FR2921259A1 - Utilisation cosmetique du phosphate de tocopherol comme agent anti-vieillissement de la peau - Google Patents

Abstract

L'invention concerne l'utilisation dans une composition cosmétique d'un phosphate de tocophérol, notamment sous sa forme dl ou d, ou sous la forme d'un de ses sels ou esters cosmétiquement acceptables, comme agent cosmétique destiné à prévenir, ou ralentir l'apparition des effets du vieillissement de la peau, en particulier du photo-vieillissement de la peau ; elle concerne tout particulièrement l'utilisation du phosphate d'alpha-tocophérol.Elle concerne également des compositions cosmétiques renfermant un phosphate de tocophérol, en particulier un phosphate d'alpha-tocophérol au moins partiellement incorporé dans des liposomes, ces compositions étant en particulier sous forme de sérum ou d'émulsion stable.L'invention concerne également un procédé de soin cosmétique de la peau.

Description

L'invention porte sur une nouvelle utilisation du phosphate de tocophérol, notamment sous sa forme dl ou d, ou de l'un de ses esters ou de l'un de ses sels, cosrnétiquement ou pharmaceutiquement acceptables, dans le domaine de la cosmétique, ainsi que sur les compositions en contenant et les méthodes cosmétiques les mettant en oeuvre. La peau est soumise chaque jour à des contraintes mécaniques importantes. Des observations ont montré que le vieillissement de la peau entraîne une perte de la densité de cellules au niveau des couches 10 superficielles de la peau. La perte de matériel tissulaire (collagène et autres protéines de la matrice dermique) qu'entraîne cette absence de cellules se traduit par une moindre cohésion tissulaire ainsi que par un épiderme plus mince, avec moins de strates tissulaires. 15 Le stress subi par la peau, en particulier l'exposition aux UV, entraîne une altération puis une élimination naturelle de nombreuses cellules de l'épiderme. Les nombreuses observations histologiques menées pour comprendre les phénomènes clefs du vieillissement dermique ont en 20 particulier permis de conclure à une perte de la densité de cellules dermiques dans les zones photoexposées ridées. Cette perte explique largement la perte de matériel tissulaire (les collagènes et les autres protéines de la matrice dermique) que l'on observe au cours du vieillissement, ce matériel ne pouvant plus être fabriqué 25 et déposé sous la ride par des cellules absentes. Au niveau épidermique, sous les rides, cet appauvrissement en cellules est aussi observé (Contet-Audonneau et al., A histological study of human wrinkle structures: comparison between sun-exposed areas of the face, with or without wrinkles, and sun-protected areas. Br J Dermatol. 1999 30 Jun;140(6):1038-47.) et qui se traduit au niveau histologique par un épiderme plus mince avec moins de strates cellulaires au creux des rides. Ce phénomène concerne tout particulièrement les cellules de la couche basale épidermique. En effet, alors que les ondulations importantes de la jonction 35 dermo-épidermique (JDE) dans les peaux jeunes supportent une population basale nombreuse, ces ondulations de la JDE disparaissent avec l'âge, cette interface ne supportant alors qu'une population de cellules basales réduites. De plus, des observations préliminaires laissent penser que dans les zones photoexposées ridées, un phénomène semblable se produit (réduction des ondulations de la JDE et du nombre de cellules basales).

Ce phénomène atteint en particulier les cellules des couches basales de l'épiderme qui assurent la formation et le renouvellement des cellules de l'épiderme, et sont elles-mêmes issues de la division de cellules souches épidermiques . Ces cellules souches épidermiques sont présentes dans les couches basales de l'épiderme et sont définies comme étant des cellules régénératrices à haut potentiel de régénération, qui possèdent la particularité de donner une descendance illimitée de cellules-filles. Le maintien de ces cellules souches épidermiques dans les couches basales de L'épiderme est donc une cible majeur pour prévenir ou ralentir la perte de densité cellulaire au niveau de l'épiderme telle qu'on l'observe au cours du photo-vieillissement de la peau. La Demanderesse a maintenant montré qu'il est possible de protéger les cellules souches de l'épiderme par un traitement à l'aide du phosphate de tocophérol, et en particulier du phosphate d'alpha-tocophérol, notamment sous sa forme dl ou d, ou de l'un de ses esters ou de l'un de ses sels, cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptables. Le phosphate de tocophérol est une molécule qui a été décrite par la Demanderesse, dans la demande de brevet WO 91/11189, pour son utilisation pour la préparation d'une composition pharmaceutique ou cosmétique ou dermatologique, destinée à la prévention ou au traitement des manifestations allergiques telles que l'allergie cutanée ou l'asthme bronchique, ou inflammatoire, ou encore à la prévention ou au traitement des effets nocifs des radicaux libres. Grâce aux travaux des inventeurs de la présente demande, il a été montré que le phosphate de tocophérol, en particulier le phosphate d'alpha-tocophérol peut être utilisé en tant qu'agent actif dans des compositions cosmétiques qui visent à préserver les cellules souches épidermiques qui sont les seules capables de se diviser et de donner de nombreuses générations de cellules filles , et ainsi d'avoir un impact positif sur la régénération de l'épiderme, se traduisant par le maintien d'une densité cellulaire suffisante au niveau des différentes couches de l'épiderme et des constituants protéiques que ces cellules fabriquent. La présente invention porte ainsi sur l'utilisation dans des compositions cosmétiques, du phosphate de tocophérol, et en particulier du phosphate d'alpha-tocophérol, notamment sous sa forme dl ou d, ou de l'un de ses esters ou de l'un de ses sels, cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptables, en tant qu'agent actif pour prévenir ou ralentir le vieillissement de la peau lié en particulier aux effets de l'exposition aux UV. L'invention porte également selon un deuxième aspect sur des 10 compositions cosmétiques nouvelles contenant un phosphate de tocophérol tel que défini ci-dessus. Elle porte également selon un troisième aspect, sur un procédé de soin cosmétique de la peau destiné à prévenir ou ralentir l'apparition des effets du vieillissement de la peau en appliquant sur les parties concernées 15 de cette dernière, une composition contenant à titre d'agent actif un phosphate de tocophérol, en particulier un phosphate de l'alpha-tocophérol. Plus précisément, selon une caractéristique essentielle de son premier aspect, l'invention concerne une utilisation dans une composition cosmétique d'un phosphate de tocophérol, notamment sous sa forme dl ou 20 d, ou sous la forme d'un de ses sels ou esters cosmétiquement acceptables, comme agent cosmétique destiné à prévenir, ou ralentir l'apparition des effets du vieillissement de la peau, en particulier du photo-vieillissement de la peau. Selon une caractéristique essentielle de son deuxième aspect, 25 l'invention concerne une composition cosmétique constituée par ou comprenant une phase continue aqueuse dans laquelle sont présents des liposomes et renfermant un phosphate de tocophérol, en particulier sous la forme d'un de ses sels ou esters cosmétiquement acceptables tels que défini précédemment, ledit phosphate de tocophérol étant partiellement incorporé 30 dans ces liposomes et ladite composition comprenant en outre au moins un polysaccharide hydrosoluble. Ainsi, les compositions cosmétiques nouvelles qui font l'objet du deuxième aspect de l'invention contiennent un phosphate de tocophérol, en particulier un phosphate d'alpha-tocophérol, au moins partiellement inclus 35 dans des liposomes eux-mêmes contenus dans une phase aqueuse. Ce deuxième aspect comprend deux variantes.

Selon la première variante, la composition cosmétique est constituée d'une phase aqueuse dans laquelle sont présents les liposomes. Selon la deuxième variante de ce deuxième aspect, la composition cosmétique contient une phase continue aqueuse dans laquelle sont présents les liposomes et se trouve plus précisément sous la forme d'une émulsion de type huile-dans-eau. Dans les deux variantes de composition nouvelle, les liposomes sont stabilisés dans la présence d'un alginate dans la phase aqueuse. Enfin, selon une caractéristique essentielle du troisième aspect, l'invention couvre un procédé de soin cosmétique de la peau destiné à prévenir ou ralentir n'apparition des effets du vieillissement de la peau, en particulier du photovieillissement de la peau, comprenant l'application sur la partie de la peau concernée d'une composition cosmétique contenant un phosphate de tocophérol tel que défini précédemment.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la description et les exemples qui suivent ainsi que dans les figures 1 à 8 auxquelles font référence les exemples. - La figure 1 qui se réfère à l'exemple 1 illustre l'efficacité du phosphate d'alpha-tocophérol par rapport à d'autres dérivés de vitamine E en 20 tant qu'agent protecteur des cellules souche de l'épiderme ; - La figure 2 se réfère à l'exemple 2 et représente la visualisation par vidéomicroscopie des colonies de kératinocytes issues des cellules souches épidermiques à 3 jours (figure 2A) et 5 jours de culture (figure 2B) ; 25 - La figure 3 (figure 3A, 3B et 3C) donne le résultat de la visualisation des colonies de kératinocytes, la figure 3A présentant ces colonies, la figure 3B donnant une classification des colonies par taille et la figure 3C obtenue après superposition des images correspondant aux figures 3A et 3B; 30 - La figure 4 se réfère à l'exemple 2 et donne la répartition des colonies issues de cellules souches épidermiques après différents traitements ; - La figure 5 est une image obtenue par microscopie électronique à balayage à partir du sérum préparé selon l'exemple 3 ; 35 - La figure 6 est donnée en référence à l'exemple 5 et donne le résultat d'un comptage des cellules Caspase 3+ après différents traitements ; - La figure 7 donne les résultats de l'immunomarquage de la Caspase 3+ (figure 7D) en comparaison avec un témoin (figure 7A) ; - La figure 8 est donnée en référence à l'exemple 6 et donne le nombre de cellules basales disparaissant par cm2 d'épiderme dans le cas d'un échantillon témoin et dans le cas de deux échantillons traités par le phosphate d'alpha-tocophérol. Dans les différents aspects de l'invention, le phosphate de tocophérol sera notamment sous sa forme dl ou sous sa forme d ou sous la forme d'un de ses sels ou esters cosmétiquement acceptables.

Selon une variante particulièrement avantageuse, le phosphate de tocophérol est le phosphate d'alpha-tocophérol. Le phosphate de tocophérol, en particulier le phosphate d'alpha-tocophérol, peut se présenter sous forme de sels cosmétiquement acceptables choisis dans le groupe constitué par les sels de métaux alcalins, en particulier les sels de sodium monosodiques ou disodiques, les sels alcalino-terreux, notamment de magnésium, et les sels d'ammonium ou d'amines primaires, secondaires ou tertiaires tels qu'en particulier la diéthylamine, la diéthanolamine, la triéthylamine ou la triéthanolamine. Les utilisations visées par le premier aspect de la présente invention sont toutes celles où l'on cherche à prévenir ou ralentir l'apparition des effets du vieillissement de la peau, en particulier du photo-vieillissement de la peau. L'invention résulte de la découverte par ses inventeurs, de ce que le phosphate de tocophérol, en particulier le phosphate d'alpha- tocophérol, agit comme un remarquable agent cosmétique pour prévenir ou ralentir l'apparition des effets du vieillissement de la peau, en particulier du photo-vieillissement de la peau. Les compositions cosmétiques dans lesquelles il est introduit permettent en particulier de prévenir ou ralentir la formation des rides du visage ou de réduire ou lisser les rides déjà formées. Comme exposé précédemment, les utilisations visées dans le premier aspect de l'invention, sont les utilisations du phosphate de tocophérol, en particulier du phosphate d'alpha-tocophérol, indépendamment du type de composition cosmétique, en tant qu'agent anti-vieillissement de la peau alors que certaines compositions, notamment celles contenant une phase aqueuse renfermant des liposomes et au moins un polysaccharide sont revendiquées en tant que produits nouveaux. C'est pourquoi on distinguera dans la suite les compositions visées par le premier aspect et ci-après désignées par composition de l'invention des compositions visées dans le deuxième aspect qui seront désignées par compositions nouvelles de l'invention. Ainsi, les compositions cosmétiques dont l'utilisation est visée par la présente invention, peuvent être de toutes natures. Toutefois, selon une variante avantageuse, la composition cosmétique sera constituée par ou comprendra une phase aqueuse dans laquelle sont présents des liposomes. Les liposomes peuvent être unilamellaires ou multilamellaires, et sont de préférence des liposomes multilamellaires. Les liposomes utilisés selon l'invention présentent un diamètre d'environ 150 à 200 pm, tels que mesurés par granulométrie laser en tant que suspension de liposomes ou par Microscopie Electronique à Transmission avec préparation de l'échantillon par cryofracture. Selon l'invention, les lipides formant les liposomes sont des lipides amphiphiles, c'est-à-dire des molécules possédant un groupe hydrophile indifféremment ionique ou non ionique et un groupe lipophile.

Dans la présente description et les revendications, le terme lipide , ou lipidique couvre toutes les substances comprenant un groupe lipophile dont la chaîne carbonée dite grasse est supérieure à 5 atomes de carbone. De même, on entend par alcools gras au sens de l'invention 25 des alcools dont la chaîne carbonée comprend au moins 5 atomes de carbone. Les lipides amphiphiles peuvent être des phospholipides, des phosphoaminolipides, des glycolipides, ou des mélanges de ces lipides. De telles substances sont par exemple constituées par une lécithine d'oeuf ou de 30 soja, une sphyngomyéline, un cérébroside ou un stéarate de polyglycérol oxyéthyléné. Les phospholipides peuvent être la phosphatidylcholine, phosphatidylsérine, la phosphatidyléthanolamine, la phosphatidylsérine, le phosphatidylglycérol, la phosphatidylinositol ou leurs mélanges.

Les bicouches des liposomes sont préférentiellement constituées de phospholipides provenant de la lécithine, provenant en particulier de la lécithine de soja. Dans un mode de réalisation préféré, ces phospholipides sont un mélange de deux types de lécithine de soja, le premier type de lécithine de soja étant un mélange de phospholipides comprenant plus de 90% de phosphatidyl choline,, le second type étant un mélange de phospholipides comprenant entre 15 et 30% de phosphatidyl choline. Des lécithines conformes à celles utilisée dans les liposomes de l'invention sont par exemple commercialisées par la société Lucas Meyer sous les noms de marque Emulmetik 300 et Emulmetik 930. Selon une variante avantageuse, le phosphate de tocophérol est au moins partiellement encapsulé dans ces liposomes. Il est apparu aux inventeurs de la présente demande, et ceci fait l'objet d'une deuxième demande de brevet déposée le même jour que la présente demande, que la présence d'un polysaccharide hydrosoluble dans la phase aqueuse d'une dispersion huile-dans-eau dans laquelle la phase aqueuse contient des liposomes en dispersion permettait d'accroître très nettement la stabilité de ces liposomes.

Il est maintenant apparu que, d'une façon générale, la présence d'au moins un polysaccharide sous forme hydrosoluble en quantité suffisante permettait d'améliorer la stabilité des liposomes dans les compositions de l'invention. Le ou (les) polysaccharide(s) sous forme hydrosoluble peuvent- être choisis dans une large gamme de polysaccharides hydrosolubles. Ils peuvent en particulier être choisis dans le groupe constitué par l'amidon ou l'un de ses dérivés, les dérivés de cellulose, les pectines, les gommes, l'alginate, les dextranes, les carraghénates, l'acide hyaluronique. Parmi les dérivés de la cellulose, on choisira en particulier la carboxyméthyl cellulose, l'hydroxyméthyl cellulose, l'acétate de cellulose, la méthyl cellulose. Parmi ies gommes, on choisira en particulier la gomme xanthane, la gomme guar. On choisira toutefois avantageusement les alginates, en particulier les alginates alcalins et tout particulièrement un sel de sodium ou de potassium ou un extrait en contenant, par exemple un extrait d'algue.

Dans une mise en oeuvre préférée, la composition contient au moins un alginate alcalin et au moins un deuxième polysaccharide sous forme hydrosoluble, en particulier un sel alcalin de carboxyméthyl cellulose, de préférence la carboxyméthyl cellulose sodique.

La concentration en polysaccharides sera choisie de façon à protéger efficacement les liposomes contre leur dégradation. De préférence, la quantité totale de polysaccharide hydrosoluble est comprise entre 0,1 et 10% en poids de la composition, de préférence compris entre 0,1 et 2°h en poids.

On veillera également à ce que le ratio [phospholipides/polysaccharide hydrosoluble] de la composition soit compris entre 0, 1 et 20, de préférence compris entre 1 et 10. La composition cosmétique selon l'invention qui comprend nécessairement au moins un polysaccharide hydrosoluble peut en outre contenir avantageusement au moins un polymère hydrophile, choisis de préférence dans le groupe constitué de la polyvinylpyrrolidone, de l'alcool polyvinylique, et leurs mélanges. Comme exposé précédemment, les compositions de l'invention sont avantageusement sous forme d'une émulsion comprenant une phase aqueuse continue renferment lesdits liposomes et ledit phosphate de tocophérol, et une phase grasse dispersée. Parmi les compositions de l'invention contenant des liposomes, celles sous forme d'émulsion huile-dans-eau s'avèrent particulièrement intéressantes dans les applications visées.

Ces compositions aqueuses sous forme d'émulsion contiennent avantageusement dans leur phase aqueuse au moins un agent tensioactif non ionique choisi parmi les polyéthylèneglycol éthers d'alcools gras et les polypropylèneglycol éthers d'alcools gras et leurs mélanges, et au moins un polysaccharide sous forme hydrosoluble tel que défini précédemment.

L'agent tensioactif non ionique est avantageusement constitué d'un mélange de polyalkylèneglycol éthers d'alcools gras présentant avantageusement des HLB différentes. L'agent tensioactif non ionique est choisi de préférence parmi les polyéthylèneglycol éthers d'alcools gras, et leurs mélanges en particulier les dérivés éthoxylés de l'alcool stéaryl de formule (A) et leurs mélanges. CH3(CH2)17(OCH2CH2)nOH (A) Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, on utilise un mélange d'agents tensioactifs non ioniques, l'un étant plutôt de nature sensiblement hydrophile, et le second étant plutôt de nature sensiblement lipophile.

Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, l'agent tensioactif non ionique est un mélange d'agents tensioactifs non ioniques comprenant le steareth-2, conforme à la formule (A) et dans laquelle n = 2 en moyenne, commercialisé sous la dénomination Brij 72 et dont la valeur de HLB est de 4,9 et le steareth-21, conforme à la formule (A) et dans laquelle n = 21 en moyenne, commercialisé sous la dénomination Brij 721P et dont la valeur de FiLB est de 15,3. Le ratio steareth-2 / steareth-21 est adapté de façon à stabiliser l'émulsion sans dégrader les liposomes. Dans les compositions de l'invention sous forme d'émulsion le polysaccharide sous forme soluble tel que défini précédemment se trouve en quantité suffisante pour protéger les liposomes contre leur dégradation sous l'effet de l'agent tensioactif. La phase grasse des émulsions de l'invention contient avantageusement des triglycérides.

Selon une variante de l'invention cette phase grasse peut être elle-même une émulsion eau-dans-huile (E/H). La composition cosmétique peut contenir en outre au moins un polymère hydrophile, en particulier choisi dans le groupe constitué de la polyvinylpyrrolidone, de l'alcool polyvinylique et de leurs mélanges.

En outre, la composition cosmétique selon l'invention peut comprendre d'autres composés hydrophiles solubles dans l'eau. Les molécules solubles peuvent être, par exemple un sucre en C6 ou en C12, avantageusement choisi parmi le glucose, le sorbitol, le saccharose, le lactitol, le glycérol ou un de leurs éthers ou esters ou de leurs dérivés. Ces molécules hydrosolubles sont de préférence obtenues à partir d'un extrait de plantes. Outre le phosphate de tocophérol, la composition cosmétique selon l'invention peut comprendre une ou plusieurs autres substances actives destinées à prévenir, ou ralentir l'apparition des effets du vieillissement de la peau, en particulier du photo-vieillissement de la peau, et en particulier destinée à prévenir ou ralentir la formation des rides du visage, ou à réduire ou lisser les rides déjà formées. Comme substance destinée à réduire les rides, on peut utiliser avantageusement le palmitoyl pentapeptide-3, commercialisé sous la dénomination (rémixyl ) Matrixyl, en particulier le (Rémixyl) Matrixyl 3000, un extrait de mauve (Vitactyl ), un extrait de grain de maïs (Deliner , zea mays kernel extract), un extrait de son d'avoine (Osilift ). La composition selon l'invention peut enfin également comprendre en outre un ou plusieurs excipients cosmétiquement acceptables choisis dans le groupe constitué par les pigments, les colorants, les agents de rhéologie, les parfums, des agents séquestrant, les électrolytes, les ajusteurs de pH, les anti-oxydants, les conservateurs, et leurs mélanges, les agents texturants, les agents ou filtres de protection solaire. Dans une mise en oeuvre préférée de l'invention, la composition cosmétique est une lotion, un sérum, un gel aqueux ou encore une émulsion huile dans eau (H/E), de préférence un sérum ou une émulsion huile-danseau. Comme exposé précédemment l'invention porte selon son deuxième aspect sur des compositions cosmétiques en tant que produits 20 nouveaux. Il s'agit parmi les compositions cosmétiques de l'invention décrites ci-dessus de celles renfermant un phosphate de tocophérol, en particulier sous la forme d'un de ses sels ou esters cosmétiquement acceptables tels que défini précédemment, ledit phosphate de tocophérol 25 étant partiellement incorporé dans des liposomes tels que définis précédemment. Dans ces compositions, le polysaccharide hydrosoluble est en quantité efficace pour stabiliser lesdits liposomes. Par ailleurs, de façon particulièrement avantageuse, le 30 polysaccharide hydrosoluble est présent au sein de la composition dans une quantité comprise entre 0,1 et 10% en poids, de préférence compris entre 0,1 et 2% en poids. Par ailleurs, également de façon particulièrement avantageuse, le ratio [phospholipides/polysaccharide hydrosoluble] de la composition est 35 compris entre 0, 1 et 20, de préférence compris entre 1 et 10. Les compositions préférées de l'invention sont sous la forme d'une émulsion. Enfin, selon un dernier aspect, l'invention couvre un procédé de soin cosmétique de la peau destiné à prévenir ou ralentir l'apparition des effets du vieillissement de la peau, en particulier du photovieillissement de la peau, comprenant l'application sur la partie de la peau concernée d'une composition cosmétique de l'invention.

EXEMPLES Exemple 1 ù tests comparatifs concernant la protection des cellules souches de l'épiderme

On cornpare l'efficacité du phosphate d'alpha-tocophérol par rapport d'autres dérivés de vitamine E en tant qu'agent protecteur des cellules souches de l'épiderme, localisées au niveau de la couche basale.

METHODE On examine sur des kératinocytes humains normaux (KHN) en culture, les cellules en apoptose (mort cellulaire programmée).

Les cellules sont préalablement traitées ou non (témoins) pendant 24h par les dérivés de vitamine E en solution à 10 pg/mI. On soumet ensuite ces cellules à un stress oxydatif (H2O2 1 mM pendant 3h). La proportion de cellules en apoptose est déterminée en cytométrie à l'aide des sondes fluorescentes JC-1 (mesure du potentiel transmembranaire mitochondrial) et TOTO-3 (mesure de la perméabilité de la membrane plasmique). Les cellules apoptotiques sont JC-1 négatives (correspondant à une chute du potentiel transmembranaire mitochondrial) et TOTO-3 positive (correspondant à une absence d'altération de la membrane plasmique). Cette methode a été publiée (Zu/iani et a/. Cytometry part A, 2003, 54A: 100-108).35 RESULTATS Les résultats de mesure sont indiqués dans le tableau ci-dessous : Conditions expérimentales % KHN en apoptose Témoin non traité 5,48 Témoin H202 non traité 54,82 Avec H202 et alpha tocophérol 58,82 Avec H202 et Gentisate de tocophérol 60,67 Avec H202 et Tocotriénol 42,85 Avec H202 et Phosphate de tocopherol 32,79 On constate un moindre pourcentage de cellules en apoptose dans la culture de cellules traitées par le phosphate de vitamine E (voir fig. 1 donnant le pourcentage de cellules en apoptose après un stress oxydatif). Le phosphate de vitamine E exerce ainsi un effet protecteur vis- à-vis du stress oxydatif pour les kératinocytes, effet significativement supérieur à celui observé pour le témoin, ainsi qu'à celui observé pour la vitamine E ou les autres dérivés.

Exemple 2 - Effet du phosphate d'alpha tocophéryl sur 15 la protection des cellules souches épidermiques in vitro

Pour étudier ces cellules souches épidermiques dans la couche cellulaire basale de l'épiderme, le test effectué, dit test de clonogénicité, repose sur la capacité qu'ont ces cellules souches à adhérer in vitro à un 20 support de culture et à se diviser pour générer une population importante de cellules filles regroupées sous forme de colonies (Barrandon Y., Green H.Three clonai types of keratinocyte with different capacities for multiplication. J.Ce// B/o/. 84, 2302-2306 (1987), et Barrandon Y. Biologie des cellules souches épidermiques. Ann. Dermato/. Venereo/. Suppl.2 : 285-286, 25 (1998)). L'analyse du nombre et de la taille des colonies après culture permet de caractériser les cellules souches de l'épiderme. Elle permet aussi d'évaluer l'action protectrice d'un actif lors d'un stress sur ces cellules. 30 La première étape d'isolation de ces cellules consiste à préparer une suspension de cellules épidermiques (Germain L et al., Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns 19, 99-104 (1993). Ces cellules sont ensemencées ensuite sur des cellules nourricières (fibroblastes 3T3) dont l'activité mitotique est bloquée par la 5 mitomycine. Ce support vivant permet de sélectionner les cellules basales de l'épiderme contenant les cellules souches et permet aussi d'assurer la croissance des cellules à forte capacité de division qui forment alors des colonies de cellules filles (Barrandon, 1987). 10 Les ceilules présentant la plus forte capacité à se diviser forment de larges colonies (>4mm2). Elles correspondent à la population cellulaire souche de départ. La figure 2 correspond à la visualisation par vidéomicroscopie des colonies de kératinocytes issues des cellules souches épidermiques à 3 15 jours (fig. 3A) et 5 jours de culture (3B). La colorisation des colonies, ici en rouge, montre la forte croissance de certaines colonies qui correspondent aux cellules souches. L'effet protecteur du aTP a été mis en évidence selon cette methodologie. 20 Dans un premier temps, les kératinocytes sont traités avec lpg/ml de aTP pendant 24H ou non (témoins) puis soumis à un stress oxydatif (peroxyde d'hydrogène) pendant 15 minutes. Elles sont réensemencées à très faible densité pour une croissance individualisée. 25 Après 7 jours de culture, les colonies cellulaires formées à partir de chaque kératinocyte initial sont colorées, dénombrées par analyse d'image en fonction de leur taille pour évaluer la quantité de cellules souches de la culture initiale. La figure 3 présente une visualisation des colonies de 30 kératinocytes. On classifie par couleur les colonies de cellules selon la taille des colonies par couleur (bleu : supérieur à 12 mm2 ; Rouge : de 8 à 12 mm2 ; Orange : de 4 à 8 mm2; Jaune : inférieur à 4 mm2). La figure 3-C représente la superposition des images représentées sur la figure 3-A 35 (original) et sur la figure 3-B (après coloration). On vérifie ainsi que toutes les colonies ont été prises en compte.

Le traitement par le phosphate d'alpha-tocophérol sodique dans ces conditions permet de maintenir de manière significative un nombre important de larges colonies (> 4mm2) malgré le stress oxydatif de +104% comparé aux témoins où ce traitement par le phosphate d'alpha-tocophérol (alpha-TP) n'a pas eu lieu. On se référera au graphe de la figure 4 dénombrant les différentes colonies issues de cellules souches de l'épiderme en fonction de leur taille : de 4 à 8 mm2, de 8 à 12 mm2 et supérieure à 12 mm2 Les larges colonies étant issues de cellules souches, ces résultats indiquent ainsi que le phosphate d'alpha-tocophérol sodique protège donc fortement cette population particulière de kératinocytes.

Exemple 3 ù Préparation d'un sérum comprenant le phosphate d'alpha-tocophérol sodique On prépare un sérum selon la formule suivante (% exprimés en poids par rapport à la formule totale) :

Phase A 20 Eau purifiée Conservateurs Phase B Carbomer (Carbopol Ultrez 10) 0,5% Phase C EDTA tétrasodique Hydroxyde de sodium Glycérol Acide ascorbique Butylène glycol 1-3 Méthyl gluceth-20 Eau purifiée Phase D Phosphate de tocophérol sodique 0,2% Sorbitol 0.3% Alginate de sodium 0,1% Carboxymethylcellulose de sodium <0,1% 60,2% 0,7% 25 30 35 0,2% 0,2% 3,5% <0,1% 2,0% 1,8% 6,0% Polyvinyl alcool Emumlmetik 300 IP Emulmetik 930 Butylène glycol 1-3 Glycérol Antioxydants Eau purifiée <0,1% 0,5% 0,5% 1,0% 1,0% 0,2% qsp 100% On homogénéise les phospholipides de la phase D à l'Ultraturrax.

On homogénéise ensuite les phospholipides avec le butylène glycol et le glycérol pendant 20 minutes et on laisse reposer pendant 60 minutes au minimum.. On ajoute les autres composés de la phase D, puis l'eau purifiée. La phase lamellaire obtenue est cisaillée pendant 20 minutes à 15 l'Ultraturrax pour former la dispersion de liposomes. Le phosphate d'alpha-tocophérol sodique est inclus dans le sérum à titre d'agent actif et se trouve encapsulé dans les liposomes ainsi préparés. Séparérnent, on chauffe les composés de la phase A à 80°C 20 A température ambiante, on ajoute les composés de la phase B, puis on laisse gonfler le gel avant d'ajouter les composés de la phase C dans le gel précédemment formé. On ajoute la dispersion de liposomes à la phase aqueuse précédemment préparée. 25 La composition ainsi obtenue est un sérum comprenant des liposomes multilamelllaires dans lesquels est encapsulé le phosphate d'alpha-tocophérol sodique. Les liposomes comprennent, comme cela apparaît sur la figure 5, dans le cas présent plusieurs couches phospholipidiques, molécules 30 semblables à celles des membranes cellulaires. Sur cette figure 5 qui est une image de microscopie électronique à balayage obtenue sur le sérum préparé selon le présent exemple, on note la présence d'objets sphériques multilamellaires correspondant au système de vectorisation. 35 Exemple 4 ù crème riche comprenant des liposomes encapsulant le phosphate d'alpha-tocophérol sodique.

Phase A Stéareth 2 paillettes (Brij 72 paillettes) 1,3% Stéaretlh 21 paillettes (Brij 721P) 2,2% Alcool c:étylique 95% 1,2 Alcool stéarylique 1,2% Acide stéarique 0,35% Acide palmitique 0,35% Cétyl palmitate 1,3% Polyisobutène hydrogéné 5,3% Dicaprilyl carbonate 4,5% Caprylic/capric triglycériges 5,0% Diméthicone 0,2% Cyclopentasiloxane 2,1% Conservateurs 0,7% Phase B Glycérol 3,5% Eau purifiée 40,6 Acrylates/C10-C30 alkyl acrylate crosspolymer 0,5% Phase C EDTA tétrasodique 0,2% Hydroxyde de sodium 0,1% Caprylyl glycol 0,5% Eau purifiée 4,8% Phase D Sorbitol 0.4% Alginate de sodium 0,2% Carboxymethylcellulose de sodium <0,1% Polyvinyl alcool <0,1% Emumlmetik 300 IP 0,5% Emulmetik 930 0,5% Butylène glycol 1-3 1,0% Glycérol 1,0% Vitamine E, phosphate sodique 0,2% Antioxydants 0,2% Eau purifiée qsp 100%

On homogénéise les phospholipides de la phase D à l'Ultraturrax.

On homogénéise ensuite les phospholipides avec le butylène glycol et le glycérol pendant 20 minutes, phase et on laisse reposer pendant 60 minutes au minimum. On ajoute les autres composés de la phase D, puis l'eau purifiée. La phase lamellaire obtenue est cisaillée pendant 20 minutes à l'Ultraturrax pour former la dispersion de liposomes. Les phases A et B sont chauffées à 85°C séparément pour obtenir deux solution homogènes. La phase B est ensuite émulsionnée dans la phase A huileuse. L'émulsion H/E obtenue est refroidie progressivement sous agitation, puis on ajoute à 70°C les composés de la phase C, en particulier pour la neutralisation des polymères. La dispersion de liposomes est ajoutée à l'émulsion H/E préparée précédemment, sous agitation et sans incorporer d'air. L'émulsion obtenue comprend des liposomes multicouches dans la phase continue aqueuse. Ces liposomes ne sont pas détruits par l'action des agents tensioactifs stabilisant l'émulsion.

Exemple 5 - Effet du phosphate d'alpha-tocophérol (aTP) encapsulé 25 dans des liposomes sur la protection des cellules basales épidermiques sur expiant cutané après agression UV On cornpare ici l'intérêt de l'encapsulation du phosphate d'alpha-tocophérol sodique dans des liposomes. Le sérum comprenant le phosphate d'alpha-tocophérol sodique 30 est préparé conformément à l'exemple 3. On prépare pour le test, un sérum dépourvu de liposomes (phase D de l'exemple précédent), dans lequel le phosphate d'alpha-tocophérol sodique est mis en solution dans la phase B 35 METHODE

Une plastie d'une femme de 36 ans (caucasien, P495AB36) a été découpée en 15 'expiants d'un diamètre de 10 mm. Ces expiants sont mis 5 en survie dans du milieu BEM (BIO-EC's Expiants Medium).

1. Traitement Au temps 0, les expiants sont placés dans le milieu de survie (2ml/explant) et le traitement est appliqué : 10 - Les expiants sont traités 2 fois par jour, par application topique (2mg/explant) durant 2 jours avant irradiation Le jour de l'irradiation, on réalise une application 3h avant l'irradiation et une application juste après irradiation. - Le jour d'après, une application 3h avant la fin de la 15 période de survie Les témoins ne reçoivent aucun traitement 2. Irradiation Le système d'irradiation est un solar simulator ORIEL, habituellement utilisé pour la détermination du facteur de protection solaire 20 (SPF) et des études de photosensibilisation. Au jour 2, avant l'irradiation, le milieu de survie est remplacé par du tampon HBSS (Hank'sBalanced Saline Solution). La dose d'irradiation est de 7J/cm2. Juste après l'irradiation, les expiants sont replacés dans le 25 milieu de survie. Les expiants non irradiés sont placés dans le noir pendant l'irradiation et leur milieu est également remplacé par du tampon HBSS. 3. Echantillons Au jour 3, 24h après la fin de l'irradiation, les expiants sont prélevés et fixés dans du tampon formol. 30 4. Irnmunomarquage caspase 3 active Les expiants sont déshydratés dans un automate Leica automat TP 1020, inclus en paraffine (automate Leica EG 1160 embedding station). Des coupes de 5 pm d'épaisseur sont réalisées sur un microtome (Leica Minot Type microtome RM 2125) et déposées sur des 35 lames silanisées. L'immunomarquage des cellules Caspase-3 est réalisé sur les 18 coupes en utilisant un anticorps polyclonal anti-caspase 3 active (rabbit Chemicon ref AB3623) qui reconnaît la forme active de la caspase 3. La révélation du marquage s'effectue via un kit Vectastain universal ABC VECTOR amplifier system avec une coloration DAB.

Les images sont prises sur un vidéomicroscope Nikon TE2000 en lumière transmise pour l'immunomarquage associée à une image en contraste de phase pour la mesure de la surface de l'épiderme. Les cellules caspase 3 positives sont comptées par analyse d'image sur le logiciel LEICA QWIN et quantifiées par rapport à la surface de l'épiderme.

RESULTATS On réalise un comptage des cellules caspase 3+ sur les échantillons de cellules traitées par les formulations testées.

Les résultats sont représentés sur la figure 6 qui donne le nombre de cellules basales de l'épiderme disparaissant dans des fragments de peau exposés à un spectre solaire complet. Ces cellules sont identifiées par immunohistochimie à l'aide d'un anticorps reconnaissant la caspase-3 active, un marqueur des cellules apoptotiques.

La figure 7 donne le résultat de l'immunomarquage de la caspase 3 active sur explants cutanés exposés à un spectre solaire complet. Seules les cellules basales de l'épiderme sont marquées. On note un nombre plus faible de cellules positives dans l'épiderme traité avec le système de vectorisation.

Nous avons démontré qu'une composition contenant le système de vectorisation lorsqu'elle est appliquée sur des échantillons de peau humaine maintenus en survie ex vivo et exposés à un spectre solaire complet, permet d'augmenter significativement l'efficacité protectrice du phosphate d'alpha-tocophérol sodique vis-à-vis des cellules souches de l'épiderme localisées dans la couche basale (fig. 6 et 7).35 Exemple 6 -Effet de l'alpha tocopheryl phosphate (aTP=TP vityl) encapsulé dans des liposomes sur la protection des cellules basales épidermiques sur expiant cutané après agression UV On évalue l'effet protecteur vis-à-vis des cellules souches de l'épiderme, de compositions cosmétiques comprenant le phosphate d'alpha-tocophérol encapsulé dans des liposomes et préparées selon les exemples 3 et 4 du présent brevet. Ces compositions sont un sérum et une émulsion huile-dans- eau dans laquelle la phase continue aqueuse comprend lesdits liposomes. On réalise sur ces compositions le même test qu'à l'exemple 5. Les résultats sont reproduits dans la figure 8 représentant le nombre de kératinocytes basaux de l'épiderme qui disparaissent lors d'une exposition aiguë avec un spectre solaire complet après un traitement par le sérum ou la crème riche comprenant le phosphate de tocophérol encapsulé dans des liposomes. Ces cellules sont identifiées par immunofluorescence indirecte à l'aide d'un anticorps anti caspase-3 active, un marqueur des cellules apoptotiques. Nous avons démontré que la crème riche et le sérum contenant 0,2% d'aTP appliqués sur des fragments de peau, réduisent de plus de 80% le nombre de cellules basales de l'épiderme qui disparaissent après une exposition aiguë avec un spectre solaire complet.

Claims (30)

REVENDICATIONS

1. Utilisation dans une composition cosmétique d'un phosphate de tocophérol, notamment sous sa forme dl ou d, ou sous la forme d'un de ses sels ou esters cosmétiquement acceptables, comme agent cosmétique destiné à prévenir, ou ralentir l'apparition des effets du vieillissement de la peau, en particulier du photo-vieillissement de la peau.

2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la composition cosmétique est destinée à prévenir ou ralentir la formation des rides du visage, ou à réduire ou lisser les rides déjà formées.

3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce ledit phosphate de tocophérol est le phosphate d'alpha-tocophérol.

4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit phosphate de tocophérol est choisi dans le groupe constitué par les sels de métaux alcalins, en particulier les sels de sodium monosodiques ou disodiques, les sels alcalino-terreux, notamment de magnésium, et les sels d'ammonium ou d'amines primaires, secondaires ou tertiaires tels qu'en particulier la diéthylamine, la diéthanolamine, la triéthylamine ou la triéthanolamine.

5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ladite composition cosmétique est constituée par, ou comprend, une phase continue aqueuse dans laquelle sont présents des liposomes.

6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit phosphate de tocophérol est au moins partiellement encapsulé dans lesdits liposomes.

7. Utilisation selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisée en ce que lesdits liposomes sont des liposomes multilamellaires.

8. Utilisation selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisée en ce que les liposomes sont formés à base de lipides amphiphiles choisis dans le groupe constitué des phospholipides, des phosphoaminolipides, des glycolipides et de leurs mélanges.

9. Utilisation selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisée en ce que les liposomes sont formés de lipides amphiphiles choisis dans le groupe constitué par la lécithine d'oeuf, la lécithine de soja, lasphyngomyéline, les cérébrosides et les stéarates de polyglycérol oxyéthyléné.

10. Utilisation selon l'une des revendications 5 à 9, caractérisée en ce que ladite composition cosmétique contient dans ladite phase aqueuse, en outre au moins un polysaccharide sous forme hydrosoluble, en quantité efficace pour améliorer la stabilité desdits liposomes.

11. Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que ledit polysaccharide est choisi dans le groupe constitué par l'amidon ou l'un de ses dérivés, les dérivés de cellulose, les pectines, les gommes, l'alginate, les dextranes, les carraghénates, l'acide hyaluronique.

12. Utilisation selon la revendication 10 ou 11, caractérisée en ce que ladite composition contient au moins un alginate sous forme hydrosoluble, en particulier un alginate alcalin.

13. Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que l'alginate alcalin est l'alginate de sodium

14. Utilisation selon l'une des revendications 10 à 13, caractérisée en ce que ladite composition comprend un deuxième polysaccharide sous forme hydrosoluble, en particulier un sel alcalin de carboxyméthyl cellulose, de préférence la carboxyméthyl cellulose sodique.

15. Utilisation selon l'une des revendications 5 à 14, caractérisée en ce que ladite composition cosmétique est sous forme d'une émulsion comprenant une phase aqueuse continue renferment lesdits liposomes et ledit phosphate de tocophérol, et une phase grasse dispersée.

16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que ladite phase aqueuse contient au moins un agent tensioactif non ionique choisi parmi les polyéthylèneglycol éthers d'alcools gras et les polypropylèneglycol éthers d'alcools gras et leurs mélanges, et au moins un polysaccharide sous forme hydrosoluble tel que défini à l'une des revendications 11 à 14.

17. Utilisation selon la revendication 15 ou 16, caractérisée en ce que ladite phase aqueuse contient un mélange d'agents tensioactifs non ioniques tels que définis dans la revendication 11.

18. Utilisation selon l'une des revendications 15 à 17, caractérisée en ce que ledit agent tensioactif non ionique est choisi parmi les polyethylèneglycol éthers d'alcools gras et leurs mélanges.

19. Utilisation selon l'une des revendications 15 à 18, caractérisée en ce que l'agent tensioactif non ionique est choisi parmi les polyethylèneglycol éthers de l'alcool stéarylique.

20. Utilisation selon la revendication 19, caractérisée en ce que ledit agent tensioactif non ionique est un mélange de stéareth-2 et de stéareth-21.

21. Utilisation selon l'une des revendications 15 à 20, caractérisée en ce que le polysaccharide sous forme soluble tel que défini à l'une des revendications 11 à 14, est en une quantité efficace pour protéger les liposomes contre leur dégradation sous l'effet dudit agent tensioactif.

22. Utilisation selon l'une des revendications 15 à 21, caractérisée en ce que ladite composition cosmétique contient en outre au moins un polymère hydrophile, en particulier choisi dans le groupe constitué de la polyvinylpyrrolidone, de l'alcool polyvinylique et de leurs mélanges.

23. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que la phase grasse de ladite émulsion contient des triglycérides.

24. Utilisation selon l'une des revendications 15 à 23, caractérisée en ce que la phase grasse de ladite émulsion est elle-même une émulsion eau-dans-huile (E/H).

25. Composition cosmétique renfermant un phosphate de tocophérol, en particulier sous la forme d'un de ses sels ou esters cosmétiquement acceptables tels que défini dans l'une des revendications 1 à 4, ledit phosphate de tocophérol étant partiellement incorporé dans des liposomes tels que définis dans l'une des revendications 5 à 9 et ladite composition comprenant en outre au moins un polysaccharide hydrosoluble tel que défini dans l'une des revendications 10 à 14.

26. Composition cosmétique selon la revendication 25, caractérisée en ce que ledit polysaccharide hydrosoluble est en quantité efficace pour stabiliser lesdits liposomes.

27. Composition cosmétique selon la revendication 25 ou 26, caractérisée en ce que ledit polysaccharide hydrosoluble est présent au sein de la composition dans une quantité comprise entre 0,1 et 10% en poids, de préférence compris entre 0,1 et 2% en poids.

28. Composition cosmétique selon l'une des revendications 25 à 27, caractérisée en ce que le ratio [phospholipides/polysaccharide hydrosoluble] de la composition est compris entre 0, 1 et 20, de préférence 5compris entre 1 et 10.

29. Composition selon l'une des revendications revendication 25 à 28, caractérisée en ce qu'elle est sous la forme d'une émulsion telle que définie dans l'une des revendications 15 à 24.

30. Procédé de soins cosmétiques de la peau destiné à prévenir ou ralentir l'apparition des effets du vieillissement de la peau, en particulier du photovieillissement de la peau, comprenant l'application sur la partie de la peau concernée d'une composition cosmétique telle que définie dans l'une des revendications 1 à 29. 10