FR3011249A1

FR3011249A1 -

Info

Publication number: FR3011249A1
Application number: FR1359518A
Authority: FR
Inventors: E-Chiang Lee; Allan Bradley; Jasper Clube
Original assignee: Kymab Ltd
Current assignee: Kymab Ltd
Priority date: 2013-10-01
Filing date: 2013-10-01
Publication date: 2015-04-03

Abstract

L'invention décrit des procédés pour la génération d'anticorps chimériques humains - non humains et de chaînes d'anticorps chimériques, des anticorps et des chaînes d'anticorps ainsi produits, et des dérivés de ceux-ci y compris des anticorps totalement humanisés ; des compositions comprenant lesdits anticorps, chaînes d'anticorps et dérivés, ainsi que des cellules, des mammifères non humains et des vecteurs, appropriés pour une utilisation dans lesdits procédés.

Description

Modèles animaux et molécules thérapeutiques Contexte La présente invention concerne entre autres des animaux et des cellules non humains qui sont modifiés pour contenir de l'ADN exogène, comme l'ADN du gène d'une immunoglobuline humaine, leur utilisation en médecine et dans l'étude de maladies, des procédés de production d'animaux et de cellules non humains, et des anticorps et des chaînes d'anticorps produits par de tels animaux et dérivés de ceux-ci. Résumé de l'invention Toutes les coordonnées nucléotidiques pour la souris sont celles correspondant à l'assemblage NCBI m37 pour la souche de souris C57BL/6J, par exemple, April 2007 ENSEMBL Release 55.37h, par exemple NCBI37 July 2007 (assemblage NCBI 37) (par exemple, UCSC version mm9, voir World Wide Web (www) genome.ucsc.edu et World Wide Web (www) genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html) sauf spécification contraire. Les coordonnées nucléotidiques humaines sont celles correspondant à l'assemblage GRCh37 (par exemple, UCSC version hg 19, World Wide Web (www) genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html), Feb 2009 ENSEMBL Release 55.37, ou ce sont celles correspondant à l'assemblage NCBI36, Ensemble release 54 sauf spécification contraire. Les coordonnées nucléotidiques de rat sont celles correspondant à l'assemblage RGSC 3.4 Dec 2004 ENSEMBL release 55.34w, ou Baylor College of Medicine HGSC v3.4 Nov 2004 (par exemple, UCSC rn4, voir World Wide Web (www) genome.ucsc.edu et World Wide Web (www) genorne.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html) sauf spécification contraire. Les références à des travaux chez les souris dans ce document sont seulement à titre d'exemple et les références à des souris sont prises pour inclure les références à tous les mammifères non humains, sauf mise en évidence contraire d'après la description, avec les souris étant préférées en tant que mammifère non humain. Les documents US2012/0204278 et PCT/GB2013/050682 font partie de l'état de la technique.

Une référence à des segments de gènes humains dans ce document englobe à la fois la séquence de segments de gènes humains de la lignée germinale ou la forme recombinée du segment de gène qui peut comprendre une ou plusieurs mutations par rapport à la séquence de segments de gènes humains de la lignée germinale, par exemple les allèles décrits dans la base de données IMGT et la base de données 1000 Genomes, ainsi que dans le document WO 2013041844.

Tous les segments de gènes dont il est fait référence dans ce document peuvent être identifiés en utilisant une analyse classique de séquences comparativement à des séquences de segments de gènes humains de la lignée germinale éventuellement en référence aux bases de données publiques de séquences, telles que la base de données IMGT ou 1000 Genomes. Dans un aspect, l'invention concerne un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat) ou une cellule dont le génome comprend des segments de gènes VH, D et JH humains en amont d'une région constante au niveau d'un locus de chaîne lourde endogène et des segments de gènes VL et JL humains en amont d'une région constante au niveau d'un locus de chaîne légère endogène, où les segments de gènes sont liés de manière fonctionnelle à la région constante de celui-ci de telle manière que le vertébré ou la cellule est capable d'exprimer des chaînes lourdes et légères d'immunoglobulines comprenant les domaines VH et VL humains respectivement, où le locus de chaîne lourde comprend un segment de gène VH allèle 01 humain capable de se recombiner avec un segment de gène D et JH humain pour produire un domaine VH, où le locus de chaîne légère comprend un segment de gène VL allèle 01 humain capable de se recombiner avec un segment de gène JL humain pour produire un domaine VL, ou bien où la cellule peut se développer chez un vertébré qui exprime lesdites chaînes lourdes et légères. Comme il est expliqué en outre dans les exemples ci-dessous, les inventeurs ont démontré de manière surprenante que les allèles 01 humains peuvent être utilisés pour produire des sites de liaison spécifique d'un antigène, où ceux-ci sont recombinés correctement chez un vertébré non humain, présentent des mutations jonctionnelles et somatiques et peuvent être correctement exprimés et isolés. Dans un autre aspect, l'invention concerne un vertébré ou une cellule non humain (par exemple, une cellule de souris ou une cellule de rat) dont le génome comprend le segment JH2*01 humain et/ou le segment JH6*02 humain, un ou plusieurs segments de gènes VH humains et un ou plusieurs segments de gènes D humains en amont d'une région constante au niveau d'un locus de chaîne lourde endogène et le segment JK2*01 humain et/ou le segment JK4*01 humain et un ou plusieurs segments de gènes 2 VK humains en amont d'une région constante au niveau d'un locus de chaîne légère endogène, où les segments de gènes dans chaque locus sont liés de manière fonctionnelle à la région constante de celui-ci de telle manière que le vertébré ou la cellule est capable de produire une chaîne-lourde d'anticorps et une chaîne légère d'anticorps, où la chaîne lourde est produite par recombinaison du segment JH2*01 et/ou JH6*02 humain avec un segment D et un segment VH et la chaîne légère est produite par recombinaison du segment JK2*01 et/ou JK4*01 humain avec un segment VK.

Comme il est expliqué en outre dans les exemples ci-dessous, les inventeurs ont démontré de manière surprenante que les chaînes lourdes et légères produites selon l'invention peuvent être utilisées pour produire des sites de liaison spécifique d'un antigène, où celles-ci sont correctement recombinées chez un vertébré non humain, affichent des mutations jonctionnelles et somatiques et peuvent être correctement exprimées et isolées. Dans un autre aspect, l'invention concerne un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat) ou une cellule dont le génome comprend un répertoire de segments de gènes Ig produits par une insertion ciblée de segments de gènes Ig humains dans un ou plusieurs loci Ig endogènes, le génome comprenant des segments de gènes VÀ et JÀ humains en amont d'une région constante, où les segments de gènes VÀ et JÀ humains sont choisis parmi un, plusieurs ou la totalité des segments du tableau 18 et ont été fournis par insertion dans un locus de chaîne légère endogène du vertébré ou de la cellule, où le vertébré comprend des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des régions variables lambda (chaînes légères lambda) ou la cellule peut se développer chez un vertébré qui exprime lesdites chaînes légères d'immunoglobulines, où les chaînes légères lambda comprennent des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des recombinants de régions variables lambda d'un, de plusieurs ou de la totalité des segments de gènes VÀ et JÀ humains du tableau 18.

Inactivation des chaînes légères endogènes et expression élevée des réqions variables lambda humaines chez des vertébrés et des cellules transgéniques non humains Comme il est en outre expliqué dans les exemples ci-dessous, les inventeurs ont observé de manière surprenante des taux d'expression très élevée des chaînes légères comprenant des régions variables lambda humaines (au moins 70 ou 80 % de V lambda humaines) provenant des loci des chaînes légères transgéniques produits 3 par une insertion ciblée de segments de gènes lambda humains dans des loci de chaînes légères de vertébrés non humains endogènes. Ceci est même possible en présence de segments de gènes V et J de vertébrés non humains endogènes dans le génome du vertébré. En outre, les taux étonnamment élevés d'expression sont obtenus lorsque l'insertion de segments de gènes lambda humains se situe dans le locus kappa ou lambda endogène. De tels taux élevés par insertion ciblée n'ont pas été publiés dans l'art jusqu'ici. Les inventeurs ont observé de manière surprenante que l'expression des chaînes kappa endogènes peut être complètement inactivée par insertion ciblée d'une séquence de gène lambda humain dans le locus kappa endogène, comme il sera expliqué en outre dans les exemples. L'insertion ciblée de segments de gènes humains dans des loci Ig endogènes est avantageuse parce qu'elle permet la localisation fonctionnelle des séquences d'Ig humaines insérées par rapport aux régions constantes d'Ig endogènes et aux régions contrôles endogènes, comme les amplificateurs et d'autres régions contrôles des loci par exemple. Ainsi, une insertion ciblée permet d'exploiter un contrôle endogène important dans un ou plusieurs de la recombinaison de segments de gènes Ig, de l'exclusion allélique, de la maturation par affinité, de la permutation de classe, des taux d'expression des Ig et du développement souhaitable du compartiment des cellules B. Comme telle, l'insertion ciblée est supérieure aux tentatives antérieures dans l'art de produire des loci Ig transgéniques et une expression, lesquelles tentatives reposaient sur l'introduction dans des cellules de vertébrés non humains de vecteurs tels que des YAC portant des segments de gènes Ig humains. Les YAC sont intégrés de manière aléatoire dans le génome des cellules de vertébrés, de telle manière qu'il est difficile d'obtenir le contrôle fourni par l'insertion ciblée et les bénéfices concomitants offerts en termes d'exploitation des mécanismes de contrôle endogènes. En outre, l'insertion aléatoire entraîne souvent le placement des segments de gènes Ig humains insérés sous le contrôle d'éléments de contrôle hétérologues et/où des modifications chromosomiques épigénétiques telles que la méthylation et des conformations de la chromatine, chacune d'entre elles pouvant être nocive pour une recombinaison de segments de gènes Ig, une exclusion allélique, une maturation par affinité, une permutation de classe, les taux d'expression des Ig et le développement souhaitable du compartiment des cellules B, corrects. L'insertion aléatoire entraîne généralement 2 copies ou plus du transgène introduit, ce qui peut provoquer une instabilité chromosomique et par conséquent entraîner des performances médiocres de 4 reproduction des animaux en plus des effets délétères sur une recombinaison de segments de gènes Ig, une exclusion allélique, une maturation par affinité, une permutation de classe, des taux d'expression des Ig et un développement souhaitable du compartiment des cellules B, corrects. Ainsi, les tentatives de l'art antérieur utilisant une insertion aléatoire ont eu tendance à mener à un développement médiocre des cellules B, à des compartiments de cellules B relativement petits et à une'expression des Ig inférieure et à une difficulté concomitante dans l'isolement d'un anticorps avec une caractéristique souhaitée. L'invention propose donc les aspects suivants.

Expression des régions variables lambda humaines Tous les modes de réalisation de l'invention décrits dans ce document peuvent être mis en pratique avec un allèle lambda spécifique décrit dans le tableau 18, ou toute combinaison de ceux-ci. Où il est fait référence dans ce document à des segments de gènes sans référence à un allèle spécifique, ceux-ci peuvent être éventuellement les allèles spécifiques décrits dans l'un quelconque des tableaux 1 à 18. 1. Un vertébré non humain (par exemple une souris ou un rat) dont le génome comprend un répertoire de segments de gènes Ig produits par insertion ciblée de segments de gènes Ig humains dans un ou plusieurs loci Ig endogènes, le génome comprenant des segments de gènes VÀ et JÀ humains en amont d'une région constante, où les segments de gènes VÀ et JÀ humains ont été fournis par insertion dans un locus de chaîne légère endogène du vertébré, où le vertébré exprime des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des régions variables lambda (chaînes légères lambda), où les chaînes légères lambda comprennent des chaînes légères -d'immunoglobulines comprenant des régions variables lambda dérivées d'une recombinaison de segments de gènes VÀ et JÀ humains. Un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat) dont le génome comprend un répertoire de segments de gènes Ig produits par insertion ciblée de segments de gènes Ig humains dans un ou plusieurs loci Ig endogènes, le génome comprenant des segments de gènes VA et JÀ humains en amont d'une région constante, où les segments de gènes VA et JÀ humains ont été fournis par insertion dans un locus de chaîne légère endogène du vertébré, où le vertébré exprime des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des régions variables lambda (chaînes légères lambda), et où au moins 70 ou 80 % des régions variables des chaînes légères lambda 5 exprimées par le vertébré sont dérivées d'une recombinaison de segments de gènes VA et JÀ humains. Ceci est démontré dans les exemples ci-dessous. Par exemple, au moins 70, 75, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 `)/0, ou 100 % des régions variables des chaînes légères lambda exprimées par le vertébré sont dérivées d'une recombinaison de segments de gènes VA et JA humains. Ceci est démontré dans les exemples ci-dessous. Dans les modes de réalisation, il est proposé Une cellule ES de vertébré non humain (par exemple, une cellule ES de souris ou une cellule ES de rat) dont le génome comprend un répertoire de segments de gènes Ig produits par insertion ciblée de segments de gènes Ig humains dans un ou plusieurs loci Ig endogènes, le génome comprenant des segments de gènes VA et JÀ humains en amont d'une région constante, où les segments de gènes VA et JA humains ont été fournis par insertion dans un locus de chaîne légère endogène de la cellule du vertébré, où la cellule peut se développer chez un vertébré qui exprime des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des régions variables lambda (chaînes légères lambda), où les chaînes légères lambda comprennent des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des régions variables lambda dérivées d'une recombinaison de segments de gènes VA et JA humains. Une cellule ES de vertébré non humain (par exemple, une cellule ES de souris ou une cellule ES de rat) dont le génome comprend un répertoire de segments de gènes Ig produits par insertion ciblée de segments de gènes Ig humains dans un ou plusieurs loci Ig endogènes, le génome comprenant des segments de gènes VA et JA humains en amont d'une région constante, où les segments de gènes VA et JA humains ont été fournis par insertion dans un locus de chaîne légère endogène de la cellule du vertébré, où la cellule peut se développer chez un vertébré qui exprime des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des régions variables lambda (chaînes légères lambda), et où au moins 70 ou 80 % (par exemple, au moins 70, 75, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 %, ou 100 %) des régions variables des chaînes légères lambda exprimées par le vertébré sont dérivées d'une recombinaison de segments de gènes VA et JA humains.

Dans un exemple, de manière surprenante, l'expression des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des régions variables lambda dérivées d'une 6 recombinaison de segments de gènes VÀ et JÀ humains est obtenue même lorsque le génome comprend des segments de gènes de régions variables lambda de vertébré non humain endogènes (par exemple, des segments de gènes VÀ et/ou JÀ endogènes, éventuellement un répertoire endogène complet de segments de gènes VÀ et JÀ): Ainsi, dans un exemple, le génome comprend des segments de gènes de régions variables lambda de vertébré non humain endogènes (par exemple, des segments de gènes VÀ et/ou JÀ endogènes, éventuellement un répertoire endogène complet de segments de gènes VÀ et JÀ). Dans un autre exemple, de tels segments de gènes endogènes sont absents du génome. 2. Le vertébré ou la cellule de l'aspect 1, éventuellement où l'insertion de VÀ et JÀ humains comprend au moins les segments de gènes V et J humains fonctionnels (éventuellement également le segment CÀ humain) composés d'un locus Ig de chaîne lambda humaine provenant des segments VÀ2-18 à CÀ7. Dans un exemple, l'insertion comprend également des séquences de segments intergéniques lambda. Ce sont des séquences humaines ou elles peuvent être des séquences de l'espèce de vertébré non humain (par exemple, où le vertébré est une souris, les séquences entre les segments de gènes lambda de souris correspondants peuvent être utilisées).

Dans un mode de réalisation, les segments de gènes V et J sont les allèles du tableau 18. Dans un autre mode de réalisation, les segments de gènes CÀ sont les allèles décrits dans le tableau 18. 3. Le vertébré ou la cellule de l'aspect 1 ou 2, éventuellement où le génome est homozygote pour l'insertion de segments de gènes VÀ et JÀ humains et l'expression des chaînes kappa endogènes chez ledit vertébré est pratiquement ou complètement inactive. Dans un exemple, moins 10, 5, 4, 3, 2, 1 ou 0,5 % des chaînes légères sont fournies par des chaînes kappa endogènes (c'est-à-dire, des chaînes kappa dont les régions variables sont dérivées d'une recombinaison de segments de gènes V et J de vertébré non humain). 4. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects précédents, éventuellement où le locus endogène est un locus kappa endogène. 5. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects précédents, éventuellement où le locus endogène est un locus lambda endogène. k 60 % de toutes les chaînes légères ont des régions V lambda humaines. 7 . Un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat) dont le génome comprend un répertoire de segments de gènes Ig produits par insertion ciblée de segments de gènes Ig humains dans un ou plusieurs loci Ig endogènes, le génome comprenant (i) des segments de gènes VA et JA humains en amont d'une région constante, où les segments de gènes VA et JA humains ont été fournis par insertion dans un locus de chaîne légère endogène du vertébré et (ii) des segments de gènes V kappa en amont d'une région constante, où le vertébré exprime des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des régions variables lambda humaines (chaînes légères lambda humaines), et où au moins 60 % des chaînes légères exprimées par le vertébré sont fournies par lesdites chaînes légères lambda humaines. Ceci est démontré dans les exemples ci-dessous. Par exemple, au moins 65, 70, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 %, ou 100 % des chaînes légères exprimées par le vertébré sont fournies par lesdites chaînes légères lambda humaines. Par exemple, au moins 84 % des chaînes légères exprimées par le vertébré sont fournies par lesdites chaînes légères lambda humaines. Par exemple, au moins 95 % des chaînes légères exprimées par le vertébré sont fournies par lesdites chaînes légères lambda humaines. Ceci est démontré dans les exemples ci-dessous.

Dans un mode de réalisation, il est proposé une cellule ES de vertébré non humain (par exemple, une cellule ES de souris ou une cellule ES de rat) dont le génome comprend un répertoire de segments de gènes Ig produits par insertion ciblée de segments de gènes Ig humains dans un ou plusieurs loci Ig endogènes, le génome comprenant (i) des segments de gènes VA et JA humains en amont d'une région constante, où les segments de gènes VA et JA humains ont été fournis par insertion dans un locus de chaîne légère endogène du vertébré et (ii) des segments de gènes V kappa en amont d'une région constante, où la cellule peut se développer chez un vertébré qui exprime des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des régions variables lambda humaines (chaînes légères lambda humaines), et où au moins 60 % des chaînes légères exprimées par le vertébré sont fournies par lesdites chaînes légères lambda humaines. 7. Un vertébré non humain ou une cellule de vertébré non humain (par exemple, une souris, un rat, une cellule de souris ou une cellule de rat) dont le génome comprend un répertoire de segments de gènes Ig produits par insertion ciblée de segments de gènes Ig humains dans un ou plusieurs loci Ig endogènes, le génome comprenant une 8 insertion ciblée de segments de gènes VA et JÀ d'immunoglobulines humaines dans un locus de chaîne légère kappa ou lambda de vertébré non humain endogène en aval de segments de gènes VL et JL endogènes pour l'expression de chaînes légères comprenant des régions variables lambda humaines ; où l'insertion des segments de gènes VA et JÀ humains comprend au moins les segments de gènes V et J humains fonctionnels (et éventuellement également un CA humain fonctionnel) composés par un locus Ig de chaîne lambda humaine de VA2-18 à CA7. Comme il est démontré dans les exemples, l'expression des chaînes légères endogènes à partir dudit locus est inactivée et également l'expression des régions variables lambda humaines est prédominante sur l'expression des régions variables lambda endogènes. Par "en aval" il est signifié en 3' des segments de gènes sur le chromosome. Dans un exemple, les segments de gènes V et J endogènes sont inversés par rapport aux segments de gènes humains et éventuellement déplacés hors du locus de chaîne légère endogène. Dans un exemple, les segments de gènes humains sont en aval de tous les segments V et J endogènes dudit locus kappa ou lambda. La possibilité de conserver les séquences V-J endogènes et les séquences intergéniques est avantageuse puisque les régions de contrôle et/ou les gènes intégrés sont conservés, ce qui peut être souhaitable chez le vertébré. Eventuellement, l'insertion comprend également des séquences de segments intergéniques lambda. Ce sont des séquences humaines ou elles peuvent être des séquences de l'espèce de vertébré non humain (par exemple, où le vertébré est une souris, les séquences entre les segments de gènes lambda de souris correspondants peuvent être utilisées). Expression de chaînes lambda VJCÀ 8. Un vertébré non humain ou une cellule de vertébré non humain (par exemple, une souris, un rat, une cellule de souris ou une cellule de rat) dont le génome comprend un répertoire de segments de gènes Ig produits par insertion ciblée de segments de gènes lg humains dans un ou plusieurs loci Ig endogènes, le génome comprenant une insertion ciblée de gènes VA, JÀ et CÀ d'immunoglobulines humaines dans un locus de chaîne légère kappa ou lambda de vertébré non humain endogène en amont d'une région constante kappa ou lambda de vertébré non humain endogène pour 9 l'expression d'une chaîne légère VJC humaine ; éventuellement où l'insertion de la chaîne légère VJC humaine comprend au moins les segments de gènes V, J et C humains fonctionnels composés d'un locus Ig de chaîne lambda humaine de VA3-1 à CÀ7 (par exemple, composés d'un locus Ig de chaîne lambda humaine de 2-18 à CÀ7).

Dans un mode de réalisation, les segments de gènes V et J sont les allèles du tableau 18. Dans un autre mode de réalisation, les segments de gènes CÀ sont les allèles décrits dans le tableau 18.

Comme il est démontré dans les exemples, l'expression de la région variable lambda humaine est prédominante sur l'expression de la région variable kappa endogène. L'expression de la chaîne kappa endogène à partir du locus endogène peut être inactivée.

Eventuellement, l'insertion comprend également des séquences de segments intergéniques lambda, ce sont des séquences humaines ou elles peuvent être des séquences de l'espèce de vertébré non humain (par exemple, où le vertébré est une souris, les séquences entre les segments de gènes lambda de souris correspondants peuvent être utilisées). 9. Un vertébré non humain ou une cellule de vertébré non humain (par exemple, une souris, un rat, une cellule de souris ou une cellule de rat) dont le génome comprend un répertoire de segments de gènes Ig produits par insertion ciblée de segments de gènes Ig humains dans un ou plusieurs loci Ig endogènes, le génome comprenant une insertion ciblée d'au moins les segments de gènes VA et JÀ humains fonctionnels (et éventuellement le CÀ humain fonctionnel) composés d'un locus Ig de chaîne lambda humaine de VÀ3-1 à CÀ7 (éventuellement de VA2-18 à CA7, en outre éventuellement les allèles spécifiques du tableau 18) dans un locus de chaîne légère kappa de vertébré non humain endogène en aval des segments de gènes VK et JK de souris pour l'expression d'une chaîne légère comprenant une région variable lambda humaine, moyennant quoi en la présence de ladite insertion, l'expression des chaînes légères kappa endogènes dérivées desdits segments de gènes VK et JK de souris est substantiellement ou complètement inactivée.

Dans un exemple, moins de 10, 5, 4, 3, 2, 1 ou 0,5 % des chaînes légères sont fournies par des chaînes kappa endogènes (c'est-à-dire, des chaînes kappa dont les régions variables sont dérivées d'une combinaison de segments de gènes W et JK de 10 vertébré non humain). Eventuellement, l'insertion comprend également des séquences de segments intergéniques lambda. Ce sont des séquences humaines ou elles peuvent être des séquences de l'espèce de vertébré non humain (par exemple, où le vertébré est une souris, les séquences entre les segments de gènes lambda de souris correspondants peuvent être utilisées). 10. Un vertébré non humain ou une cellule de vertébré non humain (par exemple, une souris, un rat, une cellule de souris ou une cellule de rat), où dans le génome duquel la région IgK-VJ de souris a été éloignée de l'amplificateur EK de souris, inactivant de cette manière les régions IgK-VJ endogènes. Ceci est démontré dans les exemples. 11 Le vertébré ou la cellule de l'aspect 10, éventuellement où la région IgK-VJ a été éloignée de l'amplificateur EK de souris par insertion de segments de gènes VL et JL humains entre la région IgK-VJ et l'amplificateur EK de souris ; éventuellement où l'insertion est une insertion telle que citée dans l'un quelconque des aspects 1 à 9 précédents ou une insertion de segments de gènes VK et JK humains. 12. Le vertébré ou la cellule selon l'un quelconque des aspects précédents, éventuellement où les segments de gènes VA et JA humains ont été insérés au sein de 100, 75, 50, 40, 30, 20, 15, 10 ou 5 kb d'un amplificateur de chaîne légère de vertébré non humain endogène. Dans un exemple, l'amplificateur est un amplificateur lambda (par exemple, EU-4, EÀ4-10 ou EA3-1 de souris) lorsque l'insertion est dans un locus lambda endogène. Dans un exemple, l'amplificateur est un amplificateur kappa (par exemple, iEK ou 3'EK) lorsque l'insertion est dans un locus kappa endogène. 13. Le vertébré ou la cellule selon l'un quelconque des aspects précédents, éventuellement où les segments de gènes VA et JA humains sont fournis dans le génome par l'insertion ciblée d'au moins 10 segments de gènes VA humains avec des segments de gènes JA humains en amont d'une région constante de chaîne légère de vertébré non humain endogène dudit locus de chaîne légère. Par exemple, les segments de gènes humains sont fournis par insertion d'au moins une partie d'un locus de chaîne lambda d'Ig humaine de VA2-18 à VA3-1 ; ou au moins une partie d'un locus de chaîne lambda d'Ig humaine de VA2-18 à VA3-1 insérée avec JA1, JA2, JA3, JA6 et JA7 ; ou au moins une partie d'un locus de chaîne lambda d'Ig humaine de VÀ2- 18 à CA7 (éventuellement en excluant JA4CA4 et/ou JA5CA5). 11 Eventuellement, au moins 2,3,4 ou 5 JÀ humains sont insérés. Dans un mode de réalisation, les JÀ insérés sont différents les uns des autres. Par exemple, JÀ1, JÀ2, JÀ3, JÀ6 et JÀ7 sont insérés, éventuellement faisant partie des groupes JÀCÀ humains respectifs.

Eventuellement, un amplificateur de chaîne légère humaine, par exemple EÀ, est inséré. Par exemple, l'insertion de EÀ humain entre les segments JÀ humains et la région constante endogène ; ou entre les segments de gènes CÀ humains (lorsque ceux-ci sont insérés) et la région constante endogène. 14. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects précédents, éventuellement où les chaînes légères lambda fournissent un répertoire de régions variables lambda humaines dérivées de segments de gènes VÀ humains VÀ3-1 et éventuellement un ou plusieurs de VÀ2-18, VÀ3-16, V2-14, VÀ3-12, VÀ2-11, VÀ3-10, VÀ3-9, VÀ2-8 et VÀ4-3 qui ont été fournis dans le génome par insertion ciblée dans ledit locus de chaîne légère. Ceci est utile parce que VÀ3-1 est un segment de gène lambda hautement utilisé chez les êtres humains (figure 59 ; Ignatovich et al. 1997) et ainsi il est souhaitable que les cellules et les vertébrés de l'invention pourvoient à l'inclusion de régions variables lambda basées sur ce segment de gène pour une sélection contre un antigène, en particulier pour le développement d'agents thérapeutiques à base d'anticorps pour un usage humain. 15. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects précédents, éventuellement où les chaînes légères lambda fournissent un répertoire de régions variables lambda humaines dérivées de segments de gènes VÀ humains VÀ2-14 et un ou, plusieurs de VÀ2-18, VÀ3-16, VÀ3-12, VÀ2-11, VÀ3-10, VÀ3-9, VÀ2-,78, VÀ4-3 et VÀ3-1 qui ont été fournis dans le génome par insertion ciblée dans ledit locus de chaîne légère.

Ceci est utile parce que VÀ2-14 est un segment de gène lambda hautement utilisé chez les êtres humains et ainsi il est souhaitable que les cellules et les vertébrés de l'invention pourvoient à l'inclusion de régions variables lambda basées sur ce segment de gène pour une sélection contre un antigène, en particulier pour le développement d'agents thérapeutiques à base d'anticorps pour un usage humain. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects précédents, éventuellement où les chaînes légères lambda fournissent un répertoire de régions variables lambda 12 humaines dérivées de segments de gènes VA humains VÀ2-8 et un ou plusieurs de VÀ2-18, VÀ3-16, V2-14, VÀ3-12, VÀ2-11, VA3-10, VÀ3-9, VA2-8, VÀ4-3 et VA3-1 qui ont été fournis dans le génome par insertion ciblée dans ledit locus de chaîne légère.

Ceci est utile parce que VÀ2-8 est un segment de gène lambda hautement utilisé chez les êtres humains et ainsi il est souhaitable que les cellules et les vertébrés de l'invention pourvoient à l'inclusion de régions variables lambda basées sur ce segment de gène pour une sélection contre un antigène, en particulier pour le développement d'agents thérapeutiques à base d'anticorps pour un usage humain. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects précédents, éventuellement où les chaînes légères lambda fournissent un répertoire de régions variables lambda humaines dérivées de segments de gènes VA humains VA3-10 et un ou plusieurs de VÀ2-18, VA3-16, V2-14, VA3-12, VA2-11, VA2-14, VA3-9, VÀ2-8, VA4-3 et VA3-1 qui ont été fournis dans le génome par insertion ciblée dans ledit locus de chaîne légère. Ceci est utile parce que VÀ3-10 est un segment de gène lambda hautement utilisé chez les êtres humains et ainsi il est souhaitable que les cellules et les vertébrés de l'invention pourvoient à l'inclusion de régions variables lambda basées sur ce segment de gène pour une sélection contre un antigène, en particulier pour le développement d'agents thérapeutiques à base d'anticorps pour un usage humain. 16. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects précédents, éventuellement où les segments de gènes VA humains comprennent les VA fonctionnels composés d'un locus Ig de chaîne lambda humaine de VÀ2-18 à VA3-1. Par exemple, les segments de gènes VA comprennent au moins le segment de gène V humain VA3-1 ou au moins les segments VA2-18, VÀ3-16, V2-14, VÀ3-14,-VA2-11, VÀ3-10, VA3-9, VÀ2-8, VÀ4-3 et VA3-1. 17. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects précédents, éventuellement où le vertébré exprime plus de chaînes lambda que de chaînes kappa. Les chaînes lambda comprennent des régions variables dérivées d'une recombinaisôn de segments de gènes VA et JÀ - par exemple, exprimées avec une région constante lambda. Les chaînes kappa comprennent des régions variables dérivées d'une 13 recombinaison de segments de gènes VK et JK - par exemple, exprimées avec une région constante kappa. 18. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects précédents, éventuellement où le vertébré n'exprime aucune chaîne kappa endogène. Par exemple, l'expression des chaînes kappa endogènes peut être inactivée par l'un quelconque des moyens décrits dans ce document, comme par inversion de la totalité ou d'une partie de la région VJ kappa endogène ou par insertion d'un marqueur (par exemple, neo) ou d'une autre séquence interférante dans un locus kappa (un locus ne comprenant pas de segments de gènes lambda humains selon l'invention). 19. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects précédents, éventuellement où l'expression des chaînes kappa est substantiellement ou complètement inactive chez ledit vertébré. Dans un exemple, moins de 10, 5, 4, 3, 2, 1 ou 0,5 % des chaînes légères sont fournies par des chaînes kappa. 20. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects précédents, éventuellement où un amplificateur EÀ humain est inséré dans ledit locus de vertébré non humain endogène. Par exemple, il est inséré un 5' MAR humain et un EÀ humain (et éventuellement le 3' MAR humain) dans la configuration de la lignée germinale. Par exemple, il est inséré une séquence correspondant à la région intronique lambda humaine immédiatement en 3' des JÀ7-CÀ7 humains jusqu'à, et y compris, au moins le EÀ humain (et éventuellement aussi le 3' MAR humain) - éventuellement y compris au moins 30 kb de la région intronique en 3' du EÀ humain. 21. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects précédents, où éventuellement au moins les segments de gènes JC humains JÀ1-CÀ1, JÀ2-CÀ2, JÀ3- CÀ3, JÀ6-CÀ6 et JÀ7-CÀ7 sont insérés en plus des autres segments de gènes humains. 22. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects précédents, où éventuellement les segments de gènes humains insérés sont dans la configuration de la lignée germinale ; éventuellement avec les séquences de segments intergéniques humains ou les séquences de segments intergéniques de vertébré non humain 14 endogènes correspondants. 23. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects précédents, où éventuellement un amplificateur de chaîne légère de vertébré non humain endogène est maintenu dans le locus endogène ; éventuellement dans la configuration de la lignée germinale. Par exemple, lorsque le locus endogène est un locus kappa, un amplificateur kappa endogène est maintenu. Celui-ci peut être le iEk et/ou le 3'Ek, éventuellement dans la configuration de la lignée germinale par rapport à une région constante de chaîne légère endogène. Ceci peut être utile pour aider le contrôle de l'expression de la chaîne légère chez le vertébré non humain ou la cellule. 24. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects précédents, éventuellement où le génome est hétérozygote pour l'insertion de lambda humaine au niveau du locus endogène. Par exemple, hétérozygote pour l'insertion de VJ ou VJC humains au niveau d'un locus kappa endogène (par exemple, kappa de souris ou de rat). Ceci aide et simplifie la reproduction des vertébrés puisque l'autre locus endogène (par exemple, l'autre locus kappa) peut être utilisé pour fournir un locus Ig transgénique différent, comme un locus kappa transgénique comprenant des segments de gènes V et J kappa humains soit en amont de la région constante kappa de souris endogène soit en amont d'une région constante kappa humaine. Dans ce cas, les amplificateurs kappa (iEk et/ou le 3'Ek) peuvent être maintenus dans ce locus kappa pour aider l'expression chez le vertébré en utilisant des mécanismes de contrôle endogènes. Dans un autre mode de réalisation, il est fourni un vertébré non humain ou une cellule selon l'un quelconque des aspects précédents, où (a) le locus endogène est un locus lambda endogène (par exemple, chez une souris), le génome étant hétérozygote pour l'insertion au niveau du locus lambda, ainsi un allèle du locus lambda comprenant l'insertion des segments de gènes VIS et JÀ humains (éventuellement avec l'insertion de segment de gène CÀ humain ; éventuellement avec l'insertion du EÀ humain) comme il a été décrit ci-dessus ; (b) l'autre allèle lambda endogène comprend une pluralité de segments de gènes VK humains et un ou plusieurs segments de gènes JK humains en amont d'une région constante (par exemple, une région constante kappa de ladite espèce de vertébré non humain ; une région constante kappa humaine ; la région constante lambda endogène ; ou une région constante lambda humaine) ; éventuellement avec un ou plusieurs amplificateurs kappa (par exemple, iEk et/ou le 3'Ek, par exemple, de ladite 15 espèce de vertébré non humain) ; et (c) l'expression des chaînes lambda et kappa endogènes a été inactivée. Ainsi, il n'y a aucune expression des chaînes légères comprenant des régions variables dérivées d'une recombinaison des régions V et J endogènes, mais il y a une expression des chaînes légères lambda humaines et kappa humaines à partir des allèles au niveau du locus lambda endogène. Ceci est bénéfique, puisque la conception aide grandement la construction et la reproduction des vertébrés en évitant le besoin de fournir des loci transgéniques au niveau des loci à la fois lambda et kappa endogènes. Le locus kappa endogène (et ainsi l'expression des chaînes kappa endogènes) peut être inactivé par inversion, délétion de segments de gènes kappa (par exemple, V et/ou J et/ou C kappa endogènes) et/ou par insertion d'une séquence d'interruption comme un marqueur (par exemple, neo) dans le locus kappa endogène.

L'insertion de segments kappa humains dans le lambda endogène peut être réalisée, par exemple, par insertion d'une séquence correspondant à une partie d'un locus kappa humain comprenant dans la configuration de la lignée germinale tous les VK et JK humains fonctionnels (c'est-à-dire, éventuellement en excluant les pseudogènes et les ORF ; voir la base de données IMGT) ; et éventuellement aussi un iEK humain. 25. Le vertébré ou la cellule de l'aspect 24, éventuellement où le génome comprend ladite insertion de segments de gènes lambda humains au niveau d'un allèle de locus kappa de vertébré non humain endogène, et où l'autre allèle de locus kappa endogène comprend une insertion de gènes V et J kappa d'immunoglobulines humaines en amont d'une région constante kappa de vertébré non humain endogène ; éventuellement où un amplificateur de chaîne légère kappa endogène est maintenu dans l'un ou les deux loci kappa ; éventuellement dans la configuration de la lignée germinale.

Le vertébré ou la cellule de l'aspect 24, éventuellement où le génome comprend ladite insertion de segments de gènes lambda humains au niveau d'un allèle de locus lambda de vertébré non humain endogène, et où l'autre allèle de locus lambda endogène comprend une insertion de gènes V et J kappa d'immunoglobulines humaines en amont d'une région constante kappa de vertébré non humain endogène ; éventuellement où un amplificateur de chaîne légère lambda endogène est maintenu dans l'un ou les deux loci lambda ; éventuellement dans la configuration de la lignée 16 germinale. 26. Le vertébré ou la cellule de l'aspect 24, éventuellement où le génome comprend ladite insertion de segments de gènes lambda humains au niveau d'un allèle de locus lambda de vertébré non humain endogène, et où l'autre allèle de locus lambda endogène comprend une insertion de gènes V et J kappa d'immunoglobulines humaines en amont d'une région constante kappa de vertébré non humain endogène ; éventuellement où un amplificateur de chaîne légère lambda endogène est maintenu dans l'un ou les deux loci kappa ; éventuellement dans la configuration de la lignée germinale. 27. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects 1 à 23, éventuellement où le génome est homozygote pour l'insertion de segments de gènes lambda humains au niveau du locus de vertébré non humain endogène. 28. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects 1 à 23, éventuellement où le génome est homozygote pour une insertion de segments de gènes lambda humains des loci kappa et lambda de vertébré non humain endogènes. 29. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects 1 à 23 et 28, éventuellement où le génome est homozygote pour une insertion de segments de gènes lambda humains au niveau des loci lambda de vertébré non humain endogènes, un allèle de locus kappa endogène comprenant une insertion de segments de gènes lambda humains et l'autre allèle de locus kappa endogène comprenant une insertion d'une pluralité de segments de gènes VK et JK humains en amont d'une région CK pour l'expression des chaînes légères kappa comprenant des régions variables kappa humaines. Les régions variables kappa humaines sont celles dérivées de la recombinaison des VK et JK humains. 30. Le vertébré ou la cellule de l'aspect 27 ou 28, éventuellement où les insertions de segments de gènes lambda humains au niveau des loci kappa et lambda sont des insertions du même répertoire de segments de gènes lambda humains. 17 . Le vertébré ou la cellule de l'aspect 27 ou 28, éventuellement où les insertions de segments de gènes lambda humains au niveau des loci kappa sont différentes des insertions de segments de gènes lambda humains au niveau des loci lambda. Ceci est utile pour étendre le répertoire potentiel des régions variables pour une sélection subséquente contre un antigène. 32. Un vertébré non humain ou une cellule de vertébré non humain (par exemple, une souris, un rat, une cellule de souris ou une cellule de rat) dont le génome comprend un répertoire de segments de gènes Ig produits par insertion ciblée de segments de gènes Ig humains dans un ou plusieurs loci Ig endogènes, le génome comprenant l'arrangement suivant des loci des chaînes légères (a) L au niveau d'un allèle de chaîne kappa endogène et K au niveau de l'autre allèle de chaîne kappa endogène ; ou (b) L au niveau d'un allèle de chaîne lambda endogène et K au niveau de l'autre allèle de chaîne lambda endogène ; ou (c) L au niveau des deux allèles de chaîne kappa endogène ; (d) L au niveau des deux allèles de chaîne lambda endogène ; (e) L au niveau d'un allèle de chaîne kappa endogène et l'autre allèle de chaîne kappa endogène a été inactivé ; ou (f) L au niveau d'un allèle de chaîne lambda endogène et l'autre allèle de chaîne lambda endogène a été inactivé ; Où L représente une insertion de segments de gènes lambda humains d'au moins les VÀ et JÀ humains fonctionnels (éventuellement aussi les segments de gènes CÀ) composés d'un locus Ig de chaîne lambda humaine de VÀ3-1 à CÀ7 (par exemple, composés d'un locus Ig de chaîne lambda humaine de 2-18 à CÀ7) ; et K représente une insertion de VK et JK humains ; Où dans le génome, les segments de gènes humains sont insérés en amont d'une région constante pour l'expression des chaînes légères comprenant des régions 35 variables dérivées de la recombinaison de segments de gènes V et J humains. 30 18 . Le vertébré ou la cellule de l'aspect 32, éventuellement où le génome comprend l'arrangement (a) et L au niveau d'un ou des deux allèles de chaîne lambda endogène ; ou (a) et K au niveau d'un ou des deux allèles de chaîne lambda endogène ; ou (a) et L au niveau d'un allèle de chaîne lambda endogène et K au niveau de l'autre allèle de chaîne lambda endogène ; ou (b) et L au niveau d'un ou des deux allèles de chaîne kappa endogène ; ou (b) et K au niveau d'un ou des deux allèles de chaîne kappa endogène ; ou (b) et L au niveau d'un allèle de chaîne kappa endogène et K au niveau de l'autre allèle de chaîne kappa endogène ; ou (c) et K au niveau d'un ou des deux allèles de chaîne lambda endogène ; ou (c) et L au niveau d'un ou des deux allèles de chaîne lambda endogène ; ou (c) et L au niveau d'un allèle de chaîne lambda endogène et K au niveau de l'autre allèle de chaîne lambda endogène ; ou (c) et les deux allèles de chaîne lambda endogène ont été inactivés ; ou (d) et L au niveau d'un ou des deux allèles de chaîne kappa endogène ; ou (d) et K au niveau d'un ou des deux allèles de chaîne kappa endogène ; ou (d) et L au niveau d'un allèle de chaîne kappa endogène et K au niveau de l'autre allèle de chaîne kappa endogène ; ou (d) et les deux allèles de chaîne kappa endogène ont été inactivés. 34. Le vertébré ou la cellule de l'aspect 32 ou 33, éventuellement où l'expression des chaînes kappa endogènes est substantiellement ou complètement inactivée. Les chaînes kappa endogènes sont des chaînes légères kappa comprenant des régions variables dérivées de la recombinaison de segments de gènes VK et JK endogènes (de vertébré non humain). 35. Le vertébré ou la cellule de l'aspect 32, 33 ou 34, éventuellement où l'expression des chaînes lambda endogènes est substantiellement ou complètement inactive. Les chaînes lambda endogènes sont des chaînes légères lambda comprenant des régions variables dérivées de la recombinaison de segments de gènes VA et JÀ endogènes (de 19 vertébré non humain). 36. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects 32 à 35, éventuellement où chaque insertion de L est en amont d'une région constante lambda ou kappa endogène. 37. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects 32 à 36, éventuellement où chaque insertion de L dans un locus lambda est en amont d'une région constante lambda endogène. 38. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects 32 à 36, éventuellement où chaque insertion de L dans un locus kappa est en amont d'une région constante kappa endogène. 39. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects 32 à 35, éventuellement où chaque insertion de L dans un locus lambda est en amont d'une région constante lambda humaine. 40. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects 32 à 35, éventuellement où chaque insertion de L dans un locus kappa est en amont d'une région constante kappa humaine. 41. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects 32 à 40, éventuellement où chaque insertion de K est en amont d'une région constante lambda ou kappa endogène. 42. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects 32 à 41, éventuellement où chaque insertion de K dans un locus lambda est en amont d'une région constante lambda endogène. 43. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects 32 à 42, éventuellement où chaque insertion de K dans un locus kappa est en amont d'une région constante kappa 20 endogène. 44. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects 32 à 40, éventuellement où chaque insertion de K dans un locus lambda est en amont d'une région constante lambda humaine. 45. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects 32 à 40 et 44, éventuellement où chaque insertion de K dans un locus kappa est en amont d'une région constante kappa humaine. 46. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects 32 à 45, éventuellement où les insertions sont selon l'un quelconque des aspects 1 à 9, 11 à 16 et 20 à 31. 47. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects 32 à 46, éventuellement où chaque insertion lambda humaine est selon l'un quelconque des aspects 1 à 9, 11 à 16 et 20 à 31. 48. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects 32 à 47, éventuellement où chaque insertion kappa humaine est selon l'un quelconque des aspects 1 à 9, 11 à 16 et 20 à 31. 49. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects 32 à 48, éventuellement où chaque insertion de lambda humaine comprend le répertoire des segments de gènes VÀ et JÀ (et éventuellement CÀ) humains. 50. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects 32 à 48, éventuellement où les première et deuxième (et éventuellement troisième) insertions lambda humaines sont réalisées et les insertions comprennent différents répertoires de segments de gènes VÀ et JÀ (et éventuellement CÀ) humains. 51. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects 32 à 50, éventuellement où chaque insertion kappa humaine comprend le répertoire des segments de gènes VK et 30 21 JK (et éventuellement CK) humains. 52. Le vertébré ou la cellule de l'un quelconque des aspects 32 à 50, éventuellement où les première et deuxième (et éventuellement troisième) insertions kappa humaines sont réalisées et les insertions comprennent différents répertoires de segments de gènes VK et JK (et éventuellement Ck) humains. 53. Le vertébré ou la cellule selon l'un quelconque des aspects précédents, éventuellement où le génome comprend un locus de chaîne lourde d'immunoglobuline comprenant des segments de gènes VH humains, par exemple, un locus de chaîne lourde tel que décrit dans ce document qui comprend des segments de gènes V, D et J humains. 54. Un procédé de production d'un anticorps ou d'une chaîne légère comprenant une région variable lambda spécifique d'un antigène souhaité, le procédé comprenant l'immunisation d'un vertébré selon l'un quelconque des aspects précédents avec l'antigène souhaité et la récupération de l'anticorps ou de la chaîne légère ou la récupération d'une cellule produisant l'anticorps ou la chaîne légère. 55. Un procédé de production d'un anticorps totalement humanisé ou d'une chaîne légère d'anticorps comprenant la réalisation du procédé de l'aspect 54 pour obtenir un anticorps ou une chaîne légère comprenant une région constante de vertébré non humain de chaîne lambda, et le remplacement de la région constante de vertébré non humain par une région constante humaine, éventuellement en modifiant l'acide nucléique codant pour l'anticorps ou la chaîne légère. 56. Un anticorps humanisé ou une chaîne légère d'anticorps produit selon l'aspect 54 ou un dérivé de ceux-ci ; éventuellement pour un usage en médecine. 57. Utilisation d'un anticorps humanisé ou d'une chaîne produit selon l'aspect 54, ou d'un dérivé de ceux-ci en médecine. 22 . Un procédé d'inactivation de régions Ig-VJ endogènes dans le génome d'un vertébré non humain ou d'une cellule de vertébré non humain (par exemple, une souris, un rat, une cellule de souris ou une cellule de rat), où le procédé comprend l'insertion de segments de gènes d'immunoglobulines humaines (par exemple, des segments de gènes V et J) dans le génome entre l'Ig-VJ endogène et un amplificateur endogène ou une région constante endogène pour éloigner la région endogène de l'amplificateur ou de la région constante, inactivant de cette manière les Ig-VJ endogènes. Dans un mode de réalisation, les Ig-VJ endogènes sont des segments de gènes de chaîne lourde, l'amplificateur est un amplificateur de chaîne lourde endogène, la région constante est une région constante de chaîne lourde endogène et les segments de gènes Ig humains comprennent des segments de gènes VH, DH et JH humains. Dans un mode de réalisation, les Ig-VJ endogènes sont des segments de gènes de chaîne lourde lambda, l'amplificateur est un amplificateur de chaîne lourde lambda endogène, la région constante est une région constante de chaîne lambda endogène et les segments de gènes Ig humains comprennent des segments de gènes VIS et JÀ humains.

Dans un mode de réalisation, les Ig-VJ endogènes sont des segments de gènes de chaîne légère kappa, l'amplificateur est un amplificateur de chaîne kappa endogène, la région constante est une région constante de chaîne kappa endogène et les segments de gènes Ig humains comprennent des segments de gènes VK et JK humains.

Un procédé d'inactivation des régions IgK-VJ endogènes dans le génome d'un vertébré non humain ou d'une cellule de vertébré non humain (par exemple, une souris, un rat, une cellule de souris ou une cellule de rat), où le procédé comprend l'insertion de segments de gènes d'immunoglobulines humaines dans le génome entre l'IgK-VJ endogène et l'amplificateur EK pour éloigner l'IgK-VJ de l'amplificateur EK, inactivant de cette manière les régions IgK-VJ endogènes. 59. Le procédé de l'aspect 58, où éventuellement les segments de gènes humains comprennent des segments de gènes VL et JL humains ; éventuellement où l'insertion est une insertion telle que citée dans l'un quelconque des aspects 1 à 9, 11 à 16 et 20 à 31 ou une insertion de segments de gènes VK et JK humains. 23 . Un procédé d'expression de chaîne légère d'immunoglobuline chez un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat), les chaînes légères comprenant des régions variables lambda (chaînes légères lambda), où au moins 70 ou 80 % (par exemple, au moins 70, 75, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 %) des régions variables des chaînes légères lambda exprimées par le vertébré sont dérivées d'une recombinaison de segments de gènes VÀ et JÀ humains, le procédé comprenant la fourniture dans le génome de vertébré d'un répertoire de segments de gènes Ig produits par une insertion ciblée de segments de gènes Ig humains dans un ou plusieurs loci Ig endogènes, le génome comprenant des segments de gènes VÀ et JA humains en amont d'une région constante, où le procédé comprend l'insertion d'au moins les segments de gènes VA et JÀ humains fonctionnels (éventuellement aussi des CÀ humains) (et éventuellement des séquences de segments intergéniques) composés d'un locus Ig de chaîne lambda humaine de VÀ2-18 à CA7 dans un locus de chaîne légère endogène du vertébré, où au moins 70 ou 80 % (par exemple, au moins 70, 75, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 %) des régions variables des chaînes légères lambda exprimées par le vertébré sont dérivées d'une recombinaison de segments de gènes VA et JA humains ; le procédé comprenant l'expression desdites chaînes légères chez le vertébré et éventuellement l'isolement d'une ou de plusieurs desdites chaînes légères (par exemple, faisant partie d'un anticorps à 4 chaînes).

Dans un mode de réalisation, le procédé comprend en outre l'isolement à partir du vertébré d'une chaîne légère lambda comprenant une région variable dérivée d'une recombinaison de segments de gènes VA et JA humains. Dans un exemple, le procédé comprend l'immunisation de la souris avec un antigène (par exemple, un antigène humain) avant l'isolement de la chaîne légère lambda. Dans un exemple, la chaîne légère fait partie d'un anticorps, par exemple, un anticorps qui lie spécifiquement l'antigène. Dans un mode de réalisation, l'utilisation comprend en outre l'isolement de tissu splénique (par exemple, la rate) à partir de la souris ; ceci éventuellement suivi de l'isolement d'au moins une cellule B spécifique de l'antigène à partir du tissu, où la ou les cellules B expriment ladite chaîne légère lambda. Par exemple, ladite chaîne légère lambda est fournie par un anticorps qui lie spécifiquement un antigène prédéterminé (par exemple, un antigène humain). Dans un exemple, l'utilisation comprend l'immunisation de la souris avec l'antigène (par exemple, un antigène humain) avant l'isolement du tissu splénique ou de la chaîne légère lambda. Dans un exemple, l'utilisation comprend l'isolement de la chaîne légère lambda produite par la cellule B 24 (ou par un hybridome produit par la fusion de la cellule B avec une cellule de myélome). Dans un exemple, l'utilisation comprend la fabrication d'un hybridome à partir d'une cellule isolée du tissu splénique, où l'hybridome exprime ladite chaîne légère lambda ou un dérivé de celle-ci. Eventuellement, l'utilisation comprend la fabrication d'un dérivé de l'anticorps ou de la chaîne légère lambda isolé. Les exemples d'anticorps dérivés (selon un aspect quelconque dans ce document) sont des anticorps qui comportent une ou plusieurs mutations comparativement à l'anticorps isolé (par exemple, pour améliorer l'affinité de liaison d'un antigène et/ou pour amplifier ou inactiver la fonction Fc). De tels mutants lient spécifiquement l'antigène. Une mutation ou une adaptation pour produire un dérivé comprend, par exemple, une mutation pour produire une amplification ou une inactivation de Fc. Un dérivé peut être un anticorps à la suite d'une conjugaison à une charge toxique ou à un rapporteur ou à un marqueur ou à un autre fragment actif. Dans un autre exemple, une chaîne d'anticorps chimérique ou un anticorps isolé d'une cellule de vertébré de l'invention est modifié en remplaçant une ou la totalité des régions constantes humaines de ceux-ci par une région constante humaine correspondante. Par exemple, toutes les régions constantes d'un anticorps isolé à partir d'une telle cellule ou d'un tel vertébré sont remplacées par des régions constantes humaines pour produire un anticorps totalement hurimin (c'est-à-dire, comprenant des régions variables et constantes humaines). Un tel anticorps est utile pour une administration à des patients humains pour réduire la réaction anti-anticorps par le patient. 61. Un procédé d'expression de chaînes légères d'immunoglobulines chez un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat), où au moins 60 % (par exemple, au moins 65, 70, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 %) des chaînes légères exprimées par le vertébré sont fournies par des chaînes légères lambda humaines, le procédé comprenant la fourniture dans le génome du vertébré d'un répertoire de segments de gènes Ig produits par une insertion ciblée de segments de gènes Ig humains dans un ou plusieurs loci Ig endogènes, le génome comprenant (i) des segments de gènes VA et JÀ humains en amont d'une région constante, où les segments de gènes VA et JÀ humains sont fournis par insertion d'au moins les segments de gènes VA et JÀ humains fonctionnels (éventuellement aussi les ÇÀ humains) (et éventuellement des séquences de segments intergéniques) composés d'un locus Ig de chaîne lambda humaine de VA2-18 à CA7 dans un locus de chaîne légère endogène du vertébré et (ii) des segments de gènes V kappa en amont d'une région constante, où le vertébré exprime des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des régions variables lambda humaines (chaînes légères lambda humaines) et au moins 60 % (par exemple, plus de 25 , 70, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 %) des chaînes légères exprimées par le vertébré sont fournies par lesdites chaînes légères lambda humaines ; le procédé comprenant l'expression desdites chaînes légères chez le vertébré et éventuellement l'isolement d'une ou de plusieurs desdites chaînes légères (par exemple, faisant partie d'un anticorps à 4 chaînes). Dans un mode de réalisation, le procédé comprend en outre l'isolement à partir du vertébré d'une chaîne légère lambda comprenant une région variable dérivée de la recombinaison de segments de gènes VÀ et JÀ humains. Dans un exemple, le procédé comprend l'immunisation de la souris avec un antigène (par exemple, un antigène humain) avant l'isolement de la chaîne légère lambda. Dans un exemple, la chaîne légère fait partie d'un anticorps, par exemple, un anticorps qui lie spécifiquement l'antigène.

Dans un mode de réalisation, l'utilisation comprend en outre l'isolement de tissu splénique (par exemple, la rate) à partir de la souris ; ceci éventuellement suivi d'un isolement d'au moins une cellule B spécifique de l'antigène à partir du tissu, où la ou les cellules B expriment ladite chaîne légère lambda. Par exemple, ladite chaîne légère lambda est fournie par un anticorps qui lie spécifiquement un antigène prédéterminé (par exemple, un antigène humain). Dans un exemple, l'utilisation comprend l'immunisation de la souris avec l'antigène (par exemple, un antigène humain) avant l'isolement du tissu splénique ou de la chaîne légère lambda. Dans un exemple, l'utilisation comprend l'isolement de la chaîne légère lambda produite par la cellule B (ou par un hybridome produit par fusion de la cellule B avec une cellule de myélome).

Dans un exemple, l'utilisation comprend la fabrication d'un hybridome à partir d'une cellule B isolée à partir du tissu splénique, où l'hybridome exprime ladite chaîne légère lambda ou un dérivé de celle-ci. Eventuellement, l'utilisation comprend la fabrication d'un dérivé de l'anticorps ou de la chaîne légère lambda isolé. Les exemples d'anticorps dérivés (selon un aspect quelconque dans ce document) sont des anticorps qui comportent une ou plusieurs mutations comparativement à l'anticorps isolé (par exemple, pour améliorer l'affinité de liaison d'un antigène et/ou pour amplifier ou inactiver la fonction Fc). De tels mutants lient spécifiquement l'antigène. 62. Un procédé d'expression de chaînes légères VJC d'immunoglobulines humaines chez un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat), le procédé comprenant la fourniture dans le génome du vertébré d'un répertoire de segments de gènes Ig humains produits par insertion ciblée de segments de gènes Ig humains dans un ou 26 plusieurs loci Ig endogènes, où le procédé comprend l'insertion d'au moins les segments de gènes VA, JA et CÀ humains fonctionnels (et éventuellement des séquences de segments intergéniques) composés d'un locus Ig de chaîne lambda humaine de VA3-1 à CA7 (par exemple, composés d'un locus Ig de chaîne lambda humaine de 2-18 à CA7) dans un locus de chaîne légère kappa de vertébré non humain endogène en amont d'une région constante kappa de vertébré non humain endogène pour l'expression d'une chaîne légère VJC humaine ; le procédé comprenant l'expression desdites chaînes légères chez le vertébré et éventuellement l'isolement d'une ou de plusieurs desdites chaînes légères (par exemple, faisant partie d'un anticorps à 4 chaînes). Dans un mode de réalisation, le procédé comprend en outre l'isolement à partir du vertébré d'une chaîne légère lambda comprenant une région variable dérivée d'une recombinaison de segments de gènes VA et JA humains. Dans un exemple, le procédé comprend l'immunisation de la souris avec un antigène (par exemple, un antigène humain) avant l'isolement de la chaîne légère lambda. Dans un exemple, la chaîne légère fait partie d'un anticorps, par exemple, un anticorps qui lie spécifiquement l'antigène.

Dans un mode de réalisation, l'utilisation comprend en outre l'isolement de tissu splénique (par exemple, la rate) à partir de la souris ; ceci éventuellement suivi de l'isolement d'au moins une cellule B spécifique d'un antigène à partir du tissu, où la ou les cellules B expriment ladite chaîne légère lambda. Par exemple, ladite chaîne légère lambda est fournie par un anticorps qui lie spécifiquement un antigène prédéterminé (par exemple, un antigène humain). Dans un exemple, l'utilisation comprend l'immunisation de la souris avec l'antigène (par exemple, un antigène humain) avant l'isolement du tissu splénique ou de la chaîne légère lambda. Dans un exemple, l'utilisation comprend l'isolement de la chaîne légère lambda produite par la cellule B (ou par un hybridome produit par fusion de la cellule B avec une cellule de myélome).

Dans un exemple, l'utilisation comprend la fabrication d'un hybridome à partir d'une cellule B isolée à partir du tissu splénique, où l'hybridome exprime ladite chaîne légère lambda ou un dérivé de celle-ci. Eventuellement, l'utilisation comprend la fabrication d'un dérivé de l'anticorps ou de la chaîne légère lambda isolé. Les exemples des anticorps dérivés (selon l'un quelconque des aspects dans ce document) sont des anticorps qui comportent une ou plusieurs mutations comparativement à l'anticorps isolé (par exemple, pour améliorer l'affinité de liaison d'un antigène et/ou amplifier ou 27 inactiver la fonction Fc). De tels mutants lient spécifiquement l'antigène. 63. Le procédé de l'un quelconque des aspects 38 à 40, éventuellement où le vertébré est selon l'un quelconque des autres aspects. 64. Une chaîne légère d'anticorps isolée selon le procédé de l'un quelconque des aspects 58 à 63 ou un dérivé de celle-ci, ou un anticorps comprenant une telle chaîne légère ou un dérivé ; éventuellement pour un usage en médecine. 65. Utilisation d'une chaîne légère d'anticorps isolée selon le procédé de l'un quelconque des aspects 58 à 63 ou d'un dérivé de celle-ci (ou d'un anticorps comprenant une telle chaîne légère ou un dérivé) en médecine. 66. Un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat) selon l'un quelconque des aspects 1 à 53 pour l'expression de chaînes légères comprenant des chaînes variables lambda (chaînes légères lambda), où au moins 70 ou 80 % (par exemple, au moins 70, 75, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 % ou 100 %) des régions variables des chaînes légères lambda exprimées par le vertébré sont dérivées d'une recombinaison de segments de gènes VÀ et JÀ humains.

Un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat) selon l'un quelconque des aspects 1 à 53 exprimant des chaînes légères comprenant des régions variables lambda (chaînes légères lambda), où au moins 70 ou 80 % (par exemple, au moins 70, 75, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 % ou 100 %) des régions variables des chaînes légères lambda exprimées par le vertébré sont dérivées d'une recombinaison de segments de gènes VÀ et JÀ humains. 67. Un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat) selon l'un quelconque des aspects 1 à 53 pour l'expression de chaînes légères, où au moins 60 % (par exemple, plus de 65, 70, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 % ou 100 %) des chaînes légères exprimées par le vertébré sont fournies par des chaînes légères lambda humaines. Un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat) selon l'un quelconque des aspects 1 à 53 exprimant des chaînes légères, où au moins 60 % (par exemple, plus de 65, 70, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 % ou 100 %) des chaînes légères 28 exprimées par le vertébré sont fournies par des chaînes légères lambda humaines. 68. Un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat) selon l'aspect 7 pour l'expression de chaînes légères comprenant des régions variables lambda (chaînes légères lambda), où l'expression des chaînes légères lambda comprenant des régions variables lambda humaines est prédominante sur l'expression des chaînes légères lambda comprenant des régions variables lambda de vertébré non humain endogènes ; et éventuellement pour l'inactivation de l'expression de régions variables lambda de vertébré non humain endogènes provenant du locus de chaîne légère endogène. Un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat) selon l'aspect 7 exprimant des chaînes légères comprenant des régions variables lambda (chaînes légères lambda), où l'expression des chaînes légères lambda comprenant des régions variables lambda humaines est prédominante sur l'expression des chaînes légères lambda comprenant des régions variables lambda de vertébré non humain endogènes ; et éventuellement pour l'inactivation de l'expression des régions variables lambda de vertébré non humain endogènes provenant du locus de chaîne légère endogène. 69. Un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat) selon l'aspect 7, 8, 9 ou 10 pour l'inactivation de l'expression des régions variables lambda de vertébré non humain endogènes provenant du locus de chaîne légère endogène. Le pourcentage d'expression ou le taux d'expression des chaînes d'anticorps peut être déterminé au niveau des transcrits d'ARNm des chaînes légères dans les cellules B (par exemple, les lymphocytes du sang périphérique). En variante ou en outre, le pourcentage d'expression est déterminé au niveau des chaînes légères d'anticorps dans le sérum ou le sang des vertébrés. En outre ou en variante, l'expression peut être déterminée par une analyse FACS (tri des cellules activées par fluorescence) des cellules B. Par exemple, en estimant l'expression de C kappa de souris ou de C lambda humaine à la surface cellulaire lorsque les régions variables lambda humaines sont exprimées avec des régions C kappa de souris ou C lambda humaines, respectivement. Le terme « chaîne légère lambda » dans ces aspects se rapporte à une chaîne légère comprenant une séquence de région variable (au niveau ARN ou acide aminé) dérivée de la recombinaison de segments de gènes VA et Ainsi, une « région variable 29 lambda humaine », par exemple, est une région variable dérivée de la recombinaison de segments de gènes VA et JA humains. La région constante peut être une région constante kappa ou lambda, par exemple, une région constante humaine ou de souris. Le vertébré dans ces exemples est, par exemple, naïf (c'est-à-dire, non immunisé avec un antigène prédéterminé, comme le terme est compris dans l'art ; par exemple, un tel vertébré quia été maintenu dans un environnement relativement stérile tel que celui fourni par une animalerie utilisée pour la R&D). Dans un autre exemple, le vertébré a été immunisé avec un antigène prédéterminé, par exemple, un antigène portant un épitope humain.

Une référence à des segments de gènes humains « fonctionnels » reconnaît que dans un locus lambda d'Ig humaines, cértains segments de gènes V sont des pseudogènes non fonctionnels (par exemple, VÀ3-17, VÀ3-15, VÀ3-13, VÀ3-7, VÀ3-6, VÀ2-5, VÀ3- 4, VÀ3-2 ; voir la base de données IMGT : à World Wide Web (www) imgt.org/IMGTrepertoire/index. php?section=LocusGenes&repertoire=locus&species=h uman&group=IGL. De même, JA4-CÀ4 et JA5-CÀ5 sont non fonctionnels chez les êtres humains. Le terme « fonctionnels » lorsqu'il est fait référence à des segments de gènes exclut les pseudogènes. Un exemple de segments de gènes VA humains fonctionnels est le groupe VA2-18, VÀ3-16, V2-14, VÀ3-12, VÀ2-11, VÀ3-10, VÀ3-9, VÀ2-8, VÀ4-3 et VÀ3-1. Un exemple de segments de gènes JÀ humains fonctionnels est le groupe JÀ1, JÀ2 et JÀ3 ; ou JÀ1, JÀ2 et JÀ7 ; ou JÀ2, JA3 et JÀ7 ; ou JÀ1, JA2, JÀ3 et JA7. Un exemple de segments de gènes CA humains fonctionnels est le groupe CÀ1, CÀ2 et CÀ3 ; ou CÀ1, CA2 et CÀ7 ; ou CÀ2, CA3 et CÀ7 ; ou CÀ1, CÀ2, CÀ3 et CÀ7. Dans un mode de réalisation, les chaînes légères lambda, conjointement avec les chaînes lourdes exprimées dans les cellules ou les vertébrés de l'invention, forment des anticorps. Les chaînes lourdes peuvent être exprimées à partir d'un locus de chaîne lourde transgénique tel que décrit dans ce document. Par exemple, le génome de la cellule ou de vertébré comprend un locus de chaîne lourde dans lequel se trouve un locus de chaîne lourde d'immunoglobuline chimérique comprenant un ou plusieurs segments de gènes V humains, un ou plusieurs segments de gènes D humains et un ou plusieurs segments de gènes J humains en amont d'une région constante mu de ladite espèce non humaine ; l'expression de chaîne lourde endogène a été substantiellement inactivée : et le locus de chaîne lourde comprend un amplificateur Ep de ladite espèce de vertébré non humain.

Dans un mode de réalisation du vertébré ou de la cellule, tous les amplificateurs endogènes sont délétés du locus endogène dans lequel les segments de gènes 30 humains sont insérés. Ainsi, lorsqu'un amplificateur humain (par exemple, EÀ) est inséré, celui-ci contrôle le locus transgénique en l'absence de l'effet d'autres amplificateurs endogènes (par exemple, les amplificateurs kappa si le locus est un amplificateur kappa endogène). Ceci peut être utile pour éviter des rapports d'expression de kappa/lambda de type vertébré non humain (par exemple, pour diriger l'expression vers un rapport supérieur de lambda/kappa chez les souris). Lorsque l'expression des chaînes légères endogènes (par exemple, kappa ou lambda) est substantiellement inactive ou inactivée comme il a été décrit dans ce document, moins de 10,5,4,3,2,1 ou 0,5 % de ces chaînes légères endogènes sont exprimées ou exprimables. Dans un exemple, il y a une inactivation complète si bien qu'aucune de ces chaînes légères n'est exprimée ou exprimable. Eventuellement, le vertébré de l'invention est naïf. Ainsi, le vertébré n'a pas été immunisé avec un antigène prédéterminé.

Où, par exemple, une cellule de l'invention est une cellule ES ou une autre cellule souche IPS ou une autre cellule souche pluripotente, la cellule peut se développer chez un vertébré de l'invention. Par exemple, la cellule peut être implantée dans un blastocyste provenant d'une mère porteuse et développée dans un embryon et un animal selon des techniques classiques. Dans un mode de réalisation, où des segments de gènes kappa humains sont insérés, chaque insertion comprend des segments de gènes kappa humains (i) VK1-5, VK1-6, VK1-8 et VK1-9 (et éventuellement VK5-2 et VK4-1) ; ou (ii) VK1-5, VK1-6, VK1-8, VK1-9, VK3-11, VK1-12, VK3-15, VK1-16, VK1-17, VK3- 20 (et éventuellement VK 2-24 et/ou VK1-13) ; ou (iii) VK1-5, VK1-6, VK1-8, VK1-9, VK3-11, VK1-12, VK3-15, VK1-16, VK1-17, VK3- 20, VK 2-24, VK1-27, VK2-28, VK2-30 et VK1-33 (et éventuellement VK 2-29 et/ou VK2-40 prix/ou VK1-39); et éventuellement (iv) JK1, JK2, JK3, JK4 et JK5.

Dans un mode de réalisation, l'insertion de kappa humaine comprend également un iEK humain et/ou un 3'EK humain en aval des segments de gènes J humains dans le locus. 31 Les souris transgéniques de l'invention exprimant essentiellement exclusivement des régions de chaînes lourdes humaines développent des compartiments splénique et de MO normaux et une expression normale des lq où les lq comprennent des régions variables de chaînes lourdes humaines Les présents inventeurs ont observé, de manière surprenante, une expression des sous-types des Ig et un développement des cellules B normaux chez les souris transgéniques de l'invention exprimant des anticorps avec des régions variables de chaînes lourdes humaines en l'absence de l'expression des chaînes lourdes et kappa endogènes. Voir l'exemple 16 ci-dessous.

Les inventeurs ont observé que, de manière surprenante, l'inactivation de l'expression des régions variables des chaînes lourdes endogènes en présence de l'expression des régions variables humaines ne change pas le rapport des cellules B dans le compartiment splénique (figure 66) ou le compartiment des progéniteurs B de la moelle osseuse (figure 67) et les taux d'immunoglobulines dans le sérum sont normaux et les sous-types d'Ig corrects sont exprimés (figure 68). Ces données démontrent que les segments de gènes de chaînes lourdes humains insérés selon l'invention (par exemple, une insertion d'au moins les segments de gènes VH humains VH2-5, 7-4-1, 4-4,1-3,1-2,6-1, et de tous les segments de gènes D et JH humains D1-1, 2-2, 3-3, 4-4,5-5,6-6,1-7,2-8,3-9,5-12,6-13,2-15,3-16,4-17,6-19,1-20,2-21,3-22, 6-25,1-26 et 7-27 ; et J1, J2, J3, J4, J5 et J6, éventuellement les allèles du tableau 7) sont totalement fonctionnels pour le réarrangement des segments de gènes VDJ provenant du locus de chaîne lourde transgénique, la signalisation des récepteurs des cellules B (RCB) et la maturation correcte des cellules B. Par conséquent, l'invention propose les aspects suivants (la numérotation démarrant à l'aspect 70) : 70. Une souris qui exprime ou pour exprimer des chaînes lourdes d'immunoglobulines comprenant des régions variables humaines, où les chaînes lourdes exprimées par la souris sont essentiellement exclusivement lesdites chaînes lourdes comprenant des régions variables humaines ; et lesdites chaînes lourdes comprenant des régions variables humaines sont exprimées comme partie des anticorps sériques IgG1,IgG2b et IgM (et éventuellement IgG2a) chez la souris ; La souris comprenant un locus de chaîne lourde d'immunoglobuline comprenant des segments de gènes VH, DH et JH humains en amont d'une région constante de souris (par exemple, C-mu et/ou C-delta et/ou C-gamma ; comme (dans une orientation 5' à 32 ') C-mu de souris et C-delta de souris et C-gamma de souris), où (a) la souris est capable d'exprimer des chaînes lourdes d'immunoglobulines comprenant des régions variables humaines et les chaînes lourdes exprimées par la souris sont essentiellement exclusivement lesdites chaînes lourdes comprenant des régions variables humaines ; et (b) la souris exprime des anticorps sériques IgG1,IgG2b et IgM (et éventuellement IgG2a) comprenant lesdites chaînes lourdes.

Les isotypes des Ig peuvent être déterminés, par exemple, en utilisant des anticorps outils d'isotype correspondant que l'homme du métier connaît bien (et comme il est illustré dans l'exemple 16). Dans un mode de réalisation, la souris est naïve. 71. La souris de l'aspect 70 pour exprimer une proportion relative normale d'anticorps sériques IgG1, IgG2a, IgG2b et IgM. Par « normal », il est signifié comparable à l'expression chez une souris (par exemple, une souris naïve) exprimant seulement des chaînes d'anticorps de souris, par exemple, une souris dont le génome comprend seulement des loci de chaîne lourdes et légères d'Ig fonctionnels de type sauvage, par exemple, une souris de type sauvage. 72. La souris de l'aspect 70 ou 71, où la souris exprime une proportion relative normale d'anticorps sériques IgG1, IgG2a, IgG2b et IgM.

Par « normal », il est signifié comparable à l'expression chez une souris (par exemple, une souris naïve) exprimant seulement des chaînes d'anticorps de souris, par exemple, une souris dont le génome comprend seulement des loci de chaîne lourdes et légères d'Ig fonctionnels de type sauvage, par exemple, une souris de type sauvage. 73. La souris de l'un quelconque des aspects 70 à 72, pour l'expression chez la souris (i) d'IgG1 sériques à une concentration d'environ 25 à 350 pg/ml ; (ii) d'IgG2a sériques à une concentration d'environ 0 à 200 pg/ml ; (iii) d'IgG2b sériques à une concentration d'environ 30 à 800 pg/ml ; et (iv) d'IgM sériques à une concentration d'environ 50 à 300 pg/ml ; 35 OU 33 (i) d'IgG1 sériques à une concentration d'environ 10 à 600 pg/ml ; (ii) d'IgG2a sériques à une concentration d'environ 0 à 500 pg/ml ; (iii) d'IgG2b sériques à une concentration d'environ 20 à 700 pg/ml ; et (iv) d'IgM sériques à une concentration d'environ 50 à 700 pg/ml ; comme il est déterminé par une capture d'Ig sur une plaque suivie d'une incubation (par exemple, pendant une heure à TA, par exemple, pendant une heure à 20 °C) avec des anticorps marqués spécifiques d'un isotype anti-souris et quantification des Ig en utilisant le marqueur (par exemple, en utilisant des anticorps spécifiques d'un isotype d'Ig anti-souris, chacun conjugué à de la peroxydase de raifort dans un rapport de 1/10000 dans du PBS avec 0,1 % de TweenTM, ceci suivi du développement du marqueur avec un substrat de tétraméthylbenzidine (TMB) pendant 4 à 5 minutes dans l'obscurité à température ambiante (par exemple, 20 °C), de l'addition d'acide sulfurique pour stopper le développement du marqueur et de la lecture du marqueur à 450 nm). Par exemple, la souris de l'un quelconque des aspects 70 à 72, pour l'expression chez la souris (i) d'IgG1 sériques à une concentration d'environ 25 à 150 pg/ml ; (ii) d'IgG2a sériques à une concentration d'environ 0 à 200 pg/ml ; (iii) d'IgG2b sériques à une concentration d'environ 30 à 300 pg/ml ; et (iv) d'IgM sériques à une concentration d'environ 50 à 200 pg/ml ; ou (i) d'IgG1 sériques à une concentration d'environ 10 à 200 pg/ml ; (ii) d'IgG2a sériques à une concentration d'environ 0 à 500 pg/mt ; (iii) d'IgG2b sériques à une concentration d'environ 20 à 400 pg/ml ; et (iv) d'IgM sériques à une concentration d'environ 50 à 700 pg/ml ; comme il est déterminé par une capture d'Ig sur une plaque suivie d'une incubation (par exemple, pendant une heure à TA, par exemple, pendant une heure à 20 °C) avec des anticorps marqués spécifiques d'un isotype anti-souris et quantification des Ig en utilisant le marqueur (par exemple, en utilisant des anticorps spécifiques d'un isotype d'Ig anti-souris, chacun conjugué à de la peroxydase de raifort dans un rapport de 1/10000 dans du PBS avec 0,1 % de Tweedm, ceci suivi du développement du 34 marqueur avec un substrat de tétraméthylbenzidine (TMB) pendant 4 à 5 minutes dans l'obscurité à température ambiante (par exemple, 20 °C), de l'addition d'acide sulfurique pour stopper le développement du marqueur et de la lecture du marqueur à 450 nm).

La souris de l'un quelconque des aspects 70 à 72, pour l'expression chez la souris des Ig dans les proportions relatives (i) d'IgG1 sériques à une concentration d'environ 25 à 350 pg/ml ; (ii) d'IgG2a sériques à une concentration d'environ 0 à 200 pg/ml ; (iii) d'IgG2b sériques à une concentration d'environ 30 à 800 pg/ml ; et (iv) d'IgM sériques à une concentration d'environ 50 à 300 pg/ml ; ou (i) d'IgG1 sériques à une concentration d'environ 10 à 600 pg/ml ; (ii) d'IgG2a sériques à une concentration d'environ 0 à 500 pg/ml ; (iii) d'IgG2b sériques à une concentration d'environ 20 à 700 pg/ml ; et (iv) d'IgM sériques à une concentration d'environ 50 à 700 pg/ml ; comme il est déterminé par une capture d'Ig sur une plaque suivie d'une incubation (par exemple, pendant une heure à TA, par exemple, pendant une heure à 20 °C) avec des anticorps marqués spécifiques d'un isotype anti-souris et quantification des Ig en utilisant le marqueur (par exemple, en utilisant des anticorps spécifiques d'un isotype d'Ig anti-souris, chacun conjugué à de la peroxydase de raifort dans un rapport de 1/10000 dans du PBS avec 0,1 % de TweenTM, ceci suivi du développement du marqueur avec un substrat de tétraméthylbenzidine (TMB) pendant 4 à 5 minutes dans l'obscurité à température ambiante (par exemple, 20 °C), de l'addition d'acide sulfurique pour stopper le développement du marqueur et de la lecture du marqueur à 450 nm).

Par exemple, la souris de l'un quelconque des aspects 70 à 72, pour l'expression chez la souris des Ig dans les proportions relatives (i) d'IgG1 sériques à une concentration d'environ 25 à 150 pg/ml ; (ii) d'IgG2a sériques à une concentration d'environ 0 à 200 pg/ml ; (iii) d'IgG2b sériques à une concentration d'environ 30 à 300 pg/ml ; et (iv) d'IgM sériques à une concentration d'environ 50 à 200 pg/ml ; OU 35 (i) d'IgG1 sériques à une concentration d'environ 10 à 200 pg/ml ; (ii) d'IgG2a sériques à une concentration d'environ 0 à 500 pg/ml ; (iii) d'IgG2b sériques à une concentration d'environ 20 à 400 pg/ml ; et (iv) d'IgM sériques à une concentration d'environ 50 à 700 pg/ml ; comme il est déterminé par une capture d'Ig sur une plaque suivie d'une incubation (par exemple, pendant une heure à TA, par exemple, pendant une heure à 20 °C) avec des anticorps marqués spécifiques d'un isotype anti-souris et quantification des Ig en utilisant le marqueur (par exemple, en utilisant des anticorps spécifiques d'un isotype d'Ig anti-souris, chacun conjugué à de la peroxydase de raifort dans un rapport de 1/10000 dans du PBS avec 0,1 % de TweenTM, ceci suivi du développement du marqueur avec un substrat de tétraméthylbenzidine (TMB) pendant 4 à 5 minutes dans l'obscurité à température ambiante (par exemple, 20 °C), de l'addition d'acide sulfurique pour stopper le développement du marqueur et de la lecture du marqueur à 450 nm). 74. La souris de l'un quelconque des aspects70 à 73, où la souris exprime (i) des IgG1 sériques à une concentration d'environ 25 à 350 pg/ml ; (ii) des IgG2a sériques à une concentration d'environ 0 à 200 pg/ml ; (iii) des IgG2b sériques à une concentration d'environ 30 à 800 pg/ml ; (iv) des IgM sériques à une concentration d'environ 50 à 300 pg/ml ; ou (i) des IgG1 sériques à une concentration d'environ 10 à 600 pg/ml ; (ii) des IgG2a sériques à une concentration d'environ 0 à 500 pg/ml ; (iii) des IgG2b sériques à une concentration d'environ 20 à 700 pg/ml ; et (iv) des IgM sériques à une concentration d'environ 50 à 700 pg/ml ; comme il est déterminé par une capture d'Ig sur une plaque suivie d'une incubation (par exemple, pendant une heure à TA, par exemple, pendant une heure à 20 °C) avec des anticorps marqués spécifiques d'un isotype anti-souris et quantification des Ig en utilisant le marqueur (par exemple, en utilisant des anticorps spécifiques d'un isotype d'Ig anti-souris, chacun conjugué à de la peroxydase de raifort dans un rapport de 1/10000 dans du PBS avec 0,1 `)/0 de TweenTM, ceci suivi du développement du marqueur avec un substrat de tétraméthylbenzidine (TMB) pendant 4 à 5 minutes dans 36 l'obscurité à température ambiante (par exemple, 20 °C), de l'addition d'acide sulfurique pour stopper le développement du marqueur et de la lecture du marqueur à 450 nm). Par exemple, la souris de l'un quelconque des aspects 70 à 72, où la souris exprime (i) des IgG1 sériques à une concentration d'environ 25 à 150 pg/ml ; (ii) des IgG2a sériques à une concentration d'environ 0 à 200 pg/ml ; (iii) des IgG2b sériques à une concentration d'environ 30 à 300 pg/ml ; et (iv) des IgM sériques à une concentration d'environ 50 à 200 pg/ml ; 10 ou (i) des IgG1 sériques à une concentration d'environ 10 à 200 pg/ml ; (ii) des IgG2a sériques à une concentration d'environ 0 à 500 pg/ml ; 15 (iii) des IgG2b sériques à une concentration d'environ 20 à 400 pg/m1; et (iv) des IgM sériques à une concentration d'environ 50 à 700 pg/ml ; comme il est déterminé par une capture d'Ig sur une plaque suivie d'une incubation (par exemple, pendant une heure à TA, par exemple, pendant une heure à 20 °C) avec 20 des anticorps marqués spécifiques d'un isotype anti-souris et quantification des Ig en utilisant le marqueur (par exemple, en utilisant des anticorps spécifiques d'un isotype d'Ig anti-souris, chacun conjugué à de la peroxydase de raifort dans un rapport de 1/10000 dans du PBS avec 0,1 % de TweenTM, ceci suivi du développement du marqueur avec un substrat de tétraméthylbenzidine (TMB) pendant 4 à 5 minutes dans 25 l'obscurité à température ambiante (par exemple, 20 °C), de l'addition d'acide sulfurique pour stopper le développement du marqueur et de la lecture du marqueur à 450 nm). La souris de l'un quelconque des aspects 70 à 73, où la souris exprime des Ig dans les 30 proportions relatives (i) d'IgG1 sériques à une concentration d'environ 25 à 350 pg/ml ; (ii) d'IgG2a sériques à une concentration d'environ 0 à 200 pg/ml ; (iii) d'IgG2b sériques à une concentration d'environ 30 à 800 pg/ml ; et (iv) d'lgM sériques à une concentration d'environ 50 à 300 pg/ml ; 35 OU 37 (i) d'IgG1 sériques à une concentration d'environ 10 à 600 pg/ml ; (ii) d'IgG2a sériques à une concentration d'environ 0 à 500 pg/ml ; (iii) d'IgG2b sériques à une concentration d'environ 20 à 700 pg/ml ; et (iv) d'IgM sériques à une concentration d'environ 50 à 700 pg/m1; comme il est déterminé par une capture d'Ig sur une plaque suivie d'une incubation (par exemple, pendant une heure à TA, par exemple, pendant une heure à 20 °C) avec des anticorps marqués spécifiques d'un isotype anti-souris et quantification des Ig en utilisant le marqueur (par exemple, en utilisant des anticorps spécifiques d'un isotype d'Ig anti-souris, chacun conjugué à de la peroxydase de raifort dans un rapport de 1/10000 dans du PBS avec 0,1 % de TweenTM, ceci suivi du développement du marqueur avec un substrat de tétraméthylbenzidine (TMB) pendant 4 à 5 minutes dans l'obscurité à température ambiante (par exemple, 20 °C), de l'addition d'acide sulfurique pour stopper le développement du marqueur et de la lecture du marqueur à 450 nm). Par exemple, la souris de l'un quelconque des aspects 70 à 72, où la souris exprime des Ig dans les proportions relatives (i) d'IgG1 sériques à une concentration d'environ 25 à 150 pg/ml ; (ii) d'IgG2a sériques à une concentration d'environ 0 à 200 pg/ml ; (iii) d'IgG2b sériques à une concentration d'environ 30 à 300 pg/ml ; et (iv) d'IgM sériques à une concentration d'environ 50 à 200 pg/ml ; OU (i) d'IgG1 sériques à une concentration d'environ 10 à 200 pg/ml ; (ii) d'IgG2a sériques à une concentration d'environ 0 à 500 pg/ml ; (iii) d'IgG2b sériques à une concentration d'environ 20 à 400 pg/ml ; et (iv) d'IgM sériques à une concentration d'environ 50 à 700 pg/ml ; comme il est déterminé par une capture d'Ig sur une plaque suivie d'une incubation (par exemple, pendant une heure à TA, par exemple, pendant une heure à 20 °C) avec des anticorps marqués spécifiques d'un isotype anti-souris et quantification des 1g en utilisant le marqueur (par exemple, en utilisant des anticorps spécifiques d'un isotype d'Ig anti-souris, chacun conjugué à de la peroxydase de raifort dans un rapport de 1/10000 dans du PBS avec 0,1 % de TweenTM, ceci suivi du développement du marqueur avec un substrat de tétraméthylbenzidine (TMB) pendant 4 à 5 minutes dans 38 l'obscurité à température ambiante (par exemple, 20 °C), de l'addition d'acide sulfurique pour stopper le développement du marqueur et de la lecture du marqueur à 450 nm). 75. La souris de l'un quelconque des aspects 70 à 74 pour l'expression desdites chaînes lourdes à partir des cellules B spléniques chez une souris qui produit une proportion ou un pourcentage normal de cellules B spléniques matures, par exemple comme il est déterminé par une analyse FACS.

Par « normal », il est signifié comparable à la production de cellules B spléniques matures chez une souris (par exemple, une souris naïve) exprimant seulement des chaînes d'anticorps de souris, par exemple, une souris dont le génome comprend seulement des loci de chaîne lourdes et légères d'Ig fonctionnels de type sauvage, par exemple, une souris de type sauvage.

Par exemple, au moins 40, 50, 60 ou 70 % des cellules B spléniques totales produites par la souris de l'invention sont des cellules B matures. Les cellules B spléniques sont B220+ et elles expriment B220 à des taux relativement élevés comme le sait l'homme du métier. Les cellules B spléniques matures expriment B220 et des IgD, les deux à des taux relativement élevés comme le sait l'homme du métier. L'expression des IgM est relativement basse dans les cellules B spléniques matures, à nouveau comme il est connu dans l'art. Par exemple, voir J Exp Med. 1999 Jul 5; 190(1): 75-89 ; "B cell development in the spleen takes place in discrete steps et is determined by the quality of B cell receptor-derived signais"; Loder F et al.

Eventuellement, la souris produit un rapport normal de cellules B spléniques T1, T2 et matures, par exemple, comme il est déterminé par une analyse FACS. Par exemple, la souris de l'invention produit environ 40 à 70 % de cellules B spléniques matures, 15 à 35 % de cellules spléniques T1 ; et 5 à 10 % de cellules spléniques T2 (le pourcentage est en référence à la population splénique totale B220-(hautement) positive). Par exemple, environ 40 à 60 % des cellules B spléniques matures, 15 à 30 % des cellules spléniques T1 ; et 5 à 10 % des cellules spléniques T2. Par « normal », il est signifié comparable à une proportion de cellules B spléniques T1/T2/matures chez une souris (par exemple, une souris naïve) exprimant seulement des chaînes d'anticorps de souris, par exemple, une souris dont le génome comprend seulement des loci de chaîne lourdes et légères d'Ig fonctionnels de type sauvage, par exemple, une souris 39 de type sauvage. 76. La souris de l'un quelconque des aspects 70 à 75, où la souris produit une proportion ou un pourcentage normal de cellules B spléniques matures, par exemple, comme il est déterminé par une analyse FACS. 77. Une souris qui exprime ou pour exprimer des chaînes lourdes d'immunoglobulines comprenant des régions variables humaines, où les chaînes lourdes exprimées par la souris sont essentiellement exclusivement lesdites chaînes lourdes comprenant des régions variables humaines et sont exprimées chez une souris qui produit une proportion ou un pourcentage normal de cellules B spléniques matures (par exemple, comme il est déterminé par une analyse FACS) ; la souris comprenant un locus de chaîne lourde d'immunoglobuline comprenant des segments de gènes VH, DH et JH humains en amont d'une région constante de souris (par exemple, C-mu et/ou C-delta et/ou C-gamma ; comme (dans une orientation 5' à 3') et où la souris produit une proportion ou un pourcentage normal de cellules B spléniques matures. Par « normal », il est signifié comparable à une proportion de cellules B spléniques matures chez une souris (par exemple, une souris naïve) exprimant seulement des chaînes d'anticorps de souris, par exemple, une souris dont le génome comprend seulement des loci de chaîne lourdes et légères d'Ig fonctionnels de type sauvage, par exemple, une souris de type sauvage. Par exemple, au moins 40, 50, 60 ou 70 % des cellules B spléniques totales produites par la souris de l'invention sont des cellules B matures. Les cellules B spléniques sont B220+ et elles expriment B220 à des taux relativement élevés comme le sait l'homme du métier. Les cellules B spléniques matures expriment B220 et des IgD, les deux à des taux relativement élevés comme le sait l'homme du métier. L'expression des IgM est relativement basse dans les cellules B spléniques matures, à nouveau comme il est connu dans l'art. Par exemple, voir J Exp Med. 1999 Jul 5; 190(1): 75-89; "B cell development in the spleen takes place in discrete steps et is determined by the quality of B cell receptor-derived signais"; Loder F et al. Eventuellement, la souris produit un rapport normal de cellules B spléniques T1, T2 et matures, par exemple, comme il est déterminé par une analyse FACS. Par exemple, la souris de l'invention produit environ 40 à 70 % de cellules B spléniques matures, 15 à 35 % de cellules spléniques T1 ; et 5 à 10 % de cellules spléniques T2 (le pourcentage est en référence à la population splénique totale B220-(hautement) positive). Par40 exemple, environ 40 à 60 % de cellules B spléniques matures, 15 à 30 % de cellules spléniques T1 ; et 5 à 10 % de cellule spléniques T2. Par « normal », il est signifié comparable à une proportion de cellules B spléniques T1/T2/matures chez une souris (par exemple, une souris naïve) exprimant seulement des chaînes d'anticorps de souris, par exemple, une souris dont le génome comprend seulement des loci de chaîne lourdes et légères d'Ig fonctionnels de type sauvage, par exemple, une souris de type sauvage. 78. La souris de l'un quelconque des aspects 70 à 77 pour l'expression desdites chaînes lourdes chez une souris qui produit une proportion ou un pourcentage normal de cellules progéniteurs des cellules B de la moelle osseuse (par exemple, comme il est déterminé par une analyse FACS). Dans un mode de réalisation, la souris est destinée à l'expression desdites chaînes lourdes chez une souris qui produit une proportion ou un pourcentage normal de pré-, pro- et prépro-cellules B de la moelle osseuse (par exemple, comme il est déterminé par une analyse FACS). Voir J Exp Med. 1991 May 1; 173(5): 1213-25; "Resolution et characterization of pro-B et pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow"; Hardy RR et al. pour de plus amples informations sur les cellules progéniteurs.

Par « normal », il est signifié comparable à une production de cellules B de la moelle osseuse chez une souris (par exemple, une souris naïve) exprimant seulement des chaînes d'anticorps de souris, par exemple, une souris dont le génome comprend seulement des loci de chaîne lourdes et légères d'Ig fonctionnels de type sauvage, par exemple, une souris de type sauvage. 79. La souris de l'un quelconque des aspects 70 à 78, où la souris produit une proportion ou un pourcentage normal de cellules progéniteurs des cellules B de la moelle osseuse (par exemple, comme il est déterminé par une analyse FACS).

Dans un mode de réalisation, la souris produit une proportion ou un pourcentage normal de pré-, pro- et prépro-cellules B de la moelle osseuse (par exemple, comme il est déterminé par une analyse FACS).

Par « normal », il est signifié comparable à une production de cellules B de la moelle osseuse chez une souris (par exemple, une souris naïve) exprimant seulement des chaînes d'anticorps de souris, par exemple, une souris dont le génome comprend 41 seulement des loci de chaîne lourdes et légères d'Ig fonctionnels de type sauvage, par exemple, une souris de type sauvage. 80. Une souris qui exprime ou pour exprimer des chaînes lourdes d'immunoglobulines comprenant des régions variables humaines, où les chaînes lourdes exprimées par la souris sont essentiellement exclusivement lesdites chaînes lourdes comprenant des régions variables humaines et sont exprimées chez une souris qui produit une proportion ou un pourcentage normal de cellules progéniteurs des cellules B de la moelle osseuse (par exemple, comme il est déterminé par une analyse FACS), la souris comprenant un locus de chaîne lourde d'immunoglobuline comprenant des segments de gènes VH, DH et JH humains en amont d'une région constante de souris (par exemple, C-mu et/ou C-delta et/ou C-gamma ; comme (dans une orientation 5' à 3') et où la souris produit une proportion ou un pourcentage normal de cellules progéniteurs des cellules B de la moelle osseuse.

Dans un mode de réalisation, la souris est destinée à l'expression desdites chaînes lourdes chez une souris qui produit une proportion ou un pourcentage normal de pré-, pro et prépro-cellules B de la moelle osseuse (par exemple, comme il est déterminé par une analyse FACS).

Par « normal », il est signifié comparable à une production de cellules B de la moelle osseuse chez une souris (par exemple, une souris naïve) exprimant seulement des chaînes d'anticorps de souris, par exemple, une souris dont le génome comprend seulement des loci de chaîne lourdes et légères d'Ig fonctionnels de type sauvage, par exemple, une souris de type sauvage. 81. La souris de l'un quelconque des aspects 70 à 80, où au moins 90 % des chaînes lourdes sont des chaînes lourdes comprenant des régions variables humaines.

Par exemple, au moins 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 99,5 % ou 100 % des chaînes lourdes comprennent des régions variables humaines, c'est-à-dire, des régions variables dérivées de la recombinaison de segments de gènes VH humains avec des segments de gènes D et JH humains. 82. La souris de l'un quelconque des aspects 70 à 81, où la région constante de souris comprend une région C-mu, une région C-delta et une région C-gamma de souris. 42 Dans un mode de réalisation, chacune des régions C est une région C de souris endogène. Dans un mode de réalisation, au moins les régions C-mu et C-delta sont des régions C de souris. Ceci est utile pour exploiter les mécanismes de contrôle endogènes impliqués dans le développement des divers types de cellules B et des progéniteurs dans la rate et la moelle osseuse. Dans un mode de réalisation, la région C-gamma est une région C-gamma humaine. Ceci est bénéfique pour produire des chaînes lourdes de type gamma avec permutation de classe chez la souris dans laquelle essentiellement la totalité des chaînes lourdes exprimées comportent des régions variables humaines et des régions constantes humaines. 83. La souris de l'un quelconque des aspects 70 à 82, où il y a un amplificateur de chaîne lourde de souris entre les segments de gènes humains et la région constante de souris. Ceci est utile pour exploiter les mécanismes de contrôle du développement des anticorps de souris et des cellules B endogènes. 84. La souris de l'un quelconque des aspects 70 à 83, où il y a une permutation S-mu de souris entre les segments de gènes humains et la région constante de souris. 85. La souris de l'un quelconque des aspects 70 à 84, où le génome de la souris comprend des segments de gènes V, D et J de locus de chaîne lourde de souris endogènes en amont des segments de gènes humains. 86. La souris de l'aspect 85, où les segments de gènes V, D et J de souris sont présents conjointement avec les séquences de segments intergéniques endogènes. 87. La souris de l'aspect 85 ou 86, où les segments de gènes de souris sont dans une orientation inversée. Ainsi, ils sont inversés par rapport à l'orientation de type sauvage dans un génome de souris. Ils sont ainsi inversés par rapport à l'orientation de la région constante de souris. 88. La souris de l'un quelconque des aspects 70 à 87, où la souris exprime des chaînes légères comprenant des régions variables humaines (par exemple, des chaînes légères kappa comprenant des régions variables kappa humaines). Ainsi, les régions variables humaines sont dérivées de la recombinaison de segments de gènes VL et JL humains, par exemple, de VK humains et de JK humains. 43 . La souris de l'aspect 88, comprenant des segments de gènes VK et JK humains en amont d'une CL de souris (par exemple, CK endogène) ; éventuellement où les segments de gènes VK et JK humains comprennent VK2-24, VK3-20, VK1-17, VK1-16, VK3-15, VK1-13, VK1-12, VK3-11, VK1-9, VK1-8, VK1-6, VK1-5, VK5-2, VK4-1, JK1, JK2, JK3, JK4 et JK5. Eventuellement où les segments de gènes sont les allèles du tableau 12. 90. La souris de l'un quelconque des aspects 70 à 89, où les segments de gènes VH, DH et JH humains comprennent les segments de gènes VH humains VH2-5, 7-4-1, 4-4, 1-3,1-2,6-1, et tous les segments de gènes D et JH humains D1-1,2-2,3-3,4-4,5- 5,6-6,1-7,2-8,3-9,5-12,6-13,2-15,3-16,4-17,6-19,1-20,2-21,3-22,6-25, 1-26 et 7-27 ; et J1, J2, J3, J4, J5 et J6. Par exemple, les segments de gènes VH, DH et JH humains comprennent les segments de gènes VH humains VH2-5, 7-4-1, 4-4, 1-3,1-2,6-1, et tous les segments de gènes D et JH humains D1-1, 2-2, 3-3, 4-4, 5- 5,6-6,1-7,2-8,3-9,3-10,4-11,5-12,6-13,1-14,2-15,3-16,4-17,5-18,6-19, 1-20,2-21,3-22,4-23,5-24,6-25,1-26 et 7-27 ; et J1, J2, J3, J4, J5 et J6. Eventuellement où les segments de gènes sont les allèles du tableau 7. 91 Utilisation de la souris de l'un quelconque des aspects 70 à 90 pour l'expression de chaînes lourdes d'immunoglobulines comprenant des régions variables humaines, où les chaînes lourdes exprimées par la souris sont essentiellement exclusivement lesdites chaînes lourdes comprenant des régions variables humaines ; et lesdites chaînes lourdes comprenant des régions variables humaines sont exprimées sous la forme de partie d'anticorps sériques IgG1,IgG2b et IgM (et éventuellement IgG2a) chez la souris. L'utilisation est une utilisation non thérapeutique, non diagnostique et non chirurgicale. Dans un mode de réalisation, l'utilisation comprend l'immunisation de la souris avec un antigène (par exemple, un antigène humain) et l'isolement d'un anticorps IgG1 qui lie spécifiquement l'antigène. Dans un mode de réalisation, l'utilisation comprend l'immunisation de la souris avec un antigène (par exemple, un antigène humain) et l'isolement d'un anticorps IgG2a qui lie spécifiquement l'antigène.

Dans un mode de réalisation, l'utilisation comprend l'immunisation de la souris avec un antigène (par exemple, un antigène humain) et l'isolement d'un anticorps IgG2b qui lie 44 spécifiquement l'antigène. Eventuellement, l'utilisation comprend la fabrication d'un dérivé de l'anticorps isolé. Les exemples d'anticorps dérivés (selon un aspect quelconque dans ce document) sont des anticorps qui comportent une ou plusieurs mutations comparativement à l'anticorps isolé (par exemple, pour améliorer l'affinité de liaison d'un antigène et/ou amplifier ou inactiver la fonction Fc). De tels mutants lient spécifiquement l'antigène. 92. Utilisation de la souris de l'un quelconque des aspects 70 à 90 pour l'expression de chaînes lourdes d'immunoglobulines comprenant des régions variables humaines, où les chaînes lourdes exprimées par la souris sont essentiellement exclusivement lesdites chaînes lourdes comprenant des régions variables humaines et sont exprimées chez une souris qui produit une proportion ou un pourcentage normal de cellules B spléniques matures. L'utilisation est une utilisation non thérapeutique, non diagnostique et non chirurgicale.

Dans un mode de réalisation, l'utilisation comprend en outre l'isolement de tissu splénique (par exemple, la rate) à partir de la souris ; ceci éventuellement suivi de l'isolement d'au moins une cellule B spécifique d'un antigène à partir du tissu, où la ou les cellules expriment un anticorps qui lie spécifiquement un antigène prédéterminé.

Dans un exemple, l'utilisation comprend l'immunisation de la souris avec l'antigène avant l'isolement du tissu splénique. Dans un exemple, l'utilisation comprend l'isolement d'un anticorps produit par la cellule B (ou par un hybridome produit par fusion de la cellule B avec une cellule de myélome). Eventuellement, l'utilisation comprend la fabrication d'un dérivé de l'anticorps isolé. Les exemples d'anticorps dérivés (selon un aspect quelconque dans ce document) sont des anticorps qui comportent une ou plusieurs mutations comparativement à l'anticorps isolé (par exemple, pour améliorer l'affinité de liaison d'un antigène et/ou amplifier ou inactiver la fonction Fc). De tels mutants lient spécifiquement l'antigène. 93. Utilisation de la souris de l'un quelconque des aspects 70 à 90 pour l'expression de chaînes lourdes d'immunoglobulines comprenant des régions variables humaines, où les chaînes lourdes exprimées par la souris sont essentiellement exclusivement lesdites chaînes lourdes comprenant des régions variables humaines et sont exprimées chez une souris qui produit une proportion ou un pourcentage normal de cellules progéniteurs des cellules B de la moelle osseuse. L'utilisation est une utilisation non thérapeutique, non diagnostique et non chirurgicale. 45 . Utilisation de la souris de l'un quelconque des aspects 70 à 90 pour l'objectif indiqué dans un ou plusieurs des aspects 70, 71, 73, 75 et 78. L'expression (par exemple, le pourcentage d'expression ou la proportion ou le taux d'expression) des Ig peut être déterminée au niveau des transcrits de l'ARNm de la chaîne de l'anticorps dans les cellules B (par exemple, les lymphocytes du sang périphérique). En variante ou en outre, le pourcentage d'expression est déterminé au niveau de l'anticorps dans le sérum ou le sang des vertébrés. En variante ou en autre, l'expression peut être déterminée par une analyse FACS des cellules B. Dans ces aspects, « chaînes lourdes comprenant des régions variables humaines » signifie des régions variables dérivées de la recombinaison de segments de gènes VH, D et JH humains. « Essentiellement exclusivement » en ce qui concerne les chaînes lourdes exprimées qui comprennent des régions variables humaines, signifie qu'il n'y a qu'une expression des régions variables des chaînes lourdes de souris endogènes relativement très basse voire même aucune. Par exemple, au moins 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 99,5 % ou 100 % des chaînes lourdes sont des chaînes lourdes comprenant des régions variables humaines. Dans un mode de réalisation, au moins 90 % des chaînes lourdes sont des chaînes lourdes comprenant des régions variables humaines. Le pourcentage d'expression peut être déterminé au niveau des transcrits d'ARNm des chaînes lourdes dans les cellules B (par exemple, les lymphocytes du sang périphérique). En variante ou en outre, le pourcentage d'expression est déterminé au niveau des chaînes lourdes ou des anticorps dans le sérum ou le sang des souris. En outre ou en variante, l'expression peut être déterminée par une analyse FACS des cellules B. La souris peut comprendre tout locus de chaîne lourde endogène dans lequel des segments de gènes V, D et J humains sont présents, comme il est décrit dans ce document. Dans un exemple, le génome de souris comprend un locus de chaîne lourde de souris dans lequel au moins les segments de gènes VH humains VH2-5, 74-1, 4-4, 1-3, 1-2, 6-1, et tous les segments de gènes D et JH humains D1-1, 2-2, 33, 4-4, 5-5, 6-6, 1-7, 2-8, 3-9, 5-12, 6-13, 2.-15, 3-16, 4-17, 6-19, 1-20, 2-21, 3- 22, 6-25, 1-26 et 7-27 ; et J1, J2, J3, J4, J5 et J6 sont en amont de la région constante de souris. Le vertébré dans ces aspects est, par exemple, naïf (c'est-à-dire, non immunisé avec un antigène prédéterminé, comme le terme est compris dans l'art ; par exemple, un tel vertébré qui a été gardé dans un environnement relativement stérile tel que fourni par 46 une animalerie utilisée pour la R&D). Dans un autre exemple, le vertébré a été immunisé avec un antigène, par exemple, un antigène portant un épitope humain. Dans un mode de réalisation, les chaînes lourdes, conjointement avec dès "chaînes légères exprimées chez les souris de l'invention, forment des anticorps (Ig). Les chaînes légères peuvent être exprimées à partir de n'importe quel locus de chaîne légère transgénique tel que décrit dans ce document. Par exemple, le génome de la souris comprend un locus de chaîne lourde dans lequel se situe un locus de chaîne lourde d'immunoglobuline chimérique comprenant un ou plusieurs segments de gènes V humains, un ou plusieurs segments de gènes D humains et un ou plusieurs segments de gènes J humains en amont d'une région constante mu de ladite espèce non humaine ; l'expression des chaînes lourdes endogènes a été substantiellement inactivée ; et le locus de chaîne lourde comprend un amplificateur Ep de ladite espèce de vertébré non humain. Dans un mode de réalisation de n'importe quel aspect, l'expression des chaînes légères endogènes (par exemple, kappa et/ou lambda) est substantiellement inactive ou inactivée, par exemple en utilisant le procédé tel que décrit dans ce document. Dans ce cas, moins de 10, 5, 4, 3, 2, 1 ou 0,5 % de ces chaînes légères lambda endogènes sont exprimées ou exprimables. En outre ou en variante, moins de 10, 5, 4, 3, 2, 1 ou 0,5 % de ces chaînes légères kappa endogènes sont exprimées ou exprimables. Dans un exemple, il y a une inactivation complète de l'expression des kappa et/ou lambda endogènes de telle manière qu'aucune de ces chaînes légères n'est exprimée ou exprimable. Dans un mode de réalisation, le génome de la souris comprend des-segments de gènes kappa humains (éventuellement les allèles du tableau 12) (i) W1-5, Vk1-6, Vk1-8 et W1-9 (et éventuellement VK5-2 et VK4-1) ; ou (ii) W1-5, Vk1-6, W1-8, W1-9, VK3-11, Vk1-12, VK3-15, VK1-16, VK1-17, Vk3- 20 (et éventuellement VK 2-24 et/ou VK1-13) ; ou (iii) Vk1-6, W1-8, Vk1-9, VK3-11, W1-12, W3-15, W1-16, Vk1-17, Vk3- 20, VK 2-24, W1-27, VK2-28, VK2-30 et W1-33 (et éventuellement VK 2-29 et/ou W2-40 et/ou W1-39) ; et éventuellement (iv) JK1, JK2, JK3, JK4 et JK5. 47 Dans un mode de réalisation, le génome comprend également (i) au moins les segments de gènes VH humains VH2-5,7-4-1,4-4,1-3,1-2,6-1, et tous les segments de gènes D et JH humains D1-1, 2-2, 3-3, 4-4, 5-5, 6-6, 1-7, 2-8, 3-9, 5- 12,6-13,2-15,3-16,4-17,6-19,1-20,2-21,3-22,6-25,1-26 et 7-27 ; et J1, J2, J3, J4, J5 et J6 (éventuellement les allèles du tableau 7) et (ii) au moins les segments de gènes humains W2-24, VK3-20, Vk1-17, Vk1-16, W3-15, Vk1-13, Vk3- 11, Vk1-9, Vk1-8, Vk1-6, Vk1-5, W5-2, W4-1, JK1, JK2, JK3, JK4 et JK5 (éventuellement les allèles du tableau 12). Comme il est démontré dans l'exemple 16, de telles souris sont totalement fonctionnelles dans l'aspect du réarrangement, de la signalisation des RCB et de la maturation des cellules B. Plus de 90 % des anticorps exprimés par les souris comprenaient des régions variables de chaînes lourdes humaines et des régions variables de chaînes légères kappa humaines. Par conséquent, ces souris sont très utiles pour la sélection d'anticorps comportant des régions variables humaines qui lient spécifiquement un antigène humain après l'immunisation des souris avec un tel antigène. Après l'isolement d'un tel anticorps, l'homme du métier peut remplacer les régions constantes de souris par des régions constantes humaines en utilisant des techniques traditionnelles pour aboutir à des anticorps totalement humains qui sont utiles en tant que médicaments candidats pour une administration à des êtres humains (éventuellement à la suite d'une mutation ou d'une adaptation pour produire un autre dérivé, par exemple, avec amplification ou inactivation de Fc ou à la suite d'une conjugaison à une charge toxique ou un rapporteur ou un marqueur ou un autre fragment actif). Dans un mode de réalisation, le génome comprend également un iEK humain et/ou un 3'EK humain en aval des segments de gènes J humains dans le locus.

L'invention comprend également les clauses suivantes : Clause 1. Une souris qui exprime des chaînes lourdes d'immunoglobulines contenant des régions variables humaines, où la souris comprend un génome qui inclut un locus de chaîne lourde 30 d'immunoglobuline comprenant des segments de gènes VH, DH, et JH humains positionnés en amont d'une région constante de souris ; où la souris exprime des chaînes lourdes d'immunoglobulines, caractérisées en ce qu'au moins 90 % des chaînes lourdes d'immunoglobulines exprimées par la souris comprennent une région variable humaine ; et 48 où la souris exprime des anticorps sériques IgG1, IgG2b, et IgM comprenant lesdites chaînes lourdes contenant une région variable humaine. Clause 2. Une souris qui exprime des chaînes lourdes d'immunoglobulines contenant des régions variables humaines, où la souris comprend un génome qui inclut un locus de chaîne lourde d'immunoglobuline comprenant des segments de gènes VH, DH, et JH humains qui sont positionnés en amont d'une région constante de souris ; où la souris exprime des chaînes lourdes d'immunoglobulines, caractérisées en ce qu'au moins 90 % des chaînes lourdes d'immunoglobulines exprimées par la souris comprennent une région variable humaine ; et où la souris produit une proportion normale de cellules B spléniques matures ; où ladite proportion normale est une proportion de cellules B spléniques matures produites par une souris qui exprime des chaînes lourdes d'immunoglobulines contenant des régions variables de souris et n'exprime pas des chaînes lourdes d'immunoglobulines contenant des régions variables humaines. Clause 3. Une souris qui exprime des chaînes lourdes d'immunoglobulines contenant des régions variables humaines, où la souris comprend un génome qui inclut un locus de chaîne lourde d'immunoglobuline comprenant des segments de gènes VH, DH, et JH humains qui sont positionnés en amont d'une région constante de souris ; où la souris exprime des chaînes lourdes d'immunoglobulines, caractérisées en ce qu'au moins 90% des chaînes lourdes d'immunoglobulines exprimées par la souris comprennent une région variable humaine ; et où la souris produit une proportion normale de cellules progéniteurs des cellules B de la moelle osseuse ; où la proportion normale est une proportion de cellules progéniteurs des cellules B de la moelle osseuse produites par une souris qui exprime des chaînes lourdes d'immunoglobulines contenant des régions variables de souris et n'exprime pas des chaînes lourdes d'immunoglobulines contenant des régions variables humaines. 49 Clause 4. La souris de l'une quelconque des clauses précédentes, où la souris exprime une proportion normale d'IgG1, d'IgG2b, et d'IgM dans un échantillon de sérum obtenu à partir de la souris ; où la proportion normale est telle que produite par une souris qui exprime des chaînes lourdes d'immunoglobulines contenant des régions variables de souris et n'exprime pas des chaînes lourdes d'immunoglobulines contenant des régions variables humaines. Clause 5. La souris de l'une quelconque des clauses précédentes, où la région constante de souris est C-mu , C-delta, et/ou C-gamma.

Clause 6. La souris de la clause 5, où la région constante de souris est au moins C- mu, C-delta et C-gamma. Clause 7. La souris de l'une quelconque des clauses précédentes, où la région constante de souris est une région C de souris endogène. Clause 8. La souris de l'une quelconque des clauses précédentes, où la souris exprime une région C-gamma humaine. Clause 9. La souris de l'une quelconque des clauses précédentes, où la souris est une souris naïve. Clause 10. La souris de la clause 1, où la souris exprime des IgG2a sériques comprenant lesdites chaînes lourdes contenant une région variable humaine.

Clause 11. La souris de l'une quelconque des clauses précédentes, où la souris exprime des sous-types d'Ig dans une proportion relative (i) d'IgG1 sériques à une concentration d'environ 25 à 350 pgiml ; (ii) d'IgG2a sériques à une concentration d'environ 0 à 200 pg/ml ; (iii) d'IgG2b sériques à une concentration d'environ 30 à 800 pg/ml ; et (iv) d'IgM sériques à une concentration d'environ 50 à 300 pg/ml ; Ou (i) d'IgG1 sériques à une concentration d'environ 10 à 600 pg/ml ; (ii) d'IgG2a sériques à une concentration d'environ 0 à 500 pg/ml ; (iii) d'IgG2b sériques à une concentration d'environ 20 à 700 pg/ml ; et (iv) d'IgM sériques à une concentration d'environ 50 à 700 pg/ml ; 50 comme il est déterminé par une capture d'immunoglobuline sur une plaque suivie d'une incubation avec des anticorps d'isotype spécifique anti-souris, chacun comprenant un marqueur et la quantification de chaque immunoglobuline en se basant sur le taux de chaque marqueur.

Clause 12. La souris de l'une quelconque des clauses précédentes, où la souris exprime des sous-types d'Ig dans une proportion relative (i) d'IgG et d'IgM sériques totales à une concentration d'environ 200 à 2500 pg/ml ; et (ii) d'IgM sériques à une concentration d'environ 100 à 800 pg/ml ; comme il est déterminé par une capture d'immunoglobuline sur une plaque suivie d'une incubation avec des anticorps d'isotype spécifique anti-souris, chacun comprenant un marqueur et la quantification de chaque immunoglobuline en se basant sur le taux de chaque marqueur. Clause 13. La souris de l'une quelconque des clauses précédentes, où la souris exprime lesdites chaînes lourdes d'immunoglobulines à partir des cellules B spléniques et où la souris produit une proportion normale de cellules B spléniques matures, au total les cellules spléniques comprenant des cellules B matures, et des cellules spléniques T1 et T2. Clause 14. La souris de l'une quelconque des clauses 1 à 3, où, au moins 95, 96, 97, 98, 99, ou 99,5 % des chaînes lourdes d'immunoglobulines exprimées par la souris sont des chaînes lourdes d'immunoglobulines comprenant des régions variables humaines. Clause 15. La souris de l'une quelconque des clauses précédentes, où un amplificateur de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris est positionné dans ledit locus de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris entre les segments de gènes VH, DH, et JH humains et la région constante de souris. Clause 16. La souris de l'une quelconque des clauses précédentes, où une permutation S-mu de souris est positionnée dans ledit locus de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris entre les segments de gènes VH, DH, et JH humains et la région constante de souris.

Clause 17. La souris de.l'une quelconque des clauses précédentes, où des segments de gènes V, D et J de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris endogènes 51 sont positionnés dans ledit locus de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris en amont des segments de gènes VH, DH, et JH humains. Clause 18. La souris de la clause 17, où les segments de gènes V, D et J de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris sont présents dans ledit locus de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris avec des séquences de segments intergénlques endogènes. Clause 19. La souris de la clause 17 ou 18, où les segments de gènes V, D et J de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris sont positionnés dans ledit locus de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris dans une orientation qui est inversée par rapport à son orientation endogène naturelle. Clause 20. La souris de l'une quelconque des clauses précédentes, où la souris exprime des chaînes légères contenant des régions variables kappa humaines. Clause 21. La souris de la clause 20, où la souris exprime des chaînes légères d'immunoglobulines dérivées d'une recombinaison de VK avec un JK humain.

Clause 22. La souris de l'une quelconque des clauses précédentes, où la souris exprime des chaînes légères contenant des régions variables lambda humaines. Clause 23. La souris de la clause 22, où la souris exprime des chaînes légères d'immunoglobulines dérivées d'une recombinaison de VÀ avec un JÀ humain. Clause 24. La souris de la clause 21, comprenant un génome qui inclut des segments de gènes VK et JK humains positionnés dans ledit locus de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris en amont d'une CL de souris. Clause 25. La souris de la clause 24, où la CL de souris est une CK endogène. Clause 26. La souris des clauses 24 ou 25, où les segments de gènes VK et JK humains comprennent VK2-24, VK3-20, Vk1-17, VK1-16, W3-15, VK1-13, Vk1-12, 25 W3-11, Vk1-9, W1-8, Vk1-6, Vk1-5, W5-2, VK4-1, JK1, JK2, JK3, JK4 et JK5. Clause 27. La souris de l'une quelconque des clauses précédentes, où les segments de gènes VH, DH et JH humains contiennent les segments de gènes VH humains : VH2-5, 7-4-1, 4-4, 1-3, 1-2, 6-1 ; les segments de gènes DH humains : D1-1, 2-2, 3-3, 4-4, 5-5, 6-6, 1-7, 2-8, 30 3-9,5-12,6-13,2-15,3-16,4-17,6-19,1-20,2-21,3-22,6-25,1-26 et 7-27 ; et 52 les segments de gènes JH humains : J1, J2, J3, J4, J5 et J6. Clause 28. Un procédé d'obtention d'une ou de plusieurs chaînes lourdes d'immunoglobulines contenant des régions variables humaines, comprenant la fourniture de la souris de l'une quelconque des clauses précédentes et l'isolement d'une ou de plusieurs chaînes lourdes d'immunoglobulines. Clause 29. Le procédé de la clause 28, dans lequel chaque chaîne lourde d'immunoglobuline est incluse dans un anticorps. Clause 30. Le procédé de la clause 29, dans lequel ladite chaîne lourde et/ou ledit anticorps contenant ladite chaîne lourde est modifié après ledit isolement. Clause 31. Le procédé de la clause 28, dans lequel une étape d'immunisation de la souris avec un antigène est réalisée avant l'étape d'isolement des chaînes lourdes d'immunoglobulines.

Clause 31a. Le procédé de la clause 30, dans lequel l'antigène est un antigène humain. Clause 32. Le procédé de la clause 30, 31, ou 31a, dans lequel les chaînes lourdes d'immunoglobulines sont incluses dans un anticorps IgG1, un fragment d'anticorps, ou un dérivé d'anticorps qui lie spécifiquement l'antigène. Clause 33. Le procédé de la clause 30, 31, ou 31a, dans lequel les chaînes lourdes d'immunoglobulines sont incluses dans un anticorps IgG2a, un fragment d'anticorps, ou un dérivé d'anticorps qui lie spécifiquement l'antigène. Clause 34. Le procédé de la clause 30, 31, ou 31a, dans lequel les chaînes lourdes d'immunoglobulines sont incluses dans un anticorps IgG2b, un fragment d'anticorps, ou un dérivé d'anticorps qui lie spécifiquement l'antigène.

Clause 35. Le procédé de la clause 30, 31, ou 31a, dans lequel les chaînes lourdes d'immunoglobulines sont incluses dans un anticorps IgM, un fragment d'anticorps, ou un dérivé d'anticorps qui lie spécifiquement l'antigène. 53 Clause 36. Un anticorps ou une chaîne lourde d'immunoglobuline isolé dans le procédé de l'une quelconque des clauses 28 à 35, ou un fragment de liaison d'un antigène ou un dérivé de l'anticorps ou de la chaîne lourde.

Clause 37. Une composition pharmaceutique comprenant l'anticorps, le fragment d'anticorps, ou le dérivé d'anticorps de la clause 36 et un support, un excipient, ou un diluant pharmaceutiquement acceptable. Clause 38. Un procédé d'isolement de tissu splénique comprenant la fourniture de la souris de 1 à 27, le prélèvement de la rate ou d'une partie de celle-ci à partir de la souris, et l'obtention de tissu à partir de la rate ou de la partie. Clause 39. Le procédé de la clause 38, comprenant en outre l'isolement d'au moins une cellule B spécifique d'un antigène à partir du tissu splénique, où la cellule B exprime une chaîne lourde contenant une région variable humaine. Clause 40. Le procédé de la clause 38 ou 39, dans lequel une étape d'immunisation de la souris avec un antigène est réalisée avant l'étape de prélèvement de la rate à partir de la souris. Clause 41. Le procédé de la clause 40, dans lequel l'antigène est un antigène humain.

Clause 42. Le procédé de la clause 40 ou 41, dans lequel la au moins une cellule B spécifique d'un antigène produit un anticorps IgG1, IgG2a, IgG2b ou IgM comprenant ladite chaîne lourde, où l'anticorps lie spécifiquement l'antigène. Clause 43. Le procédé des clauses 38 à 42, dans lequel la au moins une cellule B spécifique d'un antigène qui produit ladite chaîne lourde est fusionnée avec une cellule de myélome immortelle pour produire une cellule d'hybridome. Clause 44. Le procédé des clauses 38 à 43, comprenant en outre une étape d'isolement d'une chaîne lourde d'immunoglobuline à partir de la cellule B ou de la cellule d'hybridome. 54 Clause 45. Un anticorps ou une chaîne lourde d'immunoglobuline isolé dans le procédé de la clause 44, ou un fragment de liaison d'un antigène ou un dérivé de l'anticorps ou de la chaîne lourde.

Clause 46. Une composition pharmaceutique comprenant l'anticorps, le fragment d'anticorps ou le dérivé d'anticorps de la clause 45 et un support, un excipient ou un diluant pharmaceutiquement acceptable. Clause 47. Un procédé d'obtention d'un anticorps humanisé, comprenant la sélection d'une souris qui exprime des chaînes lourdes d'immunoglobulines contenant des régions variables humaines, où la souris comprend un génome qui inclut un locus de chaîne lourde d'immunoglobuline comprenant des segments de gènes VH, DH, et JH humains positionnés en amont d'une région constante de souris, où la souris exprime des chaînes lourdes d'immunoglobulines, caractérisées en ce qu'au moins 90 % des chaînes lourdes d'immunoglobulines exprimées par la souris sont des chaînes lourdes d'immunoglobulines contenant une région variable humaine, où la souris exprime des anticorps IgG1 , IgG2b, et IgM sériques comprenant lesdites chaînes lourdes contenant une région variable humaine, où la souris produit une proportion normale de cellules B spléniques matures, où la souris produit une proportion normale de cellules progéniteurs des cellules B de la moelle osseuse, et où la souris exprime une proportion norniàle d'IgGl, d'IgG2a, d'IgG2b, et d'IgM dans un échantillon de sérum obtenu à partir de la souris, et où chaque dite proportion normale est une proportion produite par une souris qui exprime des chaînes lourdes d'immunoglobulines contenant des régions variables de souris et n'exprime pas des chaînes lourdes d'immunoglobulines contenant des régions variables humaines ; le prélèvement de sérum à partir de ladite souris ; et l'obtention d'un groupe d'anticorps humanisés comprenant des anticorps IgGl, IgG2b, et IgM à partir du sérum. 55 Clause 48. Le procédé de la clause 47, comprenant une étape d'immunisation de la souris avec un antigène avant l'étape de prélèvement de sérum à partir de ladite souris. Clause 49. Le procédé de la clause 48, comprenant en outre des étapes de mise en contact dudit groupe d'anticorps humanisés avec ledit antigène ; de liaison dudit antigène avec un anticorps humanisé dans ledit groupe d'anticorps humanisés ; et l'isolement de l'anticorps humanisé qui se lie au dit antigène. Clause 50. Le procédé de la clause 49, comprenant en outre des étapes de mise en contact de l'anticorps humanisé qui se lie au dit antigène avec un anticorps d'isotype spécifique, où l'anticorps d'isotype spécifique reconnaît les IgG1, lgG2a, IgG2b, ou IgM ; et d'isolement de l'anticorps humanisé qui se lie au dit anticorps d'isotype spécifique.

Clause 51. Le procédé de la clause 48, comprenant en outre les étapes de prélèvement de la rate ou de tissu de celle-ci à partir de ladite souris, d'isolement des cellules B à partir du tissu splénique, de fusion desdites cellules B avec des cellules de myélome immortelles pour produire des cellules d'hybridome exprimant un groupe d'anticorps humanisés comprenant des anticorps IgG provenant du sérum, où le groupe d'anticorps est utilisé dans le procédé de la clause 48. Clause 52. Le procédé de l'une quelconque des clauses 47 à 51, dans lequel ladite souris sélectionnée comprend des segments de gènes V, D et J de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris qui sont positionnés dans ledit locus de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris dans une orientation qui est inversée par rapport à son orientation endogène naturelle. Clause 53. Le procédé de l'une quelconque des clauses 47 à 52, dans lequel la souris exprime les sous-types d'Ig dans une proportion relative (i) d'IgG1 sériques à une concentration d'environ 25 à 350 pg/ml ; (ii) d'IgG2a sériques à une concentration d'environ 0 à 200 pg/ml ; (iii) d'IgG2b sériques à une concentration d'environ 30 à 800 pg/ml ; et (iv) d'IgM sériques à une concentration d'environ 50 à 300 pg/ml ; 56 Ou (i) d'IgG1 sériques à une concentration d'environ 10 à 600 pg/ml ; (ii) d'IgG2a sériques à une concentration d'environ 0 à 500 pg/ml ; (iii) d'IgG2b sériques à une concentration d'environ 20 à 700 pg/ml ; et (iv) d'IgM sériques à une concentration d'environ 50 à 700 pg/ml ; comme il est déterminé par une capture d'immunoglobuline sur une plaque suivie d'une incubation avec des anticorps d'isotype spécifique anti-souris, chacun comprenant un marqueur et la quantification de chaque immunoglobuline en se basant sur le taux de chaque marqueur. Clause 54. Le procédé de l'une quelconque des clauses 47 à 53, dans lequel au moins 95, 96, 97, 98, 99, ou 99,5 % des chaînes lourdes d'immunoglobulines exprimées par la souris sont des chaînes lourdes d'immunoglobulines comprenant des régions variables humaines.

Clause 55. Le procédé de l'une quelconque des clauses 47 à 54, dans lequel un amplificateur de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris est positionné dans ledit locus de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris entre les segments de gènes VH, DH, et JH humains et la région constante de souris. Clause 56. Le procédé de l'une quelconque des clauses 47 à 55, dans lequel une permutation S-mu de souris est positionnée dans ledit locus de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris entre les segments de gènes VH, DH, et JH humains et la région constante de souris. Clause 57. Le procédé de l'une quelconque des clauses 47 à 56, dans lequel des segments de gènes V, D et J de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris endogènes sont positionnés dans ledit locus de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris en amont des segments de gènes VH, DH, et JH humains. Clause 58. Le procédé de la clause 57, dans lequel les segments de gènes V, D et J de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris sont présents dans ledit locus de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris avec des séquences de segments intergéniques 30 endogènes. Clause 59. Le procédé de la clause 57 ou 58, dans lequel les segments de gènes V, D et J de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris sont positionnés dans ledit locus 57 de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris dans une orientation qui est inversée par rapport à son orientation endogène naturelle. Clause 60. Le procédé de l'une quelconque des clauses 47 à 59, dans lequel la souris exprime des chaînes légères contenant des régions variables kappa humaines. Clause 61. Le procédé de la clause 60, dans lequel la souris exprime des chaînes légères d'immunoglobulines contenant un JK humain. Clause 62. Le procédé de l'une quelconque des clauses 47 à 51, dans lequel la souris exprime des chaînes légères contenant des régions variables lambda humaines. Clause 63. Le procédé de la clause 62, dans lequel la souris exprime des chaînes 10 légères d'immunoglobulines contenant un JÀ humain. Clause 64. Le procédé de la clause 61, comprenant un génome qui inclut des segments de gènes VK et JK humains positionnés dans ledit locus de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris en amont d'une CL de souris. Clause 65. La souris de la clause 64, où la CL de souris est une CK endogène. 15 Clause 66. La souris des clauses 64 ou 65, où les segments de gènes VK et JK humains comprennent VK2-24, VK3-20, W1-17, Vk1-16, VK3-15, W1-13, VK1-12, Vk3-11, VK1-9, W1-8, Vk1-6, Vk1-5, VK5-2, VK4-1, JK1, JK2, JK3, JK4 et JK5. Clause 67. Le procédé de l'une quelconque des clauses 47 à 51, dans lequel les segments de gènes VH, DH et JH humains contiennent 20 les segments de gènes VH humains : VH2-5, 7-4-1, 4-4, 1-3, 1-2, 6-1 ; les segments de gènes DH humains : D1-1, 2-2, 3-3, 4-4, 5-5, 6-6, 1-7, 2-8, 3-9,5-12,6-13,2-15,3-16,4-17,6-19,1-20,2-21,3-22,6-25,1-26 et 7-27 ; et les segments de gènes JH humains : J1, J2, J3, J4, J5 et J6. 25 Vertébrés non humains exprimant des régions variables kappa et lambda (i) Chaînes K et L produites dans des rapports de type humain Cet aspect de l'invention est utile pour la production de chaînes légères qui ne sont pas biaisées vers des rapports de type non humain. Par exemple, chez les souris, les 58 chaînes légères de type kappa prédominent de loin sur les chaînes légères de type lambda (généralement de l'ordre de 95 % de chaînes légères kappa / 5 % de chaînes légères lambda chez une souris de type sauvage). Les êtres humains, d'autre part, affichent généralement environ 60 % de kappa / environ 40 % de lambda. Ainsi, l'expression de lambda est de beaucoup supérieure à celle trouvée chez une souris. Il serait souhaitable de fournir un vertébré non humain, comme une souris ou un rat, chez lequel une proportion supérieure de chaînes légères de type lambda peut être exprimée. Ceci est utile lorsque le vertébré exprime des chaînes légères portant des régions variables lambda humaines et d'autres chaînes légères portant des régions variables kappa humaines. Dans cet objectif, les inventeurs ont démontré pour la première fois un tel vertébré qui exprime des chaînes légères lambda élevées, et ainsi l'invention propose : Un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat) dont le génome comprend un répertoire de segments de gènes Ig produits par une insertion ciblée de segments de gènes Ig humains dans un ou plusieurs loci Ig endogènes, le génome comprenant des segments de gènes VÀ et JÀ humains fournis par insertion dans un locus de chaîne légère endogène du vertébré en amont d'une région constante, le génome comprenant des segments de gènes VK et JK humains fournis par insertion dans un locus de chaîne légère endogène du vertébré en amont d'une région constante, où le vertébré exprime des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des régions variables de chaînes légères kappa et des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des régions variables de chaînes légères lambda, où plus de 20 % des chaînes légères exprimées par le vertébré comprennent des régions variables lambda (par exemple, comme il est déterminé par une analyse FACS des cellules B spléniques).

Les chaînes légères restantes expriment des régions variables kappa. Le document WO 03047336 enseigne le caractère souhaitable de produire des rapports kappa/lambda de type humain, mais celui-ci ne propose pas de description permise ou plausible de comment obtenir ceci. (ii) Chaînes K et L produites par des compartiments normaux de cellules B Les inventeurs ont généré avec succès des vertébrés non humains contenant une insertion ciblée de segments de gènes V et J lambda humains pour permettre l'expression de chaînes légères contenant des régions variables lambda humaines par des compartiments normaux de cellules B (c'est-à-dire, comparables au vertébré de type sauvage). Ainsi, les inventeurs ont fourni de tels vertébrés qui peuvent produire de 59 manière utile de telles chaînes légères avec de bons répertoires et de manière plus fiable que l'art antérieur des vertébrés non humains transgéniques qui présentent des compartiments de cellules B de taille et de maturité réduites, et en effet qui ne peuvent même pas produire des chaînes légères comportant des régions variables lambda humaines. Ainsi, l'invention propose : Un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat) dont le génome comprend un répertoire de segments de gènes Ig produits par insertion ciblée de segments de gènes Ig humains dans un ou plusieurs loci Ig endogènes, le génome comprenant des segments de gènes VA et JA humains fournis par insertion dans un locus de chaîne légère endogène du vertébré en amont d'une région constante, le génome comprenant des segments de gènes VK et JK humains fournis par insertion dans un locus de chaîne légère endogène du vertébré en amont d'une région constante, où le vertébré exprime des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des régions variables de chaînes légères kappa et des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des régions variables de chaînes légères lambda, et où le vertébré produit une proportion ou un pourcentage normal de cellules B spléniques matures (par exemple, comme il est déterminé par une analyse FACS des cellules B spléniques). En ce qui concerne les vertébrés non humains (i) et (ii), les modes de réalisation suivants sont envisagés (sauf spécification, chaque mode de réalisation s'applique à (i) ou (ii)) : Dans un mode de réalisation, l'insertion de VA et JA humains comprend au moins les segments de gènes V et J humains fonctionnels composés d'un locus Ig de chaîne lambda humaine de VÀ3-27 à Ce. Dans un mode de réalisation, l'insertion de VA et JA humains comprend au moins les 25 segments de gènes V humains VÀ3-27, VÀ3-25, VÀ2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA2-18, VA3-16, VÀ2-14, VÀ3-12, VÀ2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VÀ4-3 et VÀ3-1, éventuellement les allèles du tableau 18. Dans un mode de réalisation, l'insertion de VA et JA humains comprend un, plusieurs ou la totalité des segments de gènes J humains JÀ1, JA2, JÀ3, JA6 et JA7. 30 Dans un mode de réalisation, l'insertion de VA et JA humains comprend une insertion d'un groupe JA-CÀ humain, où le groupe comprend les segments de gènes J et C de JÀ1 à CÀ7. 60 Dans un mode de réalisation, l'insertion de VÀ et JÀ humains comprend une insertion d'un amplificateur EÀ humain. Par exemple, l'amplificateur EÀ est fourni dans la configuration de la lignée germinale par rapport à un JÀ7 humain qui est également compris par l'insertion. Par exemple, l'amplificateur EÀ est fourni dans la configuration de la lignée germinale par rapport à un groupe JÀ-CÀ humain qui est également compris par l'insertion, où le groupe comprend JÀ1 à CÀ7 dans la configuration de la lignée germinale humaine. Dans une configuration de lignée germinale humaine, l'amplificateur EÀ est en 3' du groupe JÀ-CÀ. Dans un mode de réalisation ou le vertébré (i) ou (ii), l'insertion de VÀ et JÀ humains est 10 fournie par une insertion d'une séquence correspondant aux coordonnées 22886217 à 23327884 du chromosome 22 humain. Dans un mode de réalisation ou le vertébré (ii), l'insertion de VÀ et JÀ humains est fournie par une insertion d'une séquence correspondant aux coordonnées 23064876 à 23327884 du chromosome 22 humain. 15 Dans un mode de réalisation, l'insertion de VK et JK humains comprend au moins les segments de gènes V et J humains fonctionnels composés d'un locus Ig de chaîne kappa humaine de VK1-33 à JK5. Dans un mode de réalisation, l'insertion de VK et JK humains comprend au moins les segments de gènes V humains VK1-33, W2-30, W2-29, VK2-28, VK1-27, VK2-24, 20 VK3-20, VK1-17, VK1-16, VK3-15, VK1-13, VK1-12, VK3-11, VK1-9, VK1-8, VK1-6, VK1-5, VK5-2 et VK4-1, éventuellement les allèles du tableau 12. Dans un mode de réalisation, l'insertion de VK et JK humains comprend un, plusieurs ou la totalité des segments de gènes J humains JK1, JK2, JK3, JK4 et JK5, éventuellement les allèles du tableau 12. 25 Dans un mode de réalisation, plus de 30,35,40,45 ou 50 % des chaînes légères exprimées par le vertébré comprennent des régions variables lambda. Dans un mode de réalisation, de 20 à 40,45 ou 50 % des chaînes légères exprimées par le vertébré comprennent des régions variables lambda. Dans un mode de réalisation, de 30 à 40,45 ou 50 % des chaînes légères exprimées par le vertébré 30 comprennent des régions variables lambda. Dans un mode de réalisation, lesdites régions variables des chaînes légères kappa sont des régions variables de chaînes légères kappa. 61 Dans un mode de réalisation, les segments de gènes VK et JK humains sont dans un locus de chaîne légère kappa endogène du vertébré en amont d'une région constante kappa. Dans un mode de réalisation, les segments de gènes VÀ et JÀ humains sont dans un locus de chaîne légère kappa endogène du vertébré. Dans un mode de réalisation, les segments de gènes VÀ et JÀ humains sont dans un locus de chaîne légère lambda endogène du vertébré. Dans un mode de réalisation, le vertébré exprime des chaînes légères comprenant des régions variables kappa humaines et exprime des chaînes légères comprenant des régions variables lambda. Dans un exemple, l'expression des chaînes kappa endogènes (de vertébré non humain) est substantiellement inactive ou est inactive et/ou l'expression des chaînes lambda endogènes (de vertébré non humain) est substantiellement inactive ou est inactive. Où le vertébré est une souris, l'expression de chaînes lambda de souris est généralement très basse (autour de 5 % ou moins) et dans ce cas, il peut être nécessaire de modifier le génome de la souris pour encore inactiver l'expression des chaînes lambda endogènes. Ainsi, où le vertébré est une souris, l'expression des chaînes kappa endogènes est substantiellement inactive ou est inactive et l'expression des chaînes lambda de souris est de 5 % ou moins de l'expression de toutes les chaînes légères.

Dans un mode de réalisation, le vertébré produit une proportion ou un pourcentage normal de cellules B spléniques matures. Par exemple, ceci peut être déterminé par une analyse FACS des cellules B spléniques isolées du vertébré. Dans un mode de réalisation, le vertébré produit un rapport normal de cellules B spléniques T1, T2 et matures. Par exemple, ceci peut être déterminé par une analyse FACS des cellules B spléniques isolées du vertébré. Dans un mode de réalisation, au moins 40, 50, 60 ou 70 % des cellules B spléniques totales produites par le vertébré sont des cellules B matures. Par exemple, ceci peut être déterminé par une analyse FACS des cellules B spléniques isolées du vertébré. Autres déclarations de l'invention Dans un mode de réalisation, l'invention concerne ce qui suit : Un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat) ou une cellule de vertébré dont le génome comprend des segments de gènes VH, D et JH humains en amont d'une 62 région constante au niveau d'un locus de chaîne lourde endogène et des segments de gènes VL et JL humains en amont d'une région constante au niveau d'un locus de chaîne légère endogène, où les segments de gènes sont liés de manière fonctionnelle à la région constante de celui-ci de telle manière que le vertébré ou la cellule est capable d'exprimer des chaînes lourdes et légères d'immunoglobulines comprenant des domaines VH et VL humains respectivement, où le locus de chaîne lourde comprend un segment de gène VH humain capable de se recombiner avec un segment de gène D et JH humain pour produire un domaine VH, où le locus de chaîne légère comprend un segment de gène VL humain capable de se recombiner avec un segment de gène JL humain pour produire un domaine VL, ou bien où la cellule peut se développer chez un vertébré qui exprime lesdits domaines variables de chaînes lourdes et légères. Un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat) ou une cellule de vertébré dont le génome comprend des segments de gènes VH, D et JH humains en amont d'une région constante au niveau d'un locus de chaîne lourde endogène, où les segments de gènes sont liés de manière fonctionnelle à la région constante de celui-ci de telle manière que le vertébré ou la cellule est capable d'exprimer des chaînes lourdes d'immunoglobulines contenant des domaines VH humains, où le locus de chaîne lourde comprend un segment de gène VH allèle 01 humain capable de se recombiner avec un segment de gène D et JH humain pour produire un domaine VH, ou bien où la cellule peut se développer chez un vertébré qui exprime ledit domaine variable de chaîne lourde. Un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat) ou une cellule de vertébré dont le génome comprend des segments de gènes VL et JL en amont d'une région constante au niveau d'un locus de chaîne légère, où les segments de gènes sont liés de manière fonctionnelle à la région constante de celui-ci de telle manière que le vertébré ou la cellule est capable d'exprimer des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des domaines VL humains, où le locus de chaîne légère comprend un segment de gène VL allèle 01 humain capable de se recombiner avec un segment de gène JL humain pour produire un domaine VL, ou bien où la cellule peut se développer chez un vertébré qui exprime ledit domaine variable de chaîne légère. Eventuellement, le vertébré ou la cellule a un génome comprenant le locus de chaîne lourde et le locus de chaîne légère définis ci-dessus et comprend donc un locus de chaîne lourde comprenant un segment de gène. VH allèle 01 humain capable de se recombiner avec un segment de gène D et JH humain pour produire un domaine VH et un locus de chaîne lourde comprenant un segment de gène VL allèle 01 humain capable de se recombiner avec un segment de gène JL humain pour produire un domaine VL. 63 Il est envisagé que dans tous les modes de réalisation de l'invention, le génome de la cellule ou du vertébré conformément à l'invention puisse ne pas comprendre un second allèle humain d'un, de plusieurs de la totalité des segments de gènes humains. Dans un mode de réalisation, le locus de chaîne légère endogène est le locus kappa endogène, et dans un autre mode de réalisation, il s'agit du locus lambda endogène. Combinaisons d'allèles Dans un mode de réalisation, l'allèle du segment de gène est un allèle d01, éventuellement un allèle d01 décrit dans le tableau 7, le tableau 12 ou le tableau 18. Dans un mode de réalisation, le vertébré ou la cellule à un génome comprenant en outre un allèle 02, 03, 04, 05, 10, 12, 18 ou d03 décrit dans le tableau 7, le tableau 12 ou le tableau 18. Les allèles préférés de l'invention sont présentés dans les tableaux 1 to 18 suivants : Tableau 1 : Allèles IgH #1 - allèles S1 Allèle JH6 02 JH5 02 JH4 02 JH3 02 JH2 01 JHI 01 D7-27 02 D1-26 01 D6-25 01 64 3011249 D5-24 01 D4-23 01 D3-22 01 D2-21 02 D1-20 01 06-19 01 D5-18 01 D4-17 01 D3-16 02 D2-15 01 D1-14 01 D6-13 01 D5-12 01 D4-11 01 03-10 01 D3-9 01 D2-2 02 D1-1 01 VH6-1 01 02 ou VH1-2 04 VH1-3 01 VH4-4 02 65 VH7-4 01 01 ou VH2-5 10 Tableau 2 : Allèles IgH #2 - allèles S2 ID JH6 02 J1-15 02 JH4 02 JFi3 02 JH2 01 JFil 01 D7-27 02 D1-26 01 D6-25 01 D5-24 01 D4-23 01 D3-22 01 D2-21 02 D1-20 01 D6-19 01 D5-18 01 66 D4-17 01 D3-16 02 D2-15 01 D1-14 01 D6-13 01 D5-12 01 D4-11 01 D3-10 01 D3-9 01 D2-2 02 D1-1 01 VH6-1 01 VH1-2 02 ou 04 VH1-3 01 VH4-4 02 VH7-4 01 VH2-5 01 ou 10 VH3-7 01 VH 1 -8 01 VH3-9 01 VH3- 11 01 VH3- 13 01 Tableau 3 : Allèles IgH #3 - allèles S3 ID Allèle JH6 02 JH5 02 JH4 02 JH3 02 42 01 JHI 01 D7-27 02 D1-26 01 D6-25 01 D5-24 01 D4-23 01 D3-22 01 D2-21 02 D1-20 01 68 D6-19 01 D5-18 01 D4-17 01 D3-16 02 D2-15 01 D1-14 01 D6-13 01 D5-12 01 D4-11 01 D3-10 01 D3-9 01 D2-2 02 D1-1 01 VH6-1 01 VH1-2 02 ou 04 VFi1-3 01 VH4-4 02 VH7-4 01 VH2-5 01 ou 10 VH3-7 01 VH 1 -8 01 VH3-9 01 VH3- 11 01 VH3- 13 01 VH3- 15 01 VH1- 18 01 VH3- 01 ou 20 d01 VFi3- 21 01 ou 03 VH3- 23 04 VH1- 01 ou 24 d01 VH2- 01 ou 26 d01 Tableau 4 : Allèles IgH #4 - allèles S4 ID Allèle JH6 02 J1-15 02 JH4 02 70 3011249 JH3 02 JH2 01 JHI 01 D7-27 02 D1-26 01 D6-25 01 D5-24 01 D4-23 01 D3-22 01 D2-21 02 D1-20 01 D6-19 01 D5-18 01 D4-17 01 03-16 02 D2-15 01 D1-14 01 D6-13 01 D5-12 01 D4-11 01 D3-10 01 D3-9 01 71 D1-1 01 VH6-1 01 13 01 01 01 04 02 VH4-4 VH7-4 D2-2 02 VH 1 -2 02 ou 04 VH1-3 01 01 VH2-5 01 ou 10 VH3-7 01 VH1-8 01 VH3-9 01 VH3- 01 VH3- VH3- 20 01 ou d01 VH3- 21 01 ou 03 VH3- 15 VH1- 18 VH3- 23 72 VH1- 01 ou 24 d01 VH2- 01 ou 26 d01 VF14- 28 05 VH3- 30 18 VH4- 31 03 VH3- 33 01 VH4- 34 01 VH4- 39 01 Tableau 5 : Allèles IgH #5 - allèles S5 ID Allèle JH6 02 JH5 02 JH4 02 JH3 02 JFi2 01 73 JI11 01 D7-27 02 D1-26 01 D6-25 01 D5-24 01 D4-23 01 D3-22 01 02-21 02 D1-20 01 06-19 01 D5-18 01 D4-17 01 D3-16 02 D2-15 01 D1-14 01 D6-13 01 D5-12 01 D4-11 01 D3-10 01 D3-9 01 D2-2 02 D1-1 01 01 01 01 04 02 VH4-4 VH7-4 VH6-1 01 VH1-2 02 ou 04 VH1-3 01 01 VH2-5 01 ou 10 VH3-7 01 VH 1 -8 01 VH3-9 01 VH3- 20 01 ou d01 VFi3- 21 01 ou 03 VH1- 24 01 ou d01 VH3- 11 VH3- 13 VH 15 VH1- 18 .VH 3- 23 18 03 01 01 01 01 02 01 01 VH2- 01 ou 26 d01 VH4- 28 VH3- 30 VH4- 31 VH3- 33 VH4- 34 VH4- 39 VFi3- 43 VH1- 45 VH1- 46 VH3- 48 Tableau 6 : Allèles IgH #6 - allèles S6 ID Allèle 76 JH6 02 JH5 02 JH4 02 JH3 02 JH2 01 JHI 01 D7-27 02 D1-26 01 D6-25 01 D5-24 01 D4-23 01 D3-22 01 D2-21 02 D1-20 01 D6-19 01 D5-18 01 D4-17 01 D3-16 02 D2-15 01 D1-14 01 D6-13 01 D5-12 01 D4-11 01 D3-10 01 D3-9 01 52-2 02 D1-1 01 VH6-1 01 VH 1 -2 02 ou 04 VH 1 -3 01 VH4-4 02 VFi7-4 01 VH2-5 01 ou 10 VH3-7 01 VH1-8 01 VH3-9 01 VH3- 11 01 VH3- 13 01 VH3- 15 01 VH1- 18 01 VH3- 20 01 ou d01 3011249 VH3- 21 01 ou 03 VH3- 23 04 VH1- 01 ou 24 d01 VH2- 01 ou 26 d01 VH4- 28 05 VH3- 30 18 VH4- 31 03 VH3- 33 01 VH4- 34 01 VH4- 39 01 VH3- 43 01 VH1- 45 02 VH1- 46 01 VH3- 48 01 79 VH3- 49 05 VH5- 51 01 VH3- 53 01 VH1- 58 01 VH4- 59 01 ou 05 VH4- 61 01 VH3- 64 02 VH3- 66 03 VH1- 69 12 Tableau 7 : Allèles IgH #7 - allèles S7 (répertoire complet de segments de gènes IgH fonctionnels) ID Allèle 1 JH6 02 2 JH5 02 80 JH4 02 4 JH3 02 JH2 01 6 JH1 01 7 D7-27 02 8 D1-26 01 9 D6-25 01 D5-24 01 11 D4-23 01 12 D3-22 01 13 D2-21 02 14 D1-20 01 D6-19 01 16 D5-18 01 17 D4-17 01 18 D3-16 02 19 D2-15 01 D1-14 01 21 D6-13 01 22 D5-12 01 23 D4-11 01 24 D3-10 01 81 D3-9 01 26 D2-2 02 27 D1-1 01 28 VH6-1 01 29 VFi1-2 02 ou 04 30 VH1-3 01 31 VH4-4 02 32 VH7-4 01 33 VH2-5 01 ou 10 34 VH3-7 01 35 VH1-8 01 36 VH3-9 01 37 VH3- 11 01 38 VH3- 13 01 39 VH3- 15 01 40 VH1- 18 01 41 VH3- 01 ou 20 d01 42 VH3- 21 01 ou 03 43 VH3- 04 82 23 44 VH1- 01 ou 24 d01 45 VH2- 01 ou 26 d01 46 VH4- 28 05 47 VH3- 30 18 48 VH4- 31 03 49 VH3- 33 01 50 VH4- 34 01 51 VH4- 39 01 52 VH3- 43 01 53 VH1- 45 02 54 VH1- 46 01 55 VFi3- 48 01 56 VH3- 49 05 57 VH5- 01 83 1 58 VH3-- 53 01 59 VH 1- 58 01 60 VH4- 59 01 ou 05 61 VH4- 61 01 62 VH3- 64 02 63 VH3- 66 03 64 VH1- 69 12 65 VH2- 70 04 66 VH3- 72 01 67 VH3- 73 02 68 VH3- 74 01 Tableau 8 : Allèles tg< #1 - allèles K1 ID Allèle 84 Tableau 9 : Allèles IgK #2 - allèles K2 ID Allèle JK5 01 JK4 01 JK5 JK4 JK3 JK2 JK1 VK4-1 VK5-2 VK1-5 VK1-6 VK1-8 VK1-9 01 01 01 ou 04 01 01 01 ou d01 03 01 01 01 ou d01 01 85 VK1-9 d01 VK3- 11 01 01 01 01 02 17 01 01 01 VK6- d01 VK5-2 VK1-5 VK1-6 VK1-8 JK3 JK2 JK1 VK4-1 01 01 ou 04 01 01 01 ou 01 ou 03 01 01 VK1- 12 VK1- 13 Vk3- 15 VK1- 16 VK3- 20 86 VK2- 24 01 Tableau 10 : Allèles IgK #3 - allèles K3 ID Allèle JK5 JK4 JK3 J K2 JK1 VK4-1 VK5-2 VK1-5 VK1-6 VK1-8 VK1-9 VK3- 11 01 01 01 ou 04 01 01 01 ou d01 03 01 01 01 ou d01 01 01 87 3011249 VK1- 12 01 VK1- 13 01 VK3- 15 01 VK1- 16 02 VK1- 17 01 VK3- 20 01 VK6- 21 01 VK2- 24 01 VK1- 27 01 VK2- 28 01 VK2- 29 01 VK2- 30 01 VK1- 33 01 VK1D- 39 01 88 VK2D- 40 01 Tableau 11 : Allèles IgK #4 - allèles K4 ID Allèle JK5 JK4 JK3 JK2 JK1 VK4-1 VK5-2 VK1-5 VK1-6 VK1-8 VK1-9 VK3- 11 VK1- 01 01 01 01 ou 04 01 01 01 ou d01 03 01 01 01 ou d01 01 01 89 01 02 01 VK3- 20 01 01 01 01 01 01 01 01 39 01 12 VK1D- VK2 D- 01 VK1- 13 VK3- 15 VK1- 16 VK1- 17 VK6- 21 VK2- 24 VK1- 27 VK2- 28 VK2- 29 VK2- 30 VK1- 33 90 Tableau 12 : Allèles lgk #5 - allèles K5 (un répertoire complet de segments de gènes kappa humains fonctionnels) ID Allèle 43 01 12 02 13 d01 15 d01 16 01 17 01 01 20 01 VK3D- 7 40 W1D- 8 01 ou d01 Vk1D- VK3D- 11 01 ou d01 Vk1 D- VO D- VK3D- Vid D- Vk1D- VK3D- 91 VK1-9 d01 VK3- 11 01 01 01 01 02 01 VK1- d01 VK5-2 VK1-5 VK1-6 VK1-8 JK5 JK4 JK3 JK2 JK1 VK4-1 01 01 01 ou 04 01 01 01 01 ou 01 ou 03 01 01 VK1- 12 VK1- 13 VK3- 15 VK1- 16 92 VK6- 21 01 01 01 01 01 01 01 39 01 40 01 43 01 01 VK3D- 7 17 VK1D- VK2D- VK1D- 8 01 ou d01 VK1D- VK3D- 01 ou VK3- 20 VK2- 24 Vk1- 27 VK2- 28 VK2- 29 VK2- 30 Vk1- 33 93 d01 VK1D- 12 02 VK1D- 13 d01 VK3D- 15 d01 VK1D- 16 01 VK1D- 17 01 VK3D- 20 01 VK2D 01 ou 26 d01 VK2D 01 ou 28 d01 VK2D- 29 01 VK2D- 30 01 VK1D- 33 01 VK1D- 39 01 Tableau 13 : Allèles IgÀ #1 - allèles L1 ou P1 94 ID Allèle CÀ7 01 JÀ7 01 CÀ6 04 JÀ6 01 CÀ3 03 JÀ3 02 CÀ2 02 JÀ2 01 CÀ1 02 JÀ1 01 VÀ3-1 01 Tableau 14 : Allèles IgÀ #2 - allèles L2 ou P2 ID Allèle CÀ7 01 JÀ7 01 CÀ6 04 95 JA6 01 CA3 03 JA3 02 CA2 02 JÀ2 01 CA1 02 JA1 01 VA3-1 01 VÀ4-3 01 VA2-8 01 VÀ3-9 01 10 01 VU- 11 01 VA3- 12 02 VU- 14 01 VA3- 16 01 VU- 18 01 Tableau 15 : Allèles le #3 - allèles L3 ou P3 96 ID Allèle CÀ7 01 JÀ7 01 CÀ6 04 JÀ6 01 CÀ3 03 JÀ3 02 CÀ2 02 J À2 01 CÀ1 02 JÀ1 01 VÀ3-1 01 VÀ4-3 01 VÀ2-8 01 VÀ3-9 01 VÀ3- 10 01 VÀ2- 11 01 VÀ3- 12 02 97 Tableau 16 : Allèles IgÀ #4 - allèles L4 ou P4 ID Allèle CÀ7 01 JÀ7 01 CÀ6 04 01 01 01 01 VÀ3- 22 01 VÀ3- 27 01 VÀ3- 21 01 ou d01 VÀ2- 23 02 ou d02 VÀ3- 25 01 ou d03 VÀ2- 14 VÀ3- 16 VÀ2- 18 VÀ3- 19 98 JA6 CA3 01 03 JA3 CA2 02 02 JA2 CA1 01 02 VA4-3 01 VA2-8 01 VA3-9 01 01 01 02 01 VA3- 16 01 01 01 01 JA1 VA3-1 01 VA3- 10 VU- 11 VA3- 12 VA2- 14 VA2- 18 VA3- 19 99 Tableau 17 : Allèles IgÀ #5 - allèles L5 ou P5 01 01 01 01 VÀ5- 39 01 01 01 01 03 01 VÀ3- 21 01 ou d01 VÀ2- 23 02 ou d02 VÀ3- 25 01 ou d03 VÀ3- 22 VÀ3- 27 VÀ1- 36 VÀ5- 37 VIS 1- 40 VÀ7- 43 VÀ1- 44 VÀ5- 45 VÀ7- 46 100 101 01 CA7 CA6 JA6 CA3 JA3 CA2 JA2 CA1 JA1 VA3-1 VA4-3 VA2-8 VA3-9 VA3- 10 VU- 11 12 ID Allèle 01 04 01 03 02 02 01 02 01 01 01 01 01 01 01 02 3011249 VÀ2- 14 01 VÀ3- 16 01 VÀ2- 18 01 VÀ3- 19 01 VÀ3- 01 ou 21 d01 VÀ3- 22 01 VÀ2- 02 ou 23 d02 VÀ3- 01 ou 25 d03 VÀ3- 27 01 VÀ1- 36 01 VÀ5- 37 01 VÀ5- 39 01 VÀ1- 40 01 VÀ7- 43 01 102 VÀ1- 44 01 VÀ5- 45 03 VA7- 46 01 VA1- 47 01 VA9- 49 01 VÀ1- 51 01 VA5- 52 01 VIS 10- 54 02 Tableau 18 : Allèles le #6 - allèles L6 ou P6 (un répertoire complet d'allèles lambda humains fonctionnels) ID Allèle CA7 01 JÀ7 01 CA6 04 JA6 01 103 CÀ3 JÀ3 03 02 CÀ2 JÀ2 02 01 CÀ1 JÀ1 02 01 VÀ3-1 01 VÀ4-3 01 VÀ2-8 01 VÀ3-9 01 01 01 02 01 01 01 01 VÀ3- d01 VÀ3- 10 VÀ2- 11 VÀ3- 12 VÀ2- 14 VÀ3- 16 VÀ2- 18 VÀ3- 19 104 -105 01 01 01 VÀ5- 37 01 01 01 01 01 VÀ5- 45 03 01 01 01 VÀ9- 21 VÀ2- 23 02 ou d02 01ou d03 VÀ3- 22 VÀ3- 25 VÀ3- 27 VÀ1- 36 VÀ5- 39 VÀ1- 40 VÀ7- 43 VÀ1- 44 VÀ7- 46 VÀ1- 47 VÀ1- 51 01 VÀ5- 52 01 VIS 10- 54 02 VÀ6- 57 01 VÀ4- 03 ou 60 d03 VÀ8- 61 01 VÀ4- 69 01 Le document WO 2013/041844 fait partie de l'état de la technique. Chaque aspect, mode de réalisation, clause ou condition décrit dans ce document peut être combiné chez un vertébré non humain capable d'exprimer un ou plusieurs segments de gènes humains décrits dans le document WO 2013/041844 et/ou décrits dans ce document ou un site de liaison ou un anticorps qui est un produit de la recombinaison d'un ou de plusieurs segments de gènes humains décrits dans le document WO 2013/041844 et/ou décrits dans ce document, comme il est approprié. Les segments de gènes décrits dans les tableaux 1 à 7 du document WO 2013/041844 sont décrits spécifiquement et explicitement dans ce document en tant que séquences de segments de gènes possibles par rapport à la présente invention. Les séquences sont présentées dans la liste des séquences déposée avec cette demande. 106 D'autres exemples de séquences de segments de gènes pour une utilisation dans le contexte de l'invention sont présentés dans les séquences incluses à la fin de la description. Dans un mode de réalisation préféré, le génome du vertébré et ou de la cellule de l'invention comprend un ou plusieurs segments de gènes provenant de l'un quelconque des tableaux 1 à 18. Dans un autre mode de réalisation préféré, le génome du vertébré et/ou de la cellule de l'invention comprend une combinaison de deux segments de gènes quelconques provenant de l'un quelconque des tableaux 1 à 18. Dans encore un autre mode de réalisation préféré, le génome du vertébré et ou de la cellule de l'invention comprend une combinaison de trois segments de gènes quelconques provenant de l'un quelconque des tableaux 1 à 18. Dans le mode de réalisation préféré entre tous, le génome du vertébré et/ou de la cellule de l'invention comprend une combinaison de quatre segments de gènes quelconques provenant de l'un quelconque des tableaux 1 à 18. De préférence, un segment de chaîne lourde VH et JH est choisi dans le tableau 7 et un segment de chaîne légère VL et JL est choisi dans le tableau 12 ou le tableau 18. Eventuellement, un segment de chaîne lourde D est choisi dans le tableau 7. L'invention concerne en outre un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat) ou une cellule dont le génome comprend des segments de gènes VL et JL humains en amont d'une région constante d'un locus de chaîne légère endogène, où le vertébré ou la cellule exprime des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des régions variables humaines, ou bien où la cellule peut se développer chez un vertébré qui exprime lesdites chaînes légères, où lesdites chaînes légères d'immunoglobulines comprennent des chaînes légères comprenant des régions variables humaines dérivées d'une recombinaison de (i) segments de gènes VK et JK humains choisis dans le groupe constitué par des segments de gènes VK et JK de l'un quelconque des tableaux 8 à 12 ou (ii) des segments de gènes VÀ et JÀ humains choisis dans le groupe constitué par des segments de gènes VÀ et JÀ de l'un quelconque des tableaux 12 à 18. Dans un mode de réalisation, le vertébré ou la cellule de l'invention exprime des chaînes 30 légères comprenant des régions variables lambda humaines et où au moins 60 %, 70 %, 107 %, 85 %, 90 % ou 95 % des régions variables de ces chaînes légères sont dérivées d'une recombinaison de segments de gènes VÀ et JÀ humains. Eventuellement, les chaînes légères sont exprimées sous la forme d'anticorps IgG, par exemple IgG1 ou IgG2b, éventuellement IgG2a.

La région constante peut être une région constante kappa ou lambda ; éventuellement, une région constante humaine, de souris ou de rat. Ledit locus de chaîne légère endogène peut être un locus kappa ou lambda ; éventuellement où le génome comprend au moins les segments de gènes V et J du tableau 8 au niveau d'un locus de chaîne légère endogène, par exemple le locus kappa et/ou au moins les segments de gènes V et J du tableau 13 au niveau d'un locus de chaîne légère endogène, par exemple le locus lambda ou kappa. Lesdites chaînes légères peuvent comprendre des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des régions variables humaines qui sont dérivées d'une recombinaison de de (ii), chacune de ces régions variables étant exprimée avec une région constante codée par un segment de gène CÀ choisi dans le groupe constitué par les segments de gènes CÀ du tableau 18. Dans ce mode de réalisation de l'invention, le vertébré ou la cellule peut exprimer des chaînes légères comprenant des régions variables lambda humaines et au moins 60 %, 70 % ou 80 % des régions variables de ces chaînes légères peuvent être dérivées d'une recombinaison de segments de gènes VA et JÀ humains, par exemple les segments V et J énumérés dans le tableau 18. L'invention concerne également un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat) ou une cellule dont le génome comprend des segments de gènes VH, D et JH humains en amont d'une région constante au niveau d'un locus de chaîne lourde endogène, où le vertébré ou la cellule exprime des chaînes lourdes-d'immunoglobulines comprenant des régions variables humaines ou la cellule peut se développer chez un vertébré qui exprime lesdites chaînes lourdes, ou bien où la cellule peut exprimer des chaînes lourdes d'immunoglobulines comprenant des régions variables humaines, où lesdites chaînes lourdes d'immunoglobulines comprenhent des chaînes lourdes comprenant des régions variables humaines dérivées d'une recombinaison de (iii) segments de gènes VH, D et JH humains choisis dans le groupe constitué des segments de gènes VH, D et JH du tableau 7. Dans un mode de réalisation, lesdites chaînes légères sont coexprimées avec lesdites chaînes lourdes pour former des anticorps, par exemple, des anticorps IgG. 108 Un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat) ou une cellule dont le génome comprend un répertoire de segments de gènes Ig produits par insertion ciblée de segments de gènes Ig humains dans un ou plusieurs loci Ig endogènes, le génome comprenant des segments de gènes VA et JÀ humains en amont d'une région constante, où les segments de gènes VA et JÀ humains ont été fournis par insertion dans un locus de chaîne légère endogène du vertébré ou de la cellule, où le vertébré comprend des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des régions variables lambda (chaînes légères lambda) ou la cellule peut se développer chez un vertébré qui exprime lesdites chaînes légères d'immunoglobulines, où les chaînes légères lambda comprennent des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des régions variables lambda dérivées d'une recombinaison de segments de gènes VA et JÀ humains ; où au moins 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % des régions variables des chaînes légères lambda exprimées par le vertébré sont dérivées d'une recombinaison de segments de gènes VA et JÀ humains ; éventuellement où le vertébré ou la cellule est n'importe quel vertébré ou cellule décrit dans ce document. Un domaine ou une région variable dérivé, ou produit comme résultat d'une recombinaison de segments de gènes humains est également appelé dans ce document un recombinant desdits segments de gènes. Les segments de gènes dans le locus de chaîne lourde et/ou légère sont liés de manière fonctionnelle à la région constante, de telle manière que le vertébré est capable de produire une chaîne lourde ou légère d'anticorps produite par recombinaison des segments de gènes. Dans un mode de réalisation, la cellule ou le vertébré non humain a un génome comprenant les segments kappa du tableau 8, ou du tableau 9 ou du tableau 10, ou du tableau 11 ou du tableau 12, ou de n'importe quelle combinaison de ceux-ci. Dans un mode de réalisation, la cellule ou le vertébré non humain a un génome comprenant les segments lambda du tableau 13 ou du tableau 14 ou du tableau 15 ou du tableau 16 ou du tableau 17 ou du tableau 18, ou de n'importe quelle combinaison de ceux-ci.

Dans un mode de réalisation, la cellule ou le vertébré non humain a un génome comprenant les segments de chaîne lourde du tableau 1 ou du tableau 2 ou du tableau 3 ou du tableau 4 ou du tableau 5 ou du tableau 6 ou du tableau 7 ou de n'importe quelle combinaison de ceux-ci. 109 Dans un mode de réalisation, la cellule ou le vertébré non humain de l'invention peut exprimer des chaînes légères comprenant des régions variables humaines dérivées d'une recombinaison (c'est-à-dire, des recombinants) de (i) segments de gènes VK et JK humains choisis dans le groupe constitué par des segments de gènes VK et JK du tableau 8, ou du tableau 9, ou du tableau 10, ou du tableau 11 ou du tableau 12, ou de n'importe quelle combinaison de ceux-ci. Dans un mode de réalisation, la cellule ou le vertébré non humain de l'ipvention peut exprimer des chaînes légères comprenant des régions variables humaines dérivées d'une recombinaison (c'est-à-dire, des recombinants) de (ii) segments de gènes VA et JA humains choisis dans le groupe constitué par des segments de gènes VA et JÀ du tableau 13 ou du tableau 14 ou du tableau 15 ou du tableau 16 ou du tableau 17 ou du tableau 18, ou de n'importe quelle combinaison de ceux-ci. Dans un mode de réalisation, la cellule ou le vertébré de l'invention peut exprimer des chaînes lourdes comprenant des régions variables humaines dérivées d'une recombinaison (c'est-à-dire, des recombinants) de segments de gènes VH, D et JH humains choisis dans le groupe constitué par des segments de gènes VH, D et JH du tableau 1 ou du tableau 2, ou du tableau 3, ou du tableau 4 ou du tableau 5 ou du tableau 6 ou du tableau 7, ou de n'importe quelle combinaison de ceux-ci. L'invention comprend en outre les conditions suivantes Condition 1 - Le vertébré ou la cellule de l'invention a un génome comprenant un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 1 à 68 dans le tableau 7. Condition 2 - Le vertébré ou la cellule selon la condition 1 comprenant l'allèle numéro 1 du tableau 1 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 2 à 68 du tableau 7.

Condition 3 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 2 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 3 à 68 du tableau 7. Condition 4 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 3 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 4 à 68 du tableau 7. 110 -"Condition 5 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 4 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 5 à 68 du tableau 7. Condition 6 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 5 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 6 à 68 du tableau 7. Condition 7 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 6 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 7 à 68 du tableau 7.

Condition 8 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 7 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 8 à 68 du tableau 7. Condition 9 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 8 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 9 à 68 du tableau 7. Condition 10 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 9 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 10 à 68 du tableau 7. Condition 11 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 10 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 11 à 68 du tableau 7. Condition 12 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 11 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 12 à 68 du tableau 7.

Condition 13 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 12 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 13 à 68 du tableau 7. Condition 14 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 13 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 14 à 68 du tableau 7. 111 Condition 15 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 14 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 15 à 68 du tableau 7. Condition 16 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 15 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 16 à 68 du tableau 7. Condition 17 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 16 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 17 à 68 du tableau 7.

Condition 18 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 17 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 18 à 68 du tableau 7. Condition 19 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 18 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 19 à 68 du tableau 7. Condition 20 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 19 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 20 à 68 du tableau 7. Condition 21 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 20 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 21 à 68 du tableau 7. Condition 22 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 21 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 22 à 68 du tableau 7.

Condition 23 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 22 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 23 à 68 du tableau 7. Condition 24 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes prenant l'allèle numéro 23 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 24 à 68 du tableau 7. 112 Condition 25 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 24 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 25 à 68 du tableau 7. Condition 26 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 25 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 26 à 68 du tableau 7. Condition 27 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 26 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 27 à 68 du tableau 7.

Condition 28 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 27 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 28 à 68 du tableau 7. Condition 29 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 28 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 29 à 68 du tableau 7. Condition 30 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 29 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 30 à 68 du tableau 7. Condition 31 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 30 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 31 à 68 du tableau 7. Condition 32 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 31 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 32 à 68 du tableau 7.

Condition 33 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 32 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 33 à 68 du tableau 7. Condition 34 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 33 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 34 à 68 du tableau 7. 113 Condition 35 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 34 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 35 à 68 du tableau 7. Condition 36 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 35 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 36 à 68 du tableau 7. Condition 37 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 36 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 37 à 68 du tableau 7.

Condition 38 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 37 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 38 à 68 du tableau 7. Condition 39 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 38 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 39 à 68 du tableau 7. Condition 40 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 39 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 40 à 68 du tableau 7. Condition 41 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 40 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 41 à 68 du tableau 7. Condition 42 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 41 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 42 à 68 du tableau 7.

Condition 43 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 42 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 43 à 68 du tableau 7. Condition 44 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 43 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 44 à 68 du tableau 7. 114 Condition 45 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 44 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 45 à 68 du tableau 7. Condition 46 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 45 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 46 à 68 du tableau 7. Condition 47 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 46 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 47 à 68 du tableau 7.

Condition 48 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 47 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 48 à 68 du tableau 7. Condition 49 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 48 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 49 à 68 du tableau 7. Condition 50 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 49 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 50 à 68 du tableau 7. Condition 51 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 50 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 51 à 68 du tableau 7. Condition 52 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 51 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 52 à 68 du tableau 7.

Condition 53 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 52 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 53 à 68 du tableau 7. Condition 54 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 53 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 54 à 68 du tableau 7. 115 Condition 55 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 54 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 55 à 68 du tableau 7. Condition 56 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 56 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 57 à 68 du tableau 7. Condition 57 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 57 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 58 à 68 du tableau 7. 10 Condition 58 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 58 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 59 à 68 du tableau 7. Condition 59 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 59 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles 15 choisis parmi les allèles numérotés 60 à 68 du tableau 7. Condition 60 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 60 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 61 à 68 du tableau 7. Condition 61 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions 20 précédentes comprenant l'allèle numéro 61 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 62 à 68 du tableau 7. Condition 62 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 62 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 63 à 68 du tableau 7. 25 Condition 63 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 63 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 64 à 68 du tableau 7. Condition 64 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 64 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles 30 choisis parmi les allèles numérotés 65 à 68 du tableau 7. 116 Condition 65 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 65 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 66 à 68 du tableau 7. Condition 66 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 66 du tableau 7 et un ou plusieurs allèles choisis parmi les allèles numérotés 67 ou 68 du tableau 7. Condition 67 - Le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprenant l'allèle numéro 67 du tableau 7 et l'allèle numéro 68 du tableau 7.

Dans un exemple, le vertébré ou la cellule selon l'une quelconque des conditions précédentes comprend un ou plusieurs ou la totalité des allèles JH du tableau 7, par exemple, JH2*02 et/ou au moins JH6*02 (qui est utile pour produire des domaines V de HCDR3 longs pour un usage thérapeutique chez les êtres humains comme il est montré dans les exemples). Ainsi, chaque allèle combiné avec n'importe quel autre allèle dans le tableau 7 est décrit explicitement dans ce document. La même structure de combinaisons est décrite par rapport aux allèles du tableau 12 et du tableau 18. Par conséquent, chaque allèle dans le tableau 7 combiné avec n'importe quel autre allèle dans le tableau 12 ou le tableau 18 est décrit, et chaque allèle dans le tableau 12 est décrit en combinaison avec tout autre allèle dans le tableau 12, et chaque allèle dans le tableau 18 est décrit en combinaison avec tout autre allèle dans le tableau 18. Dans un exemple, le vertébré ou la cellule selon rune quelconque des conditions précédentes comprend un ou plusieurs ou la totalité des allèles JK du tableau 12, par exemple, au moins JK2*01 et/ou JK4*01 (qui est utile pour produire des domaines VK pour un usage thérapeutique chez les êtres humains comme il est montré dans les exemples). Dans un mode de réalisation, la cellule ou le vertébré de l'invention a un génome 30 comprenant les segments de gènes VH3-23*04, JH2*01, VK4-1*01 et/ou JK2*01. Dans un autre mode de réalisation, la cellule ou le vertébré de l'invention a un génome comprenant les segments de gènes VH3-7*01, JH6*02, VK2-28,01 JK4*01. 117 Dans un autre mode de réalisation, la cellule ou le vertébré de l'invention a un génome comprenant les segments de gènes VH7-4-1*01, JH6*02, VK2-28*01 et/ou JK4*01. Eventuellement, le génome comprend en outre D3-16*02. Dans un autre mode de réalisation, la cellule ou le vertébré de l'invention a un génome 5 comprenant les segments de gènes VH4-4-1*02, JH6*02, VK1D-13*01 et/ou JK4*01. Eventuellement, le génome comprend en outre D3-10*01. Dans un autre mode de réalisation, la cellule ou le vertébré de l'invention a un génome comprenant les segments de gènes VH1-3*01, JH6*02, VK1-12*01 et/ou JK4*01. Eventuellement, le génome comprend en outre D3-10*01. 10 Dans un autre mode de réalisation, la cellule ou le vertébré de l'invention a un génome comprenant les segments de gènes VH3-13*01, JH6*02, VK1D-12*02 et/ou JK4*01. Eventuellement, le génome comprend en outre D3-9*01. Dans un autre mode de réalisation, la cellule ou le vertébré de l'invention a un génome comprenant les segments de gènes VH4-4*02, JH6*02, VK1D-13*01 et/ou JK4*01. 15 Eventuellement, le génome comprend en outre D3-10*01. Dans un autre mode de réalisation, la cellule ou le vertébré de l'invention a un génome comprenant les segments de gènes VH3-13*01, JH6*02, VK3-20*01 et/ou JK4*01. Eventuellement, le génome comprend en outre D3-10*01. Dans un autre mode de réalisation, la cellule ou le vertébré de l'invention a un génome 20 comprenant les segments de gènes VH3-23*04, JH6*02, VK1-17*01 et/ou JK4*01. Eventuellement, le génome comprend en outre D3-22*01. Dans un autre mode de réalisation, la cellule ou le vertébré de l'invention a un génome comprenant les segments de gènes VH3-7*01, JH6*02, VK1D-39*01 et/ou JK4*01. Eventuellement, le génome comprend en outre D3-9*01. 25 Dans un autre mode de réalisation, la cellule ou le vertébré de l'invention a un génome comprenant les segments de gènes VH3-13*01, JH6*02, VK1D-39*01 et/ou JK4*01. Eventuellement, le génome comprend en outre D3-10*01. Dans un autre mode de réalisation, la cellule ou le vertébré de l'invention a un génome comprenant les segments de gènes VH3-13*01, JH6*02, VK3-11*01 et/ou JK4*01. 30 Eventuellement, le génome comprend en outre D3-10*01. 118 Dans un autre mode de réalisation, la cellule ou le vertébré de l'invention a un génome comprenant les segments de gènes VH4-4*02, JH6*02, VK1D-16*01 et/ou JK4*01. Eventuellement, le génome comprend en outre D3-9*01. Dans un autre mode de réalisation, la cellule ou le vertébré de l'invention a un génome 5 comprenant les segments de gènes VH3-20*d01, JH6*02, VK1-9*d01 et/ou JK4*01. Eventuellement, le génome comprend en outre D3-10*01. Dans tous les modes de réalisation décrits dans ce document, les régions V et J de chaînes lourdes peuvent être éventuellement recombinées l'une avec l'autre et avec une région D définie ici pour former un domaine variable de chaîne lourde. En outre, les 10 régions V et J de chaînes lourdes peuvent être éventuellement recombinées pour former un domaine variable de chaîne légère. L'invention s'étend à un anticorps ou à un fragment de liaison d'un antigène comprenant des domaines variables humains produits ou dérivés d'une recombinaison de l'une quelconque des combinaisons ci-dessus de segments de gènes. 15 Des anticorps ou des fragments selon l'invention sont présentés dans les exemples comme étant utiles pour produire une recombinaison productive de segments de gènes in vivo, qui présentent une mutation jonctionnelle et une mutation somatique, et produisent des domaines qui peuvent lier spécifiquement l'antigène avec une bonne cinétique de liaison. 20 L'invention comprend des anticorps ou des fragments de liaison d'un antigène de ceux- ci qui sont obtenus ou peuvent être obtenus par une recombinaison, in vivo chez une souris, un mammifère ou un vertébré de l'invention après immunisation, d'un ou de plusieurs segments de gènes D, d'un ou de plusieurs segments de gènes VH et d'un ou de plusieurs des segments de gènes JH humains JH2*01 et JH6*02. 25 Dans un mode de réalisation, la cellule ou le vertébré de l'invention peut exprimer des chaînes lourdes comprenant des régions variables humaines dérivées d'une recombinaison d'un ou de plusieurs segments de gènes D, d'un ou de plusieurs segments de gènes JH et d'un ou de plusieurs des segments de gènes VH suivants VH3-20*d01, VH1-24*d01 et VH2-26*d01. 30 Par conséquent, l'invention comprend des anticorps ou des fragments de liaison d'un antigène de ceux-ci qui sont obtenus ou peuvent être obtenus par recombinaison, in vivo chez une souris, un mammifère ou un vertébré de l'invention après immunisation, d'un ou de plusieurs segments de gènes D, d'un ou de plusieurs segments de gènes JH 119 et d'un ou de plusieurs des segments de gènes VH humains VH3-20*d01, VH1-24*d01 et VH2-26*d01. Dans un autre mode de réalisation, la cellule ou le vertébré de l'invention peut exprimer en outre ou en variante des chaînes légères comprenant des régions variables humaines dérivées d'une recombinaison d'un ou de plusieurs segments« de gènes JK et d'un ou de plusieurs des segments de gènes VK humains VK5-2*d01, VK1-9*d01, VK1D-8*d01, VK3D-11*d01, VK1D-13*d01, VK3D-15*d01, VK2D-26*d01 et VK2D28*d01 ou d'une recombinaison d'un ou de plusieurs segments de gènes JÀ et d'un ou de plusieurs des segments de gènes VÀ humains VÀ2-22*d01, VÀ2-23*d02, VÀ3- 25*d03 et VÀ4-60*d03. Par conséquent, l'invention comprend des anticorps ou des fragments de liaison d'un antigène de ceux-ci qui sont obtenus ou peuvent être obtenus par recombinaison, in vivo chez une souris, un mammifère ou un vertébré de l'invention après immunisation, d'un ou de plusieurs segments de gènes JK et d'un ou de plusieurs des segments de gènes VK humains VK5-2*d01, VK1-9*d01, VK1D-8*d01, VK3D-11*d01, VK2D-26*d01 et VK2D-28*d01 ou d'un ou de plusieurs segments de gènes JÀ et d'un ou de plusieurs des segments de gènes VÀ humains VÀ2-22*d01, VÀ2-23*d02, VÀ3-25*d03 et VÀ4- 60*d03. Dans tous les aspects de l'invention, la cellule peut être une cellule d'hybridome, une cellule B, éventuellement une cellule B immortalisée, ou une cellule souche embryonnaire. Dans un mode de réalisation, le vertébré ou la cellule comprend une région constante qui est une région constante kappa ou lambda ; éventuellement, une région constante de souris ou de rat. Dans un mode de réalisation, la région constante peut être une région constante humaine. Dans un mode de réalisation, le vertébré ou la cellule décrit dans ce document comprend un locus de chaîne légère endogène qui est un locus kappa ou lambda ; éventuellement où le génome comprend au moins les segments de gènes V et J du tableau 8,9 ou 10 au niveau d'un locus de chaîne légère endogène, par exemple, le locus kappa et/ou au moins les segments de gènes V et J du tableau 13 ou 14 au niveau d'un locus de chaîne légère endogène, par exemple le locus soit lambda soit kappa. Dans un mode de réalisation, le vertébré ou la cellule décrit dans ce document comprend des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des régions variables 120 humaines qui sont dérivées d'une recombinaison de segments de gènes VA et JA humains choisis dans le groupe constitué par des segments de gènes VA et JA du tableau 18, chacune de ces régions variables étant exprimée avec une région constante codée par un segment de gène CÀ choisi dans le groupe constitué par les segments de gènes CA du tableau 18. Dans un mode de réalisation, les chaînes légères comprennent des régions variables humaines dérivées d'une recombinaison de segments de gènes VA et JA humains choisis dans le groupe constitué par des segments de gènes VA et JA du tableau 18. Dans tous les modes de réalisation de l'invention, les domaines VH et VL peuvent éventuellement former un site de liaison d'un antigène. La cellule de l'un quelconque des aspects de l'invention peut être une cellule d'hybridome ou une cellule B, éventuellement une cellule B immortalisée. La cellule peut être également une cellule ES. La cellule ES peut faire partie d'une population d'au moins 90, 150 ou de plus de 200 cellules. Dans un exemple, la population des cellules est contenue sur une ou plusieurs plaques multi-puits (par exemple, des plaques de 96 puits) et elle peut être, par exemple, une population triée où les-cellules simples sont comprises par différents puits respectifs d'une plaque. Le vertébré de l'un quelconque des aspects peut être compris au sein d'un conteneur comprenant de l'air filtré, éventuellement comprenant un filtre à air.

Dans un mode de réalisation, l'environnement interne du conteneur est stérile, par exemple, autant que possible en utilisant un conteneur classique pour animaux, par exemple, une cage pour souris TechniplastTM (http://www.tecniplast.it/us/product/mouse-loft.html). Dans un exemple, le conteneur a un corps en plastique, par exemple, un corps translucide ou transparent.

Le conteneur comprenant les vertébrés peut avoir un volume de pas plus de quatre, 3, 2 ou 1 mètres3. Le conteneur peut comprendre une pluralité de vertébrés, par exemple, un mâle et une femelle (par exemple, une paire fertile). Dans un mode de réalisation, les vertébrés de l'invention sont âgés d'au moins 3,5 semaines, par exemple, 4 semaines, 5 semaines, 6 semaines, 7 semaines.

L'utilisation des segments de gènes tels que revendiqués, spécifiquement tel qu'indiqué dans les tableaux 1 à 18, procure les avantages observés dans les exemples. Procédés/utilisations 121 L'invention concerne en outre un procédé de production d'un anticorps ou d'un fragment de liaison d'un antigène de celui-ci, le procédé comprenant l'immunisation d'un vertébré de l'invention avec un antigène et la récupération de l'anticorps ou du fragment et la récupération d'une cellule produisant l'anticorps ou le fragment ; éventuellement, la modification de l'anticorps ou du fragment isolé de telle manière qu'il comprend des régions constantes humaines. L'invention comprend également un procédé de production d'un anticorps ou d'un fragment de liaison d'un antigène de celui-ci, le procédé comprenant l'isolement d'un anticorps ou d'un fragment de liaison d'un antigène de celui-ci à partir d'une cellule de l'invention ; et éventuellement, la modification de l'anticorps ou du fragment isolé de telle manière qu'il comprend des régions constantes humaines. La technologie de l'ADN recombinant peut être utilisée pour produire une séquence nucléotidique modifiée codant pour l'anticorps ou le fragment modifié. Le procédé peut comprendre (a) l'isolement à partir du vertébré d'une cellule B codant pour un anticorps qui lie l'antigène, (b) l'identification ou la copie d'une séquence nucléotidique de la cellule B qui code pour un domaine VH de l'anticorps et/ou l'identification ou la copie d'une séquence nucléotidique de la cellule B qui code pour un domaine VL de l'anticorps ; et (c) l'utilisation de la ou des séquences pour produire un anticorps isolé comprenant le domaine VH et/ou VL ; éventuellement où l'anticorps isolé comprend des régions constantes humaines. L'invention comprend un procédé de production d'un anticorps totalement humanisé comprenant l'immunisation d'un vertébré tel que décrit dans ce document et ensuite le remplacement de la région constante de vertébré non humain d'un anticorps spécifiquement réactif avec l'antigène par une région constante humaine, de manière appropriée par modification de l'acide nucléique codant pour l'anticorps. L'invention concerne également un anticorps humanisé produit selon l'un quelconque des 'procédés décrits dans ce document et l'utilisation d'un anticorps humanisé ainsi produit en médecine. Dans un autre mode de réalisation, l'invention comprend l'isolement d'un anticorps IgG1, IgG2b et/ou IgM qui lie spécifiquement l'antigène cible. 122 Un anticorps isolé de l'invention peut être produit par expression à partir d'une cellule hôte choisie parmi une cellule CHO, HEK293, Cos ou de levure (par exemple, Pichia). Dans un autre mode de réalisation, l'anticorps ou le fragment isolé peut être formulé avec un diluant, un support, un excipient ou un médicament pour produire une composition pharmaceutique pour un usage médical pour les êtres humains. Eventuellement, l'anticorps formulé peut être conditionné dans un récipient stérile, par exemple, un flacon, un tube, une poche pour IV ou une seringue, éventuellement en outre la production d'un kit comprenant la combinaison du conditionnement avec une étiquette ou des instructions indiquant l'utilisation de la composition de l'anticorps pour un usage médical chez les êtres humains ; éventuellement où l'étiquette ou les instructions comprennent un numéro de lot du médicament et/ou un numéro d'autorisation de commercialisation, en outre éventuellement un numéro d'autorisation de commercialisation émis par l'EMA ou la FDA.

L'invention concerne l'anticorps ou le fragment produit par le procédé de l'invention pour un usage médical chez les êtres humains et l'utilisation de l'anticorps ou du fragment isolé produit par le procédé de l'invention dans la fabrication d'un médicament destiné à un usage médical pour les êtres humains. Le médicament peut être une composition ou un kit décrit dans ce document.

L'invention comprend des anticorps et des fragments de liaison d'un antigène de ceux-ci comprenant des domaines variables humains produits par ou dérivés d'une recombinaison de l'une quelconque des recombinaisons de segments de gènes décrites dans ce document, éventuellement où l'anticorps et les fragments sont obtenus ou peuvent être obtenus par recombinaison, in vivo chez une souris, un mammifère ou un autre vertébré de l'invention après immunisation. Dans un mode de réalisation, les chaînes lourdes d'immunoglobulines exprimées par la cellule ou le vertébré sont essentiellement exclusivement lesdites chaînes lourdes comprenant des régions variables humaines ; et lesdites chaînes lourdes comprenant des régions variables humaines sont exprimées comme faisant partie d'anticorps IgG sériques, éventuellement des anticorps IgG1, IgG2a ou IgG2b, ou IgM. Dans un mode de réalisation, la cellule ou le vertébré de l'invention exprime un anticorps IgG, éventuellement un anticorps IgG1, IgG2a ou IgG2b, ou un anticorps IgM comprenant des chaînes lourdes telles que définies dans ce document, où l'anticorps lie spécifiquement un antigène cible. 123 L'invention concerne en outre : L'anticorps, éventuellement, produit par un procédé de l'invention comprenant (a) un domaine variable de chaîne lourde humaine dérivé d'une recombinaison de 5 segments de gènes VH, D et JH humains choisis dans le groupe constitué par des segments de gènes VH, D et JH de l'un quelconque des tableaux 1 à 7 ; et (b) un domaine variable de chaîne légère humaine dérivé d'une recombinaison de segments de gènes V et J humains choisis tous les deux parmi les segments de gènes 10 V et J de l'un quelconque des tableaux 8 à 18. Un anticorps ou un fragment de liaison d'un antigène de celui-ci isolé, éventuellement obtenu ou pouvant être obtenu par le procédé de l'invention, où une région variable de l'anticorps ou du fragment comprend une ou plusieurs mutations somatiques provoquées par la désaminase induite par activation (AID) de souris ou de rat et/ou 15 mutations jonctionnelles provoquées par la désoxynucléotidyl-transférase terminale (TdT) de souris ou de rat. Le domaine ou la région variable de chaîne lourde ou légère conformément à l'invention peut comprendre jusqu'à 10, y compris 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou 9 mutations 20 jonctionnelles. Dans un autre mode de réalisation, le domaine ou la région variable de chaîne lourde ou légère conformément à l'invention peut comprendre en outre ou en variante jusqu'à 9, y compris 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 8, y compris 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, mutations somatiques. 25 Dans un autre mode de réalisation, l'invention comprend un anticorps ou un fragment de liaison, d'un antigène de celui-ci isolé, éventuellement obtenu ou pouvant être obtenu par le procédé de l'invention, qui lie un récepteur gamma, et est en outre éventuellement une région constante de chaîne légère humaine. Dans un mode de réalisation, le Fc 30 comprend des domaines constants gamma humains, par exemple, des domaines constants d'IgG1, d'IgG2, d'IgG3 ou d'lgG4 humaines. Un anticorps ou un fragment de liaison d'un antigène de celui-ci isolé, éventuellement obtenu ou pouvant être obtenu par le procédé de l'invention, où l'anticorps prend la glycosylation des cellules CHO, HEK293, Cos ou de levure (par exemple, Pichia). 124 Un anticorps ou un fragment de l'invention peut lier spécifiquement une enzyme humaine. Un anticorps ou un fragment de l'invention peut lier spécifiquement les cibles humaines : proprotéine convertase PC9, proprotéine convertase subtilisine kexine-9 (PCSK9), CD126, IL-4, récepteur de l'IL-4, IL-6, récepteur de l'IL-6, IL-13, récepteur de l'IL-18, Erbb3, ASIC1 cellulaire, ANG2, GDF-8, ligand-2 de l'angiopoïétine, ligand de protéine de type delta 4, immunoglobuline G1, ligand du PDGF, récepteur du PDGF ou récepteur du NGF, toxine A ou toxine B de Clostridium difficile, relaxine, CD48, CD20, récepteur du glucagon, récepteur activé par protéase 2, ligand de type TNF 1A (TL1A), protéine associée à l'angiopoïétine 2 (AR-2), protéine de type angiopoïétine 4, RANKL, protéine de type angiopoïétine 3 (ANGPTL3), ligand de type delta 4 (DLL4), macroendothéline-1 (ET-1), activine A, récepteur tyrosine kinases, par exemple AR-1 humaine et tyrosine kinase avec Ig et domaines d'homologie de l'EGF (TIE) ou récepteur de TIE-2. Dans un autre aspect, l'invention comprend les clauses suivantes : CLAUSES 1. Une cellule de vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat) dont le génome comprend des segments de gènes VH, D et JH humains en amont d'une région constante au niveau d'un locus de chaîne lourde endogène et des segments de gènes VL et JL humains en amont d'une région constante au niveau d'un locus de chaîne légère endogène, où les segments de gènes sont liés de manière fonctionnelle à la région constante de celui-ci de telle manière que la cellule est capable d'exprimer des chaînes lourdes et légères d'immunoglobulines comprenant des domaines VH et VL humains respectivement, où le locus de chaîne lourde comprend un segment de gène VH allèle 01 humain capable de se recombiner avec un segment de gène D et JH humain pour produire un domaine VH, où le locus de chaîne légère comprend un segment de gène VL allèle 01 humain capable de se recombiner avec un segment de gène JL humain pour produire un domaine VL, ou bien où la cellule peut se développer chez un vertébré qui exprime lesdits domaines VH et VL. 2. Un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat) dont le génome comprend des segments de gènes VH, D et JH humains en amont d'une région constante au niveau d'un locus de chaîne lourde endogène et des segments de 125 gènes VL et JL humains en amont d'une région constante au niveau d'un locus de chaîne légère endogène, où les segments de gènes sont liés de manière fonctionnelle à la région constante de celui-ci de telle manière que le vertébré est capable d'exprimer des chaînes lourdes et légères d'immunoglobulines comprenant des domaines VH et VL humains respectivement, où le locus de chaîne lourde comprend un segment de gène VH allèle 01 humain capable de se recombiner avec un segment de gène D et JH humain pour produire un domaine VH et où le locus de chaîne légère comprend un segment de gène VL allèle 01 humain capable de se recombiner avec un segment de gène JL humain pour produire un domaine VL. 3. La cellule de la clause 1 ou le vertébré de la clause 2, où l'un ou les deux allèles 01 est/sont un allèle d01. 4. La cellule ou le vertébré de l'une quelconque des clauses précédentes, où les domaines VH et VL forment un site de liaison d'un antigène. 5. La cellule ou le vertébré de l'une quelconque des clauses précédentes, où le locus de chaîne lourde ne comprend aucun second allèle humain dudit segment de gène VH. 6. La cellule ou le vertébré de l'une quelconque des clauses précédentes, où le locus de chaîne légère ne comprend aucun second allèle humain dudit segment de gène VL. 7. La cellule ou le vertébré de l'une quelconque des clauses précédentes, où le locus de chaîne lourde comprend un segment de gène D allèle 01 humain capable de se recombiner avec un segment de gène JH humain et ledit segment VH humain pour produire ledit domaine VH ; éventuellement où le locus de chaîne lourde ne comprend aucun second allèle humain dudit segment de gène D. 8. La cellule ou le vertébré de l'une quelconque des clauses précédentes, où le locus de chaîne lourde comprend un segment de gène JH allèle 02 humain (par exemple, JH6*02) capable de se recombiner avec un segment de gène D humains et ledit segment VH humain pour produire ledit domaine VH ; éventuellement où le locus de chaîne lourde ne comprend aucun second allèle humain dudit segment de gène JH. 126 . La cellule ou le vertébré de l'une quelconque des clauses précédentes, où le locus de chaîne légère comprend un segment de gène JL allèle 01 humain capable de se recombiner avec ledit segment VL humain pour produire ledit domaine VL ; éventuellement où le locus de chaîne légère ne comprend aucun second allèle humain dudit segment de gène JL. 10. La cellule ou le vertébré de l'une quelconque des clauses précédentes, où le génome comprend VH3-23*04, JH2*01 (éventuellement recombiné avec le VH3- 23*04), VK4-1*01 et JK2*01(éventuellement recombiné avec le VK4-1*01). 11. La cellule ou le vertébré de l'une quelconque des clauses précédentes, où le génome comprend VH3-7*01, JH6*02 (éventuellement recombiné avec le VH3- 7*01), VK2-28*01 et JK4*01 (éventuellement recombiné avec le VK2-28*01). 12. La cellule ou le vertébré de l'une quelconque des clauses précédentes, où le locus de chaîne légère comprend ou est constitué d'un, de plusieurs ou de la totalité des segments de gènes VL humains choisis dans le groupe constitué par VK4-1*01, VK2-28*01, VK1D-13*d01, VK1-12*01, VK1D-12*02, VK3-20*01, VK1-17*01, VK1D-39*01, VK3-11*01, VK1D-16*01 et VK1-9*d01. 13. La cellule ou le vertébré de l'une quelconque des clauses 1 à 9, où ledit locus de chaîne légère comprend ou est constitué d'un, de plusieurs ou de la totalité des segments de gènes VL humains choisis dans le groupe constitué par JK4*01 et JK2*01. 14. La cellule ou le vertébré de l'une quelconque des clauses précédentes, où ledit locus de chaîne lourde comprend ou est constitué d'un, de plusieurs ou de la totalité des segments de gènes VH humains choisis dans le groupe constitué par VH3-23*04, VH7-4-1*01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01 et VH3-20*d01. 15. La cellule ou le vertébré de l'une quelconque des clauses 1 à 9 ou 14, où le locus de chaîne légère comprend JÀ2*01. 16. La cellule ou le vertébré de l'une quelconque des clauses 1 à 6, où ledit domaine VH est un recombinant de segments VH, D et JH humains, où le VH est choisi dans le groupe constitué par un, plusieurs ou la totalité des segments de gènes VH allèle 01 du tableau 7 et/ou le domaine VL est un recombinant des (i) segments de gènes VK et JK humains, où le VK est choisi dans le groupe constitué par un, plusieurs ou la 127 totalité des segments de gènes VK allèle 01 du tableau 12 ou (ii) segments de gènes VA et JÀ humains, le VA étant choisi dans le groupe constitué par un, plusieurs ou la totalité des segments de gènes VA allèle 01 du tableau 18 ; éventuellement où les domaines VH et/ou VL sont exprimés sous la forme d'anticorps IgG. 17. La cellule ou le vertébré de l'une quelconque des clauses 1 à-6 et 16, où ledit domaine VH est un recombinant des segments VH, D et JH humains du tableau 1, du tableau 2, du tableau 3, du tableau 4, du tableau 5, du tableau 6 ou du tableau 7 et/ou le domaine VL est un recombinant des (i) segments de gènes VK et JK humains du tableau 8, du tableau 9, du tableau 10, du tableau 11 ou du tableau 12 ; ou (ii) des segments de gènes VA et JÀ humains du tableau 13, du tableau 14, du tableau 15, du tableau 16, du tableau 17 ou du tableau 18. 18. Le vertébré de l'une quelconque des clauses 2 à 17, où (a) le locus de chaîne lourde comprend les segments VH, D et JH humains d'un tableau choisi parmi le tableau 1, le tableau 2, le tableau 3, le tableau 4, le tableau 5, le tableau 6 et le tableau 7 et/ou (b) le locus de chaîne légère comprend (i) les segments de gènes VK et JK humains d'un tableau choisi parmi le tableau 8, le tableau 9, le tableau 10, le tableau 11 et le tableau 12 ; ou (ii) les segments de gènes VA et JA humains d'un tableau choisi parmi le tableau 13, le tableau 14, le tableau 15, le tableau 16, le tableau 17 et le tableau 18 ; et où le vertébré exprime un ou une pluralité de domaines VH, chacun étant un recombinant de segments de gènes VH, D et JH humains provenant d'un tableau choisi de (a) et/ou exprime un ou une pluralité de domaines VL, chacun étant un recombinant de segments VL et JL humains provenant d'un tableau choisi de (b) ; éventuellement où ces domaines VH et domaines VL forment des sites de liaison d'un antigène. 19. Le vertébré de la clause 18, où le locus de chaîne lourde comprend les segments VH, D et JH humains choisis à partir du tableau 3 et le locus de chaîne légère comprend des segments de gènes VK et JK humains choisis à partir du tableau 10. 20. Un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat) dont le génome comprend des segments de gènes VH, D et JH humains en amont d'une région constante au niveau d'un locus de chaîne lourde endogène et des segments de gènes VL et JL humains en amont d'une région constante au niveau d'un locus de chaîne légère endogène, où les segments de gènes sont liés de manière fonctionnelle à une région constante de celui-ci de telle manière que le vertébré est capable d'exprimer des chaînes lourdes et légères d'immunoglobulines comprenant des domaines VH et VL humains respectivement, où (a) le locus de chaîne lourde 128 comprend les segments VH, D et JH humains d'un tableau choisi parmi le tableau 1, le tableau 2, le tableau 3, le tableau 4, le tableau 5, le tableau 6 et le tableau 7 et/ou (b) le locus de chaîne légère comprend (i) les segments de gènes VK et JK humains d'un tableau choisi parmi le tableau 8, le tableau 9, le tableau 10, le tableau 11 et le tableau 12 ; ou (ii) les segments de gènes VÀ et JÀ humains d'un tableau choisi parmi le tableau 13, le tableau 14, le tableau 15, le tableau 16, le tableau 17 et le tableau 18 ; et où le vertébré exprime un ou une pluralité de domaines VH, chacun étant un recombinant de segments VH, D et JH provenant d'un tableau choisi de (a) et/ou exprime un ou une pluralité de domaines VL, chacun étant un recombinant de segments VL et JL humains provenant d'un tableau choisi de (b) ; éventuellement où ces domaines VH et domaines VL forment des sites de liaison d'un antigène. 21. La cellule de l'une quelconque des clauses précédentes, où ladite cellule est une cellule ES, une cellule d'hybridome ou une cellule B immortalisée. 22. Le vertébré de l'une quelconque des clauses précédentes, où ledit vertébré est compris au sein d'un conteneur disposant d'un filtre à air. 23. Une population d'au moins 90 cellules, où lesdites cellules sont conformément à l'une quelconque des clauses 1 à 17, 21 ou 22. 24. La cellule, le vertébré ou la population de l'une quelconque des clauses précédentes, où ladite région constante du locus de chaîne légère est une région constante kappa ou lambda ; éventuellement une région constante de souris ou de rat. 25. La cellule, le vertébré ou la population de l'une quelconque des clauses précédentes, où le locus de chaîne lourde est une région constante de souris ou de rat (par exemple, comprenant un segment de gène. constant gamma). 26. La cellule, le vertébré ou la population de l'une quelconque des clauses précédentes, où ledit locus de chaîne légère endogène est un locus kappa ou lambda ; éventuellement où le génome comprend au moins les segments de gènes V et J du tableau 8 au niveau d'un locus de chaîne légère endogène et/ou au moins les segments de gènes V et J du tableau 13 au niveau d'un locus de chaîne légère endogène. 129 . La cellule, le vertébré ou la population de l'une quelconque des clauses 1 à 9 ou 14 à 26, où lesdites chaînes légères comprennent des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des régions variables humaines qui sont dérivées d'une recombinaison de segments de gènes VÀ et JÀ humains choisis dans le groupe constitué par des segments de gènes VÀ et JÀ du tableau 18, éventuellement chacune de ces régions variables étant exprimée avec une région constante codée par un segment de CÀ choisi dans le groupe constitué par les segments de gènes CÀ du tableau 18. 28. La cellule, le vertébré ou la population de l'une quelconque des clauses précédentes, où le vertébré est une souche de souris C57BI/6J, 129S5 ou 129Sv ou un croisement entre une souche C57BI/6J et une souche 129S5 ou 129Sv. 29. La cellule, le vertébré ou la population de l'une quelconque des clauses précédentes, où les chaînes lourdes d'immunoglobulines exprimées par la cellule ou le vertébré sont essentiellement exclusivement lesdites chaînes lourdes comprenant des régions variables humaines ; et lesdites chaînes lourdes comprenant des régions variables humaines sont exprimées comme faisant partie d'anticorps IgG1, IgG2b et IgM (et éventuellement IgG2a) sériques. 30. La cellule, le vertébré ou la population de l'une quelconque des clauses précédentes, où le vertébré exprime des chaînes légères comprenant des régions variables lambda humaines et au moins 60 %, 70 % ou 80 % des régions variables de ces chaînes légères sont dérivées d'une recombinaison de segments de gènes VA et JÀ humains. 31. Un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat) ou une cellule dont le génome comprend un répertoire de segments de gènes Ig produits par une insertion ciblée de segments de gènes Ig humains dans un ou plusieurs loci Ig-endogènes, le génome comprenant des segments de gènes VA et JÀ humains en amont d'une 130 région constante, où les segments de gènes VÀ et JÀ humains ont été fournis par insertion dans un locus de chaîne légère endogène du vertébré ou de la cellule, où le vertébré comprend des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des régions variables lambda (chaînes légères lambda) ou la cellule peut se développer chez un vertébré qui exprime lesdites chaînes légères d'immunoglobulines, où les chaînes légères lambda comprennent des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des régions variables lambda dérivées de la recombinaison de segments de gènes VÀ et JÀ humains ; où au moins 80 % des régions variables des chaînes légères lambda exprimées par le vertébré sont des recombinants de segments de gènes VÀ et JÀ humains ; où le vertébré ou la cellule est conformément à l'une quelconque des clauses 1 à 9 ou 14 à 30. 32. Un vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat) ou une cellule dont le génome comprend un répertoire de segments de gènes Ig produits par insertion ciblée de segments de gènes Ig humains dans un ou plusieurs loci Ig endogènes, le génome comprenant des segments de gènes VÀ et JÀ humains en amont d'une région constante, où les segments de gènes VÀ et JÀ humains sont choisis parmi un, plusieurs ou la totalité des segments du tableau 18 et ont été fournis par insertion dans un locus de chaîne légère endogène du vertébré ou de la cellule, où le vertébré comprend des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des régions variables lambda (chaînes légères lambda) ou la cellule peut se développer chez un vertébré qui exprime lesdites chaînes légères d'immunoglobulines, où les chaînes légères lambda comprennent des chaînes légères d'immunoglobulines comprenant des recombinants de régions variables lambda d'une ou d'une pluralité de paires de segments de gènes VÀ et JÀ humains, où chaque segment de gène est choisi parmi les segments de gènes VÀ et JÀ humains du tableau 18. 33. Un procédé de production d'un anticorps ou d'un fragment de liaison d'un antigène de celui-ci, le procédé comprenant l'immunisation d'un vertébré de l'une quelconque des clauses 2 à 20, 22 ou 24 à 32 avec un antigène et la récupération de l'anticorps du fragment ou la récupération d'une cellule produisant l'anticorps ou le fragment ; éventuellement la modification de l'anticorps ou du fragment produit de telle manière qu'il comprend des régions constantes humaines. 34. Un procédé de production d'un anticorps ou d'un fragment de liaison d'un antigène de celui-ci, le procédé comprenant l'isolement d'un anticorps ou d'un fragment de liaison d'un antigène de celui-ci à partir d'une cellule selon l'une quelconque des 131 clauses 1, 3 à 17, 21 et 23 à 31 ; et éventuellement la modification de l'anticorps du fragment isolé de telle manière qu'il comprend des régions constantes humaines. 35. Le procédé de la clause 34, comprenant en outre (a) l'isolement à partir du vertébré d'une cellule B codant pour un anticorps qui lie l'antigène, (b) l'identification ou la copie d'une séquence nucléotidique de la cellule B qui code pour un domaine VH de l'anticorps et/ou l'identification ou la copie d'une séquence nucléotidique de la cellule B qui code pour un domaine VL de l'anticôrps ; et (c) l'utilisation de la ou des séquences pour produire un anticorps ou un fragment isolé comprenant le domaine VH et/ou VL ; éventuellement où l'anticorps ou le fragment isolé comprend des régions constantes humaines. 36. Le procédé de l'une quelconque des clauses 33 à 35, où l'anticorps ou le fragment est produit par expression à partir d'une cellule hôte choisie parmi une cellule CHO, HEK293, Cos ou de levure (par exemple, Pichia). 37. Le procédé de l'une quelconque des clauses 33 à 36, comprenant en outre la formulation de l'anticorps ou du fragment avec un diluant, un support, un excipient ou un médicament pour produire une composition pharmaceutique pour un usage médical pour les êtres humains, éventuellement comprenant en outre le conditionnement de la composition dans un récipient stérile, par exemple, un flacon, un tube, une poche pour IV ou une seringue, produisant en outre éventuellement un kit comprenant la combinaison du conditionnement avec une étiquette ou des instructions indiquant l'utilisation de la composition de l'anticorps pour un usage médical chez les êtres humains ; éventuellement où l'étiquette ou les instructions comprennent un numéro de lot du médicament et/ou un numéro d'autorisation de commercialisation, en outre éventuellement un numéro d'autorisation de commercialisation émis par l'EMA ou la FDA. 38. Le procédé de l'une quelconque des clauses 33 à 37, of le vertébré est conformément à l'une quelconque des clauses précédentes et l'anticorps ou le fragment produit par le procédé comprend (a) un domaine variable de chaîne lourde humaine recombinant de segments de gènes VH, D et JH humains choisis dans le groupe constitué par des segments de gènes VH, D et JH du tableau 7 ; et 132 (b) un domaine variable de chaîne légère humaine recombinant de segments de gènes V et J humains choisis parmi les segments de gènes V et J du tableau 12 ou choisi parmi les segments de gènes V et J du tableau 18. 39. Un anticorps ou un fragment de liaison d'un antigène de celui-ci isolé obtenu ou pouvant être obtenu par le procédé de l'une quelconque des clauses 33 à 38, où un domaine variable de chaîne lourde et/ou légère de l'anticorps ou du fragment comprend une ou plusieurs mutations somatiques provoquées par la désaminase induite par activation (AID) de souris ou de rat et/ou mutations jonctionnelles provoquées par la désoxynucléotidyl-transférase terminale (TdT) de souris ou de rat. 40. Un anticorps ou un fragment de liaison d'un antigène de celui-ci isolé obtenu ou pouvant être obtenu par le procédé de l'une quelconque des clauses 32 à 39, ou un anticorps selon la clause 98 comprenant un fragment Fc de chaîne lourde humaine, éventuellement qui lie un récepteur gamma, et en outre éventuellement une chaîne légère constante humaine. 41. Un anticorps ou un fragment de liaison d'un antigène de celui-ci isolé obtenu ou pouvant être obtenu par le procédé de l'une quelconque des clauses 33 à 40, ou un anticorps selon la clause 98 ou la clause 39 comprenant un site de liaison d'un antigène capable de se lier spécifiquement à un virus ou un antigène choisi parmi une cytokine, un facteur de croissance, une hormone, une enzyme et une protéine sérique de l'être humain. 42. Un anticorps ou un fragment de liaison d'un antigène de celui-ci isolé obtenu ou pouvant être obtenu par le procédé de l'une quelconque des clauses 32 à 36, ou un anticorps selon l'une quelconque des clauses 39 à 41, où ledit anticorps ou fragment est glycosylé, éventuellement comprenant la glycosylation des cellules CHO, HEK293, Cos ou de levure (par exemple, Pichia). 43. Un anticorps ou un fragment de liaison d'un antigène de celui-ci isolé, où les domaines variables dudit anticorps sont codés par (i) des segments VH, D et JH humains choisis dans le groupe constitué par des segments de gènes quelconques du tableau 7 et/ou (i) des segments de gènes VK et JK humains choisis dans le groupe constitué par des segments de gènes VK et JK quelconques du tableau 12 ou 133 (ii) des segments de gènes VA et JÀ humains choisis dans le groupe constitué par des segments de gènes VA et JA quelconques du tableau 18. 44. Un anticorps ou un fragment de liaison d'un antigène de celui-ci isolé de l'une quelconque des clauses 39 à-43, où l'anticorps ou le fragment se lie spécifiquement à un virus ou un antigène choisi parmi une cytokine, un facteur de croissance, une hormone, une enzyme et une protéine sérique de l'être humain. 45. Un anticorps ou un fragment de liaison d'un antigène de celui-ci isolé de l'une quelconque des clauses 39 à 44, où l'anticorps est humanisé. 46. Une composition comprenant un anticorps ou un fragment de l'une quelconque des clauses 39 à 45, où l'anticorps ou le fragment est le seul agent thérapeutique. 47. Une composition comprenant un anticorps ou un fragment de l'une quelconque des clauses 39 à 45, comprenant en outre un agent thérapeutique supplémentaire, par exemple, un médicament antirhumatismal, comme un médicament antirhumatismal modificateur de maladie, ou un médicament anticancéreux ou un médicament antihypercholestérolémiant. 48. L'anticorps ou le fragment isolé produit par le procédé de l'une quelconque des clauses 33 à 36 ou l'anticorps ou le fragment isolé de l'une quelconque des clauses 39 à 47 pour un usage médical pour l'être humain. 49. Utilisation de l'anticorps ou du fragment isolé produit par le procédé de l'une quelconque des clauses 33 à 36 ou l'anticorps ou le fragment isolé de l'une quelconque des clauses 39 à 47 dans la fabrication d'un médicament destiné à un usage médical pour l'être humain. 50. Utilisation de la clause 49, où le médicament est composé d'une composition ou d'un kit tel que cité dans la clause 37. 51. Un procédé de traitement médical comprenant la délivrance d'une quantité efficace de l'anticorps ou du fragment de celui-ci isolé selon les clauses 39 à 47 à un être humain en ayant besoin. 134 . Une cellule hôte, par exemple, une cellule CHO, HEK293, Cos ou de levure (par exemple, Pichia), exprimant un anticorps ou un fragment tel que défini dans l'une quelconque des clauses 39 à 44.

Les définitions suivantes s'appliquent à l'ensemble des configurations, aspects, clauses, conditions, exemples ou modes de réalisation de l'invention. "Dérivé de" est utilisé dans le sens ordinaire du terme. Les exemples de synonymes comprennent "produit sous la forme de", "résultant de", "reçu de", "obtenu à partir de", "un produit de", "une conséquence de", et "modifié à partir de". Par exemple, une région variable humaine d'une chaîne lourde peut être dérivée d'une recombinaison de segments de gènes VH, D et JH humains et ceci reflète la recombinaison in vivo de ces segments de gènes dans, par exemple, un locus de chaîne lourde transgénique selon l'invention avec toute mutation qui l'accompagne (par exemple, une mutation jonctionnelle).

Les échantillons à partir desquels des cellules B peuvent être obtenues comprennent, mais sans limitation, le sang, le sérum, la rate, le tissu splénique, la moelle osseuse, la lymphe, le ganglion lymphatique, le thymus et l'appendice. Les anticorps et les chaînes d'immunoglobulines peuvent être obtenus à partir de chacun des échantillons mentionnés précédemment et également à partir de la liste non limitative suivante de cellules B, de liquide d'ascite, d'hybridomes et de cultures cellulaires. "Pluralité" est utilisé dans le sens ordinaire du terme et signifie "au moins un(e)" ou "plus d'un(e)". Le terme "configuration de la lignée germinale" se rapporte à une configuration génomique de la lignée germinale. Par exemple, des segments de gènes _ d'immunoglobulines humaines d'un locus d'immunoglobuline transgénique sont dans une configuration de lignée germinale lorsque l'ordre relatif des segments de gènes est identique à l'ordre des segments de gènes correspondants dans un génome de lignée germinale humàine. Par exemple, lorsque le locus transgénique est un locus de chaîne lourde de l'invention comprenant des segments de gènes A, B et C hypothétiques d'immunoglobulines humaines, ceux-ci seront fournis dans cet ordre (5' à 3' dans le locus) lorsque les segments de gènes correspondants d'un génome de lignée germinale humaine comprennent l'arrangement 5'-A-B-C-3'. Dans un exemple, lorsque les éléments d'un locus d'immunoglobuline humain (par exemple, des segments de gènes, des amplificateurs ou d'autres éléments régulateurs) sont fournis dans un locus 135 d'immunoglobuline transgénique selon l'invention, les éléments du locus Ig humain sont dans la configuration de la lignée germinale lorsque l'ordre relatif des segments est identique à l'ordre des segments de gènes correspondants dans un génome de lignée germinale humaine et que des séquences humaines entre les éléments sont incluses, celles-ci correspondant à ces séquences entre les éléments correspondants dans le génome de la lignée germinale humaine. Ainsi, dans un exemple hypothétique, le locus transgénique comprend les éléments humains dans l'arrangement 5'-A-S1-B-S2-CS3-3', où A, B et C sont des segments de gènes d'immunoglobulines humaines et S1 à S3 sont des séquences de segments intergéniques humains, où l'arrangement correspondant 5'-A-S1-B-S2-C-S3-3' est présent dans un génome de lignée germinale humaine. Par exemple, ceci peut être obtenu en fournissant dans un locus d'immunoglobuline transgénique de l'invention, un insert d'ADN correspondant à la séquence d'ADN de A à C dans un génome de lignée germinale humaine (ou l'insert comprenant la séquence d'ADN de A à C). Les arrangements dans les génomes des lignées germinales humaines et les loci d'immunoglobulines sont connus dans l'art (par exemple, voir l'IMGT à l'adresse World Wide Web (voir ci-dessus), Kabat et d'autres ressources d'anticorps dont il est fait référence dans ce document). Le terme "anticorps" comprend des anticorps monoclonaux (y compris des anticorps pleine longueur qui comportent une région Fc d'immunoglobuline), des compositions d'anticorps avec une spécificité polyépitopique, des anticorps multispécifiques (par exemple, des anticorps bispécifiques, des diabodies, et des molécules à chaîne unique, ainsi que des fragments d'anticorps (par exemple, dAb, Fab, F(ab')2, et Fv). Le terme "anticorps" comprend également des anticorps H2 qui comprennent un dimère d'une chaîne lourde (5'- VH-(charnière facultative)-CH2-CH3-3') et qui sont dépourvus de chaîne légère (proches des anticorps H2 existant à l'état naturel ; voir, par exemple, Nature. 1993 Jun 3; 363(6428): 446-8; Naturally occurring antibodies devoid of light chains ; Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R). Ainsi, dans un mode de réalisation de la présente-invention, l'ARN produit à partir du locus de chaîne lourde transgénique code pour des chaînes lourdes qui sont dépourvues de segment de gène CH1 et qui ne comprennent aucune chaîne légère d'anticorps fonctionnelle. Dans un exemple, l'ARN produit à partir du locus de chaîne lourde transgénique code pour des domaines variables simples VH (dAb ; anticorps à domaine unique). Ceux-ci peuvent,éventuellement comprendre une région constante.

Le terme "immunoglobuline" (Ig) est utilisé de manière interchangeable avec "anticorps" dans ce document. 136 Un anticorps "isolé" est un anticorps qui a été identifié, séparé et/ou récupéré à partir d'un composant de son environnement de production (par exemple, de manière naturelle ou recombinante). De préférence, le polypeptide isolé est dépourvu d'association avec tous les autres composants provenant de son environnement de production, par exemple, de telle manière que l'anticorps a été isolé par rapport à un standard approuvé ou pouvant être approuvé par la FDA. Les composants contaminants de son environnement de production, tels que ceux résultant des cellules transfectées recombinantes, sont des matériaux qui interféreront généralement avec des utilisations de recherche, de diagnostic ou thérapeutiques pour l'anticorps, et ils peuvent comprendre des enzymes, des hormones, et d'autres solutés protéiniques ou non protéiniques. Dans des modes de réalisation préférés, le polypeptide sera purifié : (1) à plus de 95 % en poids de l'anticorps comme il est déterminé, par exemple, par le procédé de Lowry, et dans certains modes de réalisation, à plus de 99 % en poids ; (2) à un degré suffisant pour obtenir au moins 15 résidus de séquence d'acides aminés N- terminaux ou internes par utilisation d'un séquenceur à coupelles rotatives, ou (3) à une certaine homogénéité par SDS-PAGE dans des conditions réductrices ou non réductrices en utilisant du bleu de Coomassie ou, de préférence, un colorant à base d'argent. L'anticorps isolé comprend l'anticorps in situ au sein des cellules recombinantes puisqu'au moins un composant de l'environnement naturel de l'anticorps ne sera pas présent. Toutefois, habituellement, un polypeptide ou un anticorps isolé sera préparé par au moins une étape de purification. Un "fragment d'anticorps" comprend une partie d'un anticorps intact, de préférence la région de liaison d'un antigène et/ou la région variable de l'anticorps intact. Les exemples de fragments d'anticorps comprennent les fragments dAb, Fab, Fab', F(ab')2 et Fv ; les diabodies ; les anticorps linéaires ; les molécules d'anticorps à chaîne unique et les anticorps multispécifiques formés à partir de fragments d'anticorps. Un anticorps qui "se lie spécifiquement à" ou est "spécifique de" un polypeptide, un antigène ou un épitope particulier est un anticorps qui se lie à ce polypeptide, cet antigène ou cet épitope particulier sans liaison substantielle à d'autres polypeptides, antigènes ou épitopes. Par exemple, la liaison à l'antigène ou à l'épitope est spécifique lorsque l'anticorps se lie avec un KD de 100 pM ou inférieur, 10 pM ou inférieur, 1 pM ou inférieur, 100 nM ou inférieur, par exemple, 10 nM ou inférieur, 1 nM ou inférieur, 500 pM ou inférieur, 100 pM ou inférieur, ou 10pM ou inférieur. L'affinité de liaison (KB) peut être déterminée en utilisant des procédures classiques connues de l'homme du métier, par exemple, liaison dans un test ELISA et/ou détermination de l'affinité en utilisant la résonance des plasmons de surface (par exemple, Biacore TM ou KinExATM, une mesure 137 d'affinité en phase de solution qui peut détecter jusqu'à des affinités de l'ordre de la fM (Sapidyne Instruments, Idaho)). "Pharmaceutiquement acceptable" signifie approuvé ou pouvant être approuvé par un organisme réglementaire du gouvernement fédéral des Etats-Unis ou d'un gouvernement d'État ou listé dans la Pharmacopée US ou une autre pharmacopée reconnue de manière générale pour une utilisation chez les animaux, y compris des êtres humains. Un "support, excipient ou adjuvant pharmaceutiquement acceptable" se rapporte à un support, un excipient ou un adjuvant qui peut être administré à un sujet, conjointement avec un agent, par exemple, tout anticorps ou toute chaîne d'anticorps décrit dans ce document, et qui ne détruit pas l'activité pharmacologique de celui-ci et qui est non toxique lorsqu'il est administré dans des doses suffisantes pour délivrer une quantité thérapeutique de l'agent. Brève description des figures La figure 1, partie 1 illustre les premier et second BAC utilisés pour une insertion dans des loci de chaînes légères endogènes de souris. L'ADN humain dans chaque BAC est représenté. La partie 2 de la figure 1 montre le point d'insertion d'ADN du locus Ig lambda humain dans le locus de chaîne kappa endogène de souris. La partie 3 de la figure 1 montre le point d'insertion d'ADN du locus Ig lambda humain dans le locus de chaîne lambda endogène de souris.

La figure 2 représente les résultats de l'analyse FACS pour déterminer l'expression de CÀ de souris et humain (et ainsi de manière correspondante, l'expression de la région variable de souris et humaine) dans des cellules B spléniques B220+ provenant de souris homozygotes P1 (P1/P1) comparativement à des souris de type sauvage (WT). La figure 3A représente les résultats de l'analyse FACS pour déterminer l'expression des CK et CÀ de souris dans des cellules B spléniques B220+ provenant de souris homozygotes P2 (P2/P2) comparativement à des souris de type sauvage (WT). Aucune expression détectable de CK de souris n'a été observée. La figure 3B représente les résultats de l'analyse FACS pour déterminer l'expression de CÀ humain (et ainsi de manière correspondante, l'expression de la région variable humaine) dans des cellules B spléniques B220+ provenant de souris homozygotes P2 (P2/P2) comparativement à'des souris de type sauvage (WT). La figure 4 montre l'usage de VÀ humain chez des souris homozygotes P2 (P2/P2) et l'usage de VÀ type chez des êtres humains (insert). 138 La figure 5 montre l'usage de JÀ humain chez des souris homozygotes P2 (P2/P2) et l'usage de JÀ type chez des êtres humains (insert). La figure 6 montre que l'usage de VÀ est très élevé chez les souris homozygotes P2 (P2/P2).

La figure 7 représente la distribution de l'usage des segments de gènes VK de souris et VÀ humain à partir du locus kappa chimérique chez des souris homozygotes P2 (P2/P2). La figure 8 illustre l'arrangement RSS dans les loci lambda et kappa. La figure 9A représente les résultats de l'analyse FACS pour déterminer l'expression de CÀ de souris et humain (et ainsi de manière correspondante, l'expression de la région variable de souris et humaine) dans des cellules B spléniques B220+ provenant de souris homozygotes L2 chez lesquelles l'expression des chaînes kappa endogènes a été inactivée (L2/L2 ; KA/KA) comparativement à des souris n'ayant pas d'ADN lambda humain inséré et chez lesquelles l'expression des chaînes kappa endogènes a été inactivée (KA/KA). Un usage très élevé de VÀ humain a été observé chez les souris L2/L2 ; KA/KA, presque jusqu'à l'exclusion de l'usage de VÀ de souris. Figure 9B : Analyse du compartiment des cellules B spléniques. Cette figure représente les résultats de l'analyse FACS sur des cellules B spléniques provenant de souris transgéniques L2/L2 ; KA/KA (homozygotes L2 ; homozygotes pour l'insertion de segments de gènes lambda humains dans des loci lambda endogènes ; l'expression des chaînes kappa endogènes ayant été inactivée) comparativement à des cellules B spléniques provenant de souris exprimant seulement des anticorps de souris (souris KA/KA). Les résultats montrent que les compartiments des cellules B spléniques chez les souris de l'invention sont normaux (c'est-à-dire, équivalents aux compartiments des souris exprimant seulement des chaînes d'anticorps de souris).

Figure 10 : Développement et marqueurs des cellules B dans les compartiments de la moelle osseuse et splénique. Figure 11A : Analyse du compartiment des cellules B spléniques. Cette figure représente les résultats de l'analyse FACS sur des cellules B spléniques provenant de souris transgéniques S1F/HA, KA/+ de l'invention exprimant des régions variables de chaînes lourdes qui sont toutes humaines (où l'expression des chaînes lourdes endogènes a été inactivée par inversion), comparativement à des cellules B spléniques provenant de souris exprimant seulement des anticorps de souris. Les résultats montrent que les compartiments des cellules B spléniques chez les souris de l'invention sont normaux 139 (c'est-à-dire, équivalents aux compartiments des souris exprimant seulement des chaînes d'anticorps de souris). 51F/HA, +/KA = (i) 51F - le premier allèle de chaîne lourde endogène comporte une insertion d'ADN de locus de chaîne lourde humain, la région VDJ de souris endogène a été inactivée par inversion et mouvement en amont sur le chromosome ; (ii) HA - le second allèle de chaîne lourde endogène a été inactivé (par insertion d'une séquence d'interruption endogène) ; (iii) + - le premier allèle kappa endogène est un allèle kappa de type sauvage ; et (iv) KA - le second allèle kappa endogène a été inactivé (par insertion d'une séquence d'interruption endogène). Cet arrangement code exclusivement pour des chaînes lourdes à partir du premier allèle de chaîne lourde endogène. Figure 11B : Analyse du compartiment des cellules B spléniques. Cette figure représente les résultats de l'analyse FACS sur des cellules B spléniques provenant de souris transgéniques 51F/HA, K2/KA de l'invention exprimant des régions variables de chaînes lourdes qui sont toutes humaines (où l'expression des chaînes lourdes endogènes a été inactivée par inversion) et des régions variables de chaînes kappa humaines, comparativement à des cellules B spléniques provenant de souris +/HA, K2/KA. Les résultats montrent que les compartiments des cellules B spléniques chez les souris de l'invention sont normaux. 51F/HA, K2/KA = (i) K2 - le premier allèle kappa endogène comporte deux insertions d'ADN de locus de chaîne kappa entre le JK endogène le plus en 3' et le CK de souris, fournissant une insertion de 14 VK et JK1-JK5 humains ; et (ii) KA - le second allèle kappa endogène a été inactivé (par insertion d'une séquence d'interruption endogène). Cet arrangement code exclusivement pour des chaînes lourdes comprenant des régions variables humaines et des chaînes légères substantiellement kappa provenant du premier allèle kappa endogène. +/HA, K2/KA - cet arrangement code pour des chaînes lourdes de souris et des chaînes kappa humaines.

Figure 12A : Analyse du compartiment des progéniteurs B de la moelle osseuse. Cette figure représente les résultats de l'analyse FACS sur des cellules B de la moelle osseuse (MO) provenant de souris transgéniques S1F/HA, KA/+ de l'invention exprimant des régions variables de chaînes lourdes qui sont toutes humaines (où l'expression des chaînes lourdes endogènes a été inactivée par inversion), comparativement à des 140 cellules B de la MO provenant de souris exprimant seulement des anticorps de souris. Les résultats montrent que les compartiments des cellules B de la MO chez les souris de l'invention sont normaux (c'est-à-dire, équivalents aux compartiments des souris exprimant seulement des chaînes d'anticorps de souris).

Figure 12B : Analyse du compartiment des progéniteurs B de la moelle osseuse. Cette figure représente les résultats de l'analyse FACS sur des cellules B de la moelle osseuse (MO) provenant de souris transgéniques S1F/HA, K2/KA de l'invention exprimant des régions variables de chaînes lourdes qui sont toutes humaines (où l'expression des chaînes lourdes endogènes a été inactivée par inversion) et des régions variables de chaînes kappa humaines, comparativement à des cellules B de la MO provenant de souris +/HA, K2/KA. Les résultats montrent que les compartiments des cellules B de la MO chez les souris de l'invention sont normaux. Figure 13 : représente la quantification des Ig pour le sous-type et les Ig totales chez diverses souris : S1F/HA, KA/+ = (i) S1F - le premier allèle de chaîne lourde endogène comporte une insertion d'ADN de locus de chaîne lourde humain, la région VDJ de souris endogène a été inactivée par inversion et mouvement en amont sur le chromosome ; (ii) HA - le second allèle de chaîne lourde endogène a été inactivé (par insertion d'une séquence d'interruption endogène) ; (iii) KA - le premier allèle kappa endogène a été inactivé (par insertion d'une séquence d'interruption endogène) ; et (iv) + - le second allèle kappa endogène est un allèle kappa de type sauvage. Cet arrangement code exclusivement pour des chaînes lourdes à partir du premier allèle de chaîne lourde endogène. S1F/HA, K2/KA = (i) K2 - le premier allèle kappa endogène comporte deux insertions d'ADN de locus de chaîne kappa entre le JK endogène le plus en 3' et le CK de souris, fournissant une insertion de 14 VK et JK1-JK5 humains ; et (ii) KA - le second allèle kappa endogène a été inactivé (par insertion d'une séquence d'interruption endogène). Cet arrangement code exclusivement pour des chaînes lourdes comprenant des régions variables humaines et des chaînes légères substantiellement kappa à partir du premier allèle kappa endogène. +/HA, K2/+ - cet arrangement code pour des chaînes lourdes de souris et des chaînes kappa à la fois de souris et humaines. +/HA, +/KA - cet arrangement code pour des chaînes lourdes et kappa de souris. Sur cette figure; "Somme des Ig" représente la somme des isotypes IgG et IgM. 141 Figure 14 : représente la quantification des Ig pour le sous-type et les Ig totales chez diverses souris : S1F/HA, K2/KA (n = 15) et 12 souris exprimant seulement des chaînes d'anticorps de souris (+/HA, +/KA (n = 6) et des souris de type sauvage (VVT ; n = 6)).

Description détaillée de l'invention Il faudra comprendre que les modes de réalisation particuliers décrits dans ce document sont présentés à titre d'illustration et non pas en tant que limitations de l'invention. Les caractères principaux de cette invention peuvent être employés dans divers modes de réalisation sans s'écarter de l'étendue de l'invention. L'homme du métier reconnaîtra ou sera capable de déterminer qu'en utilisant une étude pas plus que de routine, de nombreux équivalents des procédures spécifiques décrites dans ce document. De tels équivalents sont considérés comme se situant au sein de l'étendue de cette invention et sont couverts par les revendications. L'utilisation du mot "un" ou "une" lorsqu'il est utilisé conjointement avec le terme "comprenant" dans les revendications et/ou le mémoire peut signifier "un(e)," mais il est également cohérent avec la signification de "un(e) ou plusieurs," "au moins un(e)," et "un(e) ou plus d'un(e)." L'utilisation du terme "ou" dans les revendications est utilisé pour signifier "et/ou" sauf indication explicite pour se rapporter à des variantes uniquement ou les variantes sont mutuellement exclusives, bien que la description supporte une définition qui se rapporte uniquement à des variantes et à "et/ou." Dans toute cette demande, le terme "environ" est utilisé pour indiquer qu'une valeur comprend la variation intrinsèque d'erreur du dispositif, le procédé étant employé pour déterminer la valeur, ou la variation qui existe parmi les sujets de l'étude. Tels qu'utilisés dans ce mémoire et les revendications, les mots "comprenant" (et toute forme de comprenant, comme "comprennent" et "comprend"), "ayant" (et toute forme d'ayant, comme "ont" et "a"), "incluant" (et toute forme d'incluant, comme "inclut" et "incluent") ou "contenant" (et toute forme de contenant, comme "contient" et "contiennent") sont inclusifs ou ouverts et n'excluent pas des éléments ou des étapes de procédé non cités supplémentaires.

Le terme "ou des combinaisons de ceux-ci" tel qu'utilisé dans ce document, se rapporte à toutes les permutations et combinaisons des éléments énumérés précédant le terme. Par exemple, "A, B, C, ou des combinaisons de ceux-ci est censé inclure au moins l'un de : A, B, C, AB, AC, BC, ou ABC, et si l'ordre est important dans un contexte particulier, également BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, ou CAB. En continuant avec cet 142 exemple, sont expressément incluses des combinaisons qui contiennent des répétitions d'un ou de plusieurs éléments ou termes, comme BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, et ainsi de suite. L'homme du métier comprendra que généralement il n'y a pas de limite au nombre d'éléments ou de termes dans une combinaison quelconque, sauf s'il est autrement évident d'après le contexte. Comme source de séquences de segments de gènes d'anticorps, l'homme du métier aura également connaissance des bases de données et des ressources disponibles suivantes (y compris les mises à jour de celles-ci) dont le contenu est incorporé dans ce document en référence : La base de données Kabat (G. Johnson et T. T.Wu, 2002 ; World Wide Web (www) kabatdatabase.com). Créée par E. A. Kabat et T. T. Wu en 1966, la base de données Kabat publie des séquences alignées d'anticorps, de récepteurs de cellules T, de molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I et II, et d'autres protéines d'un intérêt immunologique. Une interface de recherche est fournie par l'outil Seqhuntll, et tout un éventail d'utilitaires est disponible pour l'alignement de séquences, la classification de sous-groupes de séquences, et la génération de tracés de variabilité. Voir également Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H., Gottesman, K., et Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of lmmunological lnterest, 5th ed., NIH Publication No. 91-3242, Bethesda, MD, qui est incorporé dans ce document en référence, en particulier en référence à des segments de gènes humains pour une utilisation dans la présente invention. KabatMan (A. C. R. Martin, 2002 ; World Wide Web (www) bioinf.org.uk/abs/simkab.html). Il s'agit d'une interface web destinée à simplifier les recherches dans la base de données des séquences de Kabat.

IMGT (International ImMunoGeneTics Information Systeme; M.-P. Lefranc, 2002 ; World Wide Web (www) imgt.cines.fr). IMGT est un système d'informations intégrées spécialisé dans les anticorps, récepteurs des cellules T, et molécules du CMH de toutes les espèces de vertébrés. Il fournit un portail commun à toutes les données standardisées qui comprennent des séquences nucléotidiques et de protéines, des amorces oligonucléotidiques, des cartes de gènes, des polymorphismes génétiques, des spécificités, et des structures bidimensionnelles (2D) et tridimensionnelles (3D). IMGT inclut trois bases de données de séquences (IMGT/LIGM-DB, IMGT/MHC-DB, IMGT/PRIMERDB), une base de données de génomes (IMGT/GENE-DB), une base de données de structures 3D (IMGT/3Dstructure-DB), et tout un éventail de ressources web ("IMGT Marie-Paule page") et des outils interactifs. 143 V-BASE (I. M. Tomlinson, 2002 ; World Wide Web (www) mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase). V-BASE est un directoire exhaustif de toutes les séquences des régions variables de la lignée germinale des anticorps humains compilées à partir de plus d'un millier de séquences publiées. Il inclut une version du logiciel d'alignement DNAPLOT (développé par Hans-Helmar Althaus et Werner Müller) qui permet l'attribution de gènes V d'anticorps à leurs segments de gènes de la lignée germinale les plus proches. Anticorps -Structure et Séquence (A. C. R. Martin, 2002 ; World Wide Web (www) bioinf.org.uk/abs). Cette page résume les informations utiles sur la structure et la séquence des anticorps. Elle fournit une interface de recherche parmi les données des séquences d'anticorps de Kabat, les informations générales sur les anticorps, les structures cristallines, et des liens pour d'autres informations associées aux anticorps. Elle distribue également un résumé automatisé de toutes les structures d'anticorps déposées auprès de la Protein Databank (PDB). Sont d'un intérêt particulier, une description et une comparaison complète des divers schémas de numérotation pour les régions variables d'anticorps. AAAAA (A Ho's Amazing Atlas of Antibody Anatomy; A. Honegger, 2001; World Wide Web (www) unizh.ch/-antibody). Cette ressource inclut des outils pour l'analyse structurale, la modélisation et la modification. Elle adopte un schéma d'unification pour un alignement structural exhaustif des séquences d'anticorps et de récepteurs des cellules T, et comprend des macros Excel pour l'analyse d'anticorps et une représentation graphique. WAM (Web Antibody Modeling; N. Whitelegg et A. R. Rees, 2001; World Wide Web (www) antibody.bath.ac.uk). Hébergé par le Centre for Protein Analysis and Design, University of Bath, Royaume-Uni. Basé sur le progiciel AbM (anciennement commercialisé par Oxford Molecular) pour construire des modèles 3D de séquences Fv d'anticorps en utilisant une combinaison de procédés théoriques établis, ce site comprend également les toutes dernières informations sur les structures des anticorps. Mike's Immunoglobulin Structure/Function Page (M. R. Clark, 2001; World Wide Web (www) path.cam.ac.ukl-mrc7/mikeimages.html). Ces pages fournissent des matériaux éducatifs sur la structure et la fonction, et elles sont illustrées par de nombreuses images en couleurs, des modèles et des animations. Des informations supplémentaires sont disponibles sur l'humanisation des anticorps et Mike Clark's Therapeutic Antibody Human Homology Project, qui vise à corréler l'efficacité clinique et les réponses anti-immunoglobulines avec des séquences de régions variables d'anticorps thérapeutiques. 144 The Antibody Resource Page (The Antibody Resource Page, 2000 ; World Wide Web (www) antibodyresource.com). Ce site se décrit lui-même comme le "guide complet pour la recherche et les fournisseurs d'anticorps." Des liens pour des outils de séquençage d'acides aminés, des outils de séquençage de nucléotides d'anticorps, et des bases de données d'hybridomes/cultures cellulaires sont fournis. Humanization bY Design (J. Saldanha, 2000; World Wide Web (www) people.cryst.bbk.ac.ukk-ubcg07s). Cette ressource fournit des généralités sur la technologie d'humanisation des anticorps. Le caractère le plus utile est une base de données qui peut être consultée (par séquence et texte) de plus de 40 anticorps humanisés publiés y compris des informations sur les problèmes de conception, le choix des squelettes, les rétro-mutations du squelette, et l'affinité de liaison des produits d'assemblage humanisés. Voir également Antibody Engineering Methods and Protocols, Ed. Benny K C Lo, Methods in Molecular Biologe, Human Press. Egalement à World Wide Web (www) blogsua. com/pdf/antibody-engineering-methods-and-protocolsantibody-engineering- methods-and-protocols.pdf Toute partie de cette description peut être lue en combinaison avec tout autre partie de la description, sauf s'il est autrement évident d'après le contexte. La totalité des compositions et/ou des procédés décrits et revendiqués dans ce document peuvent être réalisés et exécutés sans expérimentation excessive à la lumière de la présente description. Alors que les compositions et les procédés de cette invention ont été décrits en termes de modes de réalisation préférés, il sera évident à l'homme du métier que des variations peuvent être appliquées aux compositions et/ou procédés et dans les étapes ou dans la séquence des étapes du procédé décrit dans ce document sans s'écarter du concept, de l'esprit et de l'étendue de l'invention. L'ensemble de ces substituts et modifications similaires évidents pour l'homme du métier sont jugés se situer au sein de l'esprit, de l'étendue et du concept de l'invention telle que définie par les revendications annexées. Les exemples qui suivent sont présentés de manière à fournir à la personne de compétence moyenne dans le domaine une divulgation et une description complète de comment réaliser et utiliser l'invention, et ils ne sont pas censés limiter l'étendue de ce que les inventeurs considèrent comme leur invention. 145 Exemples Exemple 1 : Expression élevée des régions variables lambda humaines chez des souris transgéniques comprenant des segments de gènes lambda humains insérés dans 5 le locus kappa endogène L'insertion de segments de gènes lambda humains provenant d'un 1er BAC d'IGL dans le locus IGK de cellules ES AB2.1 de souris (Baylou College of Medicine) a été réalisée pour créer un allèle de chaîne légère chimérique nommé allèle P1 (figure 1). La séquence humaine insérée correspond à la séquence du chromosome 22 humain de la 10 position 23217291 à la position 23327884 et comprend les segments de gènes lambda fonctionnels VÀ3-1, JÀ1-CÀ1, JÀ2-CÀ2, JÀ3-C13, JÀ6-CÀ6 et JÀ7-CÀ7 (les allèles du tableau 13). L'insertion a été réalisée entre les positions 70674755 et 706747756 sur le chromosome 6 de souris, qui est en amont de la région CK de souris et de 3'EK (c'est-àdire, au sein de 100 kb de l'amplificateur de chaîne légère endogène) comme il est 15 illustré sur la figure 1. Les segments de gènes VK et JK de souris ont été retenus dans le locus chimérique, immédiatement en amont de l'ADN lambda humain inséré. Les loci lambda de souris ont été laissés intacts. Des souris homozygotes pour le locus P1 chimérique ont été générées à partir des cellules ES en utilisant des procédures classiques. 20 Un second type de souris a été produit (souris P2) dans lequel plus de segments de gènes VÀ humains fonctionnels ont été insérés en amont (5') du VÀ3-1 humain par l'insertion séquentielle de l'ADN humain du BAC1 et ensuite de l'ADN du BAC2 pour créer l'allèle P2 (les allèles du tableau 14). La séquence humaine insérée provenant du BAC2 correspond à la séquence du chromosome 22 humain de la position 23064876 à 25 la position 23217287 et comprend les segments de gènes lambda fonctionnels VÀ2-18, VÀ3-16, V2-14, VÀ3-12, VÀ2-11, VÀ3-10, VÀ3-9, VÀ2-8 et VÀ4-3. Des souris homozygotes pour le locus P2 chimérique ont été générées à partir des cellules ES en utilisant des procédures classiques. Une analyse FACS des cellules B spléniques provenant des homozygotes P1 et P2 a 30 été réalisée pour estimer l'expression de lambda contre kappa et l'expression de lambda humaine contre lambda de souris chez les souris transgéniques. 146 Une 5'-RACE classique a été réalisée pour analyser les transcrits d'ARN provenant des loci de chaînes légères chez les homozygotes P2. Expression des chaînes légères et analyse FACS Pour obtenir une suspension de cellules simples à partir de la rate, la rate a été soumise doucement à des passages à travers un tamis cellulaire de 30 pm. Les cellules simples ont été remises en suspension dans de la solution tampon phosphate (PBS) complémentée avec 3 % sérum de veau foetal inactivé à la chaleur (FCS). Les anticorps suivants ont été utilisés pour la coloration : Anticorps de rat anti-lambda de souris (mCÀ) phycoérythrine (PE) (Southern Biotech), anticorps de rat anti-kappa de souris (mCK) (BD Pharmingen, clone 187.1) isothiocyanate de fluorescéine (FITC), anticorps anti-lambda humain (hCÀ) (eBioscience, clone 1-155-2) phycoérythrine (PE), anticorps anti-B220/CD45R (eBioscience, clone RA3-6B2) allophycocyanine (APC). Remarque : on s'attend à ce que les chaînes légères portant le CÀ humain comportent des régions variables dérivées du réarrangement des VÀ humains et JÀ humains insérés. On s'attend à ce que les chaînes légères portant le CÀ de souris comportent des régions variables dérivées du réarrangement des VÀ et JÀ de souris provenant des loci lambda endogènes. 5 x 106 cellules ont été déposées dans des tubes individuels, centrifugées pour éliminer l'excès de liquide, et remises en suspension dans 100 pl de PBS + 3 % de FCS frais.

Dans chaque tube individuel, les anticorps suivants ont été ajoutés : Pour la coloration de mÀ contre MIK, 1 pl de chaque anticorps a été ajouté en plus de 1 pl d'anticorps B220/CD45R. Pour la détection des cellules B exprimant des chaînes légères lambda humaines, l'anticorps mÀ a été substitué par l'anticorps hÀ. Les cellules ont été incubées dans l'obscurité à 6 °C pendant 15 minutes, ceci suivi de plusieurs lavages avec du PBS + 3 % de FCS frais pour éliminer l'anticorps non lié. Les cellules ont été analysées en utilisant un analyseur de tri des cellules activées par fluorescence (FACS) de Miltenyi Biotech. Les splénocytes vivants ont été séparés en utilisant la diffraction latérale (SSC) et la diffraction directe (FSC). Au sein de la population séparée par SSC et FSC, une sous- population de B220/CD45R (cellules B de souris) a été détectée en utilisant le fluorochrome APC. La population de cellules simples B220/CD45R positives a été en outre sous-divisée en cellules portant soit mÀ soit hÀ fluorochrome PE conjointement avec rYIK fluorochrome FITC. Le pourcentage de chaque population a été calculé en 14'7 utilisant un système de séparation. De manière surprenante, l'analyse FACS des cellules B spléniques provenant des homozygotes P1 n'a montré aucune expression détectable de CK de souris (figure 2), indiquant que l'insertion de l'ADN du locus lambda humain provenant du BAC1 interrompt l'expression de la chaîne IGK endogène. La forte expression du CÀ endogène et la faible expression du CÀ humain dans les cellules B spléniques groupées par l'analyse FACS (CÀ de souris/CÀ humain = 65/32) chez ces souris suggèrent que la séquence IGL humaine insérée, bien qu'elle interrompe l'activité IGK, ne peut pas totalement entrer en compétition avec les gènes IGL endogènes. L'analyse FACS, à nouveau de manière surprenante, n'a montré aucune expression détectable de CK de souris chez les homozygotes P2 (figures 3A et B). Toutefois, le CÀ humain prédomine grandement dans les cellules B exprimées groupées en CÀ de souris ou humain à la suite de l'analyse FACS (CÀ de souris/CÀ humain = 15/80 correspondant à un rapport de 15 régions variables lambda de souris/80 régions variables lambda humaines, c'est-à--dire, 84 % de régions variables lambda humaines en référence aux cellules B groupées - ce qui correspond à 80 % des cellules B totales) à partir des homozygotes P2. Tout en ne souhaitant pas être liés à une théorie quelconque, nous suggérons que la séquence du locus lambda humain insérée provenant du 2nd BAC procure certains avantages pour entrer en compétition avec le réarrangement ou l'expression des segments de gènes lambda endogènes. Nous avons analysé l'usage des VÀ et JÀ humains chez les homozygotes P2. Voir la figure 4 qui représente l'usage du VÀ humain chez les homozygotes P2. L'usage observé a été similaire à celui observé chez les êtres humains (selon J Mol Biol. 1997 Apr 25; 268(1): 69-77; "The creation of diversity in the human immunoglobulin V(lambda) repertoire"; lgnatovich O et al). En outre, l'usage du JÀ humain a été similaire à celui observé chez les êtres humains (figure 5). L'analyse de l'usage du VÀ contre VK des transcrits du CÀ humain par séquençage des clones de PCR 5'--RACE (amplification rapide des extrémités d'ADNc) non biaisée a montré que parmi 278 séquences de clones, seulement une a utilisé le VK pour un réarrangement avec le JÀ (JÀ humain), et tous les autres (277 clones) ont utilisé le VÀ humain (figures 6 et 7 ; VÀ2-5 a été détecté au niveau des transcrits d'ARN, mais il s'agit d'un pseudogène qui habituellement n'est pas repris par l'usage au niveau protéine). Tout en ne souhaitant pas être liés à une théorie quelconque, nous suggérons que les segments de gènes VK de souris retenus essentiellement ne peuvent pas se réarranger efficacement avec les segments de gènes 148 JÀ humains insérés parce qu'ils ont le même type de RSS (séquences signal de recombinaison ; voir l'explication ci-dessous) et sont incompatibles pour un réarrangement (figure 8). Ce résultat indique également que l'inactivation de l'activité IGK endogène et l'expression prédominante de la séquence lambda humaine insérée peuvent être obtenues sans autre modification du locus IGK, par exemple, la délétion ou l'inversion des segments de gènes des loci kappa endogènes n'est pas nécessaire, ce qui simplifie grandement la génération de souris transgéniques utiles exprimant des chaînes légères portant des régions variables lambda humaines (c'est-à-dire, des régions variables produites par recombinaison de segments de gènes VÀ et JÀ humains). L'arrangement des séquences signal de recombinaison (RSS) qui médient la recombinaison de V(D)J in vivo est discuté, par exemple, dans Cell. 2002 Apr; 109 Suppl: S45-55; "The mechanism et regulation of chromosomal V(D)J recombination"; Bassing CH, Swat W, Alt FW (dont la divulgation est incorporée dans ce document en référence). Deux types d'éléments de RSS ont été identifiés : une RSS à un coude (12- RSS) et une RSS à deux coudes (23-RSS). Dans la recombinaison des VJ naturels dans le locus de chaîne légère lambda, la recombinaison s'effectue entre une RSS à deux coudes qui se situe en 3' d'une V lambda et une RSS à un coude qui se situe en 5' d'une J lambda, les RSS étant dans une orientation opposée. Dans la recombinaison des VJ naturels dans le locus de chaîne légère kappa, la recombinaison s'effectue entre une RSS à un coude qui se situe en 3' d'une V kappa et une RSS à deux coudes qui se situe en 5' d'une J kappa, les RSS étant dans une orientation opposée. Ainsi, généralement une RSS à deux coudes est compatible avec une RSS à un coude dans l'orientation opposée.

Ainsi, les inventeurs ont démontré comment (i) inactiver l'expression des chaînes kappa endogènes par insertion de segments de gènes lambda humains dans le locus kappa ; et (ii) comment obtenir une expression très élevée des régions variables lambda humaines (procurant ainsi des répertoires de chaînes légères utiles pour une sélection contre un antigène cible) - même en présence de segments de gènes V lambda et kappa endogènes. Ainsi, les inventeurs ont démontré comment éliminer la compétition des segments de gènes V significativement (lambda) ou totalement (kappa) et ainsi l'expression des chaînes légères endogènes par l'insertion d'au moins les segments de gènes lambda humains fonctionnels compris par les BAC 1 et 2. Dans cet exemple, un taux très élevé d'expression des régions variables lambda humaines a été obtenu de manière surprenante (84 % des chaînes lambda totales et des chaînes légères totales comme il a été expliqué ci-dessus). 149 Exemple 2 : Expression élevée des régions variables lambda humaines chez des souris transgéniques comprenant des-segments de gènes lambda humains insérés dans le locus lambda endogène L'insertion de segments de gènes lambda humains provenant des 1st et 2nd BAC d'IGL dans le locus lambda de cellules ES AB2.1 de souris (Baylou College of Medicine) a été réalisée pour créer un allèle de chaîne légère lambda nommé l'allèle L2 (figure 1). La séquence humaine insérée correspond à la séquence du chromosome 22 humain de la position 23064876 à la position 23327884 et comprend des segments de gènes lambda fonctionnels VÀ2-18, VÀ3-16, V2-14, VÀ3-12, VÀ2-11, VÀ3-10, VÀ3-9, VÀ2-8, VÀ4-3, VÀ3-1, JÀ1-CÀ1, JÀ2-CÀ2, JÀ3-CÀ3, JÀ6-CÀ6 et JÀ7-CÀ7. L'insertion a été réalisée entre les positions 19047551 et 19047556 sur le chromosome 16 de souris, qui est en amont de la région CÀ de souris et entre EÀ4-10 et EÀ3-1 (c'est-à-dire, au sein de 100 kb des amplificateurs de chaînes légères endogènes) comme il est illustré sur la figure 1. Les segments de gènes VA et JÀ de souris ont été retenus dans le locus, immédiatement en amont de l'ADN lambda humain inséré. Les loci kappa de souris ont été inactivés pour empêcher l'expression des chaînes kappa. Des souris homozygotes pour le locus L2 ont été générées à partir des cellules ES en utilisant des procédures classiques.

En utilisant un procédé similaire à celui de l'exemple 1, une analyse FACS des cellules B spléniques provenant des homozygotes L2 a été réalisée pour estimer l'expression de lambda contre kappa et l'expression de lambda humaine contre lambda de souris chez les souris transgéniques. Expression des chaînes légères et analyse FACS L'analyse FAC,S des cellules B spléniques chez les homozygotes L2 dans le contexte d'inactivation de l'IGK (chez lesquelles, les segments de gènes VK et JK ont été retenus) a montré de manière surprenante que l'expression du CÀ humain prédomine grandement dans les cellules B groupées en CÀ de souris ou humain à la suite de l'analyse FACS (CÀ de souris/CÀ humain = 5/93 correspondant à un rapport de 5 régions variables lambda de souris/93 régions variables lambda humaines, c'est-à-dire, 95 % des régions variables lambda humaines en référence aux cellules B groupées - ce qui correspond à 93 % des cellules B totales) (figure 9A), démontrant que les segments de gènes IGÀ humains insérés au sein du locus IGÀ endogène peuvent l'emporter sur le réarrangement ou l'expression des segments de gènes IGÀ endogènes. 150 Ainsi, les inventeurs ont démontré comment obtenir une expression très élevée des régions variables lambda humaines (procurant ainsi des répertoires de chaînes légères utiles pour une sélection contre un antigène cible) - même en présence de segments de gènes V lambda et kappa endogènes. Ainsi, les inventeurs ont démontré comment éliminer significativement la compétition des segments de gènes V lambda endogènes et ainsi l'expression des chaînes légères lambda endogènes par l'insertion d'au moins les segments de gènes lambda humains fonctionnels compris par les BAC 1 et 2. Dans cet exemple, un taux très élevé d'expression des régions variables lambda humaines a été obtenu de manière surprenante (95 % des chaînes lambda totales et des chaînes légères totales comme il a été expliqué ci-dessus). Ces données indiquent que des souris portant des allèles soit P (exemple 1) soit L (exemple 2) produits par insertion ciblée des segments de gènes fonctionnels fournis par les BAC1 et BAC2 peuvent fonctionner en réarrangement et expression dans les cellules B matures. Ces deux types d'allèles sont très utiles pour fournir des souris transgéniques qui produisent des chaînes lambda d'Ig humaines pour la découverte d'anticorps thérapeutiques et en tant qu'outils de recherche. Les souris transgéniques de l'invention exprimant des régions variables lambda humaines développent des compartiments spléniques normaux Dans la rate, les cellules B sont caractérisées en immatures (T1 et T2) et matures (M) en se basant sur les taux des marqueurs de la surface cellulaire, les IgM et les IgD. Les cellules T1 présentent des taux élevés d'IgM et bas d'IgD. Les cellules T2 présentent des taux moyens des deux. Les cellules M présentent des taux bas d'IgM mais des taux élevés d'IgD (figure 10). Voir également J Exp Med. 1999 Jul 5; 190(1): 75-89; "B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signais"; Loder F et al. En utilisant des procédés similaires à ceux décrits dans l'exemple 3 ci-dessous, les cellules B spléniques provenant des animaux ont été évaluées pour l'expression des IgD et des IgM en utilisant une analyse FACS. Nous avons comparé des souris contrôles KA/KA (chez lesquelles l'expression des chaînes kappa endogènes a été inactivée, mais pas l'expression des chaînes lambda endogènes) avec des souris L2/L2 ; KA/KA (homozygotes L2). Les homozygotes L2 ont présenté de manière surprenante des compartiments de cellules B spléniques comparables aux souris contrôles (figure 9B). Exemple 3 : 151 Estimation du développement des cellules B et des Ig chez les souris transgéniques de l'invention Nous avons observé une expression normale des sous-types des Ig et un développement normal des cellules B chez les souris transgéniques de l'invention exprimant des anticorps avec des régions variables de chaînes lourdes humaines en l'absence d'expression des chaînes lourdes et kappa endogènes. En utilisant des cellules ES et les procédés de manipulations génomiques RMCE décrits ci-dessus, des souris ont été construites avec les combinaisons d'allèles de locus Ig suivantes : S1F/HA, -F/KA = (i) SlF - le premier allèle de chaîne lourde endogène comporte une insertion d'ADN de locus de chaîne lourde humain, la région VDJ de souris endogène a été inactivée par inversion et mouvement en amont sur le chromosome (voir la description ci-dessus, où cet allèle est nommé S1 inv.) ; (ii) HA - le second allèle de chaîne lourde endogène a été inactivé (par insertion d'une séquence d'interruption endogène) ; (iii) + - le premier allèle kappa endogène est un allèle kappa de type sauvage et (iv) KA - le second allèle kappa endogène a été inactivé (par insertion d'une séquence d'interruption endogène). Cet arrangement code exclusivement pour des chaînes lourdes à partir du premier allèle de chaîne lourde endogène. S1F/HA, K2/KA = (i) K2 - le premier allèle kappa endogène comporte deux insertions d'ADN de locus de chaîne kappa endogène entre le JK endogène le plus en 3' et le CK de souris, fournissant une insertion de 14 VK et JK1-JK5 humains ; et (ii) KA - le second allèle kappa endogène a été inactivé (par insertion d'une séquence d'interruption endogène). Cet arrangement code exclusivement pour des chaînes lourdes comprenant des régions variables humaines et des chaînes légères substantiellement kappa à partir du premier allèle kappa endogène. +/HA, K2/KA - cet arrangement code pour des chaînes lourdes de souris et des chaînes kappa humaines. +/HA, +/KA - cet arrangement code pour des chaînes lourdes et kappa de souris - les souris produisent seulement des chaînes lourdes et légères de souris.

Dans la moelle osseuse, les populations des progéniteurs B sont caractérisées en se basant sur leurs marqueurs de surface, B220 et CD43. Les cellules prépro-B portent la configuration des IGH et IGK/L de la lignée germinale et présentent des taux bas de B220 et élevés de CD43 sur leur surface cellulaire. Les cellules pro-B commencent à 152 initialiser la recombinaison des VDJ dans le locus IGH et portent des taux moyens à la fois de B220 et de CD43. Les cellules pré-B portent un locus VDJ d'IGH réarrangé et commencent à initialiser le réarrangement des VJ des chaînes légères et présentent des taux élevés de B220 mais bas de CD43. Dans la rate, les cellules B sont caractérisées en immatures (T1 et T2) et matures (M) en se basant sur les taux des marqueurs de la surface cellulaire, les IgM et les IgD. Les cellules T1 présentent des taux élevés d'IgM et bas d'IgD. Les cellules T2 présentent des taux moyens des deux. Les cellules M présentent des taux bas d'IgM et élevés d'IgD (figure 10). Voir également J Exp Med. 1991 May 1; 173(5): 1213-25; "Resolution et characterization of pro-B et pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow"; Hardy RR et al et J Exp Med. 1999 Jul 5; 190(1): 75-89; "B cell development in the spleen takes place in discrete steps et is determined by the quality of B cell receptor-derived signais"; Loder F et al. Les souris transgéniques de l'invention développent des compartiments spléniques et de MO normaux (a) Analyse du compartiment splénique Pour chaque souris, pour obtenir une suspension de cellules simples à partir de la rate, la rate a été doucement soumise à des passages à travers un tamis cellulaire de 30 pm. Les cellules simples ont été remises en suspension dans de la solution tampon phosphate (PBS) complémentée avec 3 % de sérum de veau foetal inactivé à la chaleur (FCS). 5 x 106 cellules ont été déposées dans des tubes individuels, centrifugées pour éliminer l'excès de liquide et remises en suspension dans 100 pl de PBS + 3 % de FCS frais. Dans chaque tube individuel, les anticorps suivants ont été ajoutés : anticorps anti-B220/CD45R (eBioscience, clone RA3-6B2) allophycocyanine (APC), anticorps dirigé contre le récepteur d'IgD conjugué avec de la phycoérythrine (PE) (eBioscience, clone 11-26) et anticorps dirigé contre le récepteur d'IgM conjugué avec de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (eBioscience, clone 11/41). Pour la coloration des IgM contre les IgD, 5 x 106 cellules ont été utilisées pour chaque coloration. Dans chaque flacon contenant des splénocytes, a été ajouté un cocktail d'anticorps constitué par : anticorps anti-IgD (PE), anticorps anti-IgM (FITC) et anticorps anti-B220/CD45R (APC). Les cellules ont été incubées à 6 °C pendant 15 minutes, lavées pour éliminer l'excès d'anticorps non liés et analysées en utilisant un analyseur de tri des cellules activées par fluorescence (FACS) de Miltenyi Biotech. Les cellules B ont été séparées en B220ELEVE IgM ELEVE u (c'est-à-dire, B220+ IgM+ IgD-) pour la population T1, B220 ELEVE lgM ELEVE IgD ELEVE (B220+ IgM+ IgD+) pour la population T2 et B220 ELEVE IgMBAS IgD ELEVE (B220+ IgM- igD+) pour la population M. Le pourcentage 153 des cellules a été calculé en utilisant un système de séparation. Nous avons utilisé des séparateurs pour identifier et définir des sous-ensembles des populations cellulaires sur les tracés avec une échelle logarithmique. Avant l'application des séparateurs, un anticorps colorant simple est utilisé pour chaque fluorochrome pour faire la discrimination entre une population positive (intensité élevée de fluorochrome) et négative (aucune intensité détectable de fluorochrome). Les séparateurs sont appliqués en se basant sur les intensités de fluorochrome de la même manière à tous les échantillons. Les colorants simples étaient : IgD-PE IgM-FITC B220-APC Les splénocytes vivants ont été séparés en utilisant la diffraction latérale (SSC) et la diffraction directe (FSC). Au sein de la population séparée par SSC et FSC, une sous-population de cellules B220/CD45R positives (cellules B de souris) a été détectée en utilisant le fluorochrome APC. La population simple B220/CD45R positive a été en outre sous-divisée en cellules portant soit des IgM isothiocyanate de fluorescéine (FITC) soit des IgD fluorochrome conjointement avec 111K fluorochrome FITC. Le pourcentage de chaque population a été calculé en utilisant un système de séparation. Les compartiments des cellules B spléniques chez les souris de l'invention sont normaux (c'est-à-dire, équivalents aux compartiments des souris exprimant uniquement des chaînes d'anticorps de souris). (b) Analyse des progéniteurs B de la moelle osseuse Pour obtenir une suspension de cellules simples à partir de la moelle osseuse pour chaque souris, le fémur et le tibia ont été rincés avec de la solution tampon phosphate (PBS) complémentée avec 3 % de sérum de veau foetal inactivé à la chaleur (FCS). Les cellules ont été en outre soumises à des passages à travers un tamis cellulaire de 30 pm pour éliminer les morceaux d'os ou les agrégats cellulaires. Les cellules ont été remises en suspension dans du PBS froid complémenté avec 3 % de sérum. 2 x 106 cellules ont été déposées dans des tubes individuels, centrifugées pour éliminer l'excès de tampon, et remises en suspension dans 100 pl de PBS + 3 % de FCS frais. Dans chaque tube individuel, les anticorps suivants ont été ajoutés : anticorps antileucosialine (CD43) isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (eBioscience, clone eBioR2/60) et anticorps anti-B220/CD45R (eBioscience, clone RA3-6B2) allophycocyanine (APC). Les cellules ont été incubées dans l'obscurité à 6 °C pendant 154 minutes, ceci suivi de pluSieurs lavages avec du PBS + 3 % de FCS frais pour éliminer les anticorps non liés. Les cellules ont été analysées en utilisant un analyseur de tri des cellules activées par fluorescence (FACS) de Miltenyi Biotech. Les cellules vivantes de la moelle osseuse ont été séparées en utilisant une diffraction latérale (SSC) et une diffraction directe (FSC). Nous avons utilisé des séparateurs pour identifier et définir des sous-ensembles des populations cellulaires sur les tracés avec une échelle logarithmique. Avant l'application des séparateurs, un anticorps colorant simple est utilisé pour chaque fluorochrome pour faire la discrimination entre une population positive (intensité élevée de fluorochrome) et négative (aucune intensité détectable de fluorochrome). Les séparateurs sont appliqués en se basant sur les intensités de fluorochrome de la même manière à tous les échantillons. Les colorants simples étaient : B220-APC CD43-FITC Au sein de la population vivante, une double population de cellules B220/CD45R et CD43 positives a été identifiée comme des cellules pré-B, pro-B et pré-pro-B. Les compartiments des cellules spléniques chez les souris de l'invention sont normaux (c'est-à-dire, équivalents aux compartiments des souris exprimant uniquement des chaînes d'anticorps de souris).

Les souris transgéniques de l'invention développent une expression normale des Ig Quantification des IgM et des IgG sériques Des plaques NUNC de 96 puits ont été sensibilisées initialement avec un anticorps de capture (anticorps Fab de chèvre anti-souris à 1 pg/ml) pendant une nuit à 4°C). Les plaques des IgG ont utilisé un anticorps anti-Fab, (M4155 Sigma) et les plaques des IgM ont utilisé un anticorps anti-Fab (OBT1527 AbD Serotec). Après trois lavages avec de la solution tampon phosphate (PBS) contenant 0,1 % v/v de Tween 20, les plaques ont été bloquées avec 200 pl de PBS contenant 1 `)/0 p/v de sérumalbumine bovine (BSA) pendant 1 heure à température ambiante (TA). Les plaques ont été lavées trois fois comme ci-dessus et ensuite 50 pI d'étalons (anticorps d'isotype contrôle de souris, IgG1 (M9269 Sigma), IgG2a (M9144 Sigma), IgG2b (M8894 sigma), IgM (M3795 Sigma) ou des échantillons de sérum dilués dans du PBS avec 0,1 % de BSA ont été ajoutés dans chaque puits, et incubés pendant 1 heure à TA. Après lavage trois fois comme ci-dessus, 100 pI d'anticorps de détection (anticorps de chèvre d'isotype spécifique antisouris conjugué à de la peroxydase de raifort, 1/10000 dans du PBS avec 0,1 % de 155 Tween) (IgG1 anti-souris (STAR132P AbD Serotec), IgG2a anti-souris (STAR133P AdD Serotec), IgG2b anti-souris (STAR134P AbD Serotec) et IgM anti-souris (ab97230 Abcam) ont été ajoutés dans chaque puits et incubés pendant 1 heure à TA. Les plaques ont été lavées trois fois comme ci-dessus et développées en utilisant du substrat de tétraméthylbenzidine (TMB, Sigma) pendant 4 à 5 minutes dans l'obscurité à TA. Le développement a été stoppé par l'addition de 50 pl/puits d'acide sulfurique 1 M. Les plaques ont été lues avec un lecteur de plaque Biotek Synergy HT à 450 nM. Conclusion : L'inversion des VH-D-JH endogènes après l'insertion de BAC d'IGH humain entraîne 10 l'inactivation du réarrangement des VH endogènes aux D-JH humains insérés. Toutefois, les inventeurs ont observé que, de manière surprenante, l'inactivation de l'expression des chaînes lourdes endogènes ne change pas le rapport des cellules B dans le compartiment splénique (figure 11) ou le compartiment des progéniteurs B de la moelle osseuse (figure 12) et les taux d'immunoglobulines dans le sérum sont normaux et les 15 sous-types d'Ig corrects sont exprimés (figure 13). Ceci a été montré chez des souris exprimant des régions variables de chaînes lourdes humaines avec des chaînes légères de souris (figures 11A et 12A) ainsi que chez des souris exprimant à la fois des régions variables de chaînes lourdes humaines et des régions variables de chaînes légères humaines (figures 11B et 12B). Ces données démontrent que les segments de gènes 20 IGH humains insérés (une insertion d'au moins les segments de gènes VH humains VH2- 5,7-4-1,4-4,1-3,1-2,6-1, et tous les segments de gènes D et JH humains D1-1, 2 2,3-3,4-4,5-5,6-6,1-7,2-8,3-9,5-12,6-13,2-15,3-16,4-17,6-19,1-20,2-21, 3-22,6-25,1-26 et 7-27; et J1, J2, J3, J4, J5 et J6) sont totalement fonctionnels dans l'aspect du réarrangement, de la signalisation des RCB et de la maturation des cellules 25 B. La fonctionnalité est également retenue lorsque des segments de gènes VJ de chaînes légères humaines sont insérés pour fournir des chaînes légères transgéniques, selon l'insertion utilisée pour créer l'allèle K2. Cette insertion est une insertion comprenant les segments de gènes humains VK2-24, VK3-20, Vk1-17, Vk1-16, Vk3- 15, W1-13, Vk1-12, W3-11, Vk1-9, Vk1-8, Vk1-6, Vk1-5, VK5-2, VK4-1, JK1, JK2, 30 JK3, JK4 et JK5. Plus de 90 % des anticorps exprimés par les souris S1F/HA ; K2/KA comprenaient des régions variables de chaînes lourdes humaines et des régions variables de chaînes légères kappa humaines. Par conséquent, ces souris sont très utiles pour la sélection d'anticorps comportant des régions variables humaines qui lient spécifiquement un antigène humain après immunisation des souris avec cet antigène. 35 Après l'isolement d'un tel anticorps, l'homme du métier peut remplacer la région constante de souris par des régions constantes humaines en utilisant des techniques 156 traditionnelles pour aboutir à des anticorps totalement humains qui sont utiles en tant que médicaments candidats pour une administration à des êtres humains (éventuellement après mutation ou adaptation pour produire un autre dérivé, par exemple, avec amplification ou inactivation du Fc ou après conjugaison à une charge toxique ou un rapporteur ou un marqueur ou un autre fragment actif). Une autre expérience a été réalisée pour estimer les taux et les proportions relatives des IgG et des IgM chez les souris transgéniques de l'invention qui expriment des anticorps qui comportent des régions variables de chaînes lourdes et légères (kappa) humaines (souris S1F/HA, K2/KA ; n = 15). Celles-ci ont été comparées à 12 souris exprimant seulement des chaînes d'anticorps de souris (+/HA, +/KA (n = 6) et des souris de type sauvage (VVT ; n = 6)). Les résultats sont compilés ci-dessous (tableau 19) et représentés sur la figure 14. On peut observer que les souris de l'invention, chez lesquelles essentiellement toutes les régions variables de chaînes lourdes sont des régions variables de chaînes lourdes humaines, ont exprimé des proportions normales d'lgM et de sous-types d'IgG, et également la proportion des IgG totales par rapport aux IgM était normale. 157 Tableau 19 : IgG1 (pg/ml) IgG2a (pg/ml) IgG2b (pg/ml) IgM (pg/ml) IgG totales + IgM (pg/ml) KMCB22.1a S1F/HA, K2/KA 30,5 38,3 49,9 224,4 343,1 KMCB 19.1d S1F/HA, K2/KA 103,6 181,2 85,6 351,7 722,1 KMCB 19.1h S1F/HA, K2/KA 191,4 456,6 383,3 643,2 1674,6 KMCB 20.1a S1F/HA, K2/KA 53,6 384,4 249,7 427,1 1114,7 KMCB 20.1c S1F/HA, K2/KA 87,3 167,0 125,7 422,1 802,1 KMCB 20.1f S1F/HA, K2/KA 55,4 177,2 95,6 295,7 623,9 KMCB22.1f S1F/HA, K2/KA 61,1 56,3 111,4 245,8 474,5 KMCB23.1c S1F/HA, K2/KA 71,4 70,7 80,5 585,4 808,0 KMCB23.1d S1F/HA, K2/KA 65,4 148,7 187,4 255,4 657,0 KMCB24.1f S1F/HA, K2/KA 60,0 56,6 15D,5 294,8 561,9 KMCB13.1a 101,2 200,5 269,8 144,1 715,7 S 1F/HA, K2/KA KMCB13.1d S1F/HA, K2/KA 124,5 117,5 246,6 183,2 671,9 158 KMCB17.1f S1F/HA, K2/KA 58,3 174,2 116,2 218,1 566,8 KMCB14.1a S1F/HA, K2/KA 51,9 46,5 27,9 222,2 348,6 KMCB14.1b S1F/HA, K2/KA 11,5 54,2 48,5 194,4 308,6 KMCB19.1e +/HA, +/KA 233,0 6,7 465,6 420,9 1126,3 KMCB19.1f +/HA, +/KA 154,3 4,6 610,2 435,7 1204,8 KMCB19.11 +/HA, +/KA 113,5 1,1 246,8 374,6 736,0 KMCB20.1e +/HA, +/KA 561,0 4,3 614,3 482,1 1661,7 KMCB13.1e +/HA, +/KA 439,3 17,1 584,1 196,9 1237,3 KMCB14.1c +/HA, +/KA 93,4 1,3 112,0 106,8 313,6 KMWT 1.3c VVT 212,9 155,2 104,6 233,7 706,4 KMWT 1.3d VVT 297,1 203,2 144,6 248,6 893,5 KMWT 1.3e VVT 143,1 174,2 619,1 251,8 1188,2 KMWT 1.3f WT 218,8 86,8 256,1 294,8 856,4 KMWT 1.3b VVT 150,2 114,2 114,7 225,6 604,7 KMWT 3.1e WT 125,9 335,5 174,6 248,9 884,9 159 Exemple 4 : Estimation du rapport kappa / lambda et des compartiments des cellules B spléniques chez les souris transgéniques de l'invention Les souris comprenant les génomes suivants ont été obtenues. 5 WT/WT = type sauvage ; KA/KA = chaque allèle kappa endogène a été inactivé ; et les loci lambda endogènes sont laissés intacts ; K3F/K3F = chaque allèle kappa endogène comporte trois insertions d'ADN de locus de chaîne kappa entre le JK endogène le plus en 3' et le CK de souris, fournissant une 10 insertion des segments de gènes V humains VK2-40, VK1-39, VK1-33, VK2-30, VK2-29, VK2-28, VK1-27, VK2-24, VK3-20, VK1-17, VK1-16, VK3-15, VK1-13, VK1-12, VK3-11, VK1-9, VK1-8, VK1-6, VK1-5, VK5-2 et VK4-1 et des segments de gènes J humains JK1, JK2, JK3, JK4 et JK5 (les segments de gènes V humains étant en 5' des segments de gènes J humains) ; chaque VJ kappa endogène a été inactivé par inversion et 15 mouvement en amont sur le chromosome ; et les loci lambda endogènes sont laissés intacts ; L2/L2 = comme décrit dans l'exemple 2 (homozygotes L2 où de l'ADN de région variable lambda humaine a été inséré dans les loci lambda endogènes ; les loci kappa endogènes sont laissés intacts) ; 20 L2/L2 ; KA/KA = comme L2/L2 mais les allèles kappa endogènes ont été inactivés (par insertion d'une séquence d'interruption endogène = KA) ; L3/L3 ; KA/KA = comme L2/L2 ; KA/KA mais complémenté par une troisième insertion d'ADN de région variable lambda humaine en 5' de la deuxième insertion d'ADN lambda dans les loci lambda endogènes de telle manière que les segments de gènes lambda 25 humains suivants sont insérés entre le JÀ endogène le plus en 3' et le CÀ de souris : les segments de gènes V humains VÀ3-27, VÀ3-25, VÀ2-23, VÀ3-22, VÀ3-21, VÀ3-19, VÀ2-18, VÀ3-16, VÀ2-14, VÀ3-12, VÀ2-11, VÀ3-10, VÀ3-9, VÀ2-8, VÀ4-3 et VÀ3-1, les segments de gènes J et C humains JÀ1-CÀ1, JÀ2-CÀ2, JÀ3-CÀ3, JÀ6-CÀ6 et JÀ7- CÀ7 (les segments non fonctionnels JÀ4-CÀ4, JÀ5-CÀ5 ont été également inclus), 30 fournissant ainsi une insertion correspondant aux coordonnées 22886217 à 23327884 du chromosome 22 humain insérée immédiatement après la position 19047551 sur le chromosome 16 de souris ; 160 S3F/HA ; KA/KA ; L3/L3 = le premier allèle de chaîne lourde endogène comporte trois insertions d'ADN de région variable de chaîne lourde humaine entre le JH endogène le plus en 3' et le Ep, fournissant une insertion des segments de gènes humains VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, D1-1, D2-2, D3-9, D3-10, 04 11, D5-12, D6-13, D1-14, 02-15, D3-16, 04-17, D5-18, D6-19, D1-20, D2-21, D322, D4-23, D5-24, D6-25, D1-26, D7-27, JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 et JH6 (dans l'ordre : les segments de gènes V humains, les segments de gènes D humains et les segments de gènes J humains) ; la séquence VDJ de chaîne lourde endogène a été inactivée par inversion et mouvement en amont sur le chromosome ; et les loci lambda endogènes sont laissés intacts ; le second allèle de chaîne lourde endogène a été inactivé par insertion d'une séquence d'interruption endogène = HA) ; les allèles kappa endogènes ont été inactivés (= KA/KA) ; et les allèles lambda endogènes ont été modifiés par insertion d'ADN de région variable lambda humaine (= L3/L3) ; P2/VVT = allèle P2 (ADN de région variable lambda humaine comme décrit dans l'exemple 1) au niveau d'un locus kappa endogène ; l'autre locus kappa endogène laissé intact ; les deux loci lambda endogènes laissés intacts ; P2/P2 = voir l'exemple 14 ; les deux loci lambda endogènes laissés intacts ; P2/K2 = allèle P2 au niveau d'un locus kappa endogène ; l'autre locus kappa endogène comportant deux insertions d'ADN entre le JK endogène le plus en 3' et le CK de souris, fournissant une insertion des segments de gènes V humains W2-24, W3-20, VK1-17, Vk1-16, VK3-15, VK1-13, VK1-12, W3-11, VK1-9, VK1-8, W1-6, VK1-5, VK5-2 et VK4-1 et des segments de gènes J humains JK1, JK2, JK3, JK4 et JK5 (les segments de gènes V humains étant en 5' des segments de gènes J humains) ; les deux loci lambda endogènes laissés intacts ; P3/K3F = comme un locus kappa endogène comportant une insertion, les segments de gènes lambda humains suivants sont insérés entre le JK endogène le plus en 3' et le CK de souris, fournissant une insertion des segments de gènes V humains VÀ3-27, VÀ3- 25, VÀ2-23, VÀ3-22, VÀ3-21, VÀ3-19, VÀ2-18, VÀ3-16, VÀ2-14, VÀ3-12, VÀ2-11, VÀ3-10, VÀ3-9, VÀ2-8, VÀ4-3 et VÀ3-1, des segments de gènes J et C humains JÀ1- CÀ1, JÀ2-CÀ2, JÀ3-CÀ3, JÀ6-CÀ6 et JÀ7-CÀ7 (les segments non fonctionnels JÀ4-CÀ4, JÀ5-CÀ5 ont été également inclus), fournissant ainsi une insertion correspondant aux coordonnées 22886217 à 23327884 du chromosome 22 humain insérée immédiatement après la position 70674755 sur le chromosome 6 de souris ; l'autre locus kappa 161 endogène ayant l'allèle K3F décrit ci-dessus (segments de gènes V et J kappa humains insérés) ; les deux loci lambda endogènes laissés intacts ; P2/P2 ; L2NVT = comme P2/P2 mais où un locus lambda endogène comporte l'allèle L2 (segments de gènes V et J lambda insérés) et l'autre locus lambda endogène est de 5 type sauvage ; et P2/P2 ; L2/L2 = homozygote pour les allèles P2 et L2 au niveau des loci kappa et lambda endogènes respectivement. Une analyse FACS des cellules B spléniques (comme il a été décrit ci-dessus) a été réalisée et les proportions d'expression des chaînes légères ont été déterminées. Nous 10 avons également déterminé les proportions de cellules B spléniques T1, T2 et matures (M) et comparé avec des souris de type sauvage, afin d'estimer si nous avons obtenu ou pas des compartiments de cellules B spléniques normaux chez les souris transgéniques. Les résultats sont présentés dans les tableaux 20 et 21. Nous avons également estimé la proportion des cellules B220 positives comme indication de la proportion des 15 cellules B dans les échantillons de cellules spléniques. Tableau 20 : Comparaisons avec des souris comportant des inserts de régions variables lambda humaines au niveau du locus lambda endogène Génotype B220 Pourcentage d'IGL Compartiment des cellules B spléniques mIGK mIGA hIGÀ T1 T2 M VVT/WT (n = 2) 20 % 90 % 3,80 % 16 % 16,5 % 57,50 % KA/KA (n = 2) 13,60 % 0,28 % 68,50 % 0 % 33 % 9 % 41 % K3F/K3F (n = 2) 20% 83% 7% 16% 15,50% 58% L2/L2 (n = 2) 17,80 % 91,60 % 1,60 % 6,50 % 21,50 % 10 % 50 % L2/L2 , - KA/KA (n = 1) 9,10% 0% 5% 93% 28% 1 % 44% L3/L3 ; KA/KA (n=2) 16,90 % 0,10 % 4,50 % 93,20 % 17,40 % 13,10 % 53,90 % S3F/HA ; KA/K ; 19 % 0,20 % 3,80 `)/0 98 % 15,50 % 19 % 53,20 % 162 L3/L3 (n=1) Tableau 21 : Souris comportant des inserts de régions variables lambda humaines au niveau du locus kappa Génotype B220 Pourcentage d'IGL Compartiment des cellules B spléniques mIGK mIGA hIGA T1 T2 M P2JWT (n = 2) N.D 90 % 4,20 % 6,55 % 17,30 % 8,90 % 52,50 '3/0 P2/P2 (n = 2) 14,80% 0,20% 15% 76% 27,50% 12% 42% P2/K2 (n = 2) 18,20 % 78,80 % 7,90 % 15,60 % 19,50 % 12 % 50 % P3/K3F (n = 2) 18,40.% 64,80 % 11,60 % 19,40 % 11,80 % 18,40 % 56,10 % P2/P2 ; 20,40 % 0,05 % 8,50 % 94 % 13,10 % 16,10 % 59,90 `)/0 L2/VVT (n = 2) P2/P2; 12,70 % 0,07 % 5,10 % 95,40 % 13,40 % 13,80 % 57,30 % L2/L2 (n = 2) Conclusions Comme il est démontré par L2/L2 ; KA/KA et L3/L3 ; KA/KA, les insertions d'ADN de région variable lambda humaine au niveau du locus lambda endogène (avec une inactivation du kappa endogène) ont affiché une expression prédominante des chaînes légères portant des régions variables lambda humaines (indiquée par l'expression des chaînes CÀ-positives autour de 93 %). Ceci se produit de manière surprenante même si 163 l'ADN de région variable lambda de souris est encore présent, indiquant que l'ADN de région variable lambda humaine inséré peut l'emporter sur le réarrangement des IGÀ endogènes. En outre, les souris comportant des segments de gènes V et J humains présents dans l'insertion des homozygotes L3 produisent des cellules B (cellules B220 positives) dans une proportion qui est similaire au type sauvage et en outre produisent une proportion ou un pourcentage normal de cellules B spléniques matures (c'est-à-dire, similaire au type sauvage). Ceci est confirmé non seulement par les souris L3/L3 ; KA/KA, mais a été également observé pour S3F/HA ; KA/KA ; L3/L3, qui comprend également un locus IgH chimérique (humain-souris). En outre, nous avons observé que les souris comportant les segments de gènes V et J humains présents dans l'insertion des homozygotes K3F produisent des cellules B (cellules B220 positives) dans une proportion qui est similaire au type sauvage et en outre produisent une proportion ou un pourcentage normal de cellules B spléniques matures (c'est-à-dire, similaire au type sauvage). Les souris comportant les segments de gènes V et J humains présents dans l'insertion des homozygotes P2 au niveau du locus kappa endogène ont présenté une expression élevée des chaînes légères comprenant des régions variables lambda humaines (comme il est indiqué par une proportion observée de 76 %). Nous avons pu biaiser pour un pourcentage global même supérieur en combinant l'insertion de segments de gènes V et J lambda humains au niveau des deux loci kappa et lambda endogènes (voir P2/P2 ; L2/WT autour de 94 % et P2/P2 ; L2/L2 autour de 95 %). En outre, les souris comprenant l'arrangement de segments de gènes V et J humains de P2/P2 ; L2/L2 produisent une proportion ou un pourcentage normal de cellules B spléniques matures (c'est-à-dire, similaire au type sauvage). Lorsque des segments de gènes V et J lambda humains ont été insérés au niveau d'un locus kappa endogène et que l'autre locus kappa endogène comprenait une insertion de segments de gènes V et J kappa humains, nous avons obtenu des souris qui pouvaient exprimer des chaînes légères comprenant des régions variables lambda et également des chaînes légères comprenant des régions variables kappa. Nous avons observé, de manière surprenante, que nous pouvions augmenter la proportion des chaînes légères comprenant des régions variables lambda au-dessus de ce qui a été observé chez une souris de type sauvage où seulement 5 % ou moins des chaînes légères comprennent généralement des régions variables lambda. Nous avons observé une proportion autour de 22 % pour le génotype P2/K2 et autour de 31 % pour le génotype P3/K3F. La 164 proportion observée avec le dernier génotype est approximativement celle observée chez un être humain où généralement autour de 60 % des chaînes légères comprennent des régions variables kappa et autour de 40 % des chaînes légères comprennent des régions variables lambda. En outre, dans les cas P2/K2 et P3/K3F, les souris ont produit une proportion normale de cellules B comparativement aux souris de type sauvage. En outre, les souris comprenant l'arrangement de segments de gènes V et J humains de P3/K3F produisent une proportion ou un pourcentage normal de cellules B spléniques matures (c'est-à-dire, similaire au type sauvage). Exemple 5 : II a été généré des souris qui comprenaient les allèles IgH spécifiques énumérés dans le tableau 3 ; et les allèles IgL spécifiques énumérés dans les tableaux 10 ou 11. Des souris ont été immunisées avec des antigènes cibles et les anticorps spécifiques des antigènes ont été isolés. Les anticorps ont été estimés pour leur spécificité de liaison, leur maturation (c'est-à-dire, l'étendue des mutations jonctionnelles et somatiques contre les séquences des segments de gènes de la lignée germinale) et leur cinétique de liaison. Les cellules B correspondantes ont été également obtenues et dans certains cas, les hybridomes produits qui expriment les anticorps choisis. Les anticorps choisis sont résumés dans le tableau 22. Les cinétiques de liaison de certains d'entre eux ont été déterminées comme suit.

Détermination de la cinétique de liaison Une surface de capture d'IgG anti-souris a été créée sur une puce GLM BiosensorîM par couplage d'amine primaire en utilisant des IgG anti-souris de GE Healthcare (BR1008-38). Les anticorps à tester tels que présentés dans le tableau 22 ont été capturés sur cette surface et l'antigène respectif a été passé sur l'Ac capturé aux concentrations indiquées. Une injection de tampon (c'est-à-dire, 0 nM d'antigène) a été utilisée en double référence pour les courbes de liaison, et les données ont été ajustées au modèle 1:1 intrinsèque au logiciel d'analyse ProteOn XPR36The. La régénération de la surface de capture a été réalisée en utilisant 10 mM de glycine, pH 1,7. Le test a été exécuté à 25 °C et en utilisant du HBS-EP en tant que tampon d'exécution.

Cible 1 : une protéine humaine à sous-unités multiples Cible 2 : une cytotoxine bactérienne Cible 3 : une protéine humaine à sous-unités multiples différente 165 Cible 4 : une protéine exprimée en protéine transmembranaire sur des cellules humaines Cible 1 mAb1.1 CIBLE 1 à concentration unique (256 nM), capture anti-souris ka kd KD 3,85E+05 3,22E-05 83 pM (affinité apparente puisque cible à sous-unités multiples) Cible 2 mAb2.1 CIBLE 2 à 256, 64, 16, 4 et 1 nM ; résultats de 3 expériences : Expérience 1 : ka kd KD 1,40E+04 1,83E-05 1,300 nM Expérience 2 : ka kd KD 2,76E+04 3,23E-05 1,170 Expérience 3 : Impossible de résoudre la vitesse de dissociation - indiquant une liaison extrêmement serrée au-delà des limites détectables. Cible 3 mAb3.1 CIBLE 3 à 256, 64, 16, 4 et 1 nM ka kd KD 4,00E+05 2,34E-04 0,59 nM (affinité apparente puisque cible à sous-unités multiples) Cible 3 mAb3.2 166 CIBLE 3 à 256, 64, 16, 4 et 1 nM ka kd KD 3,86E+05 2,57E-04 0,67 (affinité apparente puisque cible à sous-unités multiples) 5 Cible 3 mAb3.3 CIBLE 3 à 256, 64, 16, 4 et 1 nM ka kd KD Impossible de résoudre la vitesse de dissociation, liaison extrêmement serrée (affinité apparente puisque cible à sous-unités multiples) 10 En conclusion, la présente invention propose des anticorps ayant subi une maturation d'affinité in vivo avec des domaines variables humains qui peuvent être exprimés dans des systèmes in vivo, et lient spécifiquement des antigènes cibles avec de très bonnes affinités, vitesses d'association et de dissociation. L'invention propose ainsi des anticorps qui sont utiles pour la médecine chez les êtres humains, ainsi que des 15 vertébrés non humains, des cellules (par exemple, des cellules B et des hybridomes) pour produire de tels anticorps. Exemple 6 : Les lignées S (lourde), K (kappa dans locus kappa), L (lambda dans locus lambda) et P (lambda dans locus kappa) utilisées pour générer les données dans les exemples ont 20 utilisé les allèles des tableaux 1 à 18 et ont démontré que de telles collections d'allèles peuvent produire les résultats surprenants présentés (par exemple, de bons compartiments de cellules B, une expression élevée des régions V lambda humaines, un rapport lambda/kappa souhaitable chez-une souris et un répertoire normal d'isotypes IgH). Les anticorps isolés étaient tous basés sur les allèles énumérés dans les 25 tableaux 1 à 18 ci-dessus. Tous avaient des domaines V avec mutation provoquée par l'AID et la TdT de souris.

167 Autres modes de réalisation D'après la description précédente, il sera évident que des variations et des modifications peuvent être apportées à l'invention décrite dans ce document pour l'adapter à divers usages et diverses conditions. De tels modes de réalisation se situent également au sein de l'étendue des revendications. La citation d'une liste d'éléments dans une définition quelconque d'une variable dans ce document comprend les définitions de cette variable en tant qu'élément simple quelconque ou combinaison (ou sous-combinaison) des éléments énumérés. La citation d'un mode de réalisation dans ce document comprend ce mode de réalisation en tant que mode de réalisation simple quelconque ou en combinaison avec d'autres modes de réalisation quelconques ou des parties de ceux-ci. Toutes les publications et demandes de brevet mentionnées dans le mémoire sont indicatives du niveau d'expertise de l'homme du métier auquel cette invention appartient.

168 Tableau 22 Séquences des hybridomes 1.1 AA non lignée CIBLE 1 : y d j germinale' IGHV7- IGHD3- mAb1.1 4-1*01 16*02 IGHJ6*02 2 IGHV4- IGHD3- mAb1.2 4*02 10*01 IGHJ6*02 3 CIBLE 2 : IGHV1- IGHD3- mAb2.1 3*01 10*01 IGHJ6*02 6 1.2 Mutations AAk non lignée Mutations AA2 kv kj germinale' AAk 2 IGKV2- 0 28*01 IGKJ4*1 0 0 IGI<V1D- 0 13*d01 IGKJ4*1 0 0 IGKV1- 9 12*01 IGKJ4*1 1 0 CIBLE 3 : IGHV3- IGHD3- IGKV1D- mAb3.1 13*01 9*01 IGHJ6*02 3 5 12*02 IGKJ4*1 0 IGHV3- IGHD3- IGKV1D- mAb3.2 13*01 9*01 IGHJ6*02 3 5 12*02 IGKJ4*1 0 4 IGHV4- IGHD3- IGKV1D- mAb3.3 4*02 10*01 IGHJ6*02 2 7 13*d01 IGKJ4*1 3 3 Séquences BcellTech CIBLE 1 : 1.3 AA non lignée 1.4 Mutations AAk non lignée Mutations id v d j germinale' AA2 kv kj germinale' AAk2 IGHV3- IGHD3- IGKV3- mAb1.3 13*01 10*01 IGHJ6*02 5 0 20*01 IGKJ4*1 0 0 CIBLE 3 : 1.5 AA non lignée germinale' 1.6 Mutations AA2 kv kj AAk non lignée germinale' Mutations AAk2 IGHV3- IGHD3- IGKV1- mAb3.4 23*04 22*01 IGHJ6*02 9 8 17*01 IGKJ4*1 1 1 IGHV3- IGHD3- 5 IGKV1- IGKJ4*1 1 IGKJ4*1 2 IGKJ4*1 1 IGKJ4*1 2 IGKJ4*1 0 0 mAb3.5 23*04 22*01 1GHJ6*02 10 2 17*01 3 IGHV3- IGHD3- 5 IGKV1D- 1 mAb3.6 7*01 9*01 IGHJ6*02 6 6 39*01 4 IGHV3- IGHD3- 3 IGKV1- mAb3.7 23*04 22*01 IGHJ6*02 9 17*01 IGHV3- IGHD3- IGKV1D- mAb3.8 13*01 10*01 IGHJ6*02 7 39*01 IGHV3- IGHD3- IGKV3- mAb3.9 13*01 10*01 IGHJ6*02 3 11*01 7 CIBLE 4: 1.7 AA non lignée id v d j germinale' IGHV4- IGHD3- mAb4.1 4*02 9*01 IGHJ6*02 7 AAk non lignée Mutations kv kj germinale' AAk2 IGKV1D- 16*01 IGKJ4*1 1 1 1.8 Mutations AA2 IGHV3- IGHD3- IGKV1- mAb4.2 20*d01 10*01 IGHJ6*02 6 4 9*d01 IGKJ4*1 1 1 [Tous les segments de gènes sont humains] AA non lignée germinale' : nombre d'acides aminés non lignée germinale introduits dans les jonctions VH-D ou D-JH ou dans les jonctions VLJL Mutations AA2 : nombre de mutations d'AA dans.la région V et J (région CDRH3 ou CDRL3 exclue) Des séquences pour des exemples de segments de gènes conformément à l'invention sont présentées ci-dessous. IGLC7*01 ggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccaccctcctctgaggagettcaa gccaacaaggccacactggtgtgtctcgtaagtgacttctacccgggagccgtgacagtg gcctggaaggcagatggcagccccgtcaaggtgggagtggagaccaccaaaccctccaaa caaagcaacaacaagtatgcggccagcagctacctgagcctgacgcccgagcagtggaag tcccacagaagctacagctgccgggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtg gcccctgcagaatgctct IGLJ7*01 tgctgtgttcggaggaggcacccagctgaccgtcctcg IGLC6*01 ggtcagcccaaggctgccccatcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaa gccaacaaggccacactggtgtgcctgatcagtgacttctacccgggagctgtgaaagtg gcctggaaggcagatggcagccccgtcaacacgggagtggagaccaccacaccctccaaa cagagcaacaacaagtacgcggccagcagctacctgagcctgacgcctgagcagtggaag tcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtg gcccctgcagaatgttca IGLC6*04 gtcagcccaaggctgccccatcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaag ccaacaaggccacactggtgtgcctgatcagtgacttctacccgggagctgtgaaagtgg cctggaaggcagatggcagccccgtcaacacgggagtggagaccaccacaccctccaaac agagcaacaacaagtacgcggccagcagctagctacctgagcctgacgcctgagcagtgg 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gccaacaaggccacactagtgtgtctgatcagtgacttctacccgggagctgtgacagtg gcctggaaggcagatggcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccaaaccctccaaa cagagcaacaacaagtacgcggccagcagctacctgagcctgacgcccgagcagtggaag tcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtg gcccctacagaatgttca IGLJ1*01 ttatgtcttcggaactgggaccaaggtcaccgtcctag IGLV3-1*01 gatccgtggcctcctatgagctgactcagccaccctcagtgtccgtgtccccaggacagacagccagc atcacctgctctggagataaattgggggataaatatgcttgctggtatcagcagaagcca ggccagtcccctgtgctggtcatctatcaagatagcaagcggccctcagggatccctgag cgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggct atggatgaggctgactattactgtcaggcgtgggacagcagcactgca IGLV4-3*01 ctgcctgtgctgactcagcccccgtctgcatctgccttgctgggagcctcgatcaagctcacc tgcaccctaagcagtgagcacagcacctacaccatcgaatggtatcaacagagaccaggg aggtccccccagtatataatgaaggttaagagtgatggcagccacagcaaggegacggg atccccgatcgcttcatgggctccagttctggggctgaccgctacctcaccttctccaac ctccagtctgacgatgaggctgagtatcactgtggagagagccacacgattgatggccaa gtcggttgagc IGLV2-8*01 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agcagagtggaggctgaggatgttggggtttattactgcatgcaagctctacaaactcct CC 182

Claims

REVENDICATIONS1. Cellule de vertébré non humain (par exemple, une cellule de souris ou une cellule de rat) dont le génome comprend le JH2*01 humain et/ou le JH6*02 humain, un ou plusieurs segments de gènes VH humains et un ou plusieurs segments de gènes D humains en amont d'une région constante au niveau d'un locus de chaîne lourde endogène et le JK2*01 humain et/ou le JK4*01 humain et un ou plusieurs segments de gènes VK humains en amont d'une région constante au niveau d'un locus de chaîne légère endogène, où les segments de gènes dans chaque locus sont liés de manière fonctionnelle à la région constante de celui-ci de telle manière que la cellule est capable de produire une chaîne lourde d'anticorps et une chaîne légère d'anticorps, ou bien où la cellule peut se développer chez un vertébré qui exprime une chaîne lourde d'anticorps et une chaîne légère d'anticorps, où la chaîne lourde est produite par recombinaison du segment JH2*01 et/ou JH6*02 humain avec un segment D et un segment VH et la chaîne légère est produite par recombinaison du segment JK2*01 et/ou JK4*01 humain avec un segment VK.
2. Vertébré non humain (par exemple, une souris ou un rat) dont le génome comprend le JH2*01 humain et/ou le JH6*02 humain, un ou plusieurs segments de gènes VH humains et un ou plusieurs segments de gènes D humains en amont d'une région constante au niveau d'un locus de chaîne lourde endogène et le JK2*01 humain et/ou le JK4*01 humain et un ou plusieurs segments de gènes VK humains en amont d'une région constante au niveau d'un locus de chaîne légère endogène, où les segments de gènes dans chaque locus sont liés de manière fonctionnelle à la région constante de celui-ci de telle manière que le vertébré est capable de produire une chaîne lourde d'anticorps et une chaîne légère d'anticorps, où la chaîne lourde est produite par recombinaison du segment JH2*01 et/ou JH6*02 humain avec un segment D et un segment VH et la chaîne légère d'anticorps est produite par recombinaison du segment JK2*01 et/ou JK4*01 humain avec un segment VK.
3. Cellule selon la revendication 1 ou vertébré selon la revendication 2, où le génome comprend JH2*01 et JK2*01.
4. Cellule selon la revendication 1 ou 3 ou vertébré selon la revendication 2 ou 3, où le génome comprend JH6*02 et JK4*01.
5. Cellule ou vertébré selon l'une quelconque des revendications précédentes, où lesdits un ou plusieurs segments de gènes VH humains du locus de chaîne lourde comprennent ou sont constitués par un, plusieurs ou la totalité des segments de 183gènes VH humains choisis dans le groupe constitué par VH3-23*04, VH7-4-1*01, VH4-4*02, VH1-3*01, VH3-13*01, VH3-7*01 et VH3-20*d01.
6. Cellule ou vertébré selon la revendication 5, où ledit locus de chaîne lourde comprend VH3-23*04 recombiné avec JH2*01 ; ou VH3-7*01 recombiné avec JH6*02.
7. Cellule ou vertébré selon l'une quelconque des revendications précédentes, où lesdits un ou plusieurs segments de gènes VK humains comprennent ou sont constitués par un, plusieurs ou la totalité des segments de VH humains choisis dans le groupe constitué par VK4-1*01, VK2-28*01, VK1D-13*d01, VK1-12*01, VK1D- 12*02, VK3-20*01, VK1-17*01, VK1D-39*01, VK3-11*01, VK1D-16*01 et VK1- 9*d01.
8. Cellule ou vertébré selon la revendication 5, où ledit locus de chaîne légère comprend VK4-1*01 recombiné avec JK2*01 ; ou VK2-28*01 recombiné avec JK4*01.
9. Cellule ou vertébré selon l'une quelconque des revendications précédentes, où le génome comprend VH3-23*04, JH2*01 (éventuellement recombiné avec le VH3- 23*04), VK4-1*01 et JK2*01(éventuellement recombiné avec le VK4-1*01).
10. Cellule ou vertébré selon l'une quelconque des revendications précédentes, où le génome comprend VH3-7*01, JH6*02 (éventuellement recombiné avec le VH3- 7*01), VK2-28*01 et JK4*01 (éventuellement recombiné avec le VK2-28*01).
11. Cellule ou vertébré selon l'une quelconque des revendications précédentes, le locus de chaîne lourde comprenant en outre la totalité des segments de gènes de chaîne lourde supplémentaires du tableau 7.
12. Cellule ou vertébré selon l'une quelconque des revendications précédentes, le locus de chaîne lourde comprenant la totalité des segments de gènes du tableau 1.
13. Cellule ou vertébré selon l'une quelconque des revendications précédentes, le locus de chaîne lourde comprenant la totalité des segments de gènes du tableau 2.
14. Cellule ou vertébré selon l'une quelconque des revendications précédentes, le locus de chaîne lourde comprenant la totalité des segments de gènes du tableau 3.
15. Cellule ou vertébré selon l'une quelconque des revendications précédentes, le locus de chaîne lourde comprenant la totalité des segments de gènes du tableau 4. 184. Cellule ou vertébré selon l'une quelconque des revendications précédentes, le locus de chaîne lourde comprenant la totalité des segments de gènes du tableau 5. 17. Cellule ou vertébré selon l'une quelconque des revendications précédentes, le locus de chaîne lourde comprenant la totalité des segments de gènes du tableau 6. 18. Cellule ou vertébré selon l'une quelconque des revendications précédentes, le locus de chaîne légère comprenant en outre la totalité des segments de gènes de chaîne légère supplémentaires du tableau 12. 19. Cellule ou vertébré selon l'une quelconque des revendications précédentes, le locus de chaîne légère comprenant la totalité des segments de gènes du tableau 8. 20. Cellule ou vertébré selon l'une quelconque des revendications précédentes, le locus de chaîne légère comprenant la totalité des segments de gènes du tableau 9. 21. Cellule ou vertébré selon l'une quelconque des revendications précédentes, le locus de chaîne légère comprenant la totalité des segments de gènes du tableau 10. 22. Cellule ou vertébré selon l'une quelconque des revendications précédentes, le locus de chaîne légère comprenant la totalité des segments de gènes du tableau 11. 23. Cellule ou vertébré selon l'une quelconque des revendications précédentes, le locus de chaîne légère comprenant la totalité des segments de gènes du tableau 7 et la totalité des segments de gènes du tableau 12. 24. Cellule ou vertébré selon l'une quelconque des revendications précédentes, où la cellule est un hybridome ou une cellule B (par exemple, une cellule B immortalisée). 25. Vertébré ou cellule selon l'une quelconque des revendications précédentes, où les chaînes lourdes d'immunoglobulines exprimées par la souris sont essentiellement exclusivement lesdites chaînes lourdes comprenant des régions variables humaines ; et lesdites chaînes lourdes comprenant des régions variables humaines sont exprimées comme partie des anticorps IgG1, IgG2b et IgM (et éventuellement IgG2a) sériques. 26. Procédé de production d'un anticorps ou d'un fragment de liaison d'un antigène de celui-ci, le procédé comprenant l'immunisation d'un vertébré selon les revendications 2 à 25 avec un antigène et la récupération de l'anticorps ou du fragment ou la récupération d'une cellule produisant l'anticorps ou le fragment ; en modifiant éventuellement l'anticorps ou le fragment produit de telle manière qu'il comprend des régions constantes humaines. 185. Procédé de production d'un anticorps ou d'un fragment de liaison d'un antigène de celui-ci, le procédé comprenant l'isolement d'un anticorps ou d'un fragment de liaison d'un antigène de celui-ci à partir d'une cellule selon l'une quelconque des revendications 1 et 3 à 25 ; et éventuellement la modification de l'anticorps ou du fragment isolé de telle manière qu'il comprend des régions constantes humaines. 28. Procédé selon la revendication 26 ou la revendication 27, comprenant en outre (a) l'isolement à partir du vertébré d'une cellule B codant pour un anticorps qui lie l'antigène, (b) l'identification ou la copie d'une séquence nucléotidique de la cellule B qui code pour un domaine VH de l'anticorps et/ou l'identification ou la copie d'une séquence nucléotidique de la cellule B qui code pour un domaine VL de l'anticorps ; et (c) l'utilisation de la ou des séquences pour produire un anticorps ou un fragment isolé comprenant le domaine VH et/ou VL ; éventuellement où l'anticorps ou le fragment isolé comprend des régions constantes humaines. 29. Procédé selon l'une quelconque des revendications 26 à 28, dans lequel l'anticorps ou le fragment est produit par expression à partir d'une cellule hôte choisie parmi une cellule CHO, HEK293, Cos ou de levure (par exemple, Pichia). 30. Procédé selon l'une quelconque des revendications 26 à 29, comprenant en outre la formulation de l'anticorps ou du fragment avec un diluant, un support, un excipient ou un médicament pour produire une composition pharmaceutique pour un usage médical chez les êtres humains, éventuellement comprenant en outre le conditionnement de la composition dans un récipient stérile, par exemple, un flacon, un tube, une poche IV ou une seringue, en produisant éventuellement en outre un kit comprenant la combinaison du conditionnement avec une étiquette ou des instructions indiquant l'utilisation de la composition de l'anticorps pour un usage médical chez les êtres humains ; éventuellement où l'étiquette ou les instructions comprennent un numéro de lot de médicament et/ou un numéro d'autorisation de commercialisation, éventuellement en outre un numéro d'autorisation de commercialisation émis par l'EMA ou la FDA. 31. Procédé selon l'une quelconque des revendications 26 à 30, dans lequel le vertébré est selon l'une quelconque des revendications 2 à 25 et l'anticorps ou le fragment produit par le procédé comprend (a) un domaine variable de chaîne lourde humaine est un recombinant de JH2*01 humain ou de JH6*02 humain, d'un ou de plusieurs segments de gènes VH humains 186et d'un ou de plusieurs segments de gènes D humains ; et (b) un domaine variable de chaîne légère humaine est un recombinant de JK2*01 humain ou de JK4*01 humain et d'un ou de plusieurs segments de gènes VK humains. 32. Procédé selon la revendication 31, dans lequel l'anticorps le fragment produit par le procédé comprend un domaine variable de chaîne lourde humaine recombinant de VH3-23*04 et JH2*01 et un domaine variable de chaîne légère humaine recombinant de W4-1*01 et Jk2*01. 33. Procédé selon la revendication 31, dans lequel l'anticorps ou le fragment produit par le procédé comprend un domaine variable de chaîne lourde humaine recombinant de VH3-7*01 et JH6*02 et un domaine variable de chaîne légère humaine recombinant de Vk2-28*01 et JK4*01. 34. Anticorps ou fragment de liaison d'un antigène de celui-ci isolé obtenu ou pouvant être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 26 à 33, où un domaine variable de chaîne lourde et/ou légère de l'anticorps du fragment comprend une ou plusieurs mutations somatiques provoquées par la désaminase induite par activation (AID) de souris ou de rat et/ou une ou plusieurs mutations jonctionnelles provoquées par la désoxynucléotidyl-transférase terminale (TdT) de souris ou de rat. 35. Anticorps ou fragment de liaison d'un antigène de celui-ci isolé obtenu ou pouvant être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 26 à 33, ou anticorps selon la revendication 34 comprenant un fragment Fc de chaîne lourde humaine, éventuellement qui lie un récepteur gamma, et en outre éventuellement une chaîne légère constante humaine. 36. Anticorps ou fragment de liaison d'un antigène de celui-ci isolé obtenu ou pouvant être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 26 à 33, ou anticorps selon la revendication 34 ou la revendication 35 comprenant un site de liaison d'un antigène capable de se lier spécifiquement à un virus ou à un antigène choisi parmi une cytokine, un facteur de croissance, une hormone, une enzyme et une protéine sérique de l'être humain. 37. Anticorps ou fragment de liaison d'un antigène de celui-ci isolé obtenu ou pouvant être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 26 à 33, ou anticorps selon l'une quelconque des revendications 34 à 36, où ledit anticorps ou 187e fragment est glycosylé, comprenant éventuellement la glycosylation des cellules CHO, HEK293, Cos ou de levure (par exemple, Pichia). 38. Anticorps ou fragment de liaison d'un antigène de celui-ci isolé, où les domaines variables dudit anticorps sont codés par (a) les segments de gènes humains JH2*01 ou JH6*02 et un ou plusieurs segments de gènes VH humains et un ou plusieurs segments de gènes D humains ; et (b) les segments de gènes humains JK2*01 ou JK4*01 et un ou plusieurs segment de gènes VK humains. 39. Anticorps selon la revendication 38, où les domaines variables sont codés par les segments de gènes humains (i) JH2*01 et VH3-23*04 pour le domaine VH et (ii) Vk4-1*01 et JK2*01 pour le domaine VL. 40. Anticorps selon la revendication 38, où les domaines variables sont codés par les segments de gènes humains (i) JH6*02 et VH3-7*01 pour le domaine VH et (ii) Vk2- 28*01 et Jk4*01 pour le domaine VL. 41. Anticorps ou fragment de liaison d'un antigène de celui-ci isolé selon l'une quelconque des revendications 34 à 40, où l'anticorps est humanisé. 42. Composition comprenant un anticorps ou un fragment selon l'une quelconque des revendications 34 à 41, où l'anticorps ou le fragment est le seul agent thérapeutique. 43. Composition comprenant un anticorps ou un fragment selon l'une quelconque des revendications 34 à 41, comprenant en outre un agent thérapeutique supplémentaire, par exemple, un médicament antihypercholestérolémiant. 44. Anticorps ou fragment isolé produit par le procédé selon l'une quelconque des revendications 26 à 33 ou anticorps ou fragment isolé selon l'une quelconque des revendications 34 à 41 pour une utilisation médicale chez les êtres humains. 45. Utilisation de l'anticorps ou du fragment isolé produit par le procédé selon l'une quelconque des revendications 26 à 33 ou de l'anticorps ou du fragment isolé selon l'une quelconque des revendications 34 à 41 dans la fabrication d'un médicament pour un usage médical chez les êtres humains. 46. Utilisation selon la revendication 45, où le médicament est compris par une composition ou un kit tel que cité dans la revendication 30. 188. Cellule hôte, par exemple une cellule CHO, HEK293, Cos ou de levure (par exemple, Pichia), exprimant un anticorps ou un fragment tel que défini dans l'une quelconque des revendications 34 à 41. 189