactéries dans un laboratoire d'analyse biologique. La présente invention concerne plus particulièrement une composition de milieu de transport et conservation utile pour ce procédé. Plus particulièrement, la présente invention concerne un milieu de transport et/ou de conservation en conditions aérobies au froid ou à température ambiante qui doit préserver les bactéries anaérobies strictes après au moins 48h, de préférence au moins 72h, voire de préférence encore au moins 7 jours dans ledit milieu de transport et conservation pour permettre l'isolement et la détection voire la culture ultérieure de bactéries anaérobies strictes pour lesquelles l'oxygène est toxique et qui doivent être transportées ou conservées au froid dans un milieu dépourvu d'oxygène. On ne peut pas conserver un échantillon bactérien dans un milieu de culture de bactérie car dans un tel milieu en l'absence de conditions de culture, notamment à température appropriée en général supérieur à la température ambiante, les bactéries sont détruites par le milieu de culture. C'est pourquoi, dans le cas où l'on veut transporter les prélèvements bactériens destinés à une inoculation en vue de rechercher les bactéries anaérobies strictes éventuelles qu'il contient, pour une chance d'isolement optimale, on est obligé de faire deux échantillonnages, un pour les bactéries aérobies et un autre pour les bactéries anaérobies strictes. En effet, pour le cas des bactéries aérobies, on utilise généralement un milieu de transport liquide à base de tampon Phosphate ou glycérophosphate et de sels de sodium et calcium. On connait, en particulier, les milieux AMIES ou STUART liquides dédiés au transport de bactéries GRAM- en assurant la viabilité pendant au moins 48h à température ambiante ou de préférence à 4-8°C et compatible avec une culture ultérieure de bactéries aérobies. En revanche pour les bactéries anaérobies, ces milieux ne sont compatibles qu'avec une détection par analyse de biologie moléculaire (ADN) car ne protègent pas de l'effet de l'oxygène. Pour être efficaces pour le transport des bactéries anaérobies, ils doivent contenir de l'agar permettant aux bactéries anaérobies d'être protégées de l'oxygène. Ainsi pour les bactéries anaérobies strictes, on utilise un milieu solide gélosé, notamment à base d'Agar contenant un sel de phosphate et des sels sodium et calcium dont l'intérêt supposé est d'avoir un effet tampon qui évite les variations de pH. Ce milieu solide dans lequel on dépose (on « pique ») le prélèvement bactérien permet de soustraire les bactéries anaérobies présentes à l'effet de l'oxygène. On connait en particulier le milieu CAIRE BLAIR ou Amies gélosé avec ou sans charbon. Ces milieux de transport de bactéries anaérobies sont relativement coûteux et donc finalement pas utilisés de façon systématique. Après transport, les échantillons bactériens sont inoculés dans les milieux de cultures en conditions adaptées à la culture des bactéries anaérobies.
Pour le transport et la conservation au froid, le problème est similaire, que cette conservation soit faite à température ambiante de 0 à 30°C, plus généralement à 20°C +/- 5°C, ou refroidi et isolé au froid de +4°C à +8°C, voire congelé à -20°C à -80°C qui sont les températures usuelles de conservation permettant la préservation des bactéries aérobies et anaérobies.
Plus particulièrement, la présente invention concerne le transport et la conservation de bactéries dont la croissance est sensible à la tension en oxygène, notamment des bactéries qui tolèrent mal des tensions élevées d'oxygène et pour lesquelles une conservation optimale de ladite bactérie requière une atmosphère d'incubation à teneur en oxygène relativement réduite par rapport à la teneur en oxygène de l'air voire des bactéries anaérobies strictes pour lesquelles l'oxygène est toxique et qui doivent être cultivées en absence totale d'oxygène ou ne tolérant que de faibles concentrations d'oxygène. Il convient en effet de noter que certaines bactéries considérées comme anaérobie strictes peuvent parfois tolérer de faibles concentrations en oxygène. On distingue donc parmi les bactéries sensibles à l'oxygène : - les bactéries microaérophiles c'est-à-dire qu'elles ne sont pas capables de cultiver sous une atmosphère comprenant la concentration d'oxygène ambiante qui est de environ 21%, notamment entre 1% et 20%, le plus communément à environ 2-2,5%, et - les bactéries anaérobies strictes c'est-à-dire qu'elles ne sont pas capables de cultiver en présence d'oxygène ou dans des concentrations inférieures aux concentrations de microaérophilie, notamment strictement inférieure à 1%, le plus communément inférieure à 0.1%, idéalement 0%. Pour cultiver les bactéries anaérobies strictes, il faut soit les cultiver dans des étuves ne comportant pas d'oxygène, soit dans des tubes qui ont été désoxygénés et elles ne poussent alors qu'au fond du tube. Parmi les bactéries anaérobies strictes, on cite plus particulièrement les bactéries extracellulaires, c'est à dire des bactéries qui qui ne peuvent vivre qu'à l'extérieur de cellules. Parmi les bactéries cultivables en atmosphère microaérophile, on 30 distingue plus particulièrement, les bactéries intracellulaires, mais aussi des bactéries extracellulaires.
On entend ici par «bactérie intracellulaire», une bactérie qui a la capacité de se multiplier au sein d'une cellule hôte. Les bactéries intracellulaires, ayant la faculté de croître dans certaines conditions dans des milieux acellulaires, sont dénommées «bactéries intracellulaires facultatives». On entend ici par «bactérie intracellulaire facultative», une bactérie qui a la capacité de se multiplier au sein d'une cellule hôte et en milieu acellulaire. On entend ici par «bactérie extracellulaire», une bactérie qui n'a pas la capacité de se multiplier au sein d'une cellule hôte et se cultive exclusivement en milieu acellulaire. Plus particulièrement, la présente invention concerne la conservation de bactéries anaérobies strictes et des bactéries microaérophiles. 15 On entend ici par «atmosphère microaérophile», de l'air appauvri en oxygène avec une proportion molaire en oxygène inférieure à 10%, de préférence 5%, de préférence encore inférieure à 2,5%. Pour les bactéries anaérobies strictes, la teneur en oxygène doit être proche de 0%, notamment inférieure à 0.1%, comme mentionné ci-dessus, la 20 tolérance à de très faibles quantités d'oxygène étant variable selon les espèces de bactéries anaérobies. Le but de la présente invention est de proposer un nouveau milieu de transport et/ou de conservation liquide qui permette de préserver les bactéries, y compris les bactéries anaérobies strictes en 25 vue de permettre de les cultiver et isoler ultérieurement aussi bien les bactéries aérobies que les bactéries anaérobies, et ce après un transport ou conservation en conditions aérobie à température ambiante ou au froid, soit à une tension en oxygène qui est celle de l'air ambiant pendant au moins 48h, de préférence au moins 72h, voire 30 7 jours.
Les inventeurs ont découvert de façon fortuite que le mélange de plusieurs composés minéraux et de substances réductrices à effet antioxydant, et notamment l'ajout de composé anti-oxydant dans un milieu liquide de transport de bactéries standard, permettait de préserver au froid ou à température ambiante des bactéries anaérobies strictes et de les cultiver et isoler après transport en conditions aérobies, soit à un taux d'oxygène d'environ 21%. La présente invention fournit donc un procédé de transport de prélèvements contenant des bactéries anaérobies strictes sous forme d'un milieu liquide préservant la viabilité et la possibilité de culture de ces bactéries anaérobies strictes après un transport sous atmosphère d'oxygène et ce même à température ambiante. Les inventeurs formulent l'hypothèse non encore totalement élucidée et démontrée que l'effet du mélange de tous ces composés 15 pourrait provenir d'une réaction avec les radicaux libres oxygénés toxiques ayant un effet inhibiteur de la toxicité desdits radicaux à l'encontre de la croissance de ladite bactérie. Ces radicaux résultant de l'action de l'oxygène sur des substances issues des seraient responsables des difficultés de conservation en présence d'oxygène et zo de culture ultérieure. Plus particulièrement, les inventeurs ont découvert le mélange de tous ces composés confère un effet tampon au regard de la teneur en oxygène pour les bactéries anaérobies strictes. Les inventeurs ont en effet testé plusieurs combinaisons de 25 différentes molécules à différentes concentrations dont certaines présentant une activité antioxydante et ont découvert que certains composés mélangés entre eux à certaines concentrations autorisaient le transport en milieu liquide en atmosphère aérobie (air ambiant) des dites bactéries. 30 Plus précisément, la présente invention fournit un procédé de transport et/ou conservation d'échantillons de bactéries capable de préserver la viabilité de bactéries anaérobies, pendant au moins 48h, de préférence au moins 72h, voire 7 jours, à température froide ou ambiante notamment de -80°C à +30°C, de préférence à température ambiante de 4°C à 20°C, caractérisé en ce que l'on conditionne ledit échantillon de bactéries dans un récipient contenant un milieu de transport et conservation liquide, sous atmosphère contenant de l'oxygène, ledit milieu de transport et conservation étant tamponné à PH de 7 à 7,5, comprenant au moins dans de l'eau distillée : - une source de phosphore, et - au moins un sel de métal alcalin ou alcalino-terreux de K, Mg, Na, Ca, et - au moins un composé anti-oxydant choisi parmi l'acide ascorbique, le glutathion, et l'acide urique, et - une substance tampon régulateur de pH.
Plus particulièrement, ledit milieu de transport et conservation tamponné à PH de 7 à 7.5, comprend au moins : - un sel de phosphate, et - au moins un sel de chlorure de chacun des métaux K, Mg, Na, Ca, et - au moins un composé anti-oxydant choisi parmi l'acide ascorbique, le glutathion, et l'acide urique, à une concentration d'au moins 1g/L, et - une substance tampon régulateur de pH à PH de 7-7.5 qui est l'hydroxyde de potassium (KOH).
Plus particulièrement encore, ledit composé antioxydant est mis en oeuvre à une concentration de 1 pg/ml à 2 mg/ml, ou concentration molaire de 10-6 à 10-2 M, de préférence au moins 100 pg/ml ou au moins 10-5 M.
De préférence, ledit composé antioxydant comprend au moins l'acide ascorbique, de préférence à une concentration d'au moins 1g/I. Plus particulièrement encore, la composition du milieu de transport et conservation comprend : - chlorure de sodium (NaCL) - chlorure de potassium (KCI) - chlorure de calcium (CaCl2) - chlorure de magnésium (MgCl2) - phosphate monopotassique (KH2PO4) : - phosphate de sodium (Na2HPO4) - acide ascorbique (C6H806) - glutathion (C10H17N3035) - acide urique (C5H4N403) - hydroxyde de potassium (KOH) - eau distillée qsp 3g/L 0.2g/L 0.1g/L 0.1g/L 0.2g/L 1.15g/L 1g/L 0.1g/L 0.1g/L 0.3 - 0.6 g/L 1 litre De préférence, ledit milieu de transport et conservation liquide comprend en outre un indicateur coloré d'oxydoréduction apte à changer visiblement l'état du milieu, notamment sa couleur, dans le cas où celui-ci aurait perdu sa capacité anti-oxydante, de préférence la résazurine à une concentration d'au moins 0,0015g/L. Cet indicateur permet de vérifier l'absence d'oxydation préalable des antioxydants dans ledit milieu pouvant affecter la viabilité de bactéries anaérobies et le rendrait donc impropre à une utilisation. De préférence encore, ledit milieu liquide est mélangé au dit 25 échantillon contenant des bactéries à raison d'une proportion d'au moins 2 volumes de dit milieu pour 1 volume de dit échantillon de bactéries contenant un nombre de bactéries de 1 à 1015 cfu/mL, notamment de 102 à 1010 cfu/mL. Avantageusement encore, ledit échantillon de bactéries est un échantillon de prélèvement biologique clinique. Plus particulièrement encore, ledit échantillon de bactéries est un échantillon de prélèvement biologique clinique de fluide biologique tel que urine, sang ou sécrétion telle que salives, selles, et autres sécrétions corporelles de muqueuses ou autres organes corporels, pus, collections et épanchements divers, et biopsies, ledit prélèvement étant éventuellement supporté par un matériel pour réaliser le prélèvement d'un échantillon tel qu'un écouvillon en coton ou fibre synthétique. Plus particulièrement encore, ledit échantillon bactérien comprend ou peut comprendre une bactérie extracellulaire anaérobie, notamment les bactéries anaérobies du tube digestif, qui normalement ne se transportent que dans des milieux de transport spéciaux pour bactéries anaérobies, les dites bactéries anaérobies strictes étant choisies parmi les bactéries appartenant aux genres Ciostridium, Peptostreptococcus, Fil7egoldia, Anaerococcus, Peptoniphilus, Veifionefia, Lactobacillus, Actinomyces, Ciostridium, Bacteroides, Firmicutes, Porphyromonas, Prevotella, Fusobacterium, Atopobiurn, Ruminococcus, Solobacteriurn, Acidarninococcus, Aiistipes, Arnazonia, Anaerosafibacter, Anaerococcus, Barnesiefia, Bifidobacterium, Blautia, Colfinsella, Dielarn, Flavonifractot, GernefiaGodonibacter, Guyana, Hoidemania, Odoribacter, Parabacteroides, Parvimonas, Prevotella, Senegalrnassilfia, Tisssierella, Turicibacter, Veifionefia. Plus particulièrement, on cite les bactéries anaérobies strictes suivantes : Acidaminococcus intestini, Aiistipes finegoldfi, Aiistipes indistinctus, Aiistipes putredinis, Aiistipes shahii, Arnazonia rnassifiensis, Anaerococcus vaginafis, Anaerosafibacter bizertensis, Anaerosafibacter rnassifiensis, Atopobiurn vaginae, Bacteroides caccae, Bacteroides fragilis, Bacteroides intestnafis, Bacteroides massiliensis, Bacteroides nordit Bacteroides ovatus, Bacteroides stercoris, Bacteroides thetaiotaornicron, Bacteroides timonensis, Bacteroides uniformis, Bacteroides vulgatus, Barnesiella intestinihorninis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulaturn, Bifidobacterium longurn, Bifidobacterium pseudocatenulaturn, Blautia coccoides, Clostidiurn butyricum, Clostridiurn arnazonitirnonense, CNostridium arnylolyticurn, Clostridiurn anorexicamassiliensis, C/ostridiuet anorexicus, Clostridiurn baratii, Clostridiurn bartlettit Clostridiurn biferrnentans, Cffostridium boîteae, Cîostridiuur butyricum, Clostridiurn clostridioforroe, Clostridiuen cochiearium, Clostridiurn difficile, Clostridiurn diolis, Clostridiurn glycolicurn, CNostridiurn hathewayi, Clostridiurn jeddamassiliensis, Clostridiurn lituseburense, Clostridiurn paraputrificum, Clostridiurn perfringens, Clostridiurn ramosum, Clostridiurn rubfinfantis, Clostridiurn sartagoforme, Clostridiurn scinderas, Clostridiurn sordellii, Clostridiurn sporogenes, Clostridiurn subterminale, Clostridiurn syrnbiosurn, Clostridiurn tertium, Collinsella aerofaciens, Collinsella rnassilioarnazoniensis, Collinsella tanakaei, Dielma fastidiosa, Finegoldia magna, Flavonifractor plautit Fusobacterium necrophorum, Finegoldia magna, Gemella morbillorum, Gordonibacter parnelaeae, Guyana massiliensis, Hofdernania rnassiliensis, Odoribacter splanchnicus, Parabacteroides distasonis, Parabacteroides johnsonii, Parabacteroides johnsonii, Parabacteroides merdae, Parvirnonas rnicra, Prevotella buccalis, Prevotella nigrescens, Ruminococcus gnavus Senegalernassilia anaerobia, Solobacteriurn moret Tissierella praeacuta, Turicibacter sanguil7iS, Veillonella dispar, Veillonella parvula. Plus particulièrement encore, ledit échantillon bactérien 30 comprend ou peut comprendre une bactérie choisie parmi Clostridiurn tertium, CNostridiurn butyricum, Clostridiurn ramosum, CNostridium perfringens, Clostridiurn sordelli et Clostridiurn jeddarnassiliensis.
On cite également des bactéries aérobies qui supportent l'absence d'oxygène pour leur croissance dénommées « aéroanaeobies », notamment les bactéries des genres : Actinomyces, Aerococcus, Aneurinibacillus, Bacillus, Cedecea, Citrobacter, Corynebacterium, Eggerthella, Eikenella, Enterobacter, Escherichia, Eubacteriurn, Fackiamia, Granulicatella, Haemophi/us, Hafnia, Lactobacillus, Leuconostoc, Lysinibacillus, Pediococcus, Providencia, Serratia, Staphylococcus, Streptococcus. Plus particulièrement les bactéries aéro-anaérobies, Actinomyces, Actinomyces urogenitalis, Aerococcus viridans, Aneurinibacillus rnigulanus, Bacillus cereus, Bacillus arnyloliquefaciens, Bacillus aquirnaris sp.nov, Bacillus arsenicus, Bacillus badins, Bacillus bataviensis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus clausli, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus flexus, Bacillus koreensis, Bacillus lentus, Bacillus liqueniforrnis, Bacillus massi/ioamazoniensis, Bacillus megaterium, Bacillus oleronius, Bacillus purnilus, Bacillus rubiinfantis, Bacillus siralis, Bacillus subtilis, Bacillus therrnoarnylovorans, Bacillus vallisrnortis, Cedecea lapagei, Cedecea neteri, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Citrobacter sed/akii, Corynebacterium aferrnentans, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium aurimucosum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium minutissirnurn, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Corynebacterium reamassiliensis, Corynebacterium suicordis, Corynebacterium tuberculostearicurn, Corynebacterium ureicelerivorans, Eggerthella /enta, Eikenella corroderas, Enterobacter cloacae, Enterococcus aviurn, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus cecorum, Enterococcus dispar, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcous gallinarurn, Enterococcus hirae, Enterococcus rnalodoratus, Enterococcus phoeniculicola, Enterococcus pseudoaviurn, Enterococcus raffinosus, Escherichia coli, Eubacteriurn lirnosurn, Eubacteriurn tenue, Facklarnia horninis, Granulicatella elegans, Haemophilus parainfluenzae, Hafnia a/vei, Lactobacillus agilis, Lactobacillus ferrnenturn, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kafixensis, Lactobacillus rnucosae, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarurn, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus sakei, Lactococcus garvieae, Leuconostoc lactis, Lysinibacillus boronitolerans, Lysinibacillus fusiforrnis, Lysinibacillus meyeri, Lysinibacillus sphaericus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Peptoniphilus asaccharolyticus, Peptoniphilus haret Peptoniphilus senegalensis, Providencia heimbachae, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Staphylococcus capitis, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus faeca fis, Staphylococcus haemoiyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus pasteurt Staphylococcus pettenkoferi, Staphylococcus sirnulans, Staphylococcus warneri, Streptococcus cristatus, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus eqaivus, Streptococcus gallolyticus, Streptococcus gordonii, Streptococcus lutetiensis, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis, Streptococcus salivai-lus, Streptococcus sanguinis. Le milieu de transport et conservation est universel en ce sens qu'il peut aussi préserver les bactéries microaérophiles ou aérobies strictes ou aéro-anaérobies, ledit échantillon bactérien peut donc comprendre aussi des bactéries microaérophiles ou aérobies. On cite notamment, plus particulièrement encore, ledit échantillon bactérien comprend ou peut comprendre une bactérie microaérophile intracellulaire apte à être cultivée dans un dit milieu de culture acellulaire, sous atmosphère d'incubation microaérophile avec une proportion molaire en oxygène de pas plus de 5%, de préférence pas plus de 2.5% dans l'atmosphère d'incubation, en l'absence de dit composé antioxydant. Plus particulièrement encore, ladite bactérie est choisie parmi les bactéries microaérophiles intracellulaires facultatives choisies parmi les bactéries des genres Bartonella, Rickettsia, de préférence R. conorii et R. africae, Coxiella, de préférence Coxiella burnetit Tropheryma, de préférence Tropheryma whipplet mycobactéries, de préférence Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium /eprae et Mycobacterium ulcerans et Orientia spp., de préférence Orientia tsutsugamushi, et Propionibacteriunr notamment Propionibacteriurn acnes et Propionibacteriurn avidurn.
On cite également, plus particulièrement, les bactéries aérobies des genres Acinetobacter, Brevibacteriurn, Gracilibacillus,Halobacillus, Kocuria, Micrococcus, Neisseria, Oceanobacillus, Paenibaci//us, Pseudornona, Roseomonas, Rothia, Virgibacillus et Weisse//a. Plus particulièrement encore, on cite les bactéries aérobies suivantes : Acinetobacter /woffii, Acinetobacter radioresistens, Brevibacteriurn casei, Brevibacteriurn luteolum, Brevibacteriurn ra venspurgense, Gracilibacillus dipsosauri, Halobacillus trueperi, Kocuria rhizophila, Micrococcus luteus, Neisseria elongata, Neisseria flavescens, Neisseria maccacae, Neisseria mucosa, Oceanobacillus picturae, oceanobacillus sojae, Paenibaci//us barengo/tzii, Paenibaci//us lactis, Paenibaci//us thiarninolyticus, Paenibaci//us timonensis, Propionibacteriurn aches, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas oryzihabitans, Pseudomonas saudiphocaensis, Roseomonas mucosa, Rothia aeria, Rothia dentocariosa, Virgibacillus halodenitrificans, Virgibacillus rnassiliensis, Virgibacillus proornii, Virgibacillus senegalensis, Weisse//a cibaria, Weisse//a cibaria, Weisse//a cibaria. Plus particulièrement encore, on effectue le transport d'un prélèvement pouvant contenir un échantillon bactérien dans un dit milieu de transport et conservation, à température ambiante et, après transport, on conserve en stockage ledit prélèvement au froid à +4°C à +8°C ou congelé à -20°C à -80°C, sous une atmosphère d'air ambiant. La présente invention fournit aussi un récipient contenant un milieu liquide de transport et conservation apte à préserver la viabilité de bactéries aérobies et/ou bactéries anaérobies utile dans un procédé tel que défini ci-dessus, sous atmosphère contenant de l'oxygène, ledit milieu de transport et conservation étant tamponné à PH de 7 à 7,5, comprenant au moins dans de l'eau distillée : - une source de phosphore, et - au moins un sel de métal choisi parmi K, Mg, Na et Ca, et - au moins un composé anti-oxydant choisi parmi l'acide ascorbique, le glutathion, et l'acide urique, et - une substance tampon régulateur de pH. Le récipient peut être par exemple un tube ou un flacon. Plus particulièrement encore, ledit récipient contient en outre dans ledit milieu liquide, un prélèvement clinique pouvant contenir un dit échantillon bactérien et le cas échéant un matériel de collecte du dit prélèvement clinique tel qu'un écouvillon. La présente invention a également pour objet un procédé de fabrication d'un récipient selon l'invention contenant un dit milieu liquide de transport et conservation de bactéries comprenant les étapes successives suivantes dans lesquelles : 1) on chauffe dans un autoclave dans des conditions de température pour le stériliser, de préférence à une température supérieure à 121°C pendant au moins 20 mn, ledit récipient contenant un dit milieu de transport et conservation liquide incomplet ne contenant pas lesdits composés antioxydants, sous atmosphère d'air ambiant, et 2) on refroidit ledit milieu de transport et conservation incomplet, à température ambiante et on y ajoute lesdits composés anti oxydants préalablement filtrés à travers un filtre qui retient les microorganismes tels que les bactéries, notamment avec un filtre qui retient les éléments de plus de 0.2pm voire de plus de 0,1pm (c'est à dire un filtre avec des pores inférieurs à 0,2 pm, taille des plus petites bactéries). A l'étape 1), on exclut lesdits composés anti-oxydants car ceux-ci sont susceptibles d'être dégradés dans les conditions de stérilisation dans ledit autoclave. Et, à l'étape 2) on stérile les lesdits composés anti-oxydant en solution en les filtrant. Selon l'invention, le prélèvement clinique est immergé dans le milieu de transport et conservation, puis conservé en vue d'une détection de bactérie anaérobie, en présence d'une proportion molaire d'oxygène inférieure ou égale à celle de l'air. La préservation de ces bactéries est faite à température ambiante ou à +4-8°C pendant une durée de 48h ou jusqu'à 72h voire plus de 1 semaine à -20°C ou -80°C avant inoculation en conditions de culture des bactéries anaérobies pour la réalisation d'un dit test de détection.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont présentés dans la description détaillée des exemples qui suivent. Exemple 1 : Préparation d'un milieu liquide de transport et conservation de bactéries. La fabrication du milieu doit être faire selon la séquence suivante On mélange les composés suivants Chlorure de Sodium (NaCL) 3g Chlorure de Potassium (KCI) 0.2g Chlorure de Calcium (CaCl2) 0.1g Chlorure de Magnesium chloride (MgCl2) : 0.1g Phosphate monopotassique (KH2PO4) 0.2g Disodium phosphate (Na2HPO4) 1.15g Hydroxyde de potassium (KOH) 0.45 g/L Réazurine 0.0015 g/L Eau distillée qsp 1 L On stérilise dans un autoclave cette suspension de préférence dans un autoclave à une température supérieure de 121°C pendant au moins 20 mn. Séparément, on mélange les composés suivants : Acide ascorbique (C6H806) 1g Glutathion (C10l17N303S) 0.1g Acide urique (C5H4N403) 0.1g Eau distillée qsp 10 mL Après dissolution cette solution est filtrée sur un filtre à 0.2pm. On refroidit ledit milieu autoclavé à température ambiante et on mélange 1 ml de la suspension filtrée avec 99 ml de la suspension 15 autoclavée. On obtient ainsi la formulation suivante : Chlorure de Sodium (NaCL) Chlorure de Potassium (KCI) Chlorure de Calcium (CaCl2) 3g/L 0.2g/L 0.1g/L 0.1g/L 0.2g/L 1.15g/L 1g/L 20 Chlorure de Magnesium chloride (MgC12) : Phosphate monopotassique (KH2PO4) Disodium phosphate (Na2HPO4) Acide ascorbique (C6H806) Glutathion (C10l17N303S) 0.1g/L Acide urique (C5H4N403) 0.1g/L Hydroxyde de potassium (KOH) 0.45 g/L Réazurine 0.0015 g/L Le pH final de ce milieu doit être entre 7 à 7.5 Dans les valeurs de concentration ci-dessus : 1 M = 1 mol/L Exemple 2: Effet du milieu de transport et de conservation pour la culture de bactéries anaérobies. Les bactéries testées pour illustrer l'invention sont toutes des bactéries anaérobies strictes particulièrement connues pour être difficiles à viabilisé pendant leur transport et stockage, à savoir Clostridiurn tertium, Clostridiurn butyricum, Clostridiurn rarnosurn, Clostridiurn perfringens, Clostridiurn sordelli et Clostridiurn jeddamassi/iensis.
Dans un essai comparatif, ces trois bactéries ont été mises d'une part dans un milieu standard de conservation à savoir un tampon PBS, et d'autre part et parallèlement dans le milieu de transport de l'exemple 1 conservées à température ambiante comme décrit ci-après. a) Préparation d'un récipient contenant un prélèvement contenant un échantillon de dites bactéries anaérobies. Le milieu préparé dans l'exemple 1 est aliquote en tubes à raison de 1m1 par tube. Une gélose de chaque bactérie à tester est récoltée sur une boite de gélose préalablement incubée à 37°C en anaérobiose puis diluées dans 1m1 de milieu de transport préparé comme dans l'exemple 1. On procède de façon similaire dans des tubes contenant 1m1 de PBS. b) Après différentes durées de conservation, à savoir : après 24h, 48h et 72h et 7jours, 10 pl de chaque suspension est dilué en jusqu'à 10-12 puis 100p1 de chaque dilutions sont inoculées sur gélose columbia au sang et incubées en anaérobiose. Après 48h d'incubation à 37°C, la dernière dilution permettant de compter moins de 10 colonies par gélose permet d'évaluer la concentration initiale de bactéries vivantes.
Les résultats des tests sont indiqués dans les tableaux ci-après différents durés de conservation à différentes températures de conservation. On observe que la viabilité de bactéries cultivables dans le milieu de transport selon l'invention est nettement supérieure à celle observée dans le tampon PBS, cette survie est préservée de façon améliorée dans tous les cas et en particulier après conservation à +4°C pendant 7 jours. 1) Test avec conservation dans le milieu PBS à température ambiante de 20°C.
Tableau 1 Souches TO 24h 48h 72h 7j C. tertium 9.1011 cfu/mL 3.108 cfu/mL 5.106 cfu/mL 3.104 cfu/mL 102 cfu/mL C. butyncum 9.1011 cfu/mL 5.104 cfu/mL 7.103 cfu/mL 9.102 cfu/mL 0 cfu/mL C. ramosum 4.108 cfu/mL 0 cfu/mL 0 cfu/mL 0 cfu/mL 0 cfu/mL C. perfringens 109 cfu/mL 107 cfu/mL 106 cfu/mL 103 cfu/mL 0 cfu/mL C. sordellll 109 cfu/mL 105 cfu/mL 103 cfu/mL 102 cfu/mL 0 cfu/mL C. jecklamasseènsis 109 cfu/mL 106 cfu/mL 104 cfu/mL 102 cfu/mL 0 cfu/mL 2) Test dans le milieu de transport selon l'invention à 20°C. Tableau 2 Souches TO 24h 48h 72h 7j C. tertium 9.1011 cfu/mL 9.1011 cfu/mL 9.1010 cfu/mL 9.1010 cfu/mL 108 cfu/mL C. butyncum 11 11 8 8 7 9.10 cfu/mL 9.10 cfu/mL 2.10 cfu/mL 1.10 cfu/mL 10 cfu/mL C. ramosum 4.108 cfu/mL 4.108 cfu/mL 107 cfu/mL 1.105 cfu/mL 0 cfu/mL C. perfringens 109 cfu/mL 109 cfu/mL 108 cfu/mL 108 cfu/mL 107 cfu/mL C. sordellii 109 cfu/mL 109 cfu/mL 108 cfu/mL 107 cfu/mL 107 cfu/mL C. jecklamassiliensis 109 cfu/mL 109 cfu/mL 108 cfu/M1 108 cfu/mL 107 cfu/mL 3) Test avec conservation dans le milieu PBS à +4°C. Tableau 3 Souches TO 24h 48h 72h 7j C. tertium 109 cfu/mL 108 cfu/mL 106 cfu/mL 104 cfu/mL 102 cfu/mL C. butyricum 9 4 3 2 0 cfu/mL 10 cfu/mL 10 cfu/mL 10 cfu/mL 10 cfu/mL C. ramosum 109 cfu/mL 108 cfu/mL 105 cfu/mL 104 cfu/mL 0 cfu/mL C. perfringens 109 cfu/mL 107 cfu/mL 106 cfu/mL 106 cfu/mL 104 cfu/mL C. sordellii 9 5 4 2 2 10 cfu/mL 10 cfu/mL 10 cfu/mL 10 cfu/mL 10 cfu/mL C. jeddamassiliensis 109 cfu/mL 107 cfu/mL 105 cfu/mL 104 cfu/mL 103 cfu/mL 4) Test dans le milieu de transport selon l'invention à +4°C.
Tableau 4 Souches TO 24h 48h 72h 7j C. tertium 109 cfu/mL 109 cfu/mL 108cfu/mL 108 cfu/mL 107 cfu/mL C. butyricum 109 cfu/mL 108 cfu/mL 108 cfu/mL 107 cfu/mL 106 cfu/mL C. ramosum 109 cfu/mL 108 cfu/mL 106 cfu/mL 104 cfu/mL 104 cfu/mL C. perfringens 109 cfu/mL 109 cfu/mL 108cfu/mL 108 cfu/mL 107 cfu/mL C. sordellll 109 cfu/mL 109 cfu/mL 108 cfu/mL 107 cfu/mL 106 cfu/mL C. jeddamassiliensis 109 cfu/mL 109 cfu/mL 108 cfu/mL 108 cfu/mL 107 cfu/mL 5) Test avec conservation dans le milieu PBS à -20°C. Tableau 5 Souches TO 24h 48h 72h 7j C. tertium 109 cfu/mL 108 cfu/mL 106 cfu/mL 104 cfu/mL 102 cfu/mL C. butyricum 109 cfu/mL 104 cfu/mL 103 cfu/mL 102 cfu/mL 0 cfu/mL C. ramosum 109 cfu/mL 108 cfu/mL 105 cfu/mL 104 cfu/mL 0 cfu/mL C. perfringens 109 cfu/mL 108 cfu/mL 106 cfu/mL 105 cfu/mL 105 cfu/mL C. sordellll 109 cfu/mL 108 cfu/mL 108 cfu/mL 7 5 cfu/mL 10 cfu/mL C. jecklamasseènsis 109 cfu/mL 108 cfu/mL 105 cfu/mL 104 cfu/mL 104 cfu/mL 10 6) Test dans le milieu de transport selon l'invention à -20°C. Tableau 6 Souches TO 24h 48h 72h 7j C. tertium 109 cfu/mL 108 cfu/mL 106 cfu/mL 105 cfu/mL 105 cfu/mL C. butyricum 109 cfu/mL 108 cfu/mL 108 cfu/mL 7 5 10 cfu/mL 10 cfu/mL C. ramosum 109 cfu/mL 108 cfu/mL 105 cfu/mL 104 cfu/mL 0 cfu/mL C. perfringens 109 cfu/mL 108 cfu/mL 106 cfu/mL 105 cfu/mL 105 cfu/mL C. sordellll 109 cfu/mL 108 cfu/mL 108 cfu/mL 107 cfu/mL 105 cfu/mL C. jecklamasseènsis bd cfu/mL 108 cfu/mL 105 cfu/mL 104 cfu/mL 104 cfu/mL
Claims (15)
- REVENDICATIONS1. Procédé de transport et/ou conservation d'échantillons de bactéries capable de préserver la viabilité de bactéries anaérobies pendant au moins 48h, de préférence au moins 72h, à température 5 froide ou ambiante notamment de -80°C à +30°C, de préférence à température ambiante de 4°C à 20°C, caractérisé en ce que l'on conditionne ledit échantillon de bactéries dans un récipient contenant un milieu de transport et conservation liquide, sous atmosphère contenant de l'oxygène, ledit 10 milieu de transport et conservation étant tamponné à PH de 7 à 7,5, comprenant au moins dans de l'eau distillée: - une source de phosphore, et - au moins un sel de métal choisi parmi K, Mg, Na, Ca, et - au moins un composé anti-oxydant choisi parmi l'acide 15 ascorbique, le glutathion et l'acide urique, et - une substance tampon régulateur de pH.
- 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit milieu de transport et conservation est tamponné à PH de 7 à 7.5, comprenant au moins : 20 - un sel de phosphate, et - au moins un sel de chlorure de chacun des métaux K, Mg, Na, Ca, et - au moins un composé anti-oxydant choisi parmi l'acide ascorbique, le glutathion et l'acide urique, à une concentration d'au 25 moins 1g/L, et- une substance tampon régulateur de pH à PH de 7-7.5 qui est l'hydroxyde de potassium (KOH).
- 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit composé antioxydant est mis en oeuvre à une concentration de 1 pg/ml à 2 mg/ml, ou concentration molaire de 10-6 à 10-2 M, de préférence au moins 100 pg/ml ou au moins 10-5M.
- 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit composé antioxydant comprend au moins l'acide ascorbique, de préférence à une concentration d'au moins 1g/I.
- 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la composition du milieu de transport et conservation comprend : -chlorure de sodium (NaCL) - chlorure de potassium (KCI) - chlorure de calcium (CaCl2) - chlorure de magnesium (MgCl2) - phosphate monopotassique (KH2PO4) : - phosphate de sodium (Na2HPO4) - acide ascorbique (C6I-1806) - glutathion (C10H17N3035) - acide urique (C5H4N403) - hydroxyde de potassium (KOH) - eau distillée qsp 3g/L 0.2g/L 0.1g/L 0.1g/L 0.2g/L 1.15g/L 1g/L 0.1g/L 0.1g/L 0.3 - 0.6 g/L 1 litre
- 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit milieu de transport et conservation comprend en outreun indicateur coloré d'oxydoréduction apte à changer visiblement l'état du milieu, notamment sa couleur, dans le cas où celui-ci contiendrait de l'oxygène, de préférence la résazurine à une concentration d'au moins 0.0015g/L.
- 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ledit milieu liquide est mélangé au dit échantillon de bactéries à raison d'une proportion d'au moins 5 volume de dit milieu de transport et conservation pour 1 volume de dit échantillon de bactéries contenant un nombre de bactéries de 1 à 1015 cfu/mL.
- 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ledit échantillon de bactéries est un échantillon de prélèvement biologique clinique.
- 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledit échantillon de bactéries est un échantillon de prélèvement biologique clinique de fluide biologique tel que urine, sang ou sécrétion telle que salives, selles, et autres sécrétions corporelles de muqueuses ou autres organes corporels, pus, collections et épanchements divers, et biopsies, ledit prélèvement étant éventuellement supporté par un matériel pour réaliser le prélèvement d'un échantillon tel qu'un écouvillon en coton ou fibre synthétique.
- 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que ledit échantillon bactérien comprend ou peut comprendre : - des bactéries anaérobies strictes des genres Ciostridium, Peptostreptococcus, Fil7egoldia, Anaerococcus, Peptoniphilus, Veillonella, Lactobacillus, Actinomyces, Ciostridium, Bacteroides, Firmicutes, Porphyromonas, Prevotella, Fusobacterium, Atopobiurn, Ruminococcus, Solobacteriurn, Acidarninococcus, Alistipes, Arnazonia, Anaerosalibacter, Anaerococcus, Barnesiella, Bifidobacterium, Blautia, Collinsella, Dielarn, Flavonifractot, GernellaGodonibacter, Guyana, Hoidemania, Odoribacter, Parabacteroides, Parvimonas, Prevotella, Senegalmassillia, Tisssierella, Turicibacter, Veillonella., et- des bactéries aéro-anaéorobies des genres Actinomyces, Aerococcus, Aneurinibacillus, Bacillus, Cedecea, Citrobacter, Corynebacterium, Eggerthe//a, Eikene//a, Enterobacter, Escherichia, Eubacterium, Facklarnia, Granulicatella, Haemophi/us, Hafnia, Lactobacillus, Leuconostoc, Lysinibacillus, Pediococcus, Providencia, Serratia, Staphylococcus, Streptococcus.
- 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'on effectue le transport d'un prélèvement pouvant contenir un échantillon bactérien dans un dit milieu de transport et conservation, à température ambiante et, après transport, on conserve en stockage ledit prélèvement au froid à +4°C-+8°C ou congelé à -20°C à -80°C) sous une atmosphère d'air ambiant.
- 12. Récipient contenant un milieu liquide de transport et conservation apte à préserver la viabilité de bactéries aérobies et/ou bactéries anaérobies utile dans un procédé tel que défini dans l'une des revendications 1 à 11, sous atmosphère contenant de l'oxygène, ledit milieu de transport et conservation étant tamponné à PH de 7 à 7,5, comprenant au moins dans de l'eau distillée : - une source de phosphore, et - au moins un sel de métal choisi parmi K, Na, Ca et Mg, et - au moins un composé anti-oxydant choisi parmi l'acide ascorbique, le glutathion et l'acide urique, et - une substance tampon régulateur de pH.
- 13. Récipient selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il contient en outre dans ledit milieu liquide, un prélèvement clinique pouvant contenir un dit échantillon bactérien.
- 14. Récipient selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il contient en outre dans ledit milieu liquide, un prélèvement et un matériel de collecte du dit prélèvement clinique.
- 15. Procédé de fabrication d'un récipient selon l'une des revendications 12 à 14, comprenant les étapes successives suivantes dans lesquelles : 1) on chauffe dans un autoclave dans des conditions de température pour le stériliser, de préférence à une température supérieure à 121°C pendant au moins 20 mn, un dit récipient contenant ledit milieu de transport et conservation liquide incomplet ne contenant pas lesdits composés antioxydants, sous atmosphère d'air ambiant, et 2) on refroidit ledit milieu de transport et conservation incomplet, à température ambiante et on y ajoute lesdits composés anti oxydants en suspension préalablement filtrés à travers un filtre qui retient les microorganismes tels que les bactéries, de préférence avec un filtre qui retient les éléments de plus de 0.2pm.
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