FR2956324A1 - Complexe vegetal comprenant un extrait polyphenolique de bambou - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet un complexe végétal comprenant un extrait polyphénolique de bambou, une préparation de cellules de Ginkgo biloba et une préparation huileuse de son de riz. Un procédé d'obtention d'un extrait polyphénolique de bambou, à l'état sec et stable, est également revendiqué. Le complexe obtenu par l'association de ces matières végétales est doté d'une excellente activité anti-oxydante, apte à une préparation dans les conditions industrielles, à une conservation durable sans perte d'activité, avec un niveau de toxicité réduit à son plus bas niveau. Le complexe végétal est utilisé pour la préparation de compositions destinées à la prévention et au traitement des signes du vieillissement cutané, dans les applications cosmétiques et dermatologiques.

Description

COMPLEXE VEGETAL COMPRENANT UN EXTRAIT POLYPHENOLIQUE DE BAMBOU La présente invention appartient au domaine compositions à base de végétaux utilisées contenant pour la prévention et le traitement des signes du vieillissement cutané, pour les applications cosmétiques et dermatologiques.

Elle a pour objet un complexe végétal comprenant un extrait polyphénolique de bambou, une préparation de cellules de Ginkgo biloba et une préparation huileuse de son de riz, ainsi qu'un procédé d'obtention d'un tel extrait à l'état sec et stable. Les compostions contenant ledit complexe végétal ainsi que leurs applications sont également objet de la présente invention.

Retarder le vieillissement, lutter contre ses effets délétères, allonger la durée de vie est un rêve partagé par beaucoup d'humains. Le rêve se transpose vers la recherche d'ingrédients ou de composés, naturels ou synthétiques, destinés au développement de produits pharmaceutiques, cosmétiques, alimentaires. Ces produits peuvent avoir une application à la santé et au bien-être humains mais aussi vétérinaire, car les propriétaires d'animaux domestiques et de compagnie souhaitent le même bénéfice pour leurs animaux.

La peau constitue un véritable organe comprenant plusieurs couches intégrées, allant de la couche superficielle, l'épiderme, jusqu'aux couches plus profondes, le derme et l'hypoderme, et chacune possède des propriétés spécifiques permettant à l'ensemble de réagir et de s'adapter aux conditions de son environnement.

L'épiderme, principalement composé de kératinocytes (30% des cellules épidermiques), de mélanocytes (2 à 3% des cellules épidermiques) et des cellules de Langerhans, a une épaisseur variable selon les différentes parties du corps. Il assure la protection et le maintien d'une bonne trophicité.

Le derme se compose principalement de collagène, d'élastine et de protéoglycanes. Les fibres de collagène, qui représentent 70% du poids sec du derme, assurent la résistance mécanique et la texture de la peau, l'élastine est responsable de l'élasticité, et les protéoglycanes jouent un rôle majeur de structure et d'hydratation de la peau. L'un des premiers signes de vieillissement de la peau est une perte d'élasticité et la formation de rides et de ridules, qui sont le résultat direct de la détérioration de la couche du derme de soutien. L'apparition de marques pigmentaires, la diminution de l'épaisseur de la peau et son affaissement sont également des changements observés au cours du vieillissement.

La capacité de la peau à remplacer le collagène endommagé diminue avec le temps, et des espaces et des irrégularités apparaissent dans le réseau du collagène. On, observe une diminution des synthèses protéiques (collagène, élastine), une diminution de la synthèse des protéoglycanes entre autres, ainsi qu'une diminution des métalloprotéinases de type MMP3.

Ces phénomènes, qu'il soient d'origine intrinsèque, ou extrinsèque, c'est-à-dire provoqués par l'environnement, sont généralement attribués à des modifications biologiques et physiologiques se manifestant par un stress oxydatif.

Le stress oxydatif se définit comme étant le résultat d'un déséquilibre dans l'organisme de la balance entre les pro-oxydants et les systèmes anti-oxydants de défense. En effet, des espèces oxygénées réactives sont produites en permanence par le métabolisme cellulaire au niveau de la mitochondrie. II est fréquent qu'une partie de cet oxygène échappe à la transformation complète et donne des espèces libres oxygénés, toxiques pour l'intégralité cellulaire, avec comme conséquence, l'apparition de dégâts souvent irréversibles pour la cellule. Des espèces libres oxygénées sont également générées par les méfaits de l'environnement (UV, pollution, radiations ionisantes, tabac, alcool, médicaments).

Pour lutter contre le vieillissement, il est donc nécessaire de lutter contre les radicaux libres, de maintenir la production des fibres de collagène, tout en diminuant le taux de MMP3. Cependant, tous les antioxydants ne jouent pas le même rôle dans notre organisme et n'agissent pas de la même façon. La présente invention a permis de sélectionner plusieurs ingrédients d'origine végétale, qui apportent leur contribution conjuguée pour fournir des actifs utiles à une lutte efficace contre l'action oxydante de ces radicaux libres.

L'ingrédient central de ce complexe est un extrait de bambou. On sait que le bambou est riche en orientine et homoorientine, qui possèdent des propriétés antioxydantes et anti- radicalaires puissantes. Cependant, l'obtention d'un extrait actif, non toxique et stable est problématique. La présente invention apporte une solution en offrant un procédé spécifique pour la préparation d'un extrait enrichi en composés polyphénoliques, stabilisé et qui présente une activité renforcée. Le second ingrédient est une préparation de cellules de Ginkgo biloba destinée à favoriser la pénétration des molécules actives à travers le derme. Elle agissent par biomimétisme, ce qui leur confère un rôle de vecteur correspondant à une encapsulation naturelle des molécules actives. Le troisième ingrédient est une huile de son de riz, choisie du fait de sa teneur élevée en acides gras insaturés qui lui permet de maintenir l'effet barrière de la peau et d'agir comme facteur d'amélioration de la pénétration.

L'association de ces matières végétales selon la présente invention permet de proposer un complexe doté d'une excellente activité anti-oxydante, apte à une préparation dans les conditions industrielles et à une conservation durable sans perte d'activité. Ce faisant, le niveau de toxicité est réduit à son plus bas niveau.

Ainsi, la présente invention a pour objet un complexe végétal destiné à la préparation d'une composition convenant pour une utilisation pharmaceutique, cosmétique ou nutritionnelle, et comprenant un extrait polyphénolique de bambou, une préparation cellulaire de Ginkgo Biloba et une préparation huileuse de son de riz.

II a été trouvé que certains genres de bambou présentent une activité antiradicalaire particulièrement intéressante, les feuilles étant les plus riches en substances actives. Ainsi, de manière préférée, dans le complexe végétal selon l'invention, l'extrait polyphénolique de bambou est obtenu à partir de feuilles de bambou choisi parmi les espèces Phyllostachys Nigra (bambou noir), Phyllostachys Pubescens (bambou géant), et Phyllostachys Viridis (bambou géant, parfois appelé aussi Phyllostachys sulferea).

Pour arriver à ce résultat intéressant, un certain nombre d'obstacles ont du être surmontés, en particulier pour obtenir un extrait de bambou ayant une activité antioxydante élevée et stabilisée, apte à être mis en oeuvre selon l'invention.

On connaît les travaux concernant des polyphénols, notamment les C-glycosides, présents dans les extraits de végétaux tels que le bambou ou encore des poacées (autrefois appelées graminées). En particulier, des extraits bruts lyophilisés obtenus à partir de feuilles de bambou noir (Phyllostachys Nigra) ou de bambou géant (Phyllostachys Pubescens ou Phyllostachys Viridis) se sont avérés avoir une activité anti- radicalaire tout à fait intéressante, qu'ils soient obtenus dans les conditions du laboratoire (quelques grammes) ou en conditions semi-industrielles (20 kg).

Cependant, malgré l'intérêt de l'extrait de bambou comme source de polyphénols antioxydants, il n'a pas été possible jusqu'à présent d'obtenir des extraits utilisables pour la préparation de compostions cosmétiques ou médicamenteuses. En effet, les extraits végétaux bruts obtenus par les méthodes conventionnelles présentent un certain nombre d'inconvénients, les rendant inaptes à leur préparation en conditions industrielles, à leur conservation même sous forme lyophilisée, et finalement à leur emploi pour les applications visées.

En l'espèce, alors que l'échantillon de laboratoire reste stable pendant un mois dans différentes conditions de stockage (avec/sans oxygène, avec/sans lumière, température ambiante/4°C), la poudre obtenue à plus grande échelle présente des problèmes de stabilités. La poudre, au départ de couleur vert clair, fonce et devient marron foncé. L'échantillon semble fondre comme du caramel, et une odeur forte de sucre brûlé se dégage alors de l'échantillon. Le reproductibilité n'est pas assurée, car certains extraits présentent également des activités médiocres.

Plus grave, les extraits testés présentent une toxicité sur la prolifération cellulaire à partir de 4 g/I, alors que la dose efficace a été évaluée à 5 g/l.

Les crèmes formulées avec ces extraits présentent également des problèmes de stabilité, notamment au niveau de la couleur : en quelques jours à température ambiante, la couleur de la crème vire du vert clair au jaune caca d'oie. L'apparition de petits grains marrons dans la masse est également observée.

Face à ces problèmes, il a été recherché un moyen de stabiliser l'extrait, afin qu'il conserve toutes ses propriétés et garde un aspect propre à son incorporation dans des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques. Il était impératif de s'affranchir en même temps du problème de toxicité et de garantir la reproductibilité des préparations.

Les mesures prises pour limiter les réactions dues à la présence d'eau et/ou favorisant l'activité enzymatique, pouvant conduire à une dégradation de l'extrait, n'ont pas permis d'aboutir à un résultat satisfaisant. En effet, si la durée de conservation de l'extrait a été améliorée, du moins pour autant qu'il était maintenu dans des conditions protectrices, il est apparu que dès qu'il était mis en contact avec l'atmosphère et soumis à des manipulations, une dégradation rapide des échantillons se produisait. II était donc illusoire d'espérer se servir d'un tel extrait pour la préparation de compositions complexes, en conditions industrielles.

Selon l'invention, un procédé d'extraction a été mis au point qui permet d'obtenir à partir de feuilles de Bambou noir, un extrait stabilisé, c'est-à-dire ayant des propriétés antiradicalaires et anti-oxydantes, non toxique aux doses préconisées, doté d'une stabilité autorisant sa mise en oeuvre dans des processus industriels avec une activité identique d'un lot à l'autre, et permettant la conservation des compositions le contenant durant plusieurs semaines sans modification de leur aspect et de leurs propriétés bénéfiques.

C'est pourquoi la présente invention se rapporte en particulier à un procédé d'obtention d'un extrait de bambou stabilisé, enrichi en polyphénols actifs, ainsi qu'à un extrait obtenu par ledit procédé. De manière inattendue, l'extrait enrichi s'est montré bien plus actif que l'extrait brut, et surtout beaucoup plus stable. Ce faisant, les doses efficaces ne présentent pas de toxicité sur les cultures cellulaires testées.

Est ainsi objet de la présente invention un procédé de préparation d'un extrait polyphénolique à partir de feuilles de bambou du genre Phyllostachys Nigra, Phyllostachys Pubescens, ou Phyllostachys viridis, destiné à la fabrication d'un complexe végétal selon l'une des revendications précédentes, comprenant les étapes consistant à : a) - broyer les feuilles de bambou dans un broyeur à bille, à une température inférieure à 50°C, b) - réaliser au moins une extraction avec un solvant hydro-alcoolique, dans un montage à reflux à une température supérieure à 75 °C, durant au moins 18 minutes, c) - filtrer pour éliminer le résidu solide et obtenir un extrait brut, d) - faire passer l'extrait brut sur colonne d'affinité, pour obtenir un extrait enrichi en composés polyphénoliques, et e)- évaporer le solvant, congeler et lyophiliser pour obtenir un extrait polyphénolique en poudre stabilisé.

Le premier avantage notable de ce procédé est que les solvants utilisés sont l'eau et l'éthanol, solvants écologiques pouvant rentrer dans un protocole d'obtention d'un extrait répondant aux exigences de certification écologique et convenant à une utilisation cosmétique. II est par ailleurs simple à réaliser.

Son intérêt majeur est qu'il a permis de récupérer un extrait stable et d'aspect très intéressant, même à partir d'un extrait brut à l'origine instable à température ambiante. L'activité de l'extrait obtenu après passage sur colonne d'affinité s'est avéré être plus de deux fois supérieure à celle de l'extrait brut. De ce fait, il a été possible de diminuer significativement la quantité d'extrait dans les produits formulés, jusqu'à un niveau d'environ 0,5 g/I (0,05 %). II est alors apparu de manière particulièrement intéressante que la toxicité du produit était quasiment inexistante : les tests de toxicité de l'extrait polyphénolique à une concentration de 1 g/I ne montrent pas d'effet toxique de l'extrait sur les cellules.

Le procédé a également permis de résoudre le problème de la modification indésirable de la couleur des compositions cosmétiques : l'aspect d'une crème préparée avec un complexe végétal comprenant cet extrait polyphénolique est jaune paille, couleur qui est validée par les consommatrices. A température ambiante, cette couleur n'est pas modifiée au cours du temps, contrairement aux essais réalisés avec des formulations avec l'extrait brut.

A l'étape a), les feuilles sont broyées à froid dans un broyeur à bille, par exemple dans un broyeur de type Dangoumeau, qui fragmente la matière végétale par percussion uniquement, grâce à des mouvements de va-et-vient d'une bille à l'intérieur d'un bol. Cette technique vise à éviter les phénomènes de découpage/broyage qui peuvent favoriser les réactions enzymatiques. Elle évite aussi un échauffement de la matière végétale afin de minimiser les risques que des réactions non enzymatiques se produisent.

Selon un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, à l'étape b) l'extraction est réalisée avec un solvant hydro-alcoolique, à une température de 80°C, durant 20 minutes. Cette disposition contribue à s'affranchir des conséquences des réactions enzymatiques.

Selon un autre mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, à l'étape d), la phase stationnaire de la colonne d'affinité est une résine adsorbante, de préférence la résine appelée "rélite SP 700" (fournisseur Resindion).

Selon encore un autre mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, l'étape e) est suivie d'une étape de séchage pendant au moins 40 h, de préférence 60 à 65 h, avant emploi ou stockage. En effet, en augmentant le temps de séchage, par exemple en lyophilisateur, on observe une moindre sensibilité de l'extrait de bambou à température ambiante. L'extrait enrichi et stabilisé ainsi obtenu est également revendiqué. Il s'agit d'un extrait polyphénolique de bambou susceptible d'être obtenu à partir de feuilles de bambou du genre Phyllostachys Nigra, Phyllostachys Pubescens, ou Phyllostachys viridis, par un procédé tel que décrit ci-dessus, qui présente une activité anti-oxydante supérieure à 25 mg/I, mesurée par le test DPPH.

Ainsi, grâce à la présente invention, il a été mis en évidence que les problèmes d'instabilité des extraits bruts de bambou sont multifactoriels et que leurs origines sont très diverses. C'est cette combinaison de facteurs qui a rendu difficile la mise au point de la solution revendiquée : le fait qu'une disposition ne semblait pas apporter une solution au problème, ne signifiait pas qu'elle ne contribuait pas à le résoudre, mais que d'autres facteurs existaient, entraînant également l'instabilité du produit.

C'est pourquoi, la solution inventive repose sur la combinaison d'un faisceau de modifications et d'adaptations qui ont finalement permis de répondre correctement au problème d'instabilité et de toxicité. Elle a permis d'augmenter de façon considérable l'activité des compositions formulées, alors que la diminution de la quantité d'extrait à introduire dans ces compositions conduisait à diminuer l'effet de la couleur sur les produits et également à garantir la non toxicité des produits.

Selon l'invention, cet extrait est constitutif du complexe végétal précédemment évoqué, dans lequel il est incorporé, sans perte d'activité. Ainsi, est objet de la présente invention un complexe végétal tel que défini plus haut, dans lequel l'extrait polyphénolique de bambou est un extrait sec présentant une activité anti-oxydante supérieure à 25 mg/l, mesurée par le test DPPH.

Selon un mode de réalisation intéressant de l'invention, dans ledit complexe végétal, l'extrait polyphénolique de bambou est constitué, pour au moins 50%, et de préférence pour au moins 60%, d'une fraction polyphénolique comprenant, en poids rapporté à l'extrait sec : - de 2 % à 6 % d'orientine, - de 25 % à 45 % d'homoorientine.

L'orientine et l'homoorientine, qui sont des glycosides appartenant à la classe des flavonoïdes et possèdent des propriétés antioxydantes et anti-radicalaires puissantes.

L'orientine est le composé de formule 3'4',5,7-tetrahydroxyflavone-8-C-glucoside et l'homoorientine est le composé de formule 3',4',5,7-tetrahydroxyflavone-6-C-glucoside.

De manière préférée, l'extrait sec comprend environ 4 % d'orientine, environ 35 °la d'homoorientine.

Outre l'extrait polyphénolique de bambou, le complexe végétal selon l'invention contient une préparation cellulaire de Ginkgo biloba. Selon une caractéristique préférée, ladite préparation cellulaire de Ginkgo biloba est obtenue par culture de cellules. II s'agit donc de cellules indifférenciées, qui n'ont pas acquis leur fonction spécifique.

Les cellules de Ginkgo biloba ont pour rôle de maintenir la synthèse des fibres de collagènes et protéoglycanes, en stimulant leur production et en diminuant la production de l'enzyme responsable de la destruction de ces fibres. Elles permettent ainsi une double protection contre les radicaux libres, d'origine internes dus aux réactions biochimiques, et d'origine externe dus à l'environnement (UV). Ces cellules, 100% naturelles, issues d'une innovation biotechnologique sont composées de lipides, glucides, protéines, vitamines, gluco-amino-glycanes, acides gras insaturés, stérols, glucose, fructose, enzymes et aminoacides essentiels, ont une composition adaptée aux besoins de la peau.

Lors de l'application sur la peau d'une composition selon l'invention, les cellules pénètrent dans l'épiderme par biomimétisme, car leurs membranes bi-lipidiques sont de même nature que les lipides de la surface de l'épiderme, ce qui leur confère un rôle de vecteur correspondant à une encapsulation naturelle des molécules actives, par exemple des antioxydants. La pénétration s'effectue au moment de l'application. La peau est alors plus ferme, plus élastique, plus résistante et garde une tension naturelle plus longtemps.

Le complexe végétal selon l'invention contient également une préparation huileuse de son de riz. Selon une caractéristique préférée de l'invention, ladite préparation huileuse de son de riz est obtenue par chauffage d'un produit céréalier contenant des germes de riz à une température inférieure à 100°C, lequel produit chauffé est transformé en poudre et brassé en présence d'un champignon de l'espèce Aspergillus oryzae, puis incorporé à une préparation d'huile de sésame.

L'huile de son de riz est riche en acides gras essentiels. Elle contient 40% d'acide linoléique, acide gras polyinsaturé qui intervient dans la fabrication de la membrane cellulaire. Cette teneur élevée en acides gras insaturés lui permet de maintenir l'effet barrière de la peau et d'agir comme facteur d'amélioration de la pénétration. Elle est aussi riche en vitamine E qui lui confère des propriétés antioxydantes. On peut obtenir l'huile de 9

son de riz par exemple conformément au brevet FR 2692442.

Les composants végétaux sont associés dans le complexe selon l'invention, selon des proportions variables. Selon un mode de réalisation avantageux, le complexe végétal selon l'invention comprend : - de 5 % à 25 % d'extrait polyphénolique de bambou, - de 10 % à 40 % de préparation cellulaire de Ginkgo Biloba, et - de 35 % à 85 % préparation huileuse de son de riz.

Selon un mode de réalisation préféré, le complexe végétal selon l'invention comprend : - de 5 % à 10 % d'extrait polyphénolique de bambou, - de 15 % à 30 % de préparation cellulaire de Ginkgo Biloba, et - de 60 % à 80 % préparation huileuse de son de riz.

De manière particulièrement préférée, le complexe végétal selon l'invention comprend : - 7 % d'extrait polyphénolique de bambou, - 28 % de préparation cellulaire de Ginkgo Biloba, et - 65 % préparation huileuse de son de riz.

La combinaison de ces trois actifs permet une protection complète et efficace contre le vieillissement prématuré de la peau, qu'il soit lié à des facteurs internes ou externes. Tout particulièrement, l'extrait polyphénolique de bambou et le complexe végétal qui viennent d'être décrits conviennent à des utilisations cosmétiques et/ou pharmaceutiques, appliquées au corps humain ou animal.

Est ainsi visée par la présente invention l'utilisation d'un extrait polyphénolique obtenu à partir de feuilles de bambou du genre Phyllostachys Nigra, Phyllostachys Pubescens, ou Phyllostachys viridis tel que décrit précédemment, pour la préparation d'un complexe végétal destiné à la prévention ou au traitement du vieillissement de la peau. Est aussi visée par la présente invention une composition convenant pour une utilisation pharmaceutique, cosmétique ou nutritionnelle, comprenant un complexe végétal selon la description qui vient d'en être faite.

35 Pour la préparation de telles compositions, des composés pharmaceutiquement acceptables sont mis en oeuvre, de sorte que la composition selon l'invention comprend en plus dudit complexe végétal, au moins un ingrédient choisi parmi les huiles, les30 beurres, les cires, les humectants, les gélifiants, les émulsionnants, les conservateurs, les tensio-actifs, les acidifiants, les parfums.

On peut citer à titre d'exemples des extraits végétaux apportant des fonctions supplémentaires comme l'extrait de nénuphar jaune hydroglycériné, riche en tanins pour ses propriétés astringentes. Des composés gras sont par exemple une glycérine végétale, des cires de riz, du beurre de karité, de l'huile de sésame contenant des antioxydants qui accroissent la longévité des cellules, ou encore une source d' oméga-6 qui agit comme un bouclier de la peau. L'acide lactique (AHA) permet de maintenir un pH légèrement acide pour un nettoyage en douceur. Un système tensio-actif est avantageusement obtenu à base de cires végétales hydrophylisées. La vitamine E est utile pour son pouvoir antioxydant et antiradicalaire. Le dioxyde de titane, filtre UV minéral naturel, peut aussi être introduit dans la composition objet de l'invention.

Le complexe végétal susmentionné peut être utilisé à des fins cosmétiques. En particulier, ledit complexe peut être utilisé comme agent pour améliorer l'élasticité de la peau. Il peut également l'être comme agent pour retarder, diminuer ou prévenir les signes du vieillissement cutané.

Le complexe végétal selon l'invention peut avantageusement être incorporé à des préparations médicamenteuses. Est ainsi visée par la présente invention l'utilisation d'un complexe végétal tel que défini précédemment, pour la préparation d'une composition destinée à la prévention ou au traitement des signes du stress cutané.

Est aussi visée l'utilisation d'un complexe végétal tel que défini plus haut, pour la préparation d'une composition destinée au traitement ou à la prévention des maladies liées au vieillissement de la peau.

Comme déjà indiqué, les préparations obtenues conformément à l'invention peuvent être mises en oeuvre de différentes manières, au bénéfice de la personne humaine comme des animaux. En particulier le complexe végétal tel que défini plus haut peut avoir une utilisation non thérapeutique, dans laquelle il peut être administré par voix topique ou par voix orale pour atténuer les effets du vieillissement du corps humain ou animal.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description ci-après de modes de réalisation donnés à titre d'exemples non limitatifs.

EXEMPLE 1 Protocole d'extraction de feuilles de feuilles de bambou en conditions industrielles a) - Broyage On trie les feuilles en éliminant les parties sèches ou abîmées et on les laisse ensuite sécher à l'air pendant 24 heures à température ambiante. Les feuilles sont ensuite broyées à -80°C (utilisation d'azote liquide) à l'aide d'un broyeur Dangoumeau (ou tout autre équivalent), pendant une minute environ.

Le rendement de cette étape de broyage est de 95%, aussi bien en laboratoire qu'à grande échelle, (plusieurs dizaine de kg).

b) û Extraction et filtration On réalise l'extraction dans un montage à reflux. Le solvant d'extraction se compose de 40% d'éthanol et de 60% d'eau distillée. Pour chaque gramme de poudre de feuilles, on utilise 10 ml de ce solvant. L'extraction s'effectue à reflux pendant 20 minutes à la température de 80°C.

Après retour à température ambiante, le mélange obtenu est filtré sur Büchner (filtre Whatman GF/C 11,0 cm) pour éliminer le résidu verdâtre de poudre. La solution marron obtenue est ensuite filtrée à l'aide de filtres plus petits (0,8 microns, puis 0,45 microns et enfin 0,22 microns) pour éliminer les macromolécules. La solution est passée deux fois sur le filtre à 0,22 microns pour éliminer toute la chlorophylle.

La moitié du solvant eau-éthanol est éliminé à l'évaporateur rotatif (température maximale de 40°C) pour éliminer tout l'éthanol. On obtient environ 20 ml de la solution d'extrait. On ajoute 20 ml d'eau pour obtenir un volume d'environ 40 ml. c) û Traitement sur colonne d'affinité : Pour la préparation de la colonne, celle-ci est garnie de résine adsorbante RéliteTM, type SP 700 (Resindion), et est lavée avec deux fois son volume d'eau, puis avec deux fois son volume d'éthanol, puis de nouveau à l'eau. II est important qu'il y ait toujours du solvant dans la colonne.

Passage de l'échantillon : On fait passer 20 ml de solution d'extrait sur la colonne ; les impuretés sont lavées à l'eau 11 avec deux fois le volume de la colonne. Les polyphénols sont ensuite décrochés à l'éthanol jusqu'à ce que le liquide à la sortie de la colonne soit clair. La colonne est de nouveau lavée à l'eau (deux fois son volume). Les 20 ml de solution d'extrait restants sont passés sur la colonne ; celle-ci est lavée à l'eau (deux fois son volume). Les polyphénols sont de nouveau décrochés à l'éthanol comme précédemment. On obtient une solution jaune orangé. L'éthanol est alors évaporé à l'évaporateur rotatif. On obtient une pâte orangée que l'on redissout dans un minimum d'eau. La solution obtenue est alors congelée à -80°C et lyophilisée.

On obtient un extrait polyphénolique sous forme de poudre jaune paille cotonneuse avec un rendement à l'extraction d'environ 3%.

Résultats : L'extrait polyphénolique de bambou obtenu est constitué à plus de 99%, d'une fraction polyphénolique. Le rendement global de cette procédure (broyage + extraction) est de 2.85 %. L'activité anti-radicalaire de l'extrait polyphénolique ainsi obtenu, mesurée par le test DDPH, est de 22,5 mg/I, alors que l'activité de l'extrait brut équivalent était de 51 mg/I, soit deux fois moins importante.

Sachant que les polyphénols ne constituent qu'environ 30 % de l'extrait brut, on constate que le procédé d'extraction a permis d'accroître l'activité propre de la fraction polyphénolique de l'ordre de 50 %. L'extrait de bambou contenant un taux élevé de polyphénols a été soumis à des tests qui ont montré sa parfaite innocuité.

EXEMPLE 2 TEST DPPH de l'extrait polyphénolique

Le but est de tester l'activité anti-radicalaire de la fraction hydrosoluble d'une solution, en 30 l'occurrence de l'extrait polyphénolique de bambou, à l'aide d'une solution de DPPH.

Le DPPH est un radical libre stabilisé en solution d'éthanol. II absorbe dans l'UV-visible (couleur violet avec un maximum local dans le visible à 515-520 nm). Lorsqu'on mélange des anti-oxydants à une solution de DPPH, ceux-là réagissent avec les radicaux DPPH, 35 abaissant leur concentration et donc l'absorbance de la solution. On additionne différentes quantités d'extrait à des solutions de DPPH de mêmes concentrations. En comparant (après 30 minutes de réaction) les différences d'absorbance à 518 nm, on calcule les 13

différentes quantités de DPPH consommées par rapport aux différentes concentrations en extrait (pourcentage d'inhibition radicalaire). Puis, on compare l'activité de l'extrait avec celle d'une molécule de référence : le Trolox®. (Le Trolox® est le nom commercial d'un dérivé hydrosoluble de la vitamine E distribué par Hoffman-Laroche, à savoir l'acide 6- hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchroman-2-carboxylique).

Courbe d'inhibition radicalaire : On prépare une solution de DPPH dans l'éthanol de concentration 0,1 mmol/l. On prépare une solution mère de l'extrait dans l'eau-éthanol (7 : 3 - concentration 0,1 g/I).

On réalise une solution fille de l'extrait dans l'eau-éthanol (7 : 3 - concentration 0,05 g/I).

On réalise 9 échantillons comprenant des volumes d'extrait pris dans une gamme allant de 0,05 g/l à 0,005 g/l. On ajoute une quantité de DPPH (0,05 amolli), on agite vigoureusement et on laisse réagir. Le tableau ci-dessous récapitule la composition des échantillons. La dernière ligne correspond à l'absorbance du DPPH dans l'UV, A0, qui entre dans le calcul du % d'inhibition radicalaire selon la formule : % inhibition = (Ao ù A(éch)+0,08) / Ao x100 avec 0,08 : absorbance résiduelle à 518 nm. solution VDPPH mère (ml) Vextrait (ml) Véthanol (ml) CDppH (mmol/I) Cextrait (g/l) 0,1g/l 4 4 - 0,05 0,05 0,1g/l 4 3 1 0,05 0,0375 0,1g/l 4 2,4 1,6 0,05 0,030 0,1g/l 4 2 2 0,05 0,025 0,1g/l 4 1,6 2,4 0,05 0,020 0,1g/l 4 1,2 2,8 0,05 0,015 0,05g/I 4 1,6 2,4 0,05 0,010 0,05g/l 8 1,6 6,4 0,05 0,005 4 - 4 0,05 0 Après 30 minutes, on enregistre les différents spectres UV-visible et on relève l'absorbance à 518 nm, d'où on calcule la quantité de DPPH consommé. On trace la courbe mettant en relation la consommation de DPPH en fonction de la quantité d'extrait dans l'échantillon. On obtient une courbe d'inhibition radicalaire assimilable à droite d'équation y = 5375,2x .

Résultats et interprétation : On voit que la consommation en DPPH est proportionnelle à la quantité d'extrait de l'échantillon : plus sa quantité est élevée, plus l'absorbance à 518 nm chute. Pour neutraliser la solution de DPPH, il faut une quantité d'extrait de 22,5 mg/I . On trouve bien une activité anti-radicalaire de l'extrait.

On quantifie cette activité par comparaison avec la solution de référence. Pour neutraliser la même solution de DPPH, il a fallu une concentration massique en Trolox® de 5,31 10 mg/l. Ainsi 1 g d'extrait polyphénolique de bambou a une activité anti-radicalaire équivalent à celle de 99,8 mg de Trolox®, soit une activité 10,0 fois moins importante. EXEMPLE 3 15 Préparation de la biomasse de cellules indifférenciées de Ginkgo biloba.

Les étapes suivantes ont été mises en oeuvre. 1/ obtention de cellules végétales indifférenciées : Des expiants prélevés sur plante entière (feuilles, racines,...) sont stérilisés. Ces expiants 20 sont ensuite lavés avec de l'eau stérile. En conditions aseptiques, ils sont alors découpés en fragments de quelques millimètres et déposés sur des milieux de culture gélosés. Les milieux de départ sont généralement choisis pour leur diversité tant en terme de facteurs trophiques qu'en terme de balance hormonale. Ils sont alors placés à 26°C avec une photopériode de 12/12 heures. Après 2 à 4 semaines, des cellules indifférenciées 25 apparaissent au niveau de la coupure des tissus. Ce sont les cals primaires. Ils sont alors transférés sur milieu neuf identique. L'opération se répète jusqu'à stabilisation des cellules indifférenciées.

2/ Passage en milieu liquide : 30 Pour permettre une culture en bio-réacteur (10 litres), on utilise le même milieu de culture. Il est placé en fermenteur puis stérilisé. Au bout de deux semaines, les cellules se sont multipliées.

3/ Après la culture, les cellules végétales sont filtrées pour éliminer le milieu de culture 35 résiduel et sont rincées à l'eau distillée froide, puis les cellules sont dispersées dans de la glycérine végétale.5 EXEMPLE 4 Préparation d'une huile de son de riz La préparation huileuse de son de riz est obtenue par chauffage d'un produit céréalier contenant des germes de riz à une température inférieure à 100°C. Le produit chauffé est transformé en poudre et brassé en présence d'un champignon de l'espèce Aspergillus oryzae, et incorporé à une préparation d'huile de sésame.

EXEMPLE 5 Exemple de formule cosmétique : formule type d'une crème de jour Phases Types d'ingrédients Qté % Eau gsp100 Humectant 3-5 Phase aqueuse A gélifiant aqueux/stabilisant 2-2,5 Conservateurs 0,9 huiles 14 Phase huileuse B beurres 5 Conservateurs 0,5 Système tensio-actif 4 Conservateurs 0,08 Additifs Acidifiants 0,1 Parfum 0,1-0,3 Actifs végétaux 0,3 Système d'actifs Extrait de bambou 0,05 EXEMPLE 6 Mode opératoire pour la formulation d'une crème de jour

Pour la préparation d'une crème de jour telle que celle décrite à l'exemple 1, on peut 20 procéder de la manière suivante : - Disperser les ingrédients de la phase A dans l'eau sous agitation ; - Faire fondre et mélanger les ingrédients de la phase B + le système tensio-actifs sous 15 agitation ; - Faire chauffer séparément les 2 phases à environ 80°C ; - Incorporer sous agitation B dans A ; - Laisser refroidir puis émulsionner ; - A une température inférieure à 40°C, incorporer les additifs et les actifs sous agitation. Les actifs solubles dans l'eau seront dispersés dans un peu d'eau au préalable.

EXEMPLE 7 Composition d'une crème de soins sous forme d'une émulsion huile dans eau 10 Extrait de bambou : 0.3 g Huile de son de riz : 0.25 g Cellules de Ginkgo biloba : 0.20 g Cire de riz : 1 g 15 Glycérine végétale : 6 g Extrait de nénuphar : 0.10 g Vitamine E : 0.10 g Emulsionnant : 1.6 g Conservateurs : 0.19 g 20 Eau : gsp 100 g

EXEMPLE 8 Composition d'une crème de soins sous forme eau dans huile

25 Extrait de bambou : 0.10 g Huile de son de riz : 2 g Cellules de Ginkgo biloba : 1 g Cire de son de riz : 1 g Glycérine végétale : 3 g 30 Oxyde de fer : 0.5 g Vitamine F : 0.5 g Vitamine E : 0.20 g Emulsionnant : 1.6 g Conservateurs : 0.19 g 35 Parfum : 0.60 g Eau : gsp100 g

Claims (21)

1. REVENDICATIONS1. Complexe végétal destiné à la préparation d'une composition convenant pour une utilisation pharmaceutique, cosmétique ou nutritionnelle, caractérisé en ce qu'il comprend un extrait polyphénolique de bambou, une préparation cellulaire de Ginkgo Biloba et une préparation huileuse de son de riz.
2. 2. Complexe végétal selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'extrait polyphénolique de bambou est obtenu à partir de feuilles de bambou choisi parmi les 10 espèces Phyllostachys Nigra, Phyllostachys Pubescens, et Phyllostachys Viridis.
3. 3. Complexe végétal selon la revendication précédente caractérisé en ce que l'extrait polyphénolique de bambou est un extrait sec présentant une activité anti-oxydante supérieure à 25 mg/I, mesurée par le test DPPH. 15
4. 4. Complexe végétal selon la revendication précédente caractérisé en ce que l'extrait polyphénolique de bambou est constitué pour au moins 50%, de préférence pour au moins 60%, d'une fraction polyphénolique comprenant, en poids rapporté à l'extrait sec : - de 2 % à 6 % d'orientine, de préférence environ 4 %, 20 - de 25 % à 45 % d'homoorientine, de préférence environ 35 %.
5. 5. Complexe végétal selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la préparation cellulaire de Ginkgo Biloba est obtenue par culture de cellules indifférenciées. 25
6. 6. Complexe végétal selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la préparation huileuse de son de riz est obtenue par chauffage d'un produit céréalier contenant des germes de riz à une température inférieure à 100°C, lequel produit chauffé est transformé en poudre et brassé en présence d'un champignon de l'espèce Aspergillus 30 oryzae, puis incorporé à une préparation d'huile de sésame.
7. 7. Complexe végétal selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce gu'il comprend : - de 5 % à 25 % d'extrait polyphénolique de bambou, 35 - de 10 % à 40 % de préparation cellulaire de Ginkgo Biloba, et - de 35 % à 85 % préparation huileuse de son de riz.
8. 8. Complexe végétal selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce gu'il comprend : - de 5 % à 10 % d'extrait polyphénolique de bambou, de préférence 7 %, - de 15 % à 30 % de préparation cellulaire de Ginkgo Biloba, de préférence 28 %, et - de 60 % à 80 % préparation huileuse de son de riz, de préférence 65 %.
9. 9. Procédé de préparation d'un extrait polyphénolique à partir de feuilles de bambou du genre Phyllostachys Nigra, Phyllostachys Pubescens, ou Phyllostachys viridis, destiné à la fabrication d'un complexe végétal selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : a) - broyer les feuilles de bambou dans un broyeur à bille, à une température inférieure à 50°C, b) - réaliser au moins une extraction avec un solvant hydro-alcoolique, dans un montage à reflux à une température supérieure à 75 °C, durant au moins 18 minutes, c) - filtrer pour éliminer le résidu solide et obtenir un extrait brut, d) - faire passer l'extrait brut sur colonne d'affinité, pour obtenir un extrait enrichi en composés polyphénoliques, et e)- évaporer le solvant, congeler et lyophiliser pour obtenir un extrait polyphénolique en poudre stabilisé.
10. 10. Procédé selon la revendication précédente caractérisé en ce qu'à l'étape b) l'extraction est réalisée à une température de 80 °C, durant 20 minutes.
11. 11. Procédé selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce qu'à l'étape d), la phase stationnaire de la colonne d'affinité est une résine adsorbante, de préférence la résine "Rélite SP 700"TM.
12. 12. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que l'étape e) est suivie d'une étape de séchage pendant au moins 40 h, de préférence 60 ou 65 h, avant emploi ou stockage.
13. 13. Extrait polyphénolique de bambou susceptible d'être obtenu à partir de feuilles de bambou du genre Phyllostachys Nigra, Phyllostachys Pubescens, ou Phyllostachys viridis, par un procédé selon l'une des revendications 9 à 12, caractérisé en ce qu'il présente une activité anti-oxydante supérieure à 25 mg/I, mesurée par le test DPPH.
14. 14.- Utilisation d'un extrait polyphénolique obtenu à partir de feuilles de bambou du genre Phyllostachys Nigra, Phyllostachys Pubescens, ou Phyllostachys viridis selon la revendication précédente, pour la préparation d'un complexe végétal destiné à la prévention ou au traitement du vieillissement de la peau.
15. 15. Composition convenant pour une utilisation pharmaceutique, cosmétique ou nutritionnelle, caractérisée en ce qu'elle comprend un complexe végétal selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
16. 16. Composition selon la revendication précédente caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un ingrédient choisi parmi les huiles, les beurres, les cires, les humectants, les gélifiants, les émulsionnants, les conservateurs, les tensio-actifs, les acidifiants, les parfums.
17. 17. Utilisation cosmétique d'un complexe végétal tel que défini dans l'une des revendications 1 à 8 caractérisée en ce que ledit complexe est utilisé comme agent pour améliorer l'élasticité de la peau.
18. 18. Utilisation cosmétique d'un complexe végétal tel que défini dans l'une des revendications 1 à 8 caractérisée en ce que ledit complexe est utilisé comme agent pour retarder, diminuer ou prévenir les signes du vieillissement cutané.
19. 19.- Utilisation d'un complexe végétal tel que défini dans l'une des revendications 1 à 8, pour la préparation d'une composition destinée à la prévention ou au traitement des signes du stress cutané.
20. 20.- Utilisation d'un complexe végétal tel que défini dans l'une des revendications 1 à 8 pour la préparation d'une composition destinée au traitement ou à la prévention des maladies liées au vieillissement de la peau. 30
21. 21. Utilisation non thérapeutique d'un complexe végétal tel que défini dans l'une des revendications 1 à 8 destiné à être administré par voix topique ou par voix orale pour atténuer les effets du vieillissement du corps humain ou animal.25