FR2935392A1 - Dispositif et procede pour isoler et cultiver des cellules vivantes sur filtre ou extraire leur materiel genetique - Google Patents

Abstract

Le dispositif pour isoler et cultiver des cellules vivantes sur un filtre ou extraire leur matériel génétique comporte : - un support (108) de filtre solidaire d'un filtre, - un compartiment (102) présentant une ouverture supérieure et une ouverture inférieure et - un moyen mobile (110) par rapport audit compartiment pour appliquer une force sur le support et libérer ledit support. Selon les modes de réalisation, le support de filtre est mécaniquement lié au compartiment ou au moyen mobile jusqu'à l'application de ladite force. Préférentiellement, le dispositif comporte aussi un embout (104) amovible fixé de façon étanche et amovible et adapté à interdire le mouvement relatif du moyen mobile et du compartiment qui permet d'appliquer la force et libérer le support.

Description

La présente invention concerne un procédé et un dispositif pour isoler et cultiver des cellules vivantes sur un filtre ou extraire du matériel génétique amplifié de cellules vivantes isolées sur un filtre. Elle s'applique, en particulier à isoler et cultiver des cellules particulières présentes dans un liquide, notamment le sang ou à extraire le matériel génétique de ces cellules particulières. Certaines cellules particulières du sang, par exemple les cellules tumorales ou les trophoblastes, sont en très faible proportion et doivent être décomptées pour une analyse cytologique. Cependant, par rapport au principal des autres cellules présentes dans le sang, elles présentent une plus grande dimension. Il est connu d'appliquer un tampon de fixation à base de formaldéhyde à un échantillon sanguin pour fixer les cellules recherchées, puis de faire passer le liquide résultant dans un filtre poreux. Ce filtre est ensuite utilisé pour y examiner les cellules recherchées sous microscope, en laboratoire. Cependant, cette procédure ne permet pas l'obtention de cellules vivantes. Or, l'inventeur a déterminé que l'obtention de cellules vivantes permettrait d'envisager l'identification de marqueurs spécifiques et d'appliquer dans de bonnes conditions des techniques de biologie moléculaire, de cytogénétique et de FISH (acronyme de Fluorescence ln Situ Hybridization , pour hybridation fluorescente in situ) pour le diagnostic d'anomalies génétiques dans des cellules tumorales ou trophoblastiques. La présente invention vise à remédier à ces inconvénients et à répondre à ce besoin en permettant de recueillir, dans des conditions compatibles avec des examens de laboratoire de routine, des cellules vivantes pouvant être subséquemment cultivées dans des milieux adaptés en présence de facteurs de croissance adéquats.

La présente invention concerne aussi l'extraction du matériel génétique amplifié de cellules isolées sur filtre et la détection de mutations et des niveaux de l'expression de gènes de sensibilité et de résistance aux thérapies ciblées ou d'anomalies génétiques.

Elle s'applique, en particulier à recueillir et à amplifier de façon uniforme l'ADN ou l'ARN de cellules particulières présentes dans un liquide, notamment le sang. Il est connu, par exemple du document PCT/FR 2006/000562, d'appliquer un tampon de fixation à base de formaldéhyde à un échantillon sanguin pour fixer les cellules recherchées, puis de faire passer le liquide résultant dans un filtre poreux. Ce filtre est ensuite analysé en laboratoire pour y rechercher les cellules sous microscope. On peut, par la suite, les prélever sur le filtre pour des analyses, par exemple par une analyse génétique. Cependant, cette procédure ne peut faire l'objet d'une reproduction à grande échelle et à un coût raisonnable, du fait du temps, des matériels et de la précision de travail qu'elle implique. Or cette reproduction à grande échelle et moindre coût permettrait la conduite d'analyses de biologie moléculaire à la fois sur des cellules tumorales et sur des cellules trophoblastiques. La présente invention vise aussi à remédier à ces inconvénients et à répondre à ce besoin en permettant de recueillir dans des conditions compatibles avec des examens de laboratoire de routine, une grande proportion du matériel cellulaire, en particulier, ARN et ADN, des cellules considérées, en bon état. A cet effet, selon un premier aspect, la présente invention vise un dispositif pour isoler des cellules vivantes sur un filtre ou extraire leur matériel génétique, caractérisé en ce qu'il comporte : - un support de filtre solidaire d'un filtre, - un compartiment présentant une ouverture supérieure et une ouverture inférieure et - un moyen mobile par rapport audit compartiment pour appliquer une force sur le support et libérer ledit support.

On évite ainsi toute contamination ou détérioration des cellules vivantes sur le filtre ou du matériel génétique. Le contenu du compartiment est maintenu à l'état stérile lors des manipulations sous une hotte à flux laminaire adaptée. Ainsi, toutes les étapes pour isoler et cultiver les cellules ou pour extraire et analyser leur matériel génétique peuvent être effectuées dans des conditions stériles. Ce dispositif permet ainsi la récupération des cellules vivantes d'intérêt dans des conditions parfaitement compatibles avec leur mise en culture pour poursuivre des examens de caractérisation cytomorphologique et de cytogénétique. Cette récupération est effectuée directement sur filtre et pratiquement sans perte de cellules recherchées. On recueille ainsi, à moindre coût, une grande proportion des cellules considérées, en bon état, dans des conditions compatibles avec une culture de routine en laboratoire. Le dispositif objet de la présente invention permet aussi de recueillir du matériel cellulaire de cellules particulières, rapidement et efficacement, par exemple, après réalisation : - d'une étape de filtration au cours de laquelle le principal du liquide et des dites autres cellules passe à travers un filtre dont les micropores ont un diamètre intermédiaire entre celui des dites cellules particulières et celui d'autres cellules, - d'une étape de lyse et d'amplification de l'ADN et/ou de l'ARN dans ledit compartiment et - d'une étape de récupération du matériel génétique amplifié des cellules lysées, sur le filtre.

Selon des caractéristiques particulières, le dispositif objet de la présente invention comporte un embout amovible fixé de façon étanche et amovible et adapté à interdire le mouvement relatif du moyen mobile et dudit compartiment qui permet d'appliquer ladite force et libérer ledit support de filtre. Grâce à ces dispositions, on garantit le maintien en position du porte- filtre. De plus, l'embout peut le protéger contre les éclaboussures et la contamination,

Ainsi, on retient le filtre pendant la filtration puis on le libère, pour sa récupération, en retirant l'embout et en mettant en mouvement respectif le moyen mobile et le compartiment pour appliquer la force qui libère le support de filtre.

Selon des caractéristiques particulières, ledit embout présente une ouverture inférieure qui s'adapte à une chambre de dépression d'un système d'aspiration. Grâce à ces dispositions, on peut filtrer, par aspiration dans la chambre de dépression, les cellules plus petites que les cellules d'intérêt et les éventuelles cellules lysées et le principal du liquide présent dans le compartiment. Selon des caractéristiques particulières, ledit support de filtre prend la forme d'une rondelle. On rappelle, ici, qu'une rondelle est un porte-filtre annulaire.

Selon des caractéristiques particulières, ledit support de filtre est en PVC. En effet, l'inventeur a détecté que cette matière ne flotte pas, à la différence du polyéthylène hydrophobe, et est plus rigide que ce dernier ce qui est favorable à l'utilisation du support de filtre en fond de puits de culture. Selon des caractéristiques particulières, ledit support de filtre est en PVC rigide. Ces dispositions permettent la manipulation du filtre au cours d'analyses de cytomorphologie et de cytogénétique. Selon des caractéristiques particulières, ledit support de filtre prend la forme d'une lamelle couvre objet. Selon des caractéristiques particulières, ledit support de filtre à des dimensions supérieures ou égales à une lamelle couvre objet. Ces dispositions permettent le montage du filtre entre lame et lamelle. Selon des caractéristiques particulières, ledit support de filtre possède une épaisseur inférieure ou égale à 0,4 mm et, préférentiellement, à 0,3 mm.

Grâce à ces dispositions, le support de filtre peut être utilisé sous microscope, même avec de forts grossissements, sans risquer de toucher une partie du microscope lors de déplacement latéraux du support de filtre.

Selon des caractéristiques particulières, ledit support de filtre prend la forme d'une partie, au moins, d'un tube Eppendorf. Selon des caractéristiques particulières, ledit support de filtre reproduit, dans sa partie supérieure intérieure, la forme de la partie supérieure intérieure d'un tube Eppendorf. Grâce à ces dispositions, on peut fermer l'ouverture supérieure dudit support de filtre avec un bouchon de tube Eppendorf. Selon des caractéristiques particulières, ledit support de filtre reproduit, dans sa partie inférieure intérieure, la forme de la partie inférieure intérieure d'un tube Eppendorf. Selon des caractéristiques particulières, ledit filtre possède un diamètre inférieur ou égal à 5 mm et, préférentiellement, à 3.5 mm ce qui favorise la lyse des cellules et la pré-amplification du matériel génétique. On peut ainsi simuler une surface inférieure intérieure d'un tube Eppendorf. Selon des caractéristiques particulières, ledit support de filtre reproduit, dans, sa partie supérieure extérieure, la forme de la partie supérieure intérieure d'un tube Eppendorf. Grâce à ces dispositions, le support de filtre peut s'insérer dans la partie haute d'un tube Eppendorf. On peut ainsi créer une étanchéité entre la partie supérieure extérieure de ledit support de filtre et la partie supérieure intérieure d'un tube Eppendorf. Grâce aux trois dernières dispositions énoncées ci-dessus, le support de filtre présente une fonction colonne. Selon des caractéristiques particulières, le support de filtre comporte du polycarbonate. Grâce à ces dispositions, les pores du filtre retiennent le tampon de lyse et les réactifs pour amplifier le matériel génétique.

Selon des caractéristiques particulières, le support de filtre est mécaniquement lié audit compartiment jusqu'à l'application de ladite force.

Selon des caractéristiques particulières, ledit support de filtre est mécaniquement liée audit moyen mobile jusqu'à l'application de ladite force. Selon un deuxième aspect, la présente invention vise un procédé pour isoler des cellules vivantes sur un filtre ou extraire leur matériel génétique, caractérisé en ce qu'il comporte : - une étape de solidarisation d'un support de filtre solidaire d'un filtre avec un compartiment présentant une ouverture supérieure et une ouverture inférieure ou avec un moyen mobile par rapport audit compartiment et - une étape de mise en mouvement respectif dudit moyen mobile et dudit compartiment pour appliquer une force sur le support de filtre et libérer ledit support de filtre. Selon des caractéristiques particulières, au cours de l'étape de mise en mouvement, on fait passer directement le support de filtre à un puits de culture.

On évite ainsi toute contamination ou détérioration des cellules vivantes sur le filtre ou du matériel génétique extrait. Grâce à chacune de ces dispositions, le contenu du compartiment est maintenu à l'état stérile lors des manipulations sous une hotte à flux laminaire. Ainsi, toutes les étapes sont effectuées dans des conditions stériles adaptées à la culture cellulaire ou à l'extraction de matériel génétique. Les avantages, buts et caractéristiques particulières de ce procédé étant similaires à ceux du dispositif objet de la présente invention, tel que succinctement exposé ci-dessus, ils ne sont pas rappelés ici. D'autres avantages, buts et caractéristiques de la présente invention ressortiront de la description qui va suivre, faite, dans un but explicatif et nullement limitatif en regard des dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 représente, schématiquement et en perspective, l'assemblage des pièces d'un premier mode de réalisation du dispositif objet de la présente invention, - les figures 2A à 2D représentent, schématiquement et en sections axiales perpendiculaires entre elles, le premier mode de réalisation du dispositif avant utilisation,

- les figures 3A à 30 représentent, schématiquement, en élévation ou en coupe, des étapes de mise en oeuvre du premier mode de réalisation du dispositif objet de la présente invention, - la figure 4 représente, sous forme d'un logigramme, des étapes mises en oeuvre dans un premier mode de réalisation particulier du procédé objet de la présente invention, - la figure 5 représente, schématiquement et en perspective, l'assemblage des pièces d'un deuxième mode de réalisation particulier du dispositif objet de la présente invention, - les figures 6A à 6D représentent, schématiquement et en sections axiales perpendiculaires entre elles, le deuxième mode de réalisation du dispositif avant utilisation, - les figures 7A à 7L représentent, schématiquement, en élévation ou en coupe, des étapes de mise en oeuvre du deuxième mode de réalisation du dispositif objet de la présente invention, - la figure 8 représente, en coupe, un support de filtre intégré au deuxième mode de réalisation du dispositif objet de la présente invention et - la figure 9 représente, sous forme d'un logigramme, des étapes mises en oeuvre dans un deuxième mode de réalisation particulier du procédé objet de la présente invention. On observe, en figure 1, un réservoir, ou compartiment, 102, un embout 104, un joint 106, un support de filtre 108, un moyen mobile 110, un joint 112 et un bouchon 114. Le compartiment 102 est de forme générale cylindrique. Son extrémité supérieure peut être obturée, de manière étanche, par le bouchon 114. L'extrémité inférieure du compartiment 102 présente, sur sa face externe, des anneaux discontinus dont les discontinuités guident des pattes du moyen mobile 110, lesdits anneaux guidant le corps du moyen mobile 110. Ce moyen mobile 110 présente une forme générale cylindrique munie de deux pattes 116 s'étendant vers l'embout 104 et se resserrant dans cette direction de manière à être séparées, entre elles, d'une distance inférieure au diamètre du support de filtre 108. Comme on le verra, par la suite, cette forme

particulière, notamment, celle des pattes 116 recourbées l'une vers l'autre, permet au moyen mobile 110, après retrait de l'embout 104, de pousser le support de filtre 108 afin de le libérer du compartiment 102, lors du mouvement du moyen mobile vers le support de filtre 108.

L'extrémité des pattes 116 du moyen mobile 110 et l'extrémité inférieure du compartiment 102 sont adaptés à pénétrer dans une boîte ou puits, de culture. En revanche, l'anneau discontinu extrême du compartiment 102 possède un diamètre adapté à ce qu'il prenne appui sur le bord de la boîte, ou puits, de culture.

A l'ouverture inférieure du compartiment 102 est placé, de façon étanche, stérile et amovible, un embout, ou adaptateur, 104 qui enserre la paroi extérieure du compartiment 102 et présente une ouverture inférieure effilée de plus petit diamètre que celui du compartiment 102. Cette ouverture inférieure effilée de l'embout, ou adaptateur, 104 présente une longueur suffisante pour éviter de potentielles contaminations de l'extrémité du compartiment 102 par des éclaboussures provenant d'une chambre dans laquelle est réalisée la dépression. L'embout 104 présente, de manière coordonnée avec la forme de l'extrémité inférieure du compartiment 102, qui possède des ergots latéraux 118, des moyens de blocage par rotation, pour enserrer lesdits ergots, de manière connue en soi. L'embout 104 garantit ainsi le maintien en position du porte-filtre pendant les étapes de filtration. De plus, l'embout 104 protège le filtre contre les éclaboussures et les contaminations. L'extrémité inférieure du compartiment 102 présente une ouverture débouchant, après montage, sur le filtre porté par le support de filtre 108, lui-même retenu en position, d'une part, par l'extrémité inférieure du compartiment 102 et, d'autre part, par l'embout 104. Le support de filtre 108 prend, dans le premier mode de réalisation, la forme d'une rondelle de forme annulaire. Le filtre est micro perforé et soudé sous le support de filtre 108 puis inséré avec elle dans l'extrémité inférieure du compartiment 102.

Le support de filtre 108 est, préférentiellement, en PVC et possède une épaisseur inférieure ou égale à 0,4 mm, et préférentiellement, inférieure à 0,3 mm. Son diamètre extérieur est, par exemple, de 12,6 mm. Le diamètre du filtre porté par le support de filtre 108 est, par exemple, de 8,2 mm.

Le compartiment 102, l'embout 104 et le moyen mobile 110 sont réalisés, par exemple, en polypropylène. Les joints 106 et 112 sont, par exemple, en silicone. Les figures 2A et 2C sont des sections axiales, perpendiculaires entre elles, du premier mode de réalisation du dispositif objet de la présente invention, une fois assemblées les pièces illustrées en figure 1. Les figures 2B et 2D sont des vues de détails agrandies de parties des figures 2A et 2C, respectivement. On retrouve, dans les figures 2A à 2D, les éléments décrits en regard de la figure 1. La figure 3A représente le dispositif en élévation, dans sa configuration de stockage. La figure 3B représente la mise en place du dispositif dans une platine 120 d'un système d'aspiration de type connu (non représenté) après retrait du bouchon 114 et introduction de liquide (non représenté), par exemple du sang, dans le compartiment 102, à travers son ouverture supérieure. La figure 3C est une vue de détails agrandie d'une partie de la figure 3B. On observe, en figures 3B et 3C, que l'embout 104 est maintenu en position dans une pièce 122 et qu'un joint torique 124 assure l'étanchéité de la liaison entre l'intérieur de l'embout et donc, à travers le filtre 108, l'intérieur du compartiment 102 et la chambre d'aspiration du système d'aspiration. On observe que l'embout 104 dépasse à l'intérieur de la chambre d'aspiration. Lors de l'aspiration, certaines cellules particulières du liquide présent dans le compartiment 102, de plus fort diamètre, sont retenues par le filtre alors que le principal du liquide, du contenu et de la paroi des cellules lysées et les cellules de plus petites dimensions que les cellules à recueillir sont aspirés en dehors du compartiment 102, à travers le filtre. Comme illustré en figure 3D, après filtration, on retire le dispositif de la platine. Puis, comme illustré en figure 3E et 3F, on retire l'embout 104 après

une rotation le libérant des ergots 118. Puis, comme illustré en figures 3G et 3H, on insère l'extrémité du compartiment 102 dans une boîte, ou un puits, de culture 130. Comme exposé ci-dessus et comme illustré en figure 31, l'extrémité rapprochée des pattes 116 du moyen mobile 110 et l'extrémité inférieure du compartiment 102 sont adaptés à pénétrer dans une boîte ou puits, de culture. En revanche, l'anneau discontinu extrême du compartiment 102 possède un diamètre adapté à ce qu'il prenne appui sur le bord de la boîte, ou puits, de culture 130.

Plus précisément, comme illustré en figures 3J et 3K, le moyen mobile 110 peut encore, dans cette position, bouger parallèlement à l'axe du compartiment 102. Comme illustré en figures 3N et 3M, lors de ce mouvement, les pattes 116 du moyen mobile mis en mouvement par les doigts d'un opérateur, exercent une force verticale, de haut en bas, sur le support de filtre 108 et le libère de l'extrémité inférieure du compartiment 102. Le support de filtre 108 tombe alors dans la boîte, ou puits, de culture 130. Enfin, comme illustré en figure 30, on retire le compartiment 102 et le moyen mobile 110 de la boîte, ou puits, de culture 130.

La figure 4 récapitule les étapes ainsi mises en oeuvre. Au cours d'une étape 202, on assemble les pièces du dispositif. Au cours d'une étape 204, on met en place le dispositif dans une platine 120 d'un système d'aspiration. Au cours d'une étape 206, on retire le bouchon 114. Au cours d'une étape 208, on introduit un liquide, par exemple, du sang, contenant des cellules à cultiver, par l'extrémité supérieure du compartiment 102. Au cours d'une étape 210, on effectue une filtration, par aspiration dans la chambre de dépression du système d'aspiration, des cellules plus petites que les cellules d'intérêt et les éventuelles cellules lysées et le principal du liquide présent dans le compartiment 102.

Au cours d'une étape 212, on retire le dispositif de la platine. Au cours d'une étape 214, on retire l'embout 104. Au cours d'une étape 216, on insère l'extrémité du compartiment 102 dans une boîte, ou un puits, de culture.

Au cours d'une étape 218, on met en mouvement respectif le moyen mobile et le compartiment pour exercer une force sur le support de filtre et le libérer afin qu'il tombe dans la boîte, ou puits, de culture. Au cours d'une étape 220, on retire le compartiment 102 et le moyen mobile 110 de la boîte, ou puits, de culture 130. Au cours d'une étape 220, la culture est réalisée, de manière connue, dans le puits de culture 130. On observe que la présence du support 108 autour de la face supérieure du filtre, face qui porte les cellules isolées sur filtre, permet d'éviter que ces cellules ne quittent le filtre.

Lors de l'étape de mise en culture des cellules vivantes d'intérêt sur le filtre, le filtre est, par exemple, recouvert d'une mince couche de Matrigel (ou mis en contact avec une couche de Matrigel, marque déposée, préalablement mis au fond du puits de plaque et/ou du flacon de culture et sur laquelle il repose) contenant des facteurs adaptés à la croissance des cellules d'intérêt.

Lorsque l'on souhaite observer les cellules, ou leur matériel génétique, au cours d'une étape 222, on attrape le support de filtre 108, dont la saisie avec une brucelle est facilitée par la présence de trous cylindriques latéraux, ou encoches, dans la face supérieure du support de filtre 108. Puis, on peut poser le support de filtre 108 sur une lame de verre et on appliquer, sur le filtre, une lamelle de verre en forme de disque de diamètre adapté à la surface supérieure libre du filtre. L'analyse des cellules ou de leur matériel génétique est, ensuite, effectuée de manière connue en soi. On observe, en figure 5, un réservoir, ou compartiment, 302, un embout 304, un joint 306, un support de filtre 308, un moyen mobile 310, un joint 312 et un bouchon 314. Le compartiment 302 est de forme générale cylindrique. Son extrémité supérieure peut être obturée, de manière étanche, par le bouchon 314. L'extrémité inférieure du compartiment 302 présente, sur sa face externe, un cylindre 350 séparé du corps du compartiment 302, hormis par des liaisons mécaniques en forme de nervures latérales 352. Ce cylindre 350 possède un diamètre extérieur qui correspond au diamètre intérieur du corps du moyen mobile 310, afin de le guider en déplacement. Le cylindre 350 est muni de

lumières 354 adaptées à laisser pénétrer et coulisser longitudinalement les pattes 316 du moyen mobile 310. Le moyen mobile 310 présente une forme générale cylindrique munie de deux pattes 316 s'étendant vers l'embout 304 et se resserrant dans cette direction de manière à être séparées, entre elles, d'une distance inférieure au diamètre du support de filtre 308. Comme on le verra, par la suite, cette forme particulière, notamment, celle des pattes 316 recourbées l'une vers l'autre, permet au moyen mobile 310, après retrait de l'embout 304, de pousser le support de filtre 308 afin de le libérer du compartiment 302, lors du mouvement du moyen mobile vers le support de filtre 308. L'embout 304 présente, de manière coordonnée avec la forme de l'extrémité inférieure du compartiment 302, qui possède des ergots latéraux 318, des moyens de blocage par rotation, pour enserrer lesdits ergots, de manière connue en soi. L'embout 304 garantit ainsi le maintien en position du porte-filtre pendant les étapes de filtration. De plus, l'embout 304 protège le filtre contre les éclaboussures et la contamination. L'extrémité inférieure du compartiment 302 présente une ouverture débouchant, après montage, sur le filtre porté par le support de filtre 308, lui-même retenu en position, d'une part, par l'extrémité inférieure du compartiment 302 et, d'autre part, par l'embout 304. Comme illustré en figure 8, le support de filtre 308 prend, dans le deuxième mode de réalisation, une forme coordonnée à celle d'un tube Eppendorf. En particulier : - le support 308 présente, dans sa partie supérieure intérieure, la forme de la partie supérieure intérieure d'un tube Eppendorf, ce qui permet de fermer l'ouverture supérieure dudit support avec un bouchon de tube Eppendorf, - le support 308 présente, dans sa partie inférieure intérieure, la forme de la partie inférieure intérieure d'un tube Eppendorf, ce qui permet de simuler une surface inférieure intérieure d'un tube Eppendorf et

- le support 308 présente, dans sa partie inférieure extérieure, la forme de la partie supérieure intérieure d'un tube Eppendorf, ce qui permet au support de filtre 308 de s'insérer dans la partie haute d'un tube Eppendorf. De plus, le support de filtre 308 présente une fonction colonne pour permettre la lyse des cellules retenues sur filtre et le transfert du lysat cellulaire et du matériel génétique du support de filtre vers le tube Eppendorf. Le support de filtre 308 est, préférentiellement, en PC (polycarbonate). Le compartiment 302, l'embout 304 et le moyen mobile 310 sont réalisés, par exemple, en polypropylène. Les joints 306 et 312 sont, par exemple, en silicone. Les figures 6A et 6C sont des sections axiales, perpendiculaires entre elles, du premier mode de réalisation du dispositif objet de la présente invention, une fois assemblées les pièces illustrées en figure 5. Les figures 6B et 6D sont des vues de détails agrandies de parties des figures 6A et 6C, respectivement. On retrouve, dans les figures 6A à 6D, les éléments décrits en regard de la figure 5. La figure 7A représente le dispositif en élévation, dans sa configuration de stockage. La figure 7B représente la mise en place du dispositif dans une platine 320 d'un système d'aspiration de type connu (non représenté) après retrait du bouchon 314 et introduction de liquide (non représenté), par exemple du sang, dans le compartiment 302, à travers son ouverture supérieure. La figure 7C est une vue de détails agrandie d'une partie de la figure 7B. On observe, en figures 7B et 7C, que l'embout 304 est maintenu en position dans une pièce 322 et qu'un joint torique 324 assure l'étanchéité de la liaison entre l'intérieur de l'embout et donc, à travers le filtre 308, l'intérieur du compartiment 302 et la chambre d'aspiration du système d'aspiration. On observe que l'embout 304 dépasse à l'intérieur de la chambre d'aspiration. Ainsi, on filtre, par aspiration dans la chambre de dépression, les cellules plus petites que les cellules d'intérêt et les éventuelles cellules lysées et le principal du liquide présent dans le compartiment 302.

Comme illustré en figure 7D, après filtration, on retire le dispositif de la platine. Puis, comme illustré en figure 7E et 7F, on retire l'embout 304 après une rotation le libérant des ergots 318. Puis, comme illustré en figures 7G, 7H et 71, on insère l'extrémité du compartiment 302 dans un support de tube Eppendorf 328 muni d'un tube Eppendorf 330. Comme illustré en figures 7J et 7K, le moyen mobile 310 est ensuite mis en mouvement vers le bas, parallèlement à l'axe du compartiment 302. Lors de ce mouvement, les pattes 316 du moyen mobile 310 mis en mouvement par les doigts d'un opérateur, exercent une force verticale, de haut en bas, sur le support de filtre 308 et le libère de l'extrémité inférieure du compartiment 302. Le support de filtre 308 s'enfonce alors dans le tube Eppendorf 330. Enfin, comme illustré en figure 7L, on retire le compartiment 302 et le moyen mobile 310.

La figure 9 récapitule les étapes ainsi mises en oeuvre. Au cours d'une étape 402, on assemble les pièces du dispositif. Au cours d'une étape 404, on met en place le dispositif dans une platine 320 d'un système d'aspiration de type connu (non représenté). Au cours d'une étape 406, on retire le bouchon 314. Au cours d'une étape 408, on introduit un liquide, par exemple, du sang, contenant des cellules à cultiver, par l'extrémité supérieure du compartiment 302. Au cours d'une étape 410, on effectue une filtration, par aspiration dans la chambre de dépression, des cellules plus petites que les cellules d'intérêt et les éventuelles cellules lysées et le principal du liquide présent dans le compartiment 302. Au cours d'une étape 412, on retire le dispositif de la platine. Au cours d'une étape 414, on retire l'embout 304. Au cours d'une étape 416, on insère l'extrémité du compartiment 302 dans un support de tube Eppendorf. Au cours d'une étape 418, on met en mouvement respectif le moyen mobile et le compartiment pour exercer une force sur le support de filtre et le libérer afin qu'il s'enfonce dans le tube Eppendorf. Enfin, au cours d'une étape

420, on retire le compartiment 302 et le moyen mobile 310 et on referme le bouchon du tube Eppendorf. La mise en oeuvre du tube Eppendorf est ensuite réalisée de manière connue en soi, par exemple avec des étapes de lyse, de centrifugation et de récupération du matériel génétique avec pré-amplification du génome global. Dans chacun des modes de réalisation décrits ci-dessus, préférentiellement, le filtre est réalisé en polycarbonate avec un traitement de surface hydrophile. L'utilisation d'un tel filtre améliore le taux de retenu des cellules particulières et réduit l'adhérence des autres cellules ou de leur contenu, lorsqu'elles ont été spécifiquement lysées. Le filtre présente, préférentiellement, un diamètre de pores centré sur une valeur inférieure, par exemple de 1 pm, à la valeur correspondante mise en oeuvre pour les mêmes cellules fixées, c'est-à-dire rendues rigides. Par exemple, si, pour les cellules fixées, le diamètre des pores aurait été centré sur 7,5 pm, il est ici centré sur une valeur inférieure, par exemple de 6,5 pm. Du fait de la dispersion des diamètres, pratiquement aucun pore ne possède alors un diamètre supérieur à 7 pm. Pour une application de l'invention à des cellules sanguines, le filtre présente des pores dont la densité est 50.000 et 200.000 pores/cm2 et, préférentiellement d'environ 100.000 pores/cm2. Grâce à l'usage d'un filtre en polycarbonate, la dépression nécessaire est beaucoup plus limitée que dans les systèmes de l'art antérieur, jusqu'à être quatre fois moindre, ce qui évite de détériorer les cellules que l'on vise à recueillir sur le filtre. Préférentiellement, une aspiration par dépression inférieure ou égale à -25 mBar est réalisée en dessous du filtre. Dans des variantes, le support 108 ou 308 de filtre est mécaniquement lié audit moyen mobile jusqu'à l'application, par mouvement du compartiment vers le puits de culture ou le tube Eppendorf, de la force qui libère le support de filtre du moyen mobile. L'inversion des rôles de l'extrémité inférieure du compartiment 102 ou 302 et du moyen mobile 110 ou 310 pour que ce soit ce dernier qui tienne le support de filtre dans ou devant le puits de culture ou le tube Eppendorf et le premier qui le libère lors d'un appui sur

l'extrémité supérieure du compartiment est une adaptation aisée, à la portée de l'homme du métier à partir de la description des modes de réalisation donnée ci-dessus. On observe que ce qui a été exposé ci-dessus pour un seul compartiment 102 ou 302 est, préférentiellement, effectuée simultanément pour un grand nombre de compartiments retenus ensemble par un support commun (non représenté). Dans des modes de réalisation, la présentation du dispositif objet de la présente invention prend la forme d'un kit comportant, dans un sachet 10 externe, deux sachets internes dont : - le premier comporte le dispositif monté, tel qu'illustré en figures 2A ou 6A et - le second comporte le puits de culture et une lame circulaire et/ou un tube Eppendorf ou tout autre accessoire utile à la mise en oeuvre du 15 dispositif. La mise en oeuvre de la présente invention permet d'éviter des prélèvements risqués de cellules, par exemple de cellules du liquide amniotiques tout en permettant des cultures, par exemple pour une amniocentèse. De plus, du fait de la forme en réservoir du support 108 du filtre, 20 on peut réaliser directement dans ce support des réactions d'immunocytochimie ou d'hybridation fluorescente in situ ( FISH ).

Claims (1)

1. REVENDICATIONS1 - Dispositif pour isoler des cellules vivantes sur un filtre, caractérisé en ce qu'il comporte : - un support (108, 308) de filtre solidaire d'un filtre, - un compartiment (102, 302) présentant une ouverture supérieure et une ouverture inférieure et - un moyen mobile (110, 310) par rapport audit compartiment pour appliquer une force sur le support et libérer ledit support. 2 û Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte un embout (104, 304) amovible fixé de façon étanche et amovible et adapté à interdire le mouvement relatif du moyen mobile (110, 310) et dudit compartiment (102, 302) qui permet d'appliquer ladite force et libérer ledit support (108, 308) de filtre. 3 û Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit embout (104, 304) présente une ouverture inférieure qui s'adapte à une chambre de dépression d'un système d'aspiration. 4 û Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit support (108) de filtre prend la forme d'une rondelle. 5 û Dispositif selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit support (108) de filtre est en PVC. 6 û Dispositif selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit support (108) de filtre est en PVC rigide. 7 û Dispositif selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que ledit support (108) de filtre prend la forme d'une lamelle couvre objet. 8 û Dispositif selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé en ce que ledit support (108) de filtre à des dimensions supérieures ou égales à une lamelle couvre objet. 9 û Dispositif selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, caractérisé en ce que ledit support (108) de filtre possède une épaisseur inférieure ou égale à 0,4 mm et, préférentiellement, à 0,3 mm. 10 û Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que, ledit support (308) de filtre prend la forme d'une partie, au moins, d'un tube Eppendorf (330). 11 û Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit support (308) de filtre reproduit, dans sa partie supérieure intérieure, la forme de la partie supérieure intérieure d'un tube Eppendorf (330). 12 û Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce que ledit support (308) de filtre reproduit, dans sa partie inférieure intérieure, la forme de la partie inférieure intérieure d'un tube Eppendorf (330). 13 û Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que ledit support (308) de filtre reproduit, dans sa partie supérieure extérieure, la forme de la partie supérieure intérieure d'un tube Eppendorf (330). 14 û Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisé en ce que le support (308) de filtre comporte du polycarbonate. 15 û Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le support (108, 308) de filtre est mécaniquement lié audit compartiment (102, 302) jusqu'à l'application de ladite force. 16 û Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que ledit support (108, 308) de filtre est mécaniquement lié audit moyen mobile jusqu'à l'application de ladite force. 17 - Procédé pour isoler des cellules vivantes sur un filtre ou extraire leur matériel génétique, caractérisé en ce qu'il comporte : - une étape de solidarisation d'un support de filtre solidaire d'un filtre avec un compartiment présentant une ouverture supérieure et une ouverture inférieure ou avec un moyen mobile par rapport audit compartiment et- une étape de mise en mouvement respectif dudit moyen mobile et dudit compartiment pour appliquer une force sur le support de filtre et libérer ledit support de filtre. 18 û Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que, au 5 cours de l'étape de mise en mouvement, on fait passer directement le support (108) de filtre à un puits de culture (130).