FR2971159A1 - Utilisation cosmetique d'un principe actif agissant sur les cellules souches cutanees, principe actif utilise et procede d'obtention d'un principe actif adapte - Google Patents

Abstract

L'objet de l'invention est l'utilisation d'un extrait actif de pois, riche en protéines, à des fins cosmétiques agissant simultanément, en combinaison, sur les marqueurs que sont la protéine p63, l'intégrine α6 et la clonogénicité des cellules souches kératinocytaires. Procédé d'obtention et applications cosmétiques.

Description

UTILISATION COSMETIQUE D'UN PRINCIPE ACTIF AGISSANT SUR LES CELLULES SOUCHES CUTANÉES, PRINCIPE ACTIF UTILISE ET PROCEDE D'OBTENTION D'UN PRINCIPE ACTIF ADAPTE

La présente invention concerne une utilisation cosmétique d'un principe actif agissant sur les cellules souches cutanées de l'épiderme. L'invention vise également le principe actif utilisé et le procédé d'obtention d'un principe actif adapté.

L'épiderme est soumis à un renouvellement perpétuel, nécessaire à son homéostasie, ceci grâce à un équilibre entre la prolifération et la différentiation des kératinocytes qui constituent la majorité des constituants de la couche superficielle de la peau. Le renouvellement permanent de l'épiderme est obtenu par la génération de 10 cellules basales prolifératives à partir de cellules souches localisées dans la couche basale de l'épiderme. Chaque cellule souche génère une cellule souche fille et une cellule en amplification transitoire. La cellule souche fille renouvelle les cellules souches tandis que la cellule en amplification transitoire se détache de la membrane 15 basale pour migrer vers la surface cutanée, renouvelant de façon continuelle l'épiderme. C'est au sein de la membrane basale que l'on trouve les cellules souches kératinocytaires. Des signaux extrinsèques assurent l'équilibre entre l'état de quiescence et 20 d'activation.

Par contre, il n'a été identifié, au jour de la présente demande, aucun marqueur spécifique des cellules souches kératinocytaires. Afin de distinguer ces cellules kératinocytaires des cellules en amplification transitoire, il faut se baser sur des critères fonctionnels.

Les cellules souches kératinocytaires présentent trois caractéristiques majeures: A. Potentiel d'auto renouvellement des cellules souches. Elles ont une capacité à former in vitro des colonies plus importantes que les cellules en amplification transitoire. Or le comportement clonogénique des cellules est corrélé à leur propriété d'adhésion elles-mêmes dépendantes de l' intensité de l' intégrine p1. B. Fort potentiel d'adhésion à la membrane basale. Les cellules souches kératinocytaires sont caractérisées par des marqueurs leur conférant une forte capacité à adhérer à la membrane basale comme l' intégrine a6 Cette forte adhésion à la membrane basale leur permet de maintenir leur caractère souche d'une part et de rester dans une zone particulièrement adaptée mais aussi de réguler leur survie et leur prolifération. La sous-régulation des cellules souches kératinocytaires est une des caractéristiques qui amènent les cellules souches à se comporter comme des cellules en amplification transitoire. C. Le maintien de l'état progéniteur indifférencié des cellules souches kératinocytaires et le potentiel d'auto-renouvellement des cellules souches repose sur un facteur de transcription, le p63. Ainsi l' isoforme ~Np63 est majoritairement localisé dans la couche basale, son expression est forte dans les cellules souches et moindre dans les cellules en amplification transitoire et absente des cellules supra-basales.

Ainsi, cette atteinte conduit à une altération de la capacité des cellules souches kératinocytaires à s'activer et à générer une descendance suffisante de cellules en amplification transitoire d'abord et en cellules différenciées ensuite. Le renouvellement de la peau est de ce fait limité et constitue un des aspects principaux du vieillissement. Le vieillissement extrinsèque est communément admis, notamment lié au microenvironnement local. Une altération du microenvironnement local des cellules souches et une altération des signaux émis sont une hypothèse avancée. Les modifications de l'environnement des cellules souches kératinocytaires sont à l'origine du vieillissement extrinsèque, notamment l'action délétère des radiations UV. Le taux d' intégrine p1 est réduit dans les cellules souches de peaux âgées. L'expression de ~Np63 diminue dans les kératinocytes basaux après irradiation aux UVB.

Ainsi l'altération du phénotype des cellules souches induit par le vieillissement extrinsèque et notamment les UVB engendre une dégradation de leur fonctionnalité et donc conduit à une diminution des capacités régénératives de l'épiderme. La présente invention vise l'utilisation d'un principe actif pour un traitement cosmétique agissant sur les cellules souches cutanées, plus particulièrement les cellules souches kératinocytaires. Le but est de préserver la fonctionnalité des cellules souches kératinocytaires de façon à assurer le renouvellement de l'épiderme en atténuant les premières rides, en améliorant la texture de la peau et en ravivant l'éclat du teint, signe visible de jeunesse et de bonne santé.

L'invention vise aussi un procédé d'obtention d'un principe actif destiné à agir sur les cellules souches kératinocytaires de façon à préserver leur fonctionnalité. Le procédé utilise comme matière première la variété de pois Pisum sativum.

L'invention vise un principe actif susceptible de répondre à cet objectif, en montrant quelle est la fraction active de l' hydrolysat peptidique Pisum sativum.

I/ Procédé d'obtention d'un principe actif selon la présente invention, 5 notamment à partir de Pisum sativum. Le procédé d'obtention du principe actif selon la présente invention consiste en la succession des étapes suivantes : - Solubilisation de poudre de graines de pois dans l'eau, - Hydrolyse enzymatique à l'aide d'au moins une enzyme, 10 - Séparation des phases soluble et insoluble, - Inactivation des activités enzymatiques par traitement thermique, - Filtration successives, - Récupération de l'ultrafiltrat, concentration, - Filtration et filtration stérilisante. 15 Exemple 1 de mise en oeuvre du procédé : - Solubilisation de la poudre de graines de Pisum sativum dans l'eau, - Hydrolyse enzymatique à l'aide d'une protéase, - Séparation des phases soluble et insoluble, 20 - Inactivation des activités enzymatiques par traitement thermique - Filtration au filtre presse et filtration stérilisante. Exemple 2 de mise en oeuvre du procédé : - Solubilisation de la poudre de graines de Pisum sativum dans l'eau, 25 - Hydrolyse enzymatique à l'aide de trois enzymes : 2 protéases et une endo-protéase, - Séparation des phases soluble et insoluble, - Inactivation des activités enzymatiques par traitement thermique - Filtration au filtre presse et filtration stérilisante.

Exemple 3 de mise en oeuvre du procédé : - Solubilisation de la poudre de graines Pisum sativum dans l'eau, - Hydrolyse enzymatique à l'aide d'une endo-peptidase, - Séparation des phases soluble et insoluble, - Inactivation des activités enzymatiques par traitement thermique - Filtration au filtre presse et filtration stérilisante.

Dans les trois exemples ci-dessus, préférentiellement la solubilisation est réalisée à raison de 100 g/I de graines de Pisum sativum.

II/ Caractérisation du principe actif : 1. La matière sèche 2. Le pH 3. Les protéines 4. Les carbohydrates 5. Les cendres 6. Hydrolysats peptidiques 2-1/ Quantification de la matière sèche Le taux de matières sèches des principes actifs selon l'invention est mesuré par passage à l'étuve à 105°C en présence de sable d'un échantillon de poids initial donné jusqu'à l'obtention d'un poids constant. Les essais conduits avec les échantillons des exemples précédents ont conduit à des valeurs comprises entre 20 et 67 g/I, plus particulièrement 32 et 50 g/I. 2-2/ pH Le pH est mesuré par la méthode potentiométrique à température ambiante et peut être compris entre 5,5 et 8,0 préférentiellement entre 6,0 et 7,0. 2-3/ Protéines 2-3-1/ Détermination de la teneur en protéines Les protéines sont dosées par la méthode de LOWRY (Lowry et al. Protein measurement with the Folin reagent, J. Biol. Chem, 193, 265-275,1951).

Le réactif de Folin donne une coloration bleue avec certains acides aminés. La coloration obtenue est comparée à celle d'une courbe établie avec un sérum étalon. La teneur en protéines totales est comprise entre 15 et 51 g/I, préférentiellement comprise entre 24 et 38g/I.

La teneur en protéines peut être exprimée en pourcentage par rapport à la matière sèche, elle est donc préférentiellement supérieure à 60% en poids par rapport à la matière sèche. 2-3-2/ Caractérisation des protéines La détermination de la masse molaire des protéines est étudiée par exclusion 15 stérique FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography). Le profil chromatographique obtenu montre, lors d'une mesure d'absorbance à 280nm d'un éluat obtenu par passage sur colonne que la caractérisation de la fraction protéique est composée de peptides de masses molaires : - inférieures à 2000 Da, pour une valeur supérieure à 50%, en l'occurrence 20 77% - comprises entre 5000 et 2000Da, supérieure à 10%, en l'occurrence 22% - supérieures à 5000Da, pour 1%.

2-4/ Carbohydrates 25 2-4-1 Détermination de la teneur en carbohydrates Le dosage de la teneur en sucres totaux peut être réalisé par la méthode de DUBOIS (DUBOIS M. et al., (1956), Analytical chemistry, 28, n°, p. 350-356). En présence d'acide sulfurique concentré et de phénol, les sucres réducteurs donnent un composé jaune orangé. A partir d'une gamme étalon, on peut déterminer le taux de sucres totaux d'un échantillon. La teneur en sucres totaux des principes actifs selon la présente invention peut aussi être exprimée en pourcentage par rapport à la matière sèche.

Elle est inférieure à 20%.

2-4-2 Caractérisation des carbohydrates Les masses molaires des carbohydrates présents dans les principes actifs selon l'invention sont déterminées grâce à la chromatographie en phase liquide haute 1 o performance (CLHP). On obtient une masse molaire de carbohydrates récapitulée dans le tableau qui suit . Masse Molaire Degré Taux (Da) Polymérisation Carbohydrates Monosaccharides MM 180 DP 1 32% Oligosaccharides 180 < MM < 2700 DP1 < DP <_ DP15 68% Leur composition en sucres simples est déterminée par chromatographie liquide 15 ionique. Le taux de chaque sucre est déterminé au moyen d'une gamme étalon du sucre synthétique étudié de 10 à 50 mg/ml pour les oses neutres et de 20 à 100 mg/ml pour l'acide galacturonique.

Le tableau ci-après récapitule les résultats obtenus : Type de sucre Proportion Glucose 45,3 Galactose 30,7 Sucrose 24,0 20 Le principe actif a été analysé avant et après hydrolyse acide. L'hydrolyse acide coupe toutes les liaisons entre les carbohydrates et ceci permet de déterminer la nature et le taux de sucres libres et de sucres présents sous forme d'oligosaccharides dans les principes actifs.

La fraction glucidique des principes actifs selon l'invention est constituée de : - 68% d'oligosaccharides contenant majoritairement du glucose et du galactose de degré de polymérisation compris entre 2 et 15, - 32% de sucres libres représentés par le sucrose. 2-5/ Cendres La détermination de la teneur en cendres est réalisée par la pesée des résidus issus del' incinération à 550°C dans un four à moufle électrique. Le programme prévoit de placer 5g de principe actif dans un creuset avec un premier palier de 3h à 110°C et un deuxième palier de 9h à 550°C.

Quand les cendres sont blanches, le creuset est pesé après refroidissement et maintenu dans un dessiccateur. La teneur en cendres peut aussi être exprimée en pourcentage par rapport à la matière sèche. Elle est préférentiellement inférieure à 20%. 2-6/ Hydrolysats peptidiques 2-6-1 Caractérisation des hydrolysats peptidiques de pois Exemple 1 : - Teneur en matières sèches : 42,6 g/I - Teneur en protéines : 33,6 g/I, soit 79% de protéines par rapport à la matière sèche.

Exemple 2 - Teneur en matières sèches : 65,6 g/I - Teneur en protéines : 51,0 g/I, soit 78% de protéines par rapport à la matière sèche. Exemple 3 - Teneur en matières sèches : 45 g/I - Teneur en protéines : 38,2 g/I, soit 85% de protéines par rapport à la matière sèche. 2-6-2 Identification de la fraction active Afin de déterminer la fraction majoritairement active du principe actif selon l'invention, une étude a été réalisée. Cette étude consiste à fractionner les espèces moléculaires du principe actif selon l'invention : - Premier fractionnement : - fraction A constituée de carbohydrates neutres, obtenue par purification par adsorption successive des composés cationiques puis anioniques sur des résines ioniques, - fraction B constituée d'une fraction peptidique, obtenue par adsorption / élution sur une résine échangeuse de cations. - Second fractionnement : - fraction C contenant les peptides de masses molaires inférieures à 2000 Da - fraction D contenant les peptides de masses molaires supérieures à 2000 Da

Trois études sont ensuite réalisées : A. Effet des fractions A et B, sur la synthèse de p63 sur cellules souches kératinocytaires stressées par soumission aux UVB, par Western Blot ; B. Effet des fractions C et D, sur la synthèse de p63 sur cellules souches kératinocytaires stressées par soumission aux UVB par Western Blot ; C. Effet des hydrolysats peptidiques de pois des exemples 1, 2 et 3 sur la capacité de clonogénicité des cellules kératinocytaires. A/ Effet des fractions A et B Les résultats sont présentés dans le tableau suivant. Ratio p63/ actine Efficacité / Témoin (%) Témoin 0,47 Principe actif 0,50% 0,64 + 36 Fraction A 0,5% 0,44 0 Fraction B 0,5% 0,60 + 28 Testé à 0,5%, le principe actif selon l'invention stimule la synthèse de p63 des cellules souches épidermiques stressées par soumission aux UVB.

La fraction A n'est pas efficace. Par conséquent, c'est la fraction B qui confère au principe actif selon l'invention son efficacité sur la synthèse de p63 des cellules souches épidermiques stressées UVB. L'analyse de la fraction B montre qu'elle contient l'ensemble des peptides du 15 principe actif selon l'invention.

B/ Effet des fractions C et D Les résultats sont présentés dans le tableau suivant. Ratio p63/ actine Efficacité / Témoin (%) Témoin 0,47 principe actif 0,5% 0,64 +36 Fraction C 0,5% 0,62 +32 Fraction D 0,5% 0,36 0 Il Testé à 0,5%, le principe actif selon l'invention stimule la synthèse de p63 des cellules souches épidermiques stressées UVB. La fraction D n'est pas efficace. Par conséquent, c'est la fraction C qui confère au principe actif selon l'invention 5 son efficacité sur la synthèse de p63 des cellules souches épidermiques stressées par soumission aux UVB. L'analyse de la fraction C montre qu'elle est constituée de peptides de masses molaires comprises majoritairement entre 2000 Da et 5000 Da.

1 o C/ Effet des exemples 1, 2 et 3 Les résultats sont présentés dans le tableau suivant : Capacité de la clonogénicité Hydrolysat peptidique Exemple 1 +++ Hydrolysat peptidique Exemple 2 0 Hydrolysat peptidique Exemple 3 + Les hydrolysats peptidiques de pois des exemples 1 et 3 augmentent la capacité 15 de clonogénicité sur cellules kératinocytaires. Par contre, l'hydrolysat peptidique de pois de l'exemple 2 ne présente pas d'efficacité sur la capacité de clonogénicité sur cellules kératinocytaires.

Ainsi, des hydrolysats peptidiques, obtenus à partir de procédés différents, 20 présentent des structures peptidiques différentes et leurs activités sur la capacité de clonogénicité sont différentes.

III/ Effets du principe actif sur les marqueurs Comme il n'existe pas de marqueur spécifique unique des cellules souches kératinocytaires, il est retenu une combinaison de trois marqueurs choisis pour caractériser les cellules souches kératinocytaires et pour analyser les effets du principe actif selon la présente invention : - la clonogénicité, capacité d'auto-renouvellement des cellules - l' intégrine a6 , nécessaire à l'adhésion des cellules à la membrane basale - La protéine p63 , facteur de protection des cellules souches. 3-1/ Préparation des cellules et comparaison des types de cellules Les kératinocytes utilisés sont isolés à partir de plasties de peaux humaines. Les cellules souches épidermiques (CS) sont séparées des cellules en amplification transitoire (TA) par sélection sur collagène IV.

L'objectif est de quantifier le niveau de synthèse des trois marqueurs entre les cellules souches normales, les cellules en amplification transitoire et les kératinocytes normaux.

Le tableau suivant résume les différents résultats : Kératinocytes Cellules souches Cellules en Comparaison normaux kératinocytaires amplification TA/CS transitoire Capacité 1,05 1,99 0,73 -63% clonogénique (DO) Intégrine a6 (%) 80 93 74 -20% p63 0,67 0,97 0,69 -28% (ratio p63/actine) 20 La comparaison montre que la capacité clonogénique et les synthèses d'intégrine a6 et de protéine p63 des cellules souches sont significativement supérieures à celles des cellules en amplification transitoire. Cette étude confirme l'isolation de deux populations cellulaires distinctes : les 5 cellules souches kératinocytaires et les cellules en amplification transitoire.

3-2/ Comparaison des cellules souches normales ou stressées : Le but est de quantifier le niveau de synthèse des trois marqueurs entre les cellules souches normales et les cellules souches stressées et les effets des 1 o principes actifs selon l' invention. Une partie des cellules souches est stressée par irradiation aux UVB On constate la diminution importante de synthèse des marqueurs après irradiation comme le confirme le tableau qui suit. Cellules souches Cellules souches Variations kératinocytaires kératinocytaires normales après UVB Capacité Clonogénique (DO) 1,99 0,26 -87% Intégrine a6 (°/0) 93 75 -19% p63 (Ratio p63/actine) 0,97 0,47 -52% 15 3-3/ Capacité du principe actif à agir sur la capacité clonogénique Cette étude est réalisée sur des cellules souches kératinocytaires avec le principe actif de l'exemple 1, à deux dosages 0,25 et 0,50% en volume. Les cellules sont irradiées par soumission aux UVB à 20 mJ/cm2. 20 Les cellules sont ensuite trypsinées et réensemencées en plaques à puits. Les cellules cultivées sont fixées au glutaraldéhyde et colorées au crystal violet.

La densité optique est lue à 540 nm à l'aide d'un spectrophotomètre.

Les résultats sont contenus dans le tableau suivant : Densité optique Efficacité / Témoin (%) Cellules souches kératinocytaires normales Témoin 1,99 - Principe actif 0,25% 1,84 0 Principe actif 0,50% 2,37 +19 Cellules kératinocytaires stressées UVB Témoin 0,27 - Principe actif 0,25% 0,31 +15 Principe actif 0,50% 0,40 +48 La capacité clonogénique des cellules souches kératinocytaires stressées par soumission aux UVB est réduite de 87% par rapport aux cellules souches kératinocytaires normales. Le principe actif dès 0,5% augmente la capacité clonogénique des cellules 10 souches kératinocytaires stressées de 48%.

3-4/ Capacité du principe actif à stimuler la synthèse des intégrines a6 sur expiants de peaux humaines Le but est d'évaluer l'effet du principe actif selon l'invention sur la synthèse 15 des intégrines a6, nécessaire à l'adhésion des cellules souches à la membrane basale. Des expiants de peaux humaines normaux et stressés sont analysés. La visualisation est obtenue après immunohistofluorescence.

Des punchs sont réalisés à partir de plasties humaines, ces expiants de peaux sont pré traités topiquement avec le principe actif ou placebo selon la présente invention avec deux dosages : - 0,50% en volume - 1,00% en volume puis stressés par irradiation aux UVB en l'occurrence à 200 mJ/cm2. Les échantillons sont marqués immunohistologiquement puis l'analyse est effectuée par mesure de la fluorescence proportionnelle à la synthèse d' intégrine a6. 1 o Les résultats sont contenus dans le tableau suivant : Intégrine a6 Efficacité / Témoin (%) Expiants normaux Témoin 4256 - Principe actif 1,00% 5601 +32 Expiants stressés UVB Témoin 2802 - Principe actif 0,50% 3129 +12 Principe actif 1,00% 3709 +32 Le stress aux UVB provoque une diminution de la synthèse des intégrines. On constate que le principe actif selon la présente invention permet d'augmenter 15 la synthèse des intégrines de 32%, comparé au témoin des expiants stressés.

3-5/ Capacité du principe actif à stimuler la synthèse de p63 sur cellules souches kératinocytaires Le but est de déterminer la capacité du principe actif à stimuler la synthèse de 20 p63 sur cellules souches, facteur indispensable de leur protection.

Des cellules souches isolées sont prétraitées avec le principe actif avec deux dosages: - 0,25% en volume - 0,50% en volume 5 puis irradiées aux UVB en l'occurrence à 20 mJ/cm2. Les cellules sont préparées et dosées en Western Blot. Le résultat est exprimé par un ratio de la quantité de protéine cible (p63) sur la quantité de protéine référence (Active). Les résultats sont contenus dans le tableau suivant : 10 Ratio p63/actine Efficacité / Témoin (%) Cellules souches kératinocytaires normales Témoin 0,97 - Principe actif 0,25% 1,39 +43 Principe actif 0,50% 1,36 +40 Cellules souches kératinocytaire stressées UVB Témoin 0,47 - Principe actif 0,25% 0,61 +30 Principe actif 0,50% 0,68 +45 On constate une augmentation de 45% de la synthèse de p63 avec le principe actif à 0,50% sur les cellules souches alors que l'exposition aux UVB avait diminué fortement la synthèse dans l'échantillon témoin des cellules stressées. 3-6/ Capacité du principe actif à stimuler la synthèse de p63 sur expiants de peaux humaines Des expiants de peaux humaines normaux et stressés par soumission à des UVB sont analysés. 15 Ces expiants de peaux, sous forme de punchs maintenus en survie dans un milieu de culture, sont pré traités topiquement avec le principe actif selon la présente invention ou placebo avec trois dosages : - 0,50% en volume - 1,00% en volume puis irradiés aux UVB en l'occurrence à 200 mJ/cm2. Les échantillons sont marqués immunohistologiquement puis l'analyse est effectuée par mesure de la fluorescence proportionnelle à la synthèse de la protéine p63. 1 o Les résultats sont contenus dans le tableau suivant : p63 Efficacité / Témoin (%) (Moyenne intensité fluorescence 103 x UA) Expiants normaux Témoin 4976 - Principe actif 1,00% 5876 +18 Expiants stressés UVB Témoin 2170 - Principe actif 0,50% 2348 +8 Principe actif 1,00% 4024 +85 On constate une augmentation de 85% de la synthèse de p63 sur cellules stressées, comparé au témoin stressé.

IV/ Etudes d'efficacité in vivo : 4-1/ Evaluation des effets sur le renouvellement cellulaire après application du principe actif formulé L'objectif est de vérifier les effets du principe actif contre placebo sur le renouvellement cellulaire au sein d'un panel de volontaires de sexe féminin. Les mesures de couleur de la peau ont été réalisées après coloration à la dihydroxyacétone au niveau du ventre tous les deux jours pendant 15 jours d'applications biquotidiennes au niveau du ventre.

Les mesures sont effectuées à l'aide d'un chromamètre du commerce qui convertit les couleurs en un code numérique comprenant trois paramètres : - L* : représente la clarté - a* : représente la gamme des verts aux rouges - b* : représente la gamme des bleus aux jaunes 15 a* et b* sont des paramètres dits de chrominance et L* de luminance.

Pour le test présent, le paramètre b* est retenu puisqu'il est représentatif de la pigmentation jaune mélanique cutanée. Plus le paramètre b* diminue, plus la peau s'éclaircit. 20 Le principe actif est testé à 3% dans une formule de gel émulsionné. Les résultats font l'objet du tableau suivant : J2-JO J4-JO J7-JO J9-JO J11-JO J15-JO Zone non traitée -1,12 -1,79 -3,57 -3,61 -4,86 -5,58 Placebo -1,01 -2,03 -4,11 -4,29 -4,81 -5,57 Principe actif -1,29 -2,39 -4,46 -4,64 -4,94 -5,52 Le principe actif selon la présente invention accélère le renouvellement cellulaire en diminuant plus rapidement le paramètre b* représentatif de la couleur jaune mélanique. 4-2/ Evaluation des effets sur le micro relief cutané après application du principe actif formulé L'objectif est d'évaluer in vivo contre placebo, l'effet lissant du principe actif selon la présente invention. Le panel de volontaires féminins est sélectionné en fonction de la présence de 10 rides légères et du teint terne. Aussi, le principe actif est formulé à 3% en émulsion contre placebo, appliqué au niveau des pattes d'oie. Des acquisitions en 3D par projection de franges de la patte d'oie sont réalisées avant et après 28 jours d'applications biquotidiennes. 15 L'analyse par projection de franges est réalisée par prises de vue au moyen d'une caméra haute définition et un éclairage adapté, associés à un système de repositionnement de sorte à prendre une image avant et après traitement d'une même zone, autorisant alors une comparaison. Les paramètres retenus sont les paramètres de rugosité en 3D incluant : 20 - Sq : moyenne quadratique de rugosité de surface Sa : moyenne arithmétique de rugosité de surface La diminution de l'un de ces paramètres est caractéristique d'un lissage de la surface étudiée.

Les résultats obtenus sont regroupés dans le tableau suivant : Variation/Placebo (%) Paramètre Sq - 4,2 (p = 0,0473) Paramètre Sa - 4,3 (p = 0,0342) Ainsi, les paramètres de rugosité sont diminués et le principe actif selon la présente invention conduit ainsi à limiter l'apparition des premières rides et participe ainsi à la prévention du vieillissement cutané.

4-3/ Evaluation des effets visuels de l'éclat du teint après application du principe actif formulé L'objectif est d'évaluer in vivo contre placebo, l'effet du principe actif selon la présente invention sur l'éclat du teint. L'éclat du teint est une notion admise par tous comme un symbole de jeunesse et une composante primordiale de beauté féminine. Cette notion repose principalement sur la couleur de la peau, l'uniformité de la surface, la luminosité ainsi que la microcirculation. Le panel de volontaires est sélectionné par la présence de rides légères et par le teint terne. Comme pour le test précédent, le principe actif selon la présente invention est formulé en émulsion à 3%, fait l'objet d'applications biquotidiennes et il est 20 testé contre placebo pendant 28 jours. L'évaluation du teint est réalisée en aveugle par deux experts préalablement entraînés à juger différents paramètres représentatifs de l'éclat du teint. Les paramètres analysés à partir d'échelles de scores (1 à 10) sont : - Grain de peau, ce qui correspond aux irrégularités de la peau, - Transparence de la peau, permettant d'apercevoir les veinules, plus la peau est fine et plus la lumière pénètre, donnant un effet bonne mine - Rayonnement de la peau, qui caractérise un teint éclatant, - Couleur olive, si la couleur olive diminue, l'effet bonne mine augmente, - L'état de fatigue des yeux, représentatif d'une peau plus ou moins reposée, - Appréciation globale du teint.

L'évaluation de ces paramètres s'effectue sur les zones pommettes, front, menton, et yeux : Variation /Placebo (%) Grain de la peau +12,2% (p=0,0003) Transparence +5,0% (p=0,0237) Rayonnement +13,0% (p=0,0005) Couleur olive -8,0% (p=0,0065) Etat de fatigue des yeux -5,2% (p=0,0031) Appréciation visuelle globale +13,2% (p=0,0015) Ainsi, notamment à travers le pourcentage de +13,2% pour l'appréciation visuelle 15 globale, le principe actif selon l'invention permet d'unifier et d'illuminer la peau révélant ainsi toute sa jeunesse. 4-4/ Evaluation subjective des effets ressentis après application du principe actif formulé L'objectif est de quantifier les sensations ressenties après application du principe actif selon la présente invention, formulé en émulsion à 3%, sous forme 5 d'applications biquotidiennes contre placebo, pendant 28 jours. Un panel de volontaires saines, de sexe féminin, est retenu, les volontaires étant sélectionnées pour la présence de rides légères et pour un teint terne. Les résultats sont établis à partir d'une auto-évaluation à questions fermées. Le résultat aux affirmations indiquées est récapitulé dans le tableau suivant : 10 Cumul des réponses "plutôt d'accord" et "d'accord" (°/0) Placebo (°/0) Principe actif p (significativité) Ma peau est revitalisée 65 90 0,0236 Ma peau est plus lumineuse 50 85 0,0054 Ma peau est régénérée 40 80 0,0023 Mes pattes d'oie sont lissées 45 80 0,0071 Mon grain de peau est affiné 65 95 0,0053 Mon teint est unifié 55 95 0,0005 Après 28 jours d'application biquotidienne, on note donc une amélioration sur les quatre points d'analyse retenus, que ce soit la revitalisation et régénération, le caractère lumineux de la peau mais aussi un lissage des pattes d'oie et une 15 amélioration du teint pour 95% des volontaires du panel.

V/ Formulations possibles du principe actif issu de Pisum sativum : Compositions cosmétiques de soin de la peau La présente invention couvre aussi les compositions cosmétiques incluant au 20 moins un principe actif issu de Pisum sativum, en particulier un principe actif tel que décrit précédemment, dans différentes formes galéniques, adaptées à l'administration par voie topique cutanée. Ces compositions peuvent se présenter notamment sous forme d'émulsions huiledans-eau, émulsions eau-dans-huile, émulsions multiples (Eau/Huile/Eau ou Huile/Eau/Huile) qui peuvent être éventuellement des microémulsions ou des nanoémulsions, ou sous forme de solutions, suspensions, hydrodispersions, gels aqueux ou poudres. Elles peuvent être plus ou moins fluides et avoir l'aspect d'une crème, d'une lotion, d'un lait, d'un sérum, d'une pommade, d'un gel, d'une pâte ou d'une mousse, ou sous forme solide.

Ces compositions sont préférentiellement des compositions contenant entre 0,01% et 20% en poids d'un des principes actifs issus de Pisum sativum, préférentiellement entre 1% et 3%. Ces compositions comprennent, outre l'actif, un milieu physiologiquement acceptable et de préférence cosmétiquement acceptable, c'est-à-dire qui ne provoque pas de sensations d'inconfort inacceptables pour l'utilisateur telles que des rougeurs, tiraillements ou picotements. Les compositions selon l'invention peuvent contenir comme adjuvant au moins un composé choisi parmi : - les huiles, qui peuvent être choisies notamment parmi les huiles de silicone, linéaires ou cycliques, volatiles ou non volatiles ; - les cires, telles que l'ozokérite, la cire de polyéthylène, la cire d'abeille ou la cire de carnauba ; - les élastomères de silicone, - les tensioactifs, de préférence émulsionnants, qu'ils soient non ioniques, anioniques, cationiques ou amphotères ; - les co-tensioactifs, tels que les alcools gras linéaires ; - les épaississants et/ou gélifiants, - les humectants, tels que les polyols comme la glycérine ; - les filtres organiques, - les filtres inorganiques, - les colorants, les conservateurs, les charges, - les tenseurs, - les séquestrants, - les parfums, - et leurs mélanges, sans que cette liste soit limitative. Des exemples de tels adjuvants sont cités notamment dans le Dictionnaire CTFA (International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook publié par le Personal Gare Product Council). Bien entendu, l'homme du métier veillera à choisir les éventuels composés complémentaires, actifs ou non-actifs, et/ou leur quantité, de telle sorte que les propriétés avantageuses du mélange ne soient pas, ou sensiblement pas, altérées par l'ad jonction envisagée.

Ces compositions sont notamment destinées à favoriser l'amélioration de la texture de la peau et le ravivement de l'éclat du teint. Des exemples de formulations cosmétiques sont maintenant donnés.

Exemples de formulations 5-1/ Formulation émulsion éclat du teint Isononyl isononanoate (Lanol 99, Seppic) 5,0% Arachidyl alcohol / Behenyl Alcohol / Arachidyl glucoside 4,0% (Montanov 202, Seppic) Principe actif selon l'invention 3,0% Cetearyl alcohol / cetearyl glucoside (Montanov 68, 2,0% Seppic) Conservateurs 0,7% Polyacrylamide / C13-14 isoparaffin / Laureth-7 (Sepigel 0,3% 305, Seppic) Eau qsp 100% 5-2/ Formulation crème de jour: 6lycerine 7% Rita IPM (Rita) 6% DUB CA (Stéarinerie Dubois) 2% Simulsol M45 (Seppic) 2,3% Montanox 60 (Seppic) 2% DUB SE& (Stéarinerie Dubois) 3% Conservateur 0,7% Principe actif selon l'invention 3% Eau Qsp 100% 5 -3/ Formulation gel transparent contour des yeux : Viscolam AT 64 (Rita 3,1% Glycérine 6% Stérol CC 5595 (Cesalpinia) 3,4% Simulsol 1292 DF (Seppic) 3,4% Phonoemulse 100 (Rita) 2,7% Principe actif selon l'invention 3,0% Conservateur 0,7% Eau Qsp 100% 5-4/ Formulation émulsion renouvellement cellulaire : Isononyl isononanoate (Lanol 99, Seppic) 7,0% Arachidyl alcohol / Behenyl Alcohol / Arachidyl glucoside 5,0% (Montanov 202, Seppic) Propylen glycol 4,0% Cetearyl Ethylhexanoate (Lanol 1688, Seppic) 4,0% Principe actif selon l'invention - exemple 1 3,0% PEG100 stearat / Glyceryl stearat (Simulsol 165, Seppic) 2,0% Glyceryl stearat (Rita GMS, RITA) 1,0% Cethyl alcohol (Rita CA, RITA) 1,0% Conservateurs 0,7% Eau qsp 100% -5/ Formulation gel émulsionné siliconé : Ultrez 21 (Novéon) 0.2% DUB SE 15P (Stéarinerie 2% Dubois) DC 200 (Dow Corning) 5% DC345 (Dow Corning) 3% DC 7310 (Dow Corning) 10% Conservateurs 0,7% Principe actif selon l'invention 3% Talc 3% NaOH Qsp pH 5 Eau Qsp 100%

Claims (12)

1. REVENDICATIONS1. Utilisation d'un extrait actif de pois, riche en protéines, à des fins cosmétiques dans une formulation cosmétique agissant sur les cellules souches kératinocytaires.
2. 2. Utilisation d'un extrait actif de pois, riche en protéines, à des fins cosmétiques dans une formulation cosmétique agissant simultanément, en combinaison, sur les marqueurs que sont la protéine p63, l'intégrine a6 et la clonogénicité des cellules souches kératinocytaires.
3. 3. Utilisation d'un extrait actif de Pisum sativum, riche en protéines, à des fins cosmétiques dans une formulation cosmétique agissant sur les cellules souches kératinocytaires.
4. 4. Utilisation de l'un des extraits actifs selon l'une des revendications 1, 2 ou 3, caractérisée en ce qu'il stimule la synthèse du marqueur p63.
5. 5. Utilisation de l'un des extraits actifs selon l'une des revendications 1, 2 ou 3, caractérisée en ce qu'il stimule la synthèse des intégrines a6.
6. 6. Utilisation de l'un des extraits actifs selon l'une des revendications 1, 2 ou 3, caractérisée en ce qu'il améliore la capacité clonogénique.
7. 7. Procédé d'obtention d'un extrait actif pour une utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : Solubilisation de poudre de graines de Pisum sativum dans l'eau, - Hydrolyse enzymatique à l'aide d'une protéase, - Séparation des phases soluble et insoluble, Inactivation des activités enzymatiques par traitement thermique Filtration au filtre presse et filtration stérilisante.
8. 8. Principe actif obtenu à partir du procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend un taux de protéines compris entre 15 et 51 g/I, préférentiellement comprise entre 24 et 38g/I.
9. 9. Principe actif obtenu à partir du procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend un taux de matières sèches compris entre 20 et 67 g/I, plus particulièrement 32 et 50 g/I.
10. 10. Principe actif obtenu à partir du procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la composition peptidique établie en masse molaire est la suivante : - Masses molaires inférieures à 2000 Da, supérieur à 50% - Masses molaires comprises entre 5000 et 2000Da, supérieur à 10%
11. 11. Formulation du principe actif selon l'une des revendications 8 à 10 sous forme de composition cosmétique telle que gel, émulsion ou crème, intégrant entre 0,01 et 20%, en poids d'un des principes actifs issus de Pisum sativum, préférentiellement entre 1% et 3%.
12. 12.A pplication biquotidienne du principe actif formulé selon la revendication 11, pour améliorer le grain de peau, la transparence de la peau, le rayonnement de la peau, pour diminuer la couleur olive de la peau et l'état de fatigue des yeux.