FR2916761A1 - Test antibiogramme utilisant des microbilles - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte à des tests antibiogrammes. Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à un procédé de détermination de la sensibilité d'un microorganisme à un antibiotique susceptible d'empêcher le développement d'un biofilm. Le procédé de l'invention comporte l'introduction dans un milieu de culture ensemencé avec un microorganisme au moins une particule magnétique ou magnétisable, l'ajout dans ledit milieu d'un antibiotique puis le maintient du milieu de culture dans des conditions permettant le développement du microorganisme. On détermine la sensibilité du microorganisme audit antibiotique par application d'un champ magnétique destiné à mettre en mouvement ladite particule sur une surface immergée dans ledit milieu de culture ou à la surface dudit milieu de culture en l'absence de biofilm. L'absence de mouvement de ladite, au moins une, particule révélant la présence d'un biofilm et donc l'insensibilité dudit microorganisme audit antibiotique.
Description
TEST ANTIBIOGRAMME UTILISANT DES MICROBILLES DESCRIPTION Domaine technique
La présente invention se rapporte à des tests antibiogrammes. Plus particulièrement la présente invention se rapporte à un procédé de détermination de la sensibilité d'un microorganisme à un antibiotique 1 o susceptible d'empêcher le développement d'un biofilm.
Etat de la technique Les antibiogrammes sont des tests permettant de déterminer la sensibilité d'un microorganisme à un antibiotique. Cette détermination est 15 en général réalisée pour des microorganismes pathogènes. Les antibiogrammes permettent également de déterminer la dose d'antibiotique correspondant à la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI). Pour le clinicien, la CMI constitue un guide de la sensibilité du microorganisme à l'agent antibiotique et facilite les décisions de traitement. 20 Il existe actuellement plusieurs techniques de réalisation d'un antibiogramme. Les techniques classiques de réalisation des antibiogrammes sont basées sur des méthodes de dilutions ainsi que sur des méthodes de diffusion. Ces techniques sont décrites par exemple dans les documents 25 rédigés par le Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie, ou par la norme AFNOR NF EN ISO 20776-1 sensibilité in vitro des agents infectieux et évaluation des performances des dispositifs pour antibiogrammes . La technique AFNOR NF EN ISO 20776-1 décrit la technique de dilution en bouillon . 30 D'autres techniques comme le Etest (marque déposée) (AB Biodisk) ou des techniques automatiques sont venues compléter les techniques manuelles classiques. 2 Les méthodes de dilutions peuvent être réalisées en milieu liquide ou solide. En milieu liquide, le microorganisme est incubé dans des conteneurs, constitués généralement de tubes pour des volumes de l'ordre du millilitre ou cupules de plaques de microdilution pour des volumes plus faibles, avec différentes concentrations d'antibiotiques. La norme AFNOR NF EN ISO 20776-1 utilise des plaques de microdilution. Cette méthode permet de déterminer la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) via l'observation de l'absence de croissance visible du microorganisme. La norme AFNOR NF EN ISO 20776-1 utilise la dilution en bouillon, c'est-à-dire une technique dans laquelle des conteneurs (des cupules présentes sur les plaques de microdilution) comportant des volumes identiques de bouillon avec des solutions d'agent antibactérien à des concentrations augmentant de manière incrémentielle, généralement de manière géométrique, sont ensemencés avec un nombre connu de microorganismes. Cette méthode est conçue pour soumettre à essai des cultures pures de microorganismes cultivables en milieu Mueller-Hinton. Cette méthode est basée sur celle décrite par Ericsson et Sherris, Clinical and Laboratory Standards Institute (2006), Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 16th edn. Informational Supplement M100-S16, Wayne, PA. Cette méthode est utilisée en France, Allemagne, Suède, Royaume-Unis et Etats-Unis. La concentration la plus faible d'un agent antibiotique (en mg/ml) qui inhibe l'apparition d'une croissance visible d'un microorganisme au cours d'une période définie correspond à la CMI. Il est généralement accepté que les essais de CMI en bouillon sont reproductibles à plus ou moins une dilution, c'est-à-dire plus ou moins une cupule ou un tube dans une série de raison 2. La mise en oeuvre de ce test nécessite d'isoler le microorganisme (à partir d'un prélèvement) sur boite de Pétri contenant un milieu gélosé, puis à mettre en suspension un isolat correspondant à une colonie dans une cupule ou un tube contenant un milieu liquide. Cette suspension est incubée un certain temps pour permettre la croissance du microorganisme. L'évolution de cette croissance est suivie par mesure de turbidité. En parallèle, des plaques de microdilution sont préparées, en plaçant des solutions (par exemple 50pl) contenant des dilutions en bouillon d'antibiotiques dans les cupules. Des cupules témoins sont prévues, sans antibiotique, et seront soit inoculées pour montrer la viabilité du microorganisme dans le bouillon (témoin de croissance), soit non inoculées pour montrer la stérilité du bouillon. Lors du test, la turbidité de l'inoculât est normalisée par dilution. Les plaques de microdilution sont inoculées en déposant par exemple 50pl de l'inoculât normalisé, puis incubées, par exemple 18h à 37 C. Le résultat est lu à l'oeil nu, lorsque le témoin de croissance est positif et qu'il n'y a aucune croissance visible dans le témoin non inoculé. La CMI est la concentration la plus faible de l'antibiotique qui inhibe la croissance visible. Cette méthode permet de suivre la croissance des microorganismes en solution dans le milieu liquide de culture (bouillon). Ceci correspond à suivre la viabilité des microorganismes planctoniques . Or, les microorganismes colonisent aussi la surface interne du tube ou de la cupule, formant ce qu'on appelle un biofilm (D. Djordjevic, M. Wiedmann, and L.A. McLandsborough. Microtiter Plate Assay for assesment of Listeria monocytogenes biofilm formation. Applied and Environmental Microbiology 68, 2950-2958) Les biofilms sont connus pour être plus résistants aux antibiotiques (J.W. Costerton, P.S. Stewart, E.P. Greenberg, 1999. Bacterial biofilms : a common cause of persistent infections. Science 284, 1318-1322). Des biofilms peuvent aussi se former à la surface du milieu de culture. La méthode classique de réalisation d'un antibiogramme (par exemple celle décrite par la norme AFNOR NF EN ISO 20776-1 ) ne permet pas de caractériser la présence d'un biofilm dans le tube ou la cupule où est réalisé le test puisque c'est la croissance des 4 microorganismes en solution, et donc la viabilité des microorganismes planctonique , qui est suivie. Il existe également des tests antibiogramme en milieu liquide utilisant, plutôt qu'une lecture à l'oeil nu, la visualisation de la croissance bactérienne par mesure de turbidimétrie (mesure de la densité optique) d'une solution. De la même façon, dans un milieu culture liquide la croissance bactérienne peut-être également observée par néphélémétrie (mesure de la lumière diffusée dans une direction donnée en fonction de l'angle d'observation du faisceau incident). La néphélémétrie est plus 1 o sensible que la turbidimétrie mais présente une zone d'utilisation plus étroite. Ces différentes méthodes de détection mettent en évidence un trouble dans une solution que si la concentration bactérienne atteint au moins 10' bactéries par mL (la turbidimétrie nécessitant 10$ à 109 15 bactéries par mL). En outre cette détection peut être faussée par dépôt de bactéries sur les parois. Ces méthodes présentent donc des problèmes de reproductibilité des résultats mais également des problèmes de sensibilités de détection. Parallèlement aux tests en milieu liquide, il existe des tests en 20 milieu solide, où le microorganisme est ensemencé dans différentes boîtes de Pétri comprenant un milieu gélosé avec des concentrations d'antibiotiques différentes. Après incubation l'absence de croissance visible du microorganisme sur différentes boites permet de déterminer la sensibilité du microorganisme à l'antibiotique ainsi que la Concentration 25 Minimale d'Inhibition (CMI) de la croissance bactérienne. La mise en oeuvre de ce test nécessite la préparation de boîtes de Pétri, la préparation du milieu, couler le milieu dans des boîtes de Pétri, attendre la solidification du milieu, ensemencer le milieu et incuber l'ensemble. Toutes ces étapes nécessitent un temps important et du matériel stérile. De plus la nature et 30 la solidification du milieu ont un effet direct sur l'efficacité du test (propriétés de croissance des microorganismes sur milieu gélosé, disponibilité de l'antibiotique à la surface de la gélose, etc.) entraînant des variations dans les résultats provoquant des problèmes de reproductibilité. Enfin, pour chaque dilution d'antibiotique, une boite de Pétri est nécessaire, ce qui entraîne des coûts importants pour des réalisations successives de tests. Une autre technique standard d'antibiogramme est basée sur l'application de disques de papiers buvard imprégnés d'antibiotiques sur un milieu solide gélosé préalablement ensemencé par un agent bactérien. La diffusion de l'antibiotique dans le milieu solide gélosé est uniforme et permet d'établir un gradient de concentration d'antibiotique en fonction de la distance. La sensibilité de la bactérie à l'antibiotique sera visualisée par une absence de croissance bactérienne. De plus, la limite de croissance bactérienne sur le milieu correspond à la zone où la concentration en antibiotique est égale à la CMI.
Ce test sur milieux solides gélosés permet de tester plusieurs antibiotiques sur une même boîte de Pétri. Cependant un nouvel inconvénient de ce test est relatif à la diffusion de l'antibiotique dans le milieu gélosé. Ce milieu solide peut présenter des propriétés différentes en fonction de sa solidification. Ce paramètre supplémentaire pour la réalisation du test est une source supplémentaire de variabilité des résultats. En outre, les papiers buvard imprégnés et les dispositifs utilisés pour leur application sur la gélose sont assez onéreux. Un autre test antibiogramme est le Etest (marque déposée) (AB Biodisk) qui permet une estimation de la CMI par utilisation de bandelette imprégnée d'un gradient exponentiel continu d'antibiotique. Cette bandelette est appliquée sur un milieu solide gélosé préalablement ensemencé. Si la bactérie est sensible à l'antibiotique, on observe une inhibition de la croissance bactérienne en forme d'ellipse. Cette inhibition permet de déterminer la CMI qui est égale à la concentration d'antibiotique contenu dans la bandelette au niveau de l'intersection entre la bandelette et l'ellipse d'inhibition.
Ce Etest fait intervenir un milieu solide dans des boîtes de Petri. L'utilisation de ces boîtes entraîne les inconvénients précités. De plus la détermination de la CMI est dépendante de la diffusion de l'antibiotique dans le milieu. Le Test présente donc des problèmes de reproductibilité.
Les languettes utilisées peuvent présenter une variabilité dans la répartition de la concentration de l'antibiotique. Elles sont à usage unique et peuvent avoir des propriétés qui évoluent en fonction du temps. Ces différents inconvénients sont donc source de coûts supplémentaire. Pour les mycobactéries des tests particuliers sont nécessaires. 1 o Un premier test utilisé consiste à mettre en présence sur un milieu de culture solide des mycobactéries avec une forte concentration d'antibiotique et d'observer le nombre de mycobactéries résistantes. Un second test utilisé est basé sur des essais radiométriques sur milieu de culture solide permettant d'évaluer la croissance bactérienne. Ces deux 15 types de test nécessitent un délai de 3 à 4 semaines pour avoir une réponse. Ces tests présentent des inconvénients car ils nécessitent un temps important pour l'obtention de résultats ce qui implique des installations permettant un stockage long (3 semaines) des cultures. De plus, les résultats sont dépendants des conditions d'incubation qui ont un 20 effet direct sur les mycobactéries. Tous ces éléments sont sources de coûts supplémentaires pour une reproductibilité et une faisabilité des tests pas toujours satisfaisantes. Des systèmes automatiques d'antibiogramme ont été développés plus récemment. Ils correspondent aux tests manuels avec 25 une interprétation automatique des résultats. Ils n'apportent donc pas de solutions aux inconvénients précités. Au contraire, des coûts supplémentaires sont nécessaires pour l'acquisition des appareillages. La mise en oeuvre des méthodes précitées de l'art antérieur nécessite donc un temps de réalisation souvent très long et un coût 30 important. Ces différents tests antibiogrammes s'appliquent en outre principalement aux souches bactériennes se développant sur des milieux 7 communs avec un taux de croissance rapide. De plus, aucune de ces techniques d'antibiogramme ne permettent de déterminer les causes de la sensibilité accrue ou diminuée d'une bactérie vis-à-vis d'un antibiotique.
Ces techniques concernent toutes la culture de microorganismes planctoniques, c'est-à-dire en phase liquide (un milieu gélosé peut-être considéré comme étant analogue à une phase liquide pour un microorganisme puisqu'il ne peut adhérer sur la gélose), et ne permettent pas de caractériser le phénotype sessile, c'est-à-dire adhérent sur une surface, desdits microorganismes. Ce comportement sessile est à l'origine du développement de biofilms, c'est-à-dire la colonisation d'une surface par des microorganismes. Il existe plusieurs techniques permettant de caractériser le comportement sessile des microorganismes, dont la plus usitée est la méthode de coloration au cristal violet (D.J. Musk, D.A. Banko, and P.J. Hergenrother, 2005. Iron salts perturb biofilm formation and disrupt existing biofilms of Pseudomonas aeruginosas. Chem. Biol. 12, 789-796). Cette technique nécessite la culture de microorganismes dans un récipient contenant un milieu de culture. La formation de biofilm sur la paroi du récipient est révélée par coloration des microorganismes au cristal violet. La force d'adhésion du biofilm est caractérisée par sa résistance à des lavages successifs à l'eau. Ces lavages sont difficiles à standardiser, et varient d'un manipulateur à l'autre. Cette technique est lourde à mettre en oeuvre, longue à réaliser (il faut le temps que le microorganisme puisse développer un biofilm résistant aux lavages) et assez peu reproductible (déviation standard importante sur les résultats). Cette technique n'est pas utilisée en routine pour réaliser des antibiogrammes spécifiques du développement de biofilms. On connaît donc assez mal en clinique l'efficacité des antibiotiques sur les biofilms de microorganismes.
Il existe donc un réel besoin de disposer d'un antibiogramme simple à mettre en oeuvre, rapide, permettant une détection précoce des effets des antibiotiques sur un biofilm de microorganisme, économique, et permettant de déterminer la sensibilité d'un microorganisme à un antibiotique palliant les problèmes précités de l'art antérieur ainsi que les défauts de détection de la croissance bactérienne.
Exposé de l'invention La présente invention a précisément pour but de répondre aux besoins et inconvénients précités en fournissant un procédé de détermination de la sensibilité d'un microorganisme à un antibiotique susceptible d'empêcher le développement d'un biofilm.
Le procédé de l'invention se caractérise en ce qu'il comprend les étapes consistant à : introduire dans un milieu de culture liquide approprié au développement dudit microorganisme au moins une particule magnétique ou magnétisable, ladite particule flottant à la surface du milieu de culture ou reposant sur une surface immergée dans le milieu de culture, -ensemencer le milieu avec ledit microorganisme, - ajouter l'antibiotique à une concentration déterminée dans le milieu, puis, a) maintenir le milieu de culture dans des conditions permettant le développement du microorganisme, b) déterminer la sensibilité du microorganisme audit antibiotique par application d'un champ magnétique ou électromagnétique ou électrique destiné à mettre en mouvement, en l'absence de biofilm, ladite, au moins une, particule sur ladite surface immergée dans ledit milieu de culture ou à ladite surface dudit milieu de culture, l'absence de mouvement de ladite, au moins une, particule révélant l'insensibilité dudit microorganisme audit antibiotique.
Selon un autre aspect, la présente invention à pour objet un dispositif permettant la réalisation du procédé selon l'invention.
En milieu naturel, hors laboratoire, les populations bactériennes peuvent se disposer ou se fixer sur un support (état sessile ) et se développer en communauté organisée. Cette communauté bactérienne peut être englobée dans une matrice d'ExoPolySaccharides (EPS) limitant les échanges avec le milieu environnant nommée biofilm . (A. Filloux, I. Vallet. Biofilm : Mise en place et organisation d'une communauté bactérienne . Médecine/Sciences 2003 ; 19: 77-83). Un biofilm est généralement défini comme une population de microorganismes adhérée à une surface, et en général enrobée d'une matrice d'exopolysaccharides (J.W. Costerton, Z. Lewandowski, 1995. Microbial biofilms. Annu. Rev. Microbiol. 49, 711-745).
La nature des biofilms est très variée, certains sont très riches en ExoPolySaccharide (EPS), d'autres sont principalement constitués de corps bactériens. Les biofilms sont omniprésents dans de nombreux domaines présentant des risques sanitaires et provoquant de nombreux dommages. Par exemple, en santé humaine, les biofilms sont responsables d'infections de plus en plus difficiles à juguler : au niveau de la sphère otorhino-laryngologique (ORL), par exemple dans le conduit auditif ; sur la muqueuse nasale ; sur la conjonctive de l'oeil, etc. ; sur des dents, ce qui peut conduire à l'apparition de tartre, de caries, etc. ; dans les bronches, les poumons par exemple chez les patients atteints de mucoviscidose etc... et au niveau du tractus urogénital. Ils sont en outre à l'origine de la plupart des pathologies nosocomiales, causant environ 500 000 cas par an et plus de 4 000 décès (A. Vassel, Sénateur, Rapport de l'Office parlementaire d'évaluation des politiques de santé n 421 sur la politique de lutte contre les infections nosocomiales, déposé le 22 juin 2006, Compte rendu de la réunion du mercredi 21 juin 2006). Ils se forment par exemple au niveau de cathéters ou d'implants, ou au niveau des valves cardiaques, des hanches artificielles, des sondes urinaires etc. (J.W. Costerton, 2005. Biofilm theorie can guide the treatment of devicerelated orthopaedic infections. Clin. Orthop. Relat. Res. 437, 7-11). 1 o Les biofilms peuvent également se développer dans les tours de réfrigération, responsables d'infections par les Légionelles, dans l'industrie agro-alimentaire à l'origine d'intoxications alimentaires et dans les canalisations. La présente invention permet avantageusement de détecter la 15 sensibilité d'un microorganisme à un antibiotique dans la formation d'un biofilm et permet donc d'identifier des antibiotiques efficaces pour inhiber de manière ciblée la formation des biofilms, ce qui n'était pas possible avec les antibiogrammes utilisés dans l'état de la technique. De plus contrairement aux méthodes les plus utilisées dans l'état de la technique, 20 le procédé de la présente invention ne requiert pas l'utilisation de boîtes de Pétri, de papier buvard, de milieux de culture solides ou de géloses ce qui permet d'éliminer plusieurs sources de variation des résultats et de diminuer les coûts de réalisation des tests. Les différents résultats expérimentaux obtenus avec la présente invention ont montré en outre une 25 excellente reproductibilité des résultats. Cette détection de la sensibilité des microorganismes à l'antibiotique dans la formation du biofilm est révélée par observation du comportement de ladite, au moins une, particule après l'application d'un champ magnétique destiné à mettre en mouvement ladite, au moins une, 30 particule sur une surface dans un milieu de culture d'un microorganisme comprenant un antibiotique.
L'application du champ magnétique devrait avoir pour effet de mettre en mouvement ladite, au moins une, particule présente dans le milieu sur ladite surface. Si un biofilm est formé, la, au moins une, particule est piégée dans ce dernier et son mouvement est alors modifié (inexistant ou freiné). Dans ce cas, on peut considérer que le microorganisme n'est pas sensible audit antibiotique dans la formation d'un biofilm. Si le biofilm n'a pas pu se former du fait de la présence de l'antibiotique là, au moins une, particule est alors mise en mouvement sur ladite surface par l'application du champ magnétique. Dans ce cas, on peut considérer que le microorganisme est sensible audit antibiotique pour la formation du biofilm. Un autre avantage de la présente invention est la possibilité toujours offerte de mesurer la turbidité du milieu de culture. On peut ainsi distinguer les agents antibactériens efficaces sur les microorganismes planctoniques, c'est-à-dire ceux croissants en milieu liquide, mais inefficaces sur les biofilms, et les agents antibactériens totalement efficaces dans les deux cas. Un nouveau profil d'efficacité peut être identifié : si une croissance est visible dans le milieu liquide de culture et si là, au moins une, particule est toujours mobile, l'antibiotique est efficace sur les biofilms (microorganismes sessiles) et pas sur les microorganismes planctoniques. Ce type d'antibiotique peut s'avérer très intéressant et être utilisé comme traitement d'appoint à d'autres antibiotiques déjà existants, pour éliminer les risques de création de résistances au cours d'un traitement à long terme, par exemple dans les pathologies chroniques, dans les cas d'immunodéficience, ou aussi chez les enfants atteints de mucoviscidose. Enfin, la présente invention permet de tester non seulement l'effet d'un antibiotique sur un biofilm en cours de formation, mais aussi l'effet d'un antibiotique sur un biofilm formé. Dans ce dernier cas, au cours de la formation du biofilm, on observe l'immobilisation de là, au moins une particule. Lorsque cette immobilisation est totale, différentes concentrations d'antibiotique peuvent être ajoutées dans le milieu de culture et on peut alors observer un retour à la mobilité de là, au moins une, particule. Un autre avantage de la présente invention est la possibilité de réutiliser les particules ainsi que les supports nécessaires à la culture, par exemples les tubes, les cupules etc., permettant de réduire considérablement les coûts par rapport aux techniques de l'art antérieur.
Dans la présente invention, on entend par microorganisme les bactéries, les champignons, les algues et les protozoaires. 1 o Les bactéries susceptibles d'être testées dans la présente invention sont par exemples celles comprises dans le groupe, sans être limité à celui-ci, constitué de Acetobacter aurantius, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Agrobacterium tumefaciens, Azorhizobium caulinodans, Azotobacter vinelandii, Bacillus anthracis, Bacillus brevis, 15 Bacillus cereus, Bacillus fusiformis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacteroides gingivalis, Bacteroides melaninogenicus, Bartonella henselae, Bartonella quintana, Bordetella bronchiseptica, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Branhamella catarrhalis, Brucella abortus, Brucella melitensis, 20 Brucella suis, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei Calymmatobacterium granulomatis, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, 25 Clostridium tetani, Clostridium welchii, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium fusiforme, Coxiella burnetii Ehrlichia chaffeensis, Enterococcus avium, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus galllinarum, Enterococcus maloratus, Escherichia coli Francisella tularensis, Fusobacterium nucleatum 30 Gardnerella vaginalis Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus pertussis, Haemophilus vaginalis, Helicobacter pylori Klebsiella pneumoniae, Klebseilla rhinoscleromatis-klebsiella oxytoca Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactococcus lactis, Legionella pneumophila, Methanobacterium extroquens, Microbacterium multiforme, Micrococcus luteus, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis, Mycobacterium diphtheriae, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepraemurium, Mycobacterium phlei, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis , Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma pneumoniae Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides Pasteurella multocida, Pasteurella tularensis, Porphyromonas gingivalis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas maltophilia, Rhizobium radiobacter, Rickettsia prowazekii, Rickettsia mooseri, Rickettsia psittaci, Rickettsia quintana, Rickettsia rickettsii, Rickettsia trachomae, Rochalimaea henselae, Rochalimaea quintana, Rothia dentocariosa, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus avium, Streptococcus bovis, Streptococcus cricetus, Streptococcus faceium, Streptococcus faecalis, Streptococcus ferus, Streptococcus gallinarum, Streptococcus lactis, Streptococcus mitior, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus rattus, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus, Treponema pallidum, Vibrio cholerae, Vibrio comma, Vibrio parahemolyticus, Vibrio vulnificus, Xanthomonas maltophilia Yersinia enterocolitica,Yersinia pestis et Yersinia pseudotuberculosis, etc.
Dans la présente l'expression "milieu de culture" comprend tout milieu liquide dans lequel le, au moins un, microorganisme testé est susceptible de se développer. Il s'agit donc d'un milieu qui peut être naturel ou synthétique. Ainsi, par exemple, l'eau entre dans cette définition. Par la suite dans le présent texte l'expression "milieu de culture" ou les termes "milieu" ou "culture" pourront être employés indifféremment en référence à cette définition.
Des milieux liquides susceptibles d'être utilisés dans la présente invention comprennent tous les milieux liquides utilisés dans l'état de la technique pour la culture de microorganismes, notamment ceux précités. Il peut s'agir par exemple d'un milieu liquide avec l'un ou plusieurs des éléments suivants : une source de carbone, par exemple du glucose, du lactose ou un autre sucre ou oside ; une source d'azote ; des ions Na+, K+, Cal+ et des oligoéléments ; d'un milieu liquide au thioglycolate, d'un milieu liquide complété avec des acides aminés, etc. Le milieu pourra être choisi en fonction du microorganisme comme cela est présenté dans l'article Peter C.T. Hannan, Guidelines and recommendations for antimicrobial minimum inhibitory concentration (MIC) testing against veterinary mycoplasma species , Vet. Res. 31 (2000) 373-395. D'autres exemples de milieu de culture susceptible d'être utilisés dans la présente invention peuvent être choisis par exemple parmi le milieu Coeur-Cervelle (ou Brain-Heart Infusion medium, ou BHI, qui sera utilisé dans l'exemple d'antibiogramme), le milieu tryptic soy broth plus yeast extract (TSBYE), le milieu Luria-Bertani (LB), le milieu Clark et Lubs, le milieu Hugh et Leifson, le milieu King A et King B, le milieu bouillon coeur-cervelle, le milieu Rappaport, un milieu Hypersalée, un milieu Hyperbilié, un milieu érythropoïétine (EPO) supplémenté de saccharose, etc...
Selon l'invention, les conditions de réalisation du procédé de l'invention, en particulier de culture du microorganisme, sont des conditions de cultures standardisées, par exemple le pH, la température, l'oxygénation, etc. Le procédé de l'invention permet également, avantageusement, de tester différents temps de culture ; différentes températures ; différentes conditions par exemple aérobie, anaérobie, avec ou sans agitation, avec sans renouvellement du milieu etc. afin d'améliorer les conditions de culture. Selon l'invention dans le casd'utilisation de bactéries anaérobies, les conditions de culture anaérobie du microorganisme pourront êtres obtenues par obturation de l'extrémité ouverte du réacteur de culture par exemple à l'aide de parafilm, d'un bouchon etc. ou en mettant ledit réacteur dans des conditions permettant le développement des bactéries anaérobies. Selon l'invention, la, au moins une, particule, peut être choisie 1 o dans le groupe comprenant une particule chargée électriquement, une particule magnétique, une particule revêtue d'au moins une couche magnétique, une particule magnétisable, une particule revêtue d'une couche magnétisable, ou un mélange de deux ou plusieurs de ces particules. En fait, il peut s'agir de toute particule permettant de mettre en 15 oeuvre la présente invention. Selon l'invention, la particule repose sur une surface immergée dans le milieu de culture ou flotte à la surface du milieu de culture. Ladite particule est en position stable, c'est-à-dire au repos, en l'absence du champ magnétique dans le réacteur. Avantageusement, ladite particule 20 peut être une particule de toute forme adaptée à la mise en oeuvre de la présente invention, par exemple sous forme de bille, de palet, de forme géométrique asymétrique, par exemple avec une face plane, etc. Toute taille appropriée de particule magnétique peut-être utilisée. La taille peut être choisie par exemple en fonction de la taille du 25 microorganisme, et/ou de la taille du compartiment contenant le milieu de culture pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention et/ou du biofilm. La taille peut être par exemple de taille sensiblement identique à la taille du microorganisme générant le biofilm de manière à ce que là, au moins une, particule puisse être incorporée dans ledit biofilm, l'objectif étant d'utiliser 30 la particule magnétique comme un équivalent inerte du microorganisme. Quand cette particule est mobile, les microorganismes de même taille peuvent aussi se mouvoir. Quand cette particule est immobilisée, les microorganismes de même taille ne peuvent pas non plus se déplacer. D'autre part, des particules de tailles variées peuvent permettre une analyse plus fine de la structure du biofilm : dimension des espaces au sein de la structure, organisation tridimensionnelle, stabilité de l'adhérence à la surface, par exemple au fond du tube ou de la cupule de la plaque de microdilution, dans laquelle le test est réalisé. En effet, les biofilms tendent à se détacher par lambeaux (squames) de leur support en vieillissant. Dans ce cas, on observe alors une première phase d'immobilisation de là, 1 o au moins une, particule lors du développement du biofilm. Puis une phase de dégénérescence du biofilm avec libération de là, au moins une, particule. Par exemple la particule magnétique peut présenter une taille de par exemple de 10nm à 100pm, par exemple de 0,1 à 10pm (taille des 15 microorganismes les plus courants). Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, plusieurs particules peuvent être utilisées pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention. Lorsque les particules sont incorporées dans un biofilm, l'application du champ magnétique ne permet pas de provoquer de 20 mouvement desdites particules incorporées dans ledit biofilm. Ainsi, les particules ne peuvent pas être regroupées pour être détectées. Lorsque les particules ne sont pas incorporées dans ledit biofilm, l'application du champ magnétique provoque le mouvement desdites particules et le regroupement de ces dernières. Ce regroupement peut avantageusement 25 être détecté visuellement. Selon ce mode particulier de réalisation, les particules peuvent être de tailles identiques ou différentes. Lorsque les particules sont de tailles identiques, les particules sont essentiellement incorporées en même temps dans le biofilm lors de 30 sa formation. Lorsque les particules utilisées sont de tailles différentes, la taille des petites particules peut être choisie par exemple, de manière à ce qu'elles soient incorporées dans le biofilm dès le début de sa formation, les grosses particules étant incorporées plus tardivement. Dans ce cas, les particules de plus petites tailles sont incorporées avant les particules de plus grande taille.
Lorsque les particules sont de tailles différentes, les petites particules peuvent présenter une taille, par exemple, de 10 nm à lpm, par exemple de 100 à 500nm, et les grosses particules peuvent présenter une taille, par exemple, de 1 pm à 100pm, par exemple de lpm à 10pm, par exemple de lpm à 5pm. Bien sûr, la taille respective des grandes et des 1 o petites particules est choisie de manière à pouvoir déterminer différents stades de développement du biofilm comme décrit ci-dessous. En absence de biofilm, l'application du champ magnétique permet le rassemblement de toutes les particules de toutes les tailles. Au début de la formation du biofilm les petites particules sont d'abord incorporées dans celui-ci, et 15 l'application du champ magnétique ne permet de rassembler que les grosses particules. A un stade ultérieur du développement du biofilm, toutes les particules sont incorporées dans le biofilm et l'application du champ magnétique ne permet plus le rassemblement des particules. Ainsi la détection du mouvement des différentes particules permet de déterminer 20 différents stades de développement du biofilm. Cette différence dans le résultat, visible en fonction du temps de formation du biofilm, permet par exemple de mettre en évidence des antibiotiques agissant à différents stades de formation du biofilm. On peut par exemple mettre en évidence des antibiotiques pouvant avoir une action sur la formation du biofilm 25 constitué essentiellement de corps bactérien, ou sur la production d'une matrice de biofilm, par exemple le glycocalyx constitué de polymères, par exemple d'ExoPolySaccharide. Selon l'invention, on peut également utiliser une pluralité de particules de tailles identiques avec une magnétisation différente. Si les 30 particules sont partiellement incorporées dans le biofilm, l'application du champ magnétique provoque un mouvement des particules ayant été plus fortement magnétisées, la force magnétique est plus grande, tandis que les particules qui ont été plus faiblement magnétisées ne peuvent être mises en mouvement. Si le biofilm est complètement formé les particules incorporées, quelque soit leur magnétisation, ne peuvent pas être mises en mouvement. Enfin si aucun biofilm n'est présent, l'application du champ magnétique provoque un regroupement de toutes les particules. Selon l'invention, ladite, au moins une, particule est de préférence une particule génératrice d'un signal détectable. La détection de ce signal sera fonction des propriétés de la particule. À titre d'exemple, ladite, au moins une, particule peut être fluorescente, phosphorescente, radioactive, chimioluminescente, réfléchissante ou coloré. Par exemple dans le cas où là, au moins une, particule est fluorescente, la fluorescence émise par la particule peut être détectée par exemple visuellement, et/ou par tous moyens optiques connue de l'homme du métier. Ladite, au moins une, particule peut être par exemple éclairée, pour suivre son mouvement au moyen d'une source lumineuse, par exemple par un faisceau laser. Par exemple dans le cas où là, au moins une, particule est phosphorescente, cette particule peut être visualisée par exemple visuellement, par tous moyens optiques connue de l'homme du métier. Par exemple dans le cas ou la particule est radioactive, cette particule peut être détectée même au travers de liquides ou milieux de cultures optiquement opaques, ainsi qu'au travers de plaques de microdilution optiquement opaques par tous dispositifs de détection de la radioactivité émise connue de l'homme du métier, notamment la méthode classique de révélation sur film autoradiographique. Il suffit alors de plaquer le film sensible sous la plaque de microdilution et de révéler ensuite l'image du fond de ladite plaque de microdilution. Par exemple dans le cas où là, au moins une, particule est 3o chimioluminescente la détection de la particule peut se former par ajout dans le milieu du réactif chimique permettant l'émission d'énergie lumineuse par les particules. La détection de ce signal peut être par exemple visuelle et/ou par tous moyens connus de l'homme du métier notamment par l'utilisation de caméra CCD ( Charges Coupled Device ) sensible aux longueurs d'ondes émises, qui balaient (scannent) les cupules de la plaque de microdilution. Par exemple dans le cas où là, au moins une, particule est réfléchissante la détection de la particule peut être par exemple visuelle ou par tous moyens optiques connue de l'homme du métier. Avantageusement, ladite, au moins une, particule peut être par exemple éclairée, pour suivre son mouvement au moyen d'une source lumineuse, par exemple par un faisceau laser. Par exemple dans le cas où là, au moins une, particule est colorée, la détection de la particule peut être par exemple visuelle et/ou par tout moyen connue de l'homme du métier pour la détection de particules colorées. Selon l'invention, les particules peuvent avantageusement être choisies de couleurs différentes en fonction de leur taille et/ou en fonction de leur pouvoir magnétique. L'application du champ magnétique permet dans ce cas l'apparition d'un point coloré sur la surface par regroupement des particules. Cette caractéristique permet avantageusement une détection visuelle facilitée du regroupement. En effet, par exemple dans le cas où les particules sont de deux tailles différentes, les grosses particules étant d'une couleur et les petites d'une autre, lors de l'application du champ magnétique si la formation du biofilm est faible les petites particules restent immobilisées dans le biofilm tandis que les grosses particules non incorporées dans le biofilm sont regroupées. Ce regroupement est visible par l'apparition d'un point coloré qui dans ce cas est identique à la couleur des particules de plus grande taille. Si aucun biofilm n'est présent dans le milieu, les petites et les grandes particules peuvent êtres regroupés et le rassemblement des particules est visualisé par apparition d'un point coloré correspondant à la superposition des deux couleurs. Enfin si le biofilm est formé, les particules sont piégées dans le biofilm, elles ne peuvent donc pas êtres regroupés et aucun point de couleur n'est visible. L'homme du métier comprendra aisément que pour la réalisation de la présente invention, le choix des propriétés visuelles de là, au moins une, particule peut également se faire en fonction du milieu. En effet la détection du mouvement de ladite, au moins une, particules est d'autant plus facile que le contraste entre ladite, au moins une, particule et le milieu de culture est grand. L'état de formation du biofilm, et donc la mobilité des particules, 1 o est révélateur de la sensibilité du microorganisme vis-à-vis de l'antibiotique.
Dans la présente invention, le champ magnétique peut être tout champ magnétique permettant de mettre en mouvement ladite, au moins 15 une particule sur ladite surface immergée dans ledit milieu de culture ou à ladite surface dudit milieu de culture, par exemple un champ électromagnétique ou un champ magnétique. Le champ magnétique, ou électrique ou électromagnétique peut être généré, par exemple par un aimant ou par un solénoïde. L'aimant peut être par exemple sous forme de 20 barreau, de pointe, de pièce, etc. ou toute forme appropriée pour la mise en oeuvre de la présente invention. Le champ peut, par exemple être appliqué par tout moyen connu de l'homme du métier, par exemple par impulsion, par augmentation progressive du champ électromagnétique, par variations de champ électromagnétique ou par une combinaison ces 25 applications. Une augmentation progressive du champ électromagnétique peut être obtenue, par exemple, par rapprochement d'un aimant selon une trajectoire rectiligne ou sinusoïdale, ou selon un mouvement oscillant présentant ou non une amplitude d'oscillation et/ou une fréquence 3o variables. Des variations de champ plus complexes peuvent être obtenues, par exemple par rotation ou par des combinaisons de mouvements d'un matériau aimanté à proximité de ladite, au moins une, particule. Ainsi, selon l'invention, ledit champ magnétique peut être généré par des moyens générateurs de champ qui peuvent être ou non en mouvement.
Lorsque plusieurs particules doivent être mises en mouvement, le champ magnétique doit pouvoir regrouper lesdites particules sur ladite surface immergée dans le milieu de culture ou à ladite surface dudit milieu de culture.
1 o Selon l'invention, tout type d'antibiotique peut être testé. L'antibiotique testé peut être choisi, par exemple dans le groupe comprenant l'acide fusidique, les aminosides, les bêta-Lactamines, les pénicillines, les inhibiteurs de bêta-lactamases, les céphalosporines, les carbapénèmes, les monobactames, la cyclosérine, la daptomycine, la 15 fosfomycine, les lincosamides, les macrolides et kétolides, la mupirocine, les nitro-imidazolés, les nitrofuranes, les oligosaccharides, les oxazolidinones, les polypeptides : bacitracine, glycopeptides, polymyxines et colistine, les quinolones, les rifamycines, les sulfamides et les diaminopyridines, les synergistines, les tétracyclines, les antifongiques, 20 etc. Selon l'invention, l'antibiotique peut-être en solution dans le milieu de culture et/ou fixé sur surface immergée dans ledit milieu. Les moyens de fixation utilisables de l'antibiotique sont ceux connus de l'homme du métier pour la fixation d'un antibiotique sur une 25 surface. Il existe plusieurs techniques de couplages, par exemple celles proposées par les fournisseurs de plaques de microdilution NUNC (Danemark), Corning (Etats-Unis), et Greiner Bio-One (Autriche). Selon l'invention, on peut introduire dans le milieu de culture un ou plusieurs antibiotiques. Ainsi, il est possible de tester différents 30 antibiotiques seuls et/ou de rechercher un effet de combinaison s d'antibiotiques. La mise en oeuvre du procédé de l'invention avec un 22 antibiotique permet de déterminer s'il agit sur le développement du biofilm ou s'il agit sur la croissance du microorganisme ou s'il agit sur les deux. La mise en oeuvre du procédé de l'invention avec un mélange d'antibiotiques (combinaison) permet de détecter d'éventuels effets additifs, synergiques et/ou antagonistes. Par effet additif , on entend l'addition des actions d'au moins deux antibiotiques permettant, par exemple, de trouver une combinaison d'antibiotiques ayant un même effet antibiotique qu'un antibiotique seul, mais avec des concentrations inférieures. Par effet synergique , on entend une amélioration de l'efficacité d'un antibiotique 1 o par ajout d'au moins un deuxième antibiotique, ce mélange d'antibiotiques ayant un effet supérieur à l'addition de l'effet de chaque antibiotique seul. Enfin par effet antagoniste on entend l'inhibition de l'action d'un antibiotique sur le microorganisme par l'ajout d'au moins un deuxième antibiotique. Ce mode de réalisation peut permettre de sélectionner des 15 combinaisons d'antibiotiques ( co-drug ) pertinentes pour, par exemple, inhiber le développement du microorganisme. Selon l'invention, les antibiotiques peuvent également êtres introduits successivement dans le milieu afin d'identifier des effets additifs, synergiques ou antagonistes tels que décrit précédemment. 20 Le procédé de l'invention peut-être précédé d'une étape permettant de déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) de l'antibiotique vis-à-vis dudit microorganisme. Cette étape préliminaire peut être effectuée par des techniques connues de l'homme du métier ou par le 25 procédé même de l'invention, comme exposé ici. Les techniques de l'art antérieur utilisables sont, par exemple, les techniques classiques de réalisation des antibiogrammes basées sur des méthodes de dilutions, des méthodes de diffusion ainsi que d'autres techniques comme le Etest (marque déposée) (AB Biodisk) ou des techniques automatiques. 30 Selon l'invention, l'étape préliminaire de détermination de la CMI peut également consister à recueillir des données de la littérature, comme 23 par exemple celles fournies par le Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie. Ce mode de réalisation permet, par exemple, de suivre l'évolution de la CMI d'un microorganisme au cours du temps. En effet, connaissant la CMI d'un microorganisme, on peut utiliser le procédé de l'invention pour suivre l'évolution dans le temps du comportement du microorganisme vis-à-vis de l'antibiotique. Ainsi il est possible de détecter facilement l'émergence d'une résistance éventuelle dudit microorganisme audit antibiotique. Ce mode de réalisation permet, par exemple également de déterminer si l'augmentation de la CMI par rapport aux données de l'état de la technique d'un microorganisme vis-à-vis d'un antibiotique est concomitante avec la formation d'un biofilm par celui-ci. La présente invention permet par exemple de tester des micro-organismes conservés dans des collections afin de suivre leur évolution.
Le procédé de l'invention permet d'identifier une évolution de ces microorganismes vis-à-vis de la CMI mais également une évolution vis-àvis de la formation d'un biofilm. Le procédé de l'invention permet également, avantageusement, de déterminer la concentration minimale de l'antibiotique inhibant la formation du biofilm par ledit microorganisme. Cette concentration minimale correspond à la Concentration Minimale Inhibitrice de la formation d'un biofilm (CMIb). Pour cela on peut réaliser successivement ou simultanément le procédé de l'invention dans des conditions identiques utilisant un milieu de culture liquide approprié au développement d'un microorganisme, au moins une particule magnétique ou magnétisable, un microorganisme et un antibiotique dans une concentration différente d'une réalisation à une autre. Ladite concentration d'antibiotique peut être établie par exemple selon une suite géométrique de raison '/2 à partir d'une concentration initiale X, par exemple X, X/2, X/4, X/8, etc., ou de tout autre suite géométrique appropriée. On met en oeuvre le procédé de l'invention et parmi les réalisations la première où le biofilm ne se développe pas, 24 c'est-à-dire dans laquelle les particules sont mobiles, la concentration d'antibiotique correspond à la concentration minimale inhibitrice pour la formation du biofilm. Ainsi, on détermine la concentration minimale d'antibiotique à partir de laquelle le microorganisme est sensible à l'antibiotique dans la formation de biofilm, c'est-à-dire la concentration minimale pour laquelle la, au moins une, particule peut être mise en mouvement par application du champ magnétique dans un desdits compartiments. On peut également réaliser le procédé de l'invention avec une concentration d'antibiotique nulle, ladite réalisation constituant un témoin de croissance du microorganisme dans le milieu de culture. Un autre témoin peut consister à valider la stérilité du milieu en présence de particules pendant la durée du test. Un autre témoin peut consister à valider que l'antibiotique ne provoque pas d'artéfacts dans le milieu en présence de particules. Selon un mode particulier de mise en oeuvre, le procédé de l'invention peut comporter en outre une étape c) de prélèvement du milieu de culture et de mesure de la densité optique dudit milieu de culture, à une longueur d'onde permettant de détecter le développement du microorganisme dans le milieu de culture. Selon ce mode de mise en oeuvre de l'invention, le prélèvement dudit milieu de culture peut être réalisé par toutes les techniques connues de l'homme du métier, par exemple au moyen d'une pipette, d'une seringue, d'un capillaire, par exemple aussi par prélèvements automatiques, par exemple via un système de pipette automatique. La mesure de densité optique permet de déterminer si la croissance des bactéries en suspension a été modifiée par la présence de l'antibiotique. Ceci permet également de définir la concentration minimale d'antibiotique nécessaire pour inhiber la croissance bactérienne. Par exemple comme indiqué précédemment pour la détermination de la CMIb, le procédé de l'invention est réalisé successivement avec différentes 25 concentrations d'antibiotique et après incubation le milieu est prélevé et une mesure de la densité optique est réalisée. La concentration minimale d'antibiotique pour laquelle la croissance bactérienne en suspension a été inhibée par l'antibiotique correspond à la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI). Ainsi la présente invention permet d'une part de révéler la sensibilité du microorganisme vis-à-vis de la formation d'un biofilm et d'autre part d'identifier l'effet de l'antibiotique sur la croissance bactérienne en suspension dans le milieu de culture. L'antibiotique est souvent défini 1 o comme une substance antibactérienne à toxicité sélective. La présente invention permet donc avantageusement de mettre en évidence des antibiotiques agissant spécifiquement (de manière ciblée) sur la croissance du microorganisme dans le milieu de culture, spécifiquement sur le développement du biofilm sur une surface immergée 15 dans le milieu de culture, ou à la fois sur la croissance bactérienne en solution et sur le développement du biofilm sur la surface.
Ainsi, la présente invention permet également de déterminer dans le milieu de culture la Concentration Minimale Inhibitrice de la 20 formation d'un biofilm par un microorganisme (CMIb) et la Concentration minimale Inhibitrice (CMI) dudit microorganisme.
Comme indiqué précédemment les antibiotiques utilisés dans la présente invention peuvent être en solution ou fixés sur une surface 25 immergée dans le milieu de culture. Dans le cas où l'antibiotique est préalablement fixé sur une surface, le procédé de l'invention permet de déterminer la quantité d'antibiotique minimum par unité de surface pour inhiber la formation dudit biofilm. Pour cela, par exemple comme indiqué précédemment pour la détermination de la CMI et de la CMIb, le procédé 30 de l'invention est réalisé plusieurs fois avec des quantités d'antibiotiques fixées selon une suite géométrique de raison 1/2. La Quantité Minimale Inhibitrice d'antibiotique fixée par unité de surface (QMIs) pour laquelle la formation du biofilm est inhibée est la quantité d'antibiotique par unité de surface la plus faible pour laquelle le développement du biofilm est inhibé. Cette valeur présente un intérêt particulier pour lutter contre tous les biofilms qui se forment sur des surfaces telles que par exemple sur des cathéters, des sondes urinaires, des prothèses ou autres matériaux médicaux afin de prévenir des infections nosocomiales.
Quel que soit le mode de mise en oeuvre de l'invention, le 1 o procédé de l'invention peut avantageusement être réalisé simultanément dans une pluralité de compartiments. Dans ce cas, pour la mise en mouvement des particules dans lesdits compartiments, une pluralité de champs magnétiques, par exemple d'aimants, peuvent avantageusement être utilisés. Les aimants peuvent 15 par exemple êtres fixés sur un support de telle manière à permettre une juxtaposition de chaque compartiment dans lequel on réalise le procédé de l'invention avec un aimant du support. L'application du champ magnétique sur lesdits compartiments est indépendante d'un compartiment à un autre. Le champ magnétique appliqué auxdits compartiment peut être identique 20 ou différent d'un compartiment à l'autre, de préférence identique. Par compartiment dans la présente invention, on entend par exemple un réacteur de culture, des cupules, des tubes ou des puits par exemple de plaques de microdilution. On entend par plaque de microdilution le type de plaque défini par exemple par l'American National 25 Standards Institute et la Society for Biomolecular Screening ( microplates ) portant 96 puits, 384 et même 1536. Le matériau constituant ledit compartiment peut être tout matériau adapté à la réalisation de la présente invention, par exemple du plastique, par exemple du polycarbonate, du polystyrène, etc., du verre, du 30 métal, etc. Avantageusement, on peut utiliser des plaques de microdilution en polystyrène présentant des cupules sans fonds. Le fond de ces cupules 27 est obtenu en fixant une surface plane sous la plaque de microdilution. Cette surface plane peut être en matériaux transparents, par exemple en plastique, en verre, etc. ou en matériaux opaques, par exemple en métal, en céramique, etc. Le mode de fixation de la surface plane sous la plaque de microdilution peut être tout mode approprié connu de l'homme du métier pour une telle fixation, par exemple par collage au moyen d'une colle, par une méthode par friction, par collage par fusion de la matière plastique, par exemple au laser, etc. Selon l'invention, les différents compartiments peuvent êtres regroupés sur un même support, par exemple sur une plaque comportant de 1 à 396 puits, par exemple 6, 16, 64, 96, etc. Le Compartiment peut correspondre par exemple à une enceinte avec une extrémité fermée, du type tube, puits, etc. ou une enceinte présentant deux ouvertures.
Selon une première configuration, le compartiment peut présenter une extrémité fermée de sorte à former un fond plat. Selon une seconde configuration, le compartiment peut présenter une extrémité fermée de sorte à former un fond hémisphérique. Selon une troisième configuration, le compartiment peut 2o présenter deux extrémités ouvertes. Dans cette configuration ledit compartiment peut être configuré afin de permettre un écoulement du milieu de culture en flux constant ou en flux discontinu. Selon l'invention, le procédé peut-être réalisé par exemple dans une pluralité de compartiments comprenant chacun : 25 - ledit milieu de culture, - ladite, au moins une particule, et - ledit microorganisme, -ledit antibiotique, des compartiments comprenant une concentration différente dudit 30 antibiotique d'un compartiment à l'autre. Selon l'invention dans l'un desdits compartiments la 28 concentration d'antibiotique peut être nulle, ledit compartiment représentant un témoin de culture dudit microorganisme sans antibiotique. Un autre desdits compartiments peut être dépourvu de microorganisme, ce compartiment constituant un témoin de stérilité du milieu.
Le procédé de l'invention permet donc, avantageusement, de déterminer la concentration minimale de l'antibiotique inhibant la formation du biofilm (CMIb) pour ledit microorganisme par la réalisation du procédé de l'invention dans les différents compartiments en une seule étape sur un seul support. 1 o Le procédé de l'invention permet donc également, avantageusement, de déterminer la concentration minimale inhibitrice d'un antibiotique pour la croissance bactérienne (CMI) pour ledit microorganisme par la réalisation du procédé de l'invention dans les différents compartiments en une seule étape sur un seul support. 15 Le procédé de l'invention permet donc également, avantageusement, de déterminer la Quantité Minimale Inhibitrice d'antibiotique fixée inhibant la formation du biofilm (QMIs) pour ledit microorganisme par la réalisation du procédé de l'invention dans les différents compartiments en une seule étape sur un seul support. 20 Selon l'invention, on peut également déterminer, avantageusement, la concentration minimale inhibitrice dudit antibiotique vis-à-vis de la croissance dudit microorganisme en suspension dans chaque compartiment à partir desdits prélèvements et mesures de densité optique, à une longueur d'onde permettant de détecter le développement 25 du microorganisme, desdits prélèvements. Selon l'invention, la détermination de la CMI, et/ou de laCMIb et/ou de la QMIs peut être réalisée simultanément sur un même support pour au moins un microorganisme vis-à-vis d'au moins un antibiotique. Selon l'invention, on peut tester différents microorganismes en 30 même temps, lesdits microorganismes étant répartis dans différents compartiments avec au moins un antibiotique. Selon l'invention, 29 l'antibiotique utilisé peut être identique ou différent pour chaque microorganisme.
Le procédé de l'invention présente donc un très grand intérêt, par exemple dans la lutte contre les bactéries multi-résistantes présentes notamment en milieu hospitalier et qui sont à l'origine des infections nosocomiales.
Le procédé de l'invention peut par exemple être utilisé pour la mise en oeuvre d'un antibiogramme d'aide à la prescription : à l'image des tests de dépistage d'angines à streptocoque (pour savoir s'il convient ou non d'administrer un antibiotique), on peut tester in-vitro un microorganisme prélevé chez un patient, par application du procédé de l'invention. Ce microorganisme peut alors être testé avec différents antibiotiques, par exemple sur un seul support d'analyse, pour optimiser le traitement de ce patient. L'application du procédé sur ledit microorganisme permet de vérifier que le micro-organisme est bien sensible à des antibiotiques à une concentration par exemple égale à la CMI. Dans le cas où le microorganisme présente une résistance aux antibiotiques testés, le procédé de l'invention permet de savoir si celle-ci est concomitante avec la présence d'un biofilm. De ce fait une sélection d'antibiotiques ayant un effet sur les microorganismes en solution mais aussi sur le développement de biofilm dudit microorganisme testé est possible. Le procédé de l'invention permet donc de proposer des associations d'antibiotiques ( co- drug ) afin d'inhiber plus efficacement le développement dudit microorganisme. Le procédé de l'invention peut permettre également de suivre in-vitro l'évolution de la CMI d'un microorganisme d'un patient vis-à-vis d'un antibiotique. Cet aspect est important pour des traitements au long cours, ou pour des malades immunodéprimés sujets à des infections chroniques avec le même micro-organisme. Le procédé de l'invention permet de suivre l'apparition d'une résistance à un traitement, par exemple suite au développement par ledit micro-organisme d'un biofilm. Le procédé permet alors de trouver d'autres antibiotiques plus aptes à inhiber la croissance dudit microorganisme. D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif.
10 Brève description des figures ù La figure 1 est une représentation schématique d'un mode de réalisation du procédé de détection de la sensibilité d'un microorganisme à un antibiotique dans la formation d'un biofilm dans des tubes à fond plats sur une plaque de microdilution 96 puits. 15 ù La figure 2 représente des images du fond de deux puits avant (t) et après (t1) magnétisation après mise en oeuvre du procédé de l'invention ; ù La figure 3 représente la réalisation du procédé de détection de la sensibilité d'un microorganisme à un antibiotique dans la formation d'un 2 0 biofilm dans un tube avec des extrémités ouvertes. ù La figure 4 représente un tableau de résultats expérimentaux de mise en oeuvre de la présente invention incluant les photographies des résultats exposés dans le tableau 1 de l'exemple 1.
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EXEMPLES Exemple 1 : Antibiogramme Matériel utilisé : 30 Concernant l'utilisation du dispositif de l'invention, on se référera à la demande internationale WO 2005/090944. En particulier, le dispositif utilisé pour mettre en oeuvre la présente invention dans cet exemple est schématisé sur la figure 1 annexée. Sur cette figure : PM = plaque de microdilution 96 puits PU = puits CU = culot ou fond du puits vu du dessous, les culots vides (blancs) correspondant à l'absence de regroupement des particules magnétiques et le culot avec un gros point noir correspondant à un regroupement des 1 o particules magnétiques. PI = Pipette pour déposer 200pL de milieu de culture + particules par puits IN = Incubateur LE = Lecteur BioFilm Control (étape de lecture par relevé d'image numérique) 15 l min = étape de magnétisation pendant 1 minute, la PM est posée sur un socle portant 96 aimants (Al) centrés sous chacun des 96 puits de la PM Al = Aimant centré sous chaque puits pendant l'étape de magnétisation MO = MicroOrganisme (bâtonnets blancs dans le puits) PA = Particules magnétiques (sphères noires dans le puits) 20 On retrouve également sur ce schéma les étapes d'analyse présentées ci-dessous : • lère image de fonds de puits (CU) par relevé d'image numérique (scan) avant magnétisation (à gauche). 25 ^ Etape de magnétisation au-dessus de l'accolade intitulée 1 minute : chaque aimant (Al) est centré sous le fond de chaque puits. • 2ème image de fond de puits par relevé d'image numérique après magnétisation (à droite). 30 La lère image présente une image unie, témoin de la répartition 32 homogène des particules au fond du puits. La 2ème image présente : - soit un spot constitué des particules attirées par l'aimant pendant l'étape de magnétisation, témoignant de la mobilité des particules ; - soit une image unie, témoin de la répartition homogène des particules comme sur la 1ère image, témoignant de l'immobilité des particules, ayant résisté à l'attraction magnétique exercée par l'aimant La figure 2 annexée représente des images du fond de deux puits avant (t) et après (t1) magnétisation après mise en oeuvre du procédé de l'invention. Dans le cas A, les particules sont mobiles sur la surface du fond du tube et se réunissent pour former un point noir visible (t1 ,A). Dans le cas B, les particules sont immobilisées par un biofilm sur la surface (t1, B).
Protocole Dans cet exemple, on réalise le procédé de l'invention dans les puits de plaques de microdilution 96 puits BioFilm Control (Biopole Clermont-Limagne, 63360 Saint-Beauzire, France). On utilisera pour cet exemple une version de plaque portant 12 barrettes (numérotées de 1 à 12) de 8 puits (puits A, B, C, D, E, F, G et H, voir tableau 1 et figure 4). On préparera autant de barrettes que nécessaire pour réaliser les mesures aux temps 0 heure, 2 heures, 4 heures, 6 heures, 8 heures et 24 heures, c'est-à-dire 6 barrettes de 8 puits. Le milieu de culture est constitué de BHI (Brain Heart Infusion medium) provenant de la société Difco (Difco, Detroit, MI, USA). On utilise le milieu de culture BHI maintenu à 37 C dans un bain-marie pour réaliser toutes les étapes nécessaires dans la réalisation du test, notamment les dilutions successives, puis les incubations Les particules magnétiques utilisées dans le procédé sont le Toner TON001 provenant de la société BioFilm Control (Biopole Clermont-Limagne, 63360 Saint-Beauzire, France) avec une taille de 1 pm de diamètre. En général, on utilise de l'ordre de 105 à 106 particules dans chaque puits de la plaque de microdilution. Le champ magnétique est réalisé à l'aide d'un bloc portant 96 mini-aimants BioFilm Control. La plaque de microdilution est calée sur le bloc de façon à ce que les 96 mini-aimants soient centrés sous le fond de chacun des 96 puits de la plaque de microdilution.
L'antibiotique utilisé est l'ampicilline (fournisseur SIGMA, MO, USA). L'antibiotique est testé aux concentrations suivantes : 200, 100, 10, 1, et 0,1 pg/mL. La progression est géométrique de raison 10, sauf pour la concentration la plus importante limitée à 200 pg/mL. En effet, la CMI est de l'ordre de 10pg/mL. (entre 4 et 16pg/mL pour l'ampicilline en solution selon les valeurs relevées dans les "recommandations 2007 du Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie"). Cette dose a été encadrée par des dilutions de raison 10 pour être certain d'observer un effet/dose net. Une concentration de 1000pg/mL ayant été jugée excessive, il a été choisi dans cet exemple de tester seulement un maximum de 200pg/mL sans compliquer les conditions de réalisation du test. Le microorganisme est une bactérie Staphylococcus xylosus DSM 20267 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH ou DSMZ, collection allemande de microorganismes). L'inoculât de staphylococcus x. DSM 20267 est préparé comme suit : on utilise un isolat sur boîte de Pétri (contenant un milieu de culture gélosé), prélevé avec une oese stérile et remis en suspension dans du milieu de culture liquide en tube, une nuit à 37 C. Ensuite, la densité optique de cette culture sur la nuit est ramenée à 1 par dilution en milieu de culture, puis diluée au 1/250ème en milieu de culture. Cette dernière dilution constitue l'inoculât dans le test.
Pour connaître la concentration en staphylocoque de l'inoculât, plusieurs dilutions de raison 10 sont réalisées (100pL de l'isolat dilués dans 900pL de milieu de culture) plusieurs fois itérativement. Ensuite, 100pL de ces dilutions sont étalés sur boîte de Pétri (contenant un milieu de culture gélosé). Après 24 ou 48 heures d'incubation à 37 C, il suffit de repérer la boîte de Pétri où les colonies sont toutes bien isolées (ce qui correspond à un certain niveau de dilution de l'isolât) et compter le nombre de colonies visibles, toutes isolées. L'inoculât du test contient en général entre 104 et 105 cfu ( colony forming unit ou unité formant colonie), en fonction de la souche de microorganisme.
Différents puits témoins sont prévus: - Puits A : le milieu de culture avec des particules sans antibiotique et sans microorganismes. Ce puits permet de valider le comportement des particules seules dans le milieu de culture (T1) ; - Puits B : le milieu de culture avec un microorganisme, sans antibiotique, ce puits est le témoin de viabilité, permettant de valider le comportement normal du microorganisme dans le milieu (T2) ; -Puits H : le milieu de culture avec des particules avec un antibiotique et sans microorganismes, ce puits permettant de démontrer que l'antibiotique ne provoque pas d'artéfacts (images insolites) avec les particules (T3).
Les seuls effets observés dans les puits seront donc liés à la présence des microorganismes et de l'antibiotique.
Mise en oeuvre du procédé de l'invention : Préparation de la qamme de dilution d'ampicilline : On prépare au préalable des dilutions d'ampicilline dans le BHI à partir d'une solution mère contenant 2mg/mL d'ampicilline. La solution mère d'ampicilline a été préparée par pesée de 30mg dilués dans 15mL de BHI. Ensuite un volume de 2,5mL de la solution mère est dilué dans 13,5mL de BHI pour obtenir une solution titrant 200pg/mL d'ampicilline. Puis 4mL de la solution 200pg/mL sont dilués dans 4mL de BHI pour obtenir une solution titrant 100pg/mL. Puis 1 mL de la solution 100pg/mL est dilué dans 9mL pour obtenir une solution titrant 10pg/mL. La même opération est répétée pour réaliser les solutions titrant 1 pg/mL et 0,1 pg/mL.
Préparation des témoins : 1 o On prépare les solutions témoins en quantité nécessaire pour le test : il faut un témoin par temps de lecture (0, 2, 4, 6, 8 et 24 heures) et on dépose 200pl dans chaque puits. Pour le témoin Ti de stérilité, on mélange 2mL de BHI avec 36pL de Toner TON001. On répartit 200pL de cette solution dans les puits 15 de la ligne A sur les 6 barrettes (voir tableau des résultats). Pour le témoin T2 de viabilité, on dilue 20pL de l'inoculât dans 5mL de BHI, et on ajoute ensuite 36pL de Toner TON001 que l'on mélange. On dépose 200pL de cette solution dans les puits de la ligne B sur les 6 barrettes. 20 Pour le témoin T3 montrant que l'ampicilline ne crée pas d'artéfact avec les particules magnétiques (Toner TON001), on mélange 2mL de la solution titrant 200mg/mL d'ampicilline avec 36pL de Toner TON001. On répartit 200pL de cette solution dans les puits de la ligne H sur les 6 barrettes. 25 Préparation des puits tests : Pour tester l'effet de 200pg/mL d'ampicilline sur la croissance d'un biofilm, on dilue 20pL de l'inoculât dans 5mL de la solution de BHI titrant 200pg/mL, et on ajoute ensuite 36pL de Toner TON001 que l'on 30 mélange. On dépose 200pL de cette solution dans les puits de la ligne C sur les 6 barrettes.
On réalise la même opération pour tester l'effet de 100, 10, 1 et 0,1 pg/mL d'ampicilline, en déposant les solutions respectivement dans les puits D, E, F et G sur les 6 barrettes. Description du protocole du test : 1) On a préparé différentes dilutions, ici X, X/2, X/20, X/200, X/2000 à partir d'une concentration initiale de 200pg/mL de l'antibiotique à tester pour déterminer le plus précisément possible la Concentration Minimale Inhibitrice de la formation du biofilm; 2) On a réparti ces dilutions réalisées avec le milieu de cultures dans chaque puits d'une microplaque sur 6 barrettes avec dans chacun des puits : le micro-organisme (de l'ordre de 105 cfu par puits), les particules magnétiques (de l'ordre de 106 particules par puits) afin observer une différence (visuelle ou par analyse d'image) entre les puits dans lesquels se forme un biofilm et les puis ou aucun biofilm se forme, entre les puits témoins et les puits échantillons, les puits échantillons comportant un microorganisme pouvant former un biofilm qui peut entraver le mouvement des particules magnétisables sous l'effet du champ magnétique. 3) Au temps initial (0 heure) et après incubation de la plaque de microdilution pendant 2 heures, 4 heures, 6 heures, 8 heures et 24 heures, on prélève une barrette 8 puits que l'on place sur le Lecteur BioFilm Control qui permet de relever une image visuelle numérique (scan) du fond des puits par-dessous. L'intérieur du puits est visible par transparence à travers le fond polystyrène desdits puits ; 4) On place ensuite la barrette sur un bloc porte-aimant. Sous chaque puits est centré un mini-aimant. De cette façon, chaque fond de chacun des 8 puits est soumis à un champ magnétique. La magnétisation est maintenue pendant 1 minute; 5) Ensuite, on place sur le Lecteur BioFilm Control qui permet de relever une seconde image visuelle numérique (scan) du fond des puits, après effet du champ magnétique. 6) On compare alors les images avant et après magnétisation soit visuellement (figure 2), soit à l'aide du logiciel d'analyse d'image BioFilm Control Elements (marque déposée) de BioFilm Control (Saint-Beauzire, France).
Les résultats de cette expérimentation sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous et sur la figure 4 annexées. a. dans les puits où on a observé une différence visuelle entre l'image avant et l'image après application du champ magnétique, c'est-à-dire les particules magnétisables ont été rassemblées autour du point de contact de l'aimant, elles sont donc mobiles, rien n'a entravé leur mobilité, il n'y a pas de développement de biofilm de micro-organismes test (-) (tableau 1 et figure 4) ;
b. Dans les puits où on n'a observé aucune différence visuelle entre l'image avant et l'image après application du champ magnétique, c'est-à-dire les particules magnétiques n'ont pas été rassemblées autour du point de contact de l'aimant, les microorganismes ont développé un biofilm entravant la mobilité de ladite, au moins une, particules test (+) (tableau 1 et figure 4) ;
Dans cet exemple, on observe très nettement l'immobilisation progressive des particules en fonction de la dose en ampicilline dans le BHI : - dans les puits B : ce qui est normal, il s'agit des puits témoins de la viabilité du staphylocoque dans les conditions du test ; - dans les puits F et G : ceci indique que le staphylocoque peut développer un biofilm qui immobilise les particules du Toner TON001 en présence de 1 pg/mL et de 0,1 pg/mL d'ampicilline.
Le premier puits où on n'observe pas une immobilisation des particules est le puits E contenant 10pg/mL d'ampicilline, ce qui correspond à la CMI du fournisseur. Le test montre que la CMIb observée correspond à la CMI. Considérant les résultats présentés dans le tableau 1 et la figure 4, la concentration d'antibiotique minimale pour laquelle le microorganisme n'a pas développé de biofilm (CMIb), c'est-à-dire la concentration minimale pour laquelle on observe un rassemblement des particules magnétiques est donc de 10pg/mL.
20
Tableau 1 : résultats expérimentaux de mise en oeuvre de la présente invention (voir aussi figure 4 le même tableau avec les photographies 25 des résultats) Position A B C D E F G H sur la micro- plaque Milieu de BHI BHI BHI BHI BHI BHI BHI BHI culture particules oui oui oui oui oui oui oui oui Staphyllo non oui oui oui oui oui oui non -coque DSM Ampicilline non 0 200 100 10 1 0,1 200 (pg/mL) Commen Témoin Témoin + Gamme Gamme Gamme Gamme Gamme Témoin + -taires Staphyllo Ampicilline Ampicilline Ampicilline Ampicilline Ampicilline Ampicilline coque 0 heures 2 heures 4 heures 6 heures 8 heures + ù ù ù ù + 24 ù + ù ù ù + + heures Exemple 2 : Représentation de la réalisation de l'antibiogramme dans un tube présentant deux extrémités ouvertes.
La figure 3 illustre un autre mode de réalisation de l'invention avec un tube (TU) présentant des extrémités ouvertes. Le tube est configuré pour permettre un flux continu du milieu de culture (FX). Le tube du dessus présente une cupule où se trouve(nt) une ou plusieurs particules (PA). Le tube du dessous présente une plage ou zone plane avec deux cavités, une particule PA, au moins une, reposant sur l'une des cavités. Les conditions de réalisation de l'antibiogramme, le milieu, l'antibiotique, microorganisme sont identiques à ceux utilisés dans l'exemple 1. Selon le même principe que celui de l'exemple 1 un aimant (Al) est présenté de façon à mettre en mouvement la particule magnétique (PA) de façon à ce qu'elle passe d'une cavité à l'autre dans le cas de la zone plane (figure 3, tube du dessus).
Dans le cas de la cupule (figure 3, tube du haut), l'aimant (Al) est présenté et déplacé de façon à remonter lesdites billes le long des parois de la cupule dudit tube (TU). La détection de la sensibilité du microorganisme à l'antibiotique est identique à celle de l'exemple 1, c'est-à-dire si la particule est mise en mouvement après incubation du microorganisme par application de l'aimant, il n'y a pas de biofilm, le microorganisme est donc sensible à l'antibiotique dans la formation de biofilm.
Exemple 3 : Représentation d'un antibiogramme dans un tube à fond plat utilisant plusieurs particules magnétiques. La figure 1 est une illustration du principe de détection de la sensibilité d'un microorganisme à un antibiotique dans le développement d'un biofilm dans un puits (PU) à fond (CU) plat. Les conditions de réalisation de l'antibiogramme sont identiques à celles de l'exemple 1. Le microorganisme, le milieu, la particule magnétique et l'antibiotique sont identiques à ceux utilisés dans l'exemple 1. Les tubes à fond plat (puits) comportent des particules magnétiques (PA) déposées au fond de chaque puits (PU), un milieu de culture, un microorganisme pouvant évoluer en biofilm et un antibiotique, le tout étant dans des conditions de cultures standardisées (température, oxygénation, pH ...). Après incubation, un aimant (Al) est positionné sous le puits (PU). Lorsque les particules (PA) ne rencontrent pas d'obstacle dans leur mouvement ou ne sont pas suffisamment entravées dans la matrice 1 o sécrétée par les bactéries et constituant le biofilm, elles sont attirées en direction de l'aimant et forment un point noir visible à l'oeil nu. Ceci révèle la sensibilité du microorganisme à l'antibiotique dans la formation de biofilm. Lorsque les particules sont englobées dans le biofilm, leur mouvement est entravé voire empêché et elles restent immobiles au fond 15 du tube (culot blanc). On en conclut dans ce cas que le microorganisme n'est pas sensible à l'antibiotique. Une mesure est également faite pour déterminer le nombre de microorganismes présents dans le milieu de culture (en suspension). Cette différence est mesurée par prélèvement du milieu de culture, de l'ordre de 20 50pL, dans chaque puits à l'aide d'une pipette analogue à celle qui a été utilisée pour le dépôt initial de 200pL. On mesure ensuite la densité optique à 580nm du prélèvement de 50pL. Cette mesure permet de mettre en évidence la sensibilité du microorganisme planctonique à l'antibiotique pour la croissance dans le milieu de culture (hors biofilm). 25 Dans d'autres puits, les microorganismes sont présents en plus grand nombre le microorganisme n'est donc pas sensible à l'antibiotique pour la croissance bactérienne. Avec ce dispositif, on a pu mettre en évidence des microorganismes sensibles à un antibiotique dans la formation d'un biofilm, 30 et dans la croissance bactérienne, ainsi que des microorganismes sensibles à un antibiotique, et enfin des microorganismes sensibles à un antibiotique dans la formation d'un biofilm uniquement ou sensible à l'antibiotique pour la croissance bactérienne uniquement.
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Claims (15)
1. Procédé de détermination de la sensibilité d'un microorganisme à un antibiotique susceptible d'empêcher le développement d'un biofilm, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: introduire un milieu de culture liquide approprié au développement dudit microorganisme au moins une particule magnétique ou magnétisable, ladite particule flottant à la surface du milieu de culture ou reposant sur une surface immergée dans le milieu de culture, ensemencer le milieu avec ledit microorganisme, ajouter l'antibiotique à une concentration déterminée dans le milieu, puis, a) maintenir le milieu de culture dans des conditions permettant le développement du microorganisme, b) déterminer la sensibilité du microorganisme audit antibiotique par application d'un champ magnétique destiné à mettre en mouvement ladite, en l'absence de biofilm, au moins une, particule sur ladite surface immergée dans ledit milieu de culture ou à ladite surface dudit milieu de culture, l'absence de mouvement de ladite particule révélant l'insensibilité dudit microorganisme audit antibiotique.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ladite, au moins une, particule est une particule chargée électriquement, magnétique ou magnétisable ou recouverte d'au moins une couche magnétique ou magnétisable.
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel ladite, au moins une, particule est soumise à un champ électromagnétique, éventuellement appliqué par impulsion. 45
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite, au moins une, particule est soumise à une augmentation progressive du champ électromagnétique.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit champ magnétique est généré par des moyens générateurs de champ en mouvement.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 o précédentes, dans lequel ladite, au moins une, particule est éclairée au moyen d'une source lumineuse pour détecter son mouvement.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite particule, au moins une, est génératrice 15 d'un signal.
8. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel ladite particule, au moins une, est fluorescente ou phosphorescente ou radioactive ou chimioluminescente. 20
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant en outre une étape c) de prélèvement du milieu de culture et de mesure de la densité optique dudit milieu de culture à une longueur d'onde permettant de suivre le développement du 25 microorganisme.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant une étape préliminaire, avant la mise en oeuvre du procédé de la revendication 1, permettant d'établir la concentration 30 minimale inhibitrice (CMI) de l'antibiotique vis-à-vis du microorganisme.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel on immerge dans le milieu de culture plusieurs particules, et dans lequel dans l'étape (b) on détermine la sensibilité du microorganisme audit antibiotique par application d'un champs magnétique destiné à mettre en mouvement lesdites particules, le microorganisme est peu ou non sensible à l'antibiotique lorsque le rassemblement des particules par le champs magnétique sur ladite surface est freiné, voir empêché par la formation du biofilm.
12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel lorsque les particules peuvent être rassemblées par le champ magnétique, la détection de ce rassemblement est visuelle.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel l'antibiotique est choisi dans le groupe comprenant l'acide fusidique, les aminosides, les béta-Lactamines, les pénicillines, des inhibiteurs le béta-lactamases, les céphalosporines, les carbapénèmes, les monobactames, la cyclosérine, la daptomycine, la fosfomycine, es lincosamides, les macrolides et kétolides, la mupirocine, les nitro-imidazolés, les nitrofuranes, les Oligosaccharides, les oxazolidinones, les polypeptides : bacitracine, glycopeptides, polymyxines et colistine, les quinolones, les rifamycines, les sulfamides et les diaminopyridines, les synergistines, les tétracyclines, les antifongiques.
14. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on utilise une pluralité de compartiments comprenant chacun : - ledit milieu de culture, - ladite, au moins une particule, et - ledit microorganisme,- ledit antibiotique, des compartiments comprenant une concentration différente dudit antibiotique d'un compartiment à l'autre.
15. Procédé selon la revendication 14, dans lequel dans l'un desdits compartiments la concentration d'antibiotique est nulle, ledit compartiment représentant un témoin de culture dudit microorganisme sans antibiotique. 10 16 Procédé selon la revendication 14, dans lequel l'un desdits compartiments ne comprend pas ledit microorganisme, ledit compartiment représentant un témoin du milieu. 17. Procédé selon la revendication 14, dans lequel au moins 15 un des compartiments comprend au moins 2 antibiotiques. 18. Procédé selon la revendication 14, dans lequel on détermine grâce à la pluralité desdits compartiments la concentration minimale de l'antibiotique inhibant la formation du biofilm par ledit 20 microorganisme. 19. Procédé selon la revendication 15 ou 16 comprenant en outre une étape c) de prélèvements de milieu de culture desdits compartiments et de mesures de la densité optique de chacun des 25 prélèvements à une longueur d'onde permettant de suivre le développement du microorganisme. 20. Procédé selon la revendication 19, dans lequel on détermine la concentration minimale inhibitrice dudit antibiotique vis-à-vis 30 de la croissance dudit microorganisme en suspension dans ledit milieu de culture à partir desdits prélèvements et mesures de densité optique desditsprélèvements à une longueur d'onde permettant de suivre le développement dudit microorganisme.
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