FR2866706A1 - Procede et dispositif permettant de detecter la formation et le developpement de biofilms dans un milieu de culture - Google Patents
Procede et dispositif permettant de detecter la formation et le developpement de biofilms dans un milieu de culture Download PDFInfo
- Publication number
- FR2866706A1 FR2866706A1 FR0401791A FR0401791A FR2866706A1 FR 2866706 A1 FR2866706 A1 FR 2866706A1 FR 0401791 A FR0401791 A FR 0401791A FR 0401791 A FR0401791 A FR 0401791A FR 2866706 A1 FR2866706 A1 FR 2866706A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- particle
- culture
- culture medium
- magnetic
- electromagnetic field
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N11/00—Investigating flow properties of materials, e.g. viscosity, plasticity; Analysing materials by determining flow properties
- G01N11/10—Investigating flow properties of materials, e.g. viscosity, plasticity; Analysing materials by determining flow properties by moving a body within the material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N11/00—Investigating flow properties of materials, e.g. viscosity, plasticity; Analysing materials by determining flow properties
- G01N11/10—Investigating flow properties of materials, e.g. viscosity, plasticity; Analysing materials by determining flow properties by moving a body within the material
- G01N11/14—Investigating flow properties of materials, e.g. viscosity, plasticity; Analysing materials by determining flow properties by moving a body within the material by using rotary bodies, e.g. vane
- G01N2011/147—Magnetic coupling
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
La présente invention se rapporte à un procédé permettant de mesurer la viscosité d'un milieu de culture (4) d'un microorganisme (5), caractérisé en ce qu'il comporte les étapes consistant successivement à :a) immerger au moins une particule magnétique (3) dans la culture (4),b) soumettre la culture (4) à un champ électromagnétique de façon à mettre ladite particule magnétique (3) en mouvement,c) détecter le degré de liberté de mouvement de la particule magnétique (3) dans la culture.La présente invention s'applique plus particulièrement à un procédé et dispositif pour détecter la formation et le développement de biofilms dans une culture de microorganismes.
Description
PROCEDE ET DISPOSITIF PERMETTANT DE DETECTER LA FORMATIONET LE DEVELOPPEMENT DE BIOFILMS DANS UN MILIEU DE CULTURE
La présente invention se rapporte au domaine de la détection de la viscosité d'un fluide.
La présente invention se rapporte plus particulièrement au domaine de l'étude du développement d'un biofilm dans un milieu de culture non homogène.
La plupart des micro-organismes (pathogènes ou non) ont été étudiés jusqu'ici sous leur forme planctonique , libres et isolés dans un milieu (cultivés en suspension ou sur milieu sélectif). Or, en milieu naturel, hors laboratoire, les populations bactériennes se trouvent fixées sur un support (état sessile ) et se développent en communauté organisée nommée biofilm . Cette communauté bactérienne est englobée dans une matrice d'exopolysaccharides limitant les échanges avec le milieu environnant (A. Filloux, I. Vallet. Biofilm : Mise en place et organisation d'une communauté bactérienne . Médecine/Sciences 2003 ; 19: 7783).
Le processus biologique de la formation d'un biofilm est le suivant : les bactéries se déplacent isolément puis se déposent sur le support en question pour s'organiser en groupes et s'y fixer ; les cellules, ainsi assemblées, sécrètent alors une matrice visqueuse (matrice extracellulaire) où circulent des molécules qui transmettent la consigne de se multiplier et de former une microcolonie. Le biofilm est alors constitué. Il est à noter que certaines cellules peuvent s'échapper pour reprendre une vie isolée et éventuellement pour former de nouveaux biofilms.
En santé humaine, les biofilms sont responsables d'infections de plus en plus difficiles à juguler . sur toute la sphère ORL (conduit auditif, muqueuse nasale, conjonctive de l'oeil ...), sur les dents (apparition de tartre, de caries, ...) , sur les bronches, les poumons (chez les patients atteints de mucoviscidose ...) , au niveau du tractus urogénital (...) .
Ils sont en outre à l'origine de la plupart des pathologies nosocomiales (plus de 10 000 décès par ans) en se formant au niveau de cathéters, ou d'implants (valves cardiaques, hanches artificielles, sondes urinaires ...)(J.W. Costerton, P. Stewart et E.P. Greenberg, Bacterial Biofilms : A common cause of persistent infections . Science, vol. 284, pp1318-1322).
Les biofilms sont également présents dans les tours de réfrigération, responsables d'infections par Legionella.
Ils concernent également l'industrie agroalimentaire pour leur implication dans les cas d'intoxications alimentaires (formation lors de ruptures de la chaîne du froid, développement sur les outils de tranchage, de broyage, sur les surfaces de travail).
De même, les biofilms se développent dans les canalisations, provoquant notamment des phénomènes de corrosion.
Il est à noter que les bactéries ne sont pas seules à créer des biofilms : les champignons, les algues, les protozoaires s'organisent également en biofilms.
Les biofilms sont donc omniprésents dans de nombreux domaines, présentant des risques sanitaires et causant des dommages relativement importants.
Cependant, le développement et le comportement de ces biofilms restent mal connus du fait de leur complexité à être étudiées, bien que de nombreuses méthodes d'étude du développement des biofilms sont mises en u̇vre.
Les méthodes d'études des biofilms sont encore principalement basées sur la colonisation de pièces de verre ou de plastique immergées dans un milieu de culture contenu dans des flacons sous agitation dans des étuves afin par la suite de les colorer au cristal violet ou de les observer au microscope.
Il existe d'autres méthodes de détection plus complexes, comme par exemple des détections par Micro balance à cristal de quartz (Q-CMD, Quartz Cristal Microbalance with Dissipation Monitoring), des détections par MTA (Mass Transport Analysis, D. Festi et B. Tribollet), par UFDR (Ultrasonic Frequency Domain Reflectometry), par PCR in situ (sur gene fonctionnel Amo A), par FISH (hybridation in situ en fluorescence), par CLSM (Confocal Laser Scanning Microscopy), par PAS (Photo Acoustic Spectroscopy), ...
D'autres méthodes encore utilisent des particules/billes magnétiques revêtues de lectine, ou d'anticorps pour isoler les bactéries responsables du développement de biofilm, ceci pour permettre ensuite la caractérisation de ces microorganismes par des méthodes classiques d'immunoanalyse ou par biologie moléculaire (hybridation ou PCR).
De telles méthodes s'avèrent cependant lourdes à mettre en u̇vre et restent relativement onéreuses. Par ailleurs, elles ne permettent pas de donner un enseignement suffisamment probant sur le comportement des bactéries et donc la formation et le développement des biofilms. En effet, ces méthodes ne permettent pas le suivi du développement d'un biofilm, qu'il soit principalement constitué de corps cellulaires (type listeria), d'EPS (ExoPolySaccharide) ou d'une matrice analogue sécrétée par les microorganismes colonisateurs (type pseudomonas).
La présente invention se rapporte à un procédé et un dispositif permettant de détecter l'évolution de la viscosité d'un milieu non homogène, trouble et opaque et, dans une application particulière, à un procédé et un dispositif permettant de détecter la formation et le développement de biofilms dans un milieu de culture non homogène.
Le terme de milieu de culture non homogène doit être compris, dans la présente Demande, dans son sens le plus large. En particulier, un milieu de culture non homogène pourra consister en un milieu de culture limpide dans lequel évoluent des microorganismes en suspension.
On connaît de l'art antérieur la demande de brevet français FR2555316. Cette demande de brevet porte sur un procédé et un dispositif pour déterminer la viscosité d'un milieu fluide, le procédé consistant à immerger une bille conductrice dans le milieu fluide, à appliquer à la bille un champ magnétique tournant sensiblement centré sur celle-ci, le champ tournant étant tel que l'écoulement du fluide au contact de la bille mise en rotation demeure laminaire, et à déterminer une grandeur reliée au couple exercé sur la bille du fait de la viscosité du milieu fluide. Ainsi, la bille, plongée dans un milieu visqueux, subit un moment de freinage proportionnel à la viscosité, et prend en régime permanent une rotation dont la période est également proportionnelle à la viscosité du milieu liquide à analyser.La rotation de la bille peut être visualisée à l'aide des tâches de diffraction obtenues par éclairement de la bille à l'aide d'un faisceau laser selon son axe de rotation.
Cependant, un tel procédé n'est adapté à être mis en u̇vre seulement dans un milieu visqueux homogène. Or, un milieu de culture de bactéries est opalescent, trouble et opaque. La méthode présentée ne permet donc pas de déterminer la formation ou non de biofilms dans le milieu de culture.
Il est également proposé dans l'abrégé de la demande de brevet japonais JP61161436 une méthode de mesure de la viscosité d'un fluide non-newtonien reposant sur le principe de l'attraction magnétique. La méthode consiste à mesurer la viscosité au moyen de la mesure du déplacement et de la vitesse de déplacement d'un barreau aimanté sous l'effet d'un champ magnétique.
La méthode proposée dans l'abrégé japonais permet de déterminer les caractéristiques relatives au fluide visqueux telles que la viscosité. Cependant, la méthode en question ne permet en aucune manière de reproduire le comportement d'un microorganisme, tel qu'une bactérie, évoluant dans le fluide visqueux.
La présente invention a donc pour objet de proposer un procédé et un dispositif permettant de modéliser le développement des biofilms dans un milieu non homogène, trouble et opaque correspondant au milieu de culture dans lequel les microorganismes se développent pour former de tels biofilms.
La présente invention a également pour but de permettre la modélisation du processus de colonisation par des microorganismes sur une surface.
La présente invention a également pour but de permettre la mise en évidence des différences de viscosité dans un milieu non homogène, et par conséquent de permettre la modélisation du milieu de culture en différentes zones selon le développement de biofilms dans chaque zone.
La présente invention a également pour objet de proposer un procédé et un dispositif de détection du développement des biofilms de mise en u̇vre simple, peu onéreuse et automatisable.
Pour ce faire, la présente invention est du type décrit ci-dessus et elle est remarquable, dans son acception la plus large, en ce que ledit procédé comporte les étapes consistant successivement à : a) immerger au moins une particule magnétique dans la culture disposée, b) soumettre la culture à un champ électromagnétique, et de préférence magnétique, de façon à mettre ladite particule magnétique en mouvement, c) détecter le degré de liberté de mouvement de la particule magnétique dans la culture, de préférence par mesure optique.
L'étape b) consiste à soumettre le milieu de culture soit à un champ électromagnétique appliqué par impulsion, soit à une augmentation progressive d'un champ électromagnétique. Cette augmentation progressive du champ électromagnétique est obtenue, selon une configuration particulière de l'invention, par rapprochement d'un aimant selon une trajectoire rectiligne ou sinusoïdale, ou bien selon un mouvement oscillant présentant ou non une amplitude d'oscillation et une fréquence variables.
Avantageusement, le champ électromagnétique est généré par des moyens générateurs de champ électromagnétique en mouvement.
Avantageusement, la culture s'écoule en flux constant ou en flux discontinu à intervalle de temps donné à travers un réacteur ouvert. Cette dernière configuration est préférée dans la mesure où elle permet une adéquation avec les conditions naturelles du développement d'un biofilm.
Selon un mode préférentiel de l'invention, l'étape c) consiste à éclairer au moyen d'une source lumineuse la particule magnétique et de détecter le mouvement de la particule dans la culture.
Pour ce faire, la particule pourra avantageusement être fluorescente.
Avantageusement, ledit procédé consiste en outre à réaliser une mesure de la viscosité du milieu de culture à une température t=0 correspondant à l'ensemencement de la culture, et au moins une mesure à un temps t de la viscosité de la culture, ainsi qu'à comparer lesdites mesures à to et t.
La présente invention est également remarquable en ce que le dispositif permettant de détecter la formation et le développement de biofilms dans une culture non homogène comprend : - au moins un réacteur de culture destiné à recevoir la culture pour réaliser la détection de la formation et du développement de biofilms, - au moins une particule magnétique immergée dans la culture, - des moyens pour générer un champ électromagnétique, de préférence un champ magnétique, ledit champ électromagnétique étant appliqué à ladite particule, - un dispositif de détection du mouvement de ladite particule.
Par réacteur de culture, on entend soit une enceinte présentant au moins une extrémité fermée, du type tube, puit, (...) (réacteur fermé), soit une enceinte présentant deux ouvertures pour permettre l'écoulement du milieu de culture au travers de ladite enceinte (réacteur ouvert).
Selon une première configuration de l'invention, ledit réacteur présente une extrémité fermée de sorte à former un fond plat.
Afin de présenter une position stable au fond du tube lorsque la particule est au repos, c'est-à-dire lorsque aucun champ électromagnétique n'est généré, le fond dudit réacteur présente une pluralité de cavités ou de sillons destinés à recevoir la ou lesdites particule(s) magnétique(s).
Selon une autre variante de l'invention, la particule magnétique sera directement configurée pour rester dans une position stable au repos dans le fond plat dudit réacteur. Avantageusement, la particule magnétique est une particule par exemple en forme de palet, de géométrie asymétrique avec une face plane, (...).
Selon une deuxième configuration de l'invention, ledit réacteur présente une extrémité fermée de sorte à former un fond hémisphérique.
Selon une autre configuration de l'invention, le réacteur présente deux extrémités ouvertes. Dans cette configuration, ledit réacteur est configuré pour permettre un écoulement de la culture en flux constant ou en flux discontinu à intervalle de temps donné.
En ce qui concerne la particule, cette dernière est, avantageusement, soit une particule magnétique, soit une particule revêtue d'un couche magnétique, soit une particule magnétisable.
Avantageusement, ladite particule magnétique présente une taille sensiblement identique à la taille des microorganismes générant les biofilms.
De même, selon une configuration avantageuse de l'invention, ladite particule est génératrice d'un signal détectable par ledit dispositif de détection du mouvement. Avantageusement, ladite particule est de type fluorescente ou radioactive.
Concernant ledit dispositif de détection du mouvement, il est constitué d'un dispositif de détection optique.
Avantageusement, ledit dispositif de détection optique comporte une source lumineuse émettant en direction de ladite particule, et des moyens de détection permettant de détecter le mouvement de ladite particule dans la culture.
Dans le cadre de cette détection, la particule éclairée consistera en une particule fluorescente ou une particule noire, ou tout du moins opaque.
Avantageusement, ledit dispositif comprend en outre des moyens de mesure pour mesurer la viscosité du milieu de culture à des intervalles de temps donnés et des moyens de comparaison permettant de comparer les mesures obtenues. De cette manière, il peut être testé l'entrave au déplacement de la particule magnétique due à la présence des microorganismes colonisateurs, ou à l'ExoPolySaccharide ou la matrice secrétée par les microorganismes dans laquelle ladite particule est enchâssée.
On comprendra mieux l'invention à l'aide de la description, faite ci-après à titre purement explicatif, d'un mode de réalisation de l'invention, en référence aux figures annexées :
les figures la à 1d illustrent le principe de détection de la formation et du développement du biofilm dans un tube à fond semi-sphérique ; les figures 2a à 2d illustrent le principe de détection de la formation et du développement du biofilm dans un tube à fond plat ; et la figure 3 illustre le principe de détection de la formation et du développement du biofilm dans un tube aux extrémités ouvertes.
Le principe général pour détecter la formation et le développement d'un biofilm dans un milieu de culture contenant des microorganismes se déroule comme suit.
Une ou plusieurs particules ou billes magnétique(s), magnétisable(s) ou revêtue(s) d'une couche magnétiques est (sont) placée(s) dans le milieu de culture. La composition des particules pourra varier à condition qu'elle soit compatible avec une réactivité dans un champ magnétique ou électromagnétique. Afin d'alléger la description qui suit, on ne décrira lesdites particules qu'en terme de billes magnétiques.
Lesdites billes magnétiques vont alors se retrouver incorporées petit à petit dans la matrice sécrétée par les microorganismes, jusqu'à une immobilisation complète.
Dans le processus biologique de la formation du biofilm, les microorganismes sont immobilisés et englobés dans cette matrice. Ils sont alors dissimulés, protégés des agressions du milieu extérieur, d'où l'origine des résistances aux antibiotiques observées (pathologies nosocomiales). Les billes magnétiques permettent de mimer cette immobilisation.
Afin de mimer cette immobilisation, un aimant est approché vers lesdites billes. Ainsi, dans les milieux où aucun biofilm ne s'est développé, les billes magnétiques réagissent à l'approche de l'aimant et déplacent selon le mouvement de l'aimant. En revanche, si les particules sont englobées dans la matrice du biofilm, leur mouvement sera freiné, voire empêché selon le degré de formation du biofilm.
La méthode selon la présente invention réside donc dans l'exploitation du comportement de billes magnétiques pouvant être mises en mouvement sous l'effet de champs magnétiques (ou électromagnétiques). Si le comportement de ces molécules est entravé par la présence de la matrice qui compose le biofilm, il est alors possible de détecter et de visualiser le degré de mobilité des particules (mobiles, semi mobiles, immobiles), et par conséquent de visualiser le développement du biofilm.
Elle permet en outre de différencier les billes pouvant être mises en mouvement sous l'effet d'un champ magnétique et celles dont les mouvements sont entravés par la présence de la matrice sécrétée par les microorganismes.
La détection du mouvement des billes magnétiques dans le biofilm est effectuée avantageusement par mesure optique, soit par éclairage direct, soit par éclairage indirect. Dans ce dernier cas, les billes magnétiques utilisées seront avantageusement fluorescentes.
Il est entendu que la détection du mouvement des billes magnétiques par mesure optique est un mode de détection particulier, d'autre mode de détection de détection pouvant être mis en u̇vre sans pour autant sortir du champ de la présente invention.
En fonction du format choisi des billes (géométrie, taille, densité), le corps bactérien sera mimé plus ou moins précisément et l'évolution du biofilm caractérisée avec de nouveaux critères.
En fonction de la fréquence de présentation de l'aimant, en fonction de la force du champ magnétique / électromagnétique, l'évolution dynamique de la matrice constitutive du biofilm pourra être suivie. De même, une fois un biofilm constitué, la dégradation de ce dernier pourra être suivie sous l'effet d'un traitement particulier.
Il est alors possible, avec des tests biochimiques, d'analyser la constitution de ladite matrice.
De même, le suivi de l'immobilisation de la bille par la matrice constituant le biofilm permet de suivre par analogie le processus d'enfouissement des bactéries dans cette matrice qu'elles sécrètent.
Afin de tester le développement de biofilm au fond d'un tube, la détection sera conduite avec des particules suffisamment denses pour sédimenter au fond dudit tube. Inversement, la détection sera conduite avec des particules peu dense pour flotter en surface du milieu de culture suscité, ceci afin d'étudier le développement de biofilm en surf ace .
En outre, en jouant sur la densité des particules, des séries de détection peuvent être conduites à des interfaces solide/liquide, liquide/liquide, liquide/gaz.
Les détections peuvent également mettre en u̇vre des particules de tailles différentes, pouvant être, par exemple, différencier par des couleurs différentes.
Nous allons à présent décrire des exemples de mise en u̇vre de cette méthode. Dans ces exemples, les microorganismes décrits sont des bactéries. Il est entendu que la description qui suit est applicable à tout autre microorganisme pour lequel on voudra étudier le développement du biofilm. Cependant, la taille des billes magnétiques sera avantageusement adaptée à la taille des microorganismes étudiés si l'on souhaite modéliser le comportement des microorganismes dans le biofilm formé.
Les figures 1 à 3 illustrent le principe de détection de la formation d'un biofilm dans différentes géométries de tubes recevant une culture comprenant les bactéries à étudier.
La figure 1 illustre en particulier le principe de détection de la formation et du développement du biofilm dans un réacteur (1) du type tube (1) à fond (2) hémisphérique.
Par exemple, l'expérience peut être conduite sur une plaque présentant 96 tubes (ou puits) de contenance de 200ul. Dans le présent exemple, une bille magnétique (3) est déposée au fond de chaque tube (1). Bien entendu, le procédé ne se limite pas nécessairement à une seule bille. Un milieu de culture (4) est alors ajouté dans chacun des tubes (1), ce milieu étant ensuite ensemencé avec une souche bactérienne (5) pouvant évoluer en biofilm (6) et ce, dans des conditions de cultures standardisées (température, oxygénation, pH ...).
A intervalle de temps régulier, un aimant (7) positionné sous le tube (1), et plus particulièrement sous la bille magnétique (3), se déplace pour remonter régulièrement le long de la paroi dudit tube (1).
Lorsque la bille (3) ne rencontre pas d'obstacle dans son mouvement ou n'est pas suffisamment entravée dans la matrice sécrétée par les bactéries (5) et constituant le biofilm (6), la bille magnétique (3) suit le mouvement dudit aimant (7) (figures lb et le). En revanche, lorsque la formation du biofilm (6) est telle que le mouvement de la bille (3) est entravé voire empêché, ladite bille (3) reste immobile au fond du tube (1) (figure 1d). Cet état traduit alors un développement de la matrice extracellulaire constitutive du biofilm (6) dans le tube (1) tel que ladite matrice englobe la bille magnétique (1) de la même façon qu'elle englobe les bactéries (5).
Dans cet exemple, l'aimant est manipulé de façon à déplacer la bille magnétique (3) le long de la paroi dudit tube (1). Cependant, il pourra être avantageux de manipuler l'aimant en direction de la bille magnétique (3) ou inversement, de manipuler le tube vers l'aimant, de sorte à déplacer la bille magnétique (3) selon une trajectoire autre que la paroi dudit tube (1).
Avantageusement, un dispositif optique permet de visualiser automatiquement le degré de liberté de ladite bille (non représenté). Ledit dispositif comprend une source lumineuse émettant en direction de ladite bille (3) et des moyens de détection permettant de détecter le mouvement de la bille (3) dans la culture (4).
Lorsque le tube (3) est transparent, la source lumineuse est disposée sous ledit tube (1) de sorte à émettre le faisceau lumineux directement vers la bille magnétique (3). Les moyens de détection, du type caméra, microscope, (...) sont alors disposés au-dessus dudit tube (3). Ainsi, la détection du mouvement de la bille (3) est effectuée en suivant le mouvement de la tâche sombre correspondant à la bille magnétique (3).
Lorsque le tube (1) est en matériau opaque, comme par exemple en métal, la source lumineuse est disposée au-dessus dudit tube de sorte à émettre le faisceau lumineux au travers de la culture (4) vers la bille magnétique (3). De même que précédemment, lesdits moyens de détection sont disposés au-dessus dudit tube (3). Dans cette configuration, lesdits billes magnétiques (3) sont constituées avantageusement en matériau fluorescent. Ainsi, lorsque lesdites billes (3) sont éclairées via la source lumineuse, leur mouvement est détecté par lesdits moyens de détection en suivant le mouvement de la tâche fluorescente correspondant à la bille (3).
Les figures 2a à 2d illustrent, selon une variante de réalisation de l'invention, la détection de la formation du biofilm (6) dans un réacteur (1) du type tube (1) à fond (2) plat.
Avantageusement, le fond (2) du tube (1) est muni de deux cavités (8, 9) adjacentes. Une bille magnétique (3) est déposée au temps initial dans une desdites cavités (8). L'aimant (7) est alors disposé au contact de l'autre cavité (9). Lorsque la bille (3) n'est pas entravée dans son mouvement par le biofilm (6), elle glisse de la cavité (8) à la cavité adjacente (9) (figure 2b). L'aimant (7) est ensuite déplacé sous la première cavité (8) (figure 2c). Sous l'effet attractif de l'aimant (7), son mouvement n'étant toujours pas empêché, ou tout du moins pas suffisamment entravé, la bille magnétique (3) glisse vers ladite première cavité (8).Et le test va être répété à intervalles réguliers jusqu'à observer l'immobilisation totale ou partielle des billes (3) comme l'illustre la figure 2d : lorsque l'aimant (7) est déplacé sous la deuxième cavité (9), la bille magnétique (3), engluée dans le biofilm (6) , ne peut plus, en réponse à l'effet attractif de l'aimant (7), passée dans la deuxième cavité (9) du fait de l'entravement de son mouvement dans ledit biofilm (6).
Dans une variante, le fond du tube ne présente pas de cavités destinées à recevoir la ou les billes magnétiques. A cet effet, ladite bille magnétique (3) est configurée pour pouvoir se maintenir dans une position stable au fond dudit tube (1).
La figure 3 illustre un troisième mode de réalisation de l'invention mettant en u̇vre un réacteur (1) du type tube (1) présentant des extrémités ouvertes (10, 11). Le tube (1) est alors configuré pour permettre un flux continu du milieu de culture (5).
Comme dans l'exemple du tube à fond plat, la surface interne (12) de la paroi (13) dudit tube (1) présente avantageusement des cavités (8, 9) pour recevoir la ou lesdites bille(s) (3). Selon le même principe que celui décrit précédemment, un aimant (7) est présenté de façon à mettre en mouvement les billes (3) de façon à ce qu'elles passent d'une cavité à l'autre.
Dans le cas où aucune cavité n'est formée à la surface interne (12) de la paroi (13) dudit tube (1), le principe sera similaire à celui décrit pour le tube à fond hémisphérique : l'aimant (7) est présenté et déplacé de façon à remonter lesdites billes sur la face interne (12) de la paroi (13) dudit tube (1).
Selon une configuration particulière de l'invention, les billes magnétiques enchâssées dans le biofilm (6) peuvent être par la suite récupérées par un aimant plongeant dans le milieu de culture. De cette sorte, un fragment du biofilm est prélevé et destiné à des tests de caractérisation physique (viscosité de la matrice ...), chimique, biochimique (éléments constitutifs de la matrice, ...), biologique (microorganismes constitutifs de la matrice en état de latence, en activité, corps morts, ...) .
L'invention est décrite dans ce qui précède à titre d'exemple. Il est entendu que l'homme du métier est à même de réaliser différentes variantes de l'invention sans pour autant sortir du cadre du brevet.
La présente invention se rapporte au domaine de la détection de la viscosité d'un fluide.
La présente invention se rapporte plus particulièrement au domaine de l'étude du développement d'un biofilm dans un milieu de culture non homogène.
La plupart des micro-organismes (pathogènes ou non) ont été étudiés jusqu'ici sous leur forme planctonique , libres et isolés dans un milieu (cultivés en suspension ou sur milieu sélectif). Or, en milieu naturel, hors laboratoire, les populations bactériennes se trouvent fixées sur un support (état sessile ) et se développent en communauté organisée nommée biofilm . Cette communauté bactérienne est englobée dans une matrice d'exopolysaccharides limitant les échanges avec le milieu environnant (A. Filloux, I. Vallet. Biofilm : Mise en place et organisation d'une communauté bactérienne . Médecine/Sciences 2003 ; 19: 7783).
Le processus biologique de la formation d'un biofilm est le suivant : les bactéries se déplacent isolément puis se déposent sur le support en question pour s'organiser en groupes et s'y fixer ; les cellules, ainsi assemblées, sécrètent alors une matrice visqueuse (matrice extracellulaire) où circulent des molécules qui transmettent la consigne de se multiplier et de former une microcolonie. Le biofilm est alors constitué. Il est à noter que certaines cellules peuvent s'échapper pour reprendre une vie isolée et éventuellement pour former de nouveaux biofilms.
En santé humaine, les biofilms sont responsables d'infections de plus en plus difficiles à juguler . sur toute la sphère ORL (conduit auditif, muqueuse nasale, conjonctive de l'oeil ...), sur les dents (apparition de tartre, de caries, ...) , sur les bronches, les poumons (chez les patients atteints de mucoviscidose ...) , au niveau du tractus urogénital (...) .
Ils sont en outre à l'origine de la plupart des pathologies nosocomiales (plus de 10 000 décès par ans) en se formant au niveau de cathéters, ou d'implants (valves cardiaques, hanches artificielles, sondes urinaires ...)(J.W. Costerton, P. Stewart et E.P. Greenberg, Bacterial Biofilms : A common cause of persistent infections . Science, vol. 284, pp1318-1322).
Les biofilms sont également présents dans les tours de réfrigération, responsables d'infections par Legionella.
Ils concernent également l'industrie agroalimentaire pour leur implication dans les cas d'intoxications alimentaires (formation lors de ruptures de la chaîne du froid, développement sur les outils de tranchage, de broyage, sur les surfaces de travail).
De même, les biofilms se développent dans les canalisations, provoquant notamment des phénomènes de corrosion.
Il est à noter que les bactéries ne sont pas seules à créer des biofilms : les champignons, les algues, les protozoaires s'organisent également en biofilms.
Les biofilms sont donc omniprésents dans de nombreux domaines, présentant des risques sanitaires et causant des dommages relativement importants.
Cependant, le développement et le comportement de ces biofilms restent mal connus du fait de leur complexité à être étudiées, bien que de nombreuses méthodes d'étude du développement des biofilms sont mises en u̇vre.
Les méthodes d'études des biofilms sont encore principalement basées sur la colonisation de pièces de verre ou de plastique immergées dans un milieu de culture contenu dans des flacons sous agitation dans des étuves afin par la suite de les colorer au cristal violet ou de les observer au microscope.
Il existe d'autres méthodes de détection plus complexes, comme par exemple des détections par Micro balance à cristal de quartz (Q-CMD, Quartz Cristal Microbalance with Dissipation Monitoring), des détections par MTA (Mass Transport Analysis, D. Festi et B. Tribollet), par UFDR (Ultrasonic Frequency Domain Reflectometry), par PCR in situ (sur gene fonctionnel Amo A), par FISH (hybridation in situ en fluorescence), par CLSM (Confocal Laser Scanning Microscopy), par PAS (Photo Acoustic Spectroscopy), ...
D'autres méthodes encore utilisent des particules/billes magnétiques revêtues de lectine, ou d'anticorps pour isoler les bactéries responsables du développement de biofilm, ceci pour permettre ensuite la caractérisation de ces microorganismes par des méthodes classiques d'immunoanalyse ou par biologie moléculaire (hybridation ou PCR).
De telles méthodes s'avèrent cependant lourdes à mettre en u̇vre et restent relativement onéreuses. Par ailleurs, elles ne permettent pas de donner un enseignement suffisamment probant sur le comportement des bactéries et donc la formation et le développement des biofilms. En effet, ces méthodes ne permettent pas le suivi du développement d'un biofilm, qu'il soit principalement constitué de corps cellulaires (type listeria), d'EPS (ExoPolySaccharide) ou d'une matrice analogue sécrétée par les microorganismes colonisateurs (type pseudomonas).
La présente invention se rapporte à un procédé et un dispositif permettant de détecter l'évolution de la viscosité d'un milieu non homogène, trouble et opaque et, dans une application particulière, à un procédé et un dispositif permettant de détecter la formation et le développement de biofilms dans un milieu de culture non homogène.
Le terme de milieu de culture non homogène doit être compris, dans la présente Demande, dans son sens le plus large. En particulier, un milieu de culture non homogène pourra consister en un milieu de culture limpide dans lequel évoluent des microorganismes en suspension.
On connaît de l'art antérieur la demande de brevet français FR2555316. Cette demande de brevet porte sur un procédé et un dispositif pour déterminer la viscosité d'un milieu fluide, le procédé consistant à immerger une bille conductrice dans le milieu fluide, à appliquer à la bille un champ magnétique tournant sensiblement centré sur celle-ci, le champ tournant étant tel que l'écoulement du fluide au contact de la bille mise en rotation demeure laminaire, et à déterminer une grandeur reliée au couple exercé sur la bille du fait de la viscosité du milieu fluide. Ainsi, la bille, plongée dans un milieu visqueux, subit un moment de freinage proportionnel à la viscosité, et prend en régime permanent une rotation dont la période est également proportionnelle à la viscosité du milieu liquide à analyser.La rotation de la bille peut être visualisée à l'aide des tâches de diffraction obtenues par éclairement de la bille à l'aide d'un faisceau laser selon son axe de rotation.
Cependant, un tel procédé n'est adapté à être mis en u̇vre seulement dans un milieu visqueux homogène. Or, un milieu de culture de bactéries est opalescent, trouble et opaque. La méthode présentée ne permet donc pas de déterminer la formation ou non de biofilms dans le milieu de culture.
Il est également proposé dans l'abrégé de la demande de brevet japonais JP61161436 une méthode de mesure de la viscosité d'un fluide non-newtonien reposant sur le principe de l'attraction magnétique. La méthode consiste à mesurer la viscosité au moyen de la mesure du déplacement et de la vitesse de déplacement d'un barreau aimanté sous l'effet d'un champ magnétique.
La méthode proposée dans l'abrégé japonais permet de déterminer les caractéristiques relatives au fluide visqueux telles que la viscosité. Cependant, la méthode en question ne permet en aucune manière de reproduire le comportement d'un microorganisme, tel qu'une bactérie, évoluant dans le fluide visqueux.
La présente invention a donc pour objet de proposer un procédé et un dispositif permettant de modéliser le développement des biofilms dans un milieu non homogène, trouble et opaque correspondant au milieu de culture dans lequel les microorganismes se développent pour former de tels biofilms.
La présente invention a également pour but de permettre la modélisation du processus de colonisation par des microorganismes sur une surface.
La présente invention a également pour but de permettre la mise en évidence des différences de viscosité dans un milieu non homogène, et par conséquent de permettre la modélisation du milieu de culture en différentes zones selon le développement de biofilms dans chaque zone.
La présente invention a également pour objet de proposer un procédé et un dispositif de détection du développement des biofilms de mise en u̇vre simple, peu onéreuse et automatisable.
Pour ce faire, la présente invention est du type décrit ci-dessus et elle est remarquable, dans son acception la plus large, en ce que ledit procédé comporte les étapes consistant successivement à : a) immerger au moins une particule magnétique dans la culture disposée, b) soumettre la culture à un champ électromagnétique, et de préférence magnétique, de façon à mettre ladite particule magnétique en mouvement, c) détecter le degré de liberté de mouvement de la particule magnétique dans la culture, de préférence par mesure optique.
L'étape b) consiste à soumettre le milieu de culture soit à un champ électromagnétique appliqué par impulsion, soit à une augmentation progressive d'un champ électromagnétique. Cette augmentation progressive du champ électromagnétique est obtenue, selon une configuration particulière de l'invention, par rapprochement d'un aimant selon une trajectoire rectiligne ou sinusoïdale, ou bien selon un mouvement oscillant présentant ou non une amplitude d'oscillation et une fréquence variables.
Avantageusement, le champ électromagnétique est généré par des moyens générateurs de champ électromagnétique en mouvement.
Avantageusement, la culture s'écoule en flux constant ou en flux discontinu à intervalle de temps donné à travers un réacteur ouvert. Cette dernière configuration est préférée dans la mesure où elle permet une adéquation avec les conditions naturelles du développement d'un biofilm.
Selon un mode préférentiel de l'invention, l'étape c) consiste à éclairer au moyen d'une source lumineuse la particule magnétique et de détecter le mouvement de la particule dans la culture.
Pour ce faire, la particule pourra avantageusement être fluorescente.
Avantageusement, ledit procédé consiste en outre à réaliser une mesure de la viscosité du milieu de culture à une température t=0 correspondant à l'ensemencement de la culture, et au moins une mesure à un temps t de la viscosité de la culture, ainsi qu'à comparer lesdites mesures à to et t.
La présente invention est également remarquable en ce que le dispositif permettant de détecter la formation et le développement de biofilms dans une culture non homogène comprend : - au moins un réacteur de culture destiné à recevoir la culture pour réaliser la détection de la formation et du développement de biofilms, - au moins une particule magnétique immergée dans la culture, - des moyens pour générer un champ électromagnétique, de préférence un champ magnétique, ledit champ électromagnétique étant appliqué à ladite particule, - un dispositif de détection du mouvement de ladite particule.
Par réacteur de culture, on entend soit une enceinte présentant au moins une extrémité fermée, du type tube, puit, (...) (réacteur fermé), soit une enceinte présentant deux ouvertures pour permettre l'écoulement du milieu de culture au travers de ladite enceinte (réacteur ouvert).
Selon une première configuration de l'invention, ledit réacteur présente une extrémité fermée de sorte à former un fond plat.
Afin de présenter une position stable au fond du tube lorsque la particule est au repos, c'est-à-dire lorsque aucun champ électromagnétique n'est généré, le fond dudit réacteur présente une pluralité de cavités ou de sillons destinés à recevoir la ou lesdites particule(s) magnétique(s).
Selon une autre variante de l'invention, la particule magnétique sera directement configurée pour rester dans une position stable au repos dans le fond plat dudit réacteur. Avantageusement, la particule magnétique est une particule par exemple en forme de palet, de géométrie asymétrique avec une face plane, (...).
Selon une deuxième configuration de l'invention, ledit réacteur présente une extrémité fermée de sorte à former un fond hémisphérique.
Selon une autre configuration de l'invention, le réacteur présente deux extrémités ouvertes. Dans cette configuration, ledit réacteur est configuré pour permettre un écoulement de la culture en flux constant ou en flux discontinu à intervalle de temps donné.
En ce qui concerne la particule, cette dernière est, avantageusement, soit une particule magnétique, soit une particule revêtue d'un couche magnétique, soit une particule magnétisable.
Avantageusement, ladite particule magnétique présente une taille sensiblement identique à la taille des microorganismes générant les biofilms.
De même, selon une configuration avantageuse de l'invention, ladite particule est génératrice d'un signal détectable par ledit dispositif de détection du mouvement. Avantageusement, ladite particule est de type fluorescente ou radioactive.
Concernant ledit dispositif de détection du mouvement, il est constitué d'un dispositif de détection optique.
Avantageusement, ledit dispositif de détection optique comporte une source lumineuse émettant en direction de ladite particule, et des moyens de détection permettant de détecter le mouvement de ladite particule dans la culture.
Dans le cadre de cette détection, la particule éclairée consistera en une particule fluorescente ou une particule noire, ou tout du moins opaque.
Avantageusement, ledit dispositif comprend en outre des moyens de mesure pour mesurer la viscosité du milieu de culture à des intervalles de temps donnés et des moyens de comparaison permettant de comparer les mesures obtenues. De cette manière, il peut être testé l'entrave au déplacement de la particule magnétique due à la présence des microorganismes colonisateurs, ou à l'ExoPolySaccharide ou la matrice secrétée par les microorganismes dans laquelle ladite particule est enchâssée.
On comprendra mieux l'invention à l'aide de la description, faite ci-après à titre purement explicatif, d'un mode de réalisation de l'invention, en référence aux figures annexées :
les figures la à 1d illustrent le principe de détection de la formation et du développement du biofilm dans un tube à fond semi-sphérique ; les figures 2a à 2d illustrent le principe de détection de la formation et du développement du biofilm dans un tube à fond plat ; et la figure 3 illustre le principe de détection de la formation et du développement du biofilm dans un tube aux extrémités ouvertes.
Le principe général pour détecter la formation et le développement d'un biofilm dans un milieu de culture contenant des microorganismes se déroule comme suit.
Une ou plusieurs particules ou billes magnétique(s), magnétisable(s) ou revêtue(s) d'une couche magnétiques est (sont) placée(s) dans le milieu de culture. La composition des particules pourra varier à condition qu'elle soit compatible avec une réactivité dans un champ magnétique ou électromagnétique. Afin d'alléger la description qui suit, on ne décrira lesdites particules qu'en terme de billes magnétiques.
Lesdites billes magnétiques vont alors se retrouver incorporées petit à petit dans la matrice sécrétée par les microorganismes, jusqu'à une immobilisation complète.
Dans le processus biologique de la formation du biofilm, les microorganismes sont immobilisés et englobés dans cette matrice. Ils sont alors dissimulés, protégés des agressions du milieu extérieur, d'où l'origine des résistances aux antibiotiques observées (pathologies nosocomiales). Les billes magnétiques permettent de mimer cette immobilisation.
Afin de mimer cette immobilisation, un aimant est approché vers lesdites billes. Ainsi, dans les milieux où aucun biofilm ne s'est développé, les billes magnétiques réagissent à l'approche de l'aimant et déplacent selon le mouvement de l'aimant. En revanche, si les particules sont englobées dans la matrice du biofilm, leur mouvement sera freiné, voire empêché selon le degré de formation du biofilm.
La méthode selon la présente invention réside donc dans l'exploitation du comportement de billes magnétiques pouvant être mises en mouvement sous l'effet de champs magnétiques (ou électromagnétiques). Si le comportement de ces molécules est entravé par la présence de la matrice qui compose le biofilm, il est alors possible de détecter et de visualiser le degré de mobilité des particules (mobiles, semi mobiles, immobiles), et par conséquent de visualiser le développement du biofilm.
Elle permet en outre de différencier les billes pouvant être mises en mouvement sous l'effet d'un champ magnétique et celles dont les mouvements sont entravés par la présence de la matrice sécrétée par les microorganismes.
La détection du mouvement des billes magnétiques dans le biofilm est effectuée avantageusement par mesure optique, soit par éclairage direct, soit par éclairage indirect. Dans ce dernier cas, les billes magnétiques utilisées seront avantageusement fluorescentes.
Il est entendu que la détection du mouvement des billes magnétiques par mesure optique est un mode de détection particulier, d'autre mode de détection de détection pouvant être mis en u̇vre sans pour autant sortir du champ de la présente invention.
En fonction du format choisi des billes (géométrie, taille, densité), le corps bactérien sera mimé plus ou moins précisément et l'évolution du biofilm caractérisée avec de nouveaux critères.
En fonction de la fréquence de présentation de l'aimant, en fonction de la force du champ magnétique / électromagnétique, l'évolution dynamique de la matrice constitutive du biofilm pourra être suivie. De même, une fois un biofilm constitué, la dégradation de ce dernier pourra être suivie sous l'effet d'un traitement particulier.
Il est alors possible, avec des tests biochimiques, d'analyser la constitution de ladite matrice.
De même, le suivi de l'immobilisation de la bille par la matrice constituant le biofilm permet de suivre par analogie le processus d'enfouissement des bactéries dans cette matrice qu'elles sécrètent.
Afin de tester le développement de biofilm au fond d'un tube, la détection sera conduite avec des particules suffisamment denses pour sédimenter au fond dudit tube. Inversement, la détection sera conduite avec des particules peu dense pour flotter en surface du milieu de culture suscité, ceci afin d'étudier le développement de biofilm en surf ace .
En outre, en jouant sur la densité des particules, des séries de détection peuvent être conduites à des interfaces solide/liquide, liquide/liquide, liquide/gaz.
Les détections peuvent également mettre en u̇vre des particules de tailles différentes, pouvant être, par exemple, différencier par des couleurs différentes.
Nous allons à présent décrire des exemples de mise en u̇vre de cette méthode. Dans ces exemples, les microorganismes décrits sont des bactéries. Il est entendu que la description qui suit est applicable à tout autre microorganisme pour lequel on voudra étudier le développement du biofilm. Cependant, la taille des billes magnétiques sera avantageusement adaptée à la taille des microorganismes étudiés si l'on souhaite modéliser le comportement des microorganismes dans le biofilm formé.
Les figures 1 à 3 illustrent le principe de détection de la formation d'un biofilm dans différentes géométries de tubes recevant une culture comprenant les bactéries à étudier.
La figure 1 illustre en particulier le principe de détection de la formation et du développement du biofilm dans un réacteur (1) du type tube (1) à fond (2) hémisphérique.
Par exemple, l'expérience peut être conduite sur une plaque présentant 96 tubes (ou puits) de contenance de 200ul. Dans le présent exemple, une bille magnétique (3) est déposée au fond de chaque tube (1). Bien entendu, le procédé ne se limite pas nécessairement à une seule bille. Un milieu de culture (4) est alors ajouté dans chacun des tubes (1), ce milieu étant ensuite ensemencé avec une souche bactérienne (5) pouvant évoluer en biofilm (6) et ce, dans des conditions de cultures standardisées (température, oxygénation, pH ...).
A intervalle de temps régulier, un aimant (7) positionné sous le tube (1), et plus particulièrement sous la bille magnétique (3), se déplace pour remonter régulièrement le long de la paroi dudit tube (1).
Lorsque la bille (3) ne rencontre pas d'obstacle dans son mouvement ou n'est pas suffisamment entravée dans la matrice sécrétée par les bactéries (5) et constituant le biofilm (6), la bille magnétique (3) suit le mouvement dudit aimant (7) (figures lb et le). En revanche, lorsque la formation du biofilm (6) est telle que le mouvement de la bille (3) est entravé voire empêché, ladite bille (3) reste immobile au fond du tube (1) (figure 1d). Cet état traduit alors un développement de la matrice extracellulaire constitutive du biofilm (6) dans le tube (1) tel que ladite matrice englobe la bille magnétique (1) de la même façon qu'elle englobe les bactéries (5).
Dans cet exemple, l'aimant est manipulé de façon à déplacer la bille magnétique (3) le long de la paroi dudit tube (1). Cependant, il pourra être avantageux de manipuler l'aimant en direction de la bille magnétique (3) ou inversement, de manipuler le tube vers l'aimant, de sorte à déplacer la bille magnétique (3) selon une trajectoire autre que la paroi dudit tube (1).
Avantageusement, un dispositif optique permet de visualiser automatiquement le degré de liberté de ladite bille (non représenté). Ledit dispositif comprend une source lumineuse émettant en direction de ladite bille (3) et des moyens de détection permettant de détecter le mouvement de la bille (3) dans la culture (4).
Lorsque le tube (3) est transparent, la source lumineuse est disposée sous ledit tube (1) de sorte à émettre le faisceau lumineux directement vers la bille magnétique (3). Les moyens de détection, du type caméra, microscope, (...) sont alors disposés au-dessus dudit tube (3). Ainsi, la détection du mouvement de la bille (3) est effectuée en suivant le mouvement de la tâche sombre correspondant à la bille magnétique (3).
Lorsque le tube (1) est en matériau opaque, comme par exemple en métal, la source lumineuse est disposée au-dessus dudit tube de sorte à émettre le faisceau lumineux au travers de la culture (4) vers la bille magnétique (3). De même que précédemment, lesdits moyens de détection sont disposés au-dessus dudit tube (3). Dans cette configuration, lesdits billes magnétiques (3) sont constituées avantageusement en matériau fluorescent. Ainsi, lorsque lesdites billes (3) sont éclairées via la source lumineuse, leur mouvement est détecté par lesdits moyens de détection en suivant le mouvement de la tâche fluorescente correspondant à la bille (3).
Les figures 2a à 2d illustrent, selon une variante de réalisation de l'invention, la détection de la formation du biofilm (6) dans un réacteur (1) du type tube (1) à fond (2) plat.
Avantageusement, le fond (2) du tube (1) est muni de deux cavités (8, 9) adjacentes. Une bille magnétique (3) est déposée au temps initial dans une desdites cavités (8). L'aimant (7) est alors disposé au contact de l'autre cavité (9). Lorsque la bille (3) n'est pas entravée dans son mouvement par le biofilm (6), elle glisse de la cavité (8) à la cavité adjacente (9) (figure 2b). L'aimant (7) est ensuite déplacé sous la première cavité (8) (figure 2c). Sous l'effet attractif de l'aimant (7), son mouvement n'étant toujours pas empêché, ou tout du moins pas suffisamment entravé, la bille magnétique (3) glisse vers ladite première cavité (8).Et le test va être répété à intervalles réguliers jusqu'à observer l'immobilisation totale ou partielle des billes (3) comme l'illustre la figure 2d : lorsque l'aimant (7) est déplacé sous la deuxième cavité (9), la bille magnétique (3), engluée dans le biofilm (6) , ne peut plus, en réponse à l'effet attractif de l'aimant (7), passée dans la deuxième cavité (9) du fait de l'entravement de son mouvement dans ledit biofilm (6).
Dans une variante, le fond du tube ne présente pas de cavités destinées à recevoir la ou les billes magnétiques. A cet effet, ladite bille magnétique (3) est configurée pour pouvoir se maintenir dans une position stable au fond dudit tube (1).
La figure 3 illustre un troisième mode de réalisation de l'invention mettant en u̇vre un réacteur (1) du type tube (1) présentant des extrémités ouvertes (10, 11). Le tube (1) est alors configuré pour permettre un flux continu du milieu de culture (5).
Comme dans l'exemple du tube à fond plat, la surface interne (12) de la paroi (13) dudit tube (1) présente avantageusement des cavités (8, 9) pour recevoir la ou lesdites bille(s) (3). Selon le même principe que celui décrit précédemment, un aimant (7) est présenté de façon à mettre en mouvement les billes (3) de façon à ce qu'elles passent d'une cavité à l'autre.
Dans le cas où aucune cavité n'est formée à la surface interne (12) de la paroi (13) dudit tube (1), le principe sera similaire à celui décrit pour le tube à fond hémisphérique : l'aimant (7) est présenté et déplacé de façon à remonter lesdites billes sur la face interne (12) de la paroi (13) dudit tube (1).
Selon une configuration particulière de l'invention, les billes magnétiques enchâssées dans le biofilm (6) peuvent être par la suite récupérées par un aimant plongeant dans le milieu de culture. De cette sorte, un fragment du biofilm est prélevé et destiné à des tests de caractérisation physique (viscosité de la matrice ...), chimique, biochimique (éléments constitutifs de la matrice, ...), biologique (microorganismes constitutifs de la matrice en état de latence, en activité, corps morts, ...) .
L'invention est décrite dans ce qui précède à titre d'exemple. Il est entendu que l'homme du métier est à même de réaliser différentes variantes de l'invention sans pour autant sortir du cadre du brevet.
REVENDICATIONS
1. Procédé permettant de mesurer la viscosité d'un milieu de culture (4) d'un microorganisme (5), caractérisé en ce qu'il comporte les étapes consistant successivement à : a) immerger au moins une particule magnétique (3) dans la culture (4) , b) soumettre la culture (4) à un champ électromagnétique de façon à mettre ladite particule magnétique (3) en mouvement, c) détecter le degré de liberté de mouvement de la particule magnétique (3) dans la culture.
1. Procédé permettant de mesurer la viscosité d'un milieu de culture (4) d'un microorganisme (5), caractérisé en ce qu'il comporte les étapes consistant successivement à : a) immerger au moins une particule magnétique (3) dans la culture (4) , b) soumettre la culture (4) à un champ électromagnétique de façon à mettre ladite particule magnétique (3) en mouvement, c) détecter le degré de liberté de mouvement de la particule magnétique (3) dans la culture.
Claims (20)
- 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape b) consiste à soumettre le milieu de culture (4) à un champ électromagnétique appliqué par impulsion.
- 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape b) consiste à soumettre la culture (4) à une augmentation progressive d'un champ électromagnétique.
- 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le champ électromagnétique est généré par des moyens générateurs de champ électromagnétique en mouvement.
- 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le milieu de culture (4) s'écoule en flux constant à travers un réacteur (1) ouvert.6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le milieu de culture (4) s'écoule à travers un réacteur (1) ouvert en flux discontinu à intervalle de temps donné.
- 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape c) consiste à éclairer au moyen d'une source lumineuse la particule magnétique (3) et de détecter le mouvement de la particule (3) dans la culture (4).
- 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la particule (3) est génératrice d'un signal.
- 9. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que la particule (3) est du type fluorescente ou radioactive.10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, ledit procédé permettant de détecter la formation et le développement de biofilms (6) dans la culture (4), caractérisé en ce qu'il comprend- une mesure de la viscosité du milieu de culture (4) à un temps t=0 correspondant à l'ensemencement de la culture (4) ,- au moins une mesure à un temps t de la viscosité de la culture (4),- une étape de comparaison des mesures à to et t.
- 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 , caractérisé en ce que le milieu de culture (4) est non homogène.
- 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le champ appliqué à la particule est un champ magnétique.13. Dispositif permettant de mesurer la viscosité d'un milieu de culture (4) d'un microorganisme(5), caractérisé en ce qu'il comprend :- au moins un réacteur (1) destiné à recevoir la culture (4) pour réaliser la détection de la formation et du développement de biofilms (6),- au moins une particule magnétique (3) immergée dans la culture (4),- des moyens pour générer un champ électromagnétique, ledit champ électromagnétique étant appliqué à ladite particule (3),- un dispositif de détection du mouvement de ladite particule (3).
- 14. Dispositif selon la revendication précédente, caractérisé en ce que ledit réacteur (1) présente une extrémité fermée de sorte à former un fond(2) plat.15. Dispositif selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le fond (1) dudit réacteur (1) présente une pluralité de cavités (8, 9) ou de sillons destinés à recevoir la ou lesdites particule(s) magnétiques.
- 16. Dispositif selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit réacteur (1) présente une extrémité fermée de sorte à former un fond (2) hémisphérique.
- 17. Dispositif selon la revendication 13, caractérisé en ce que le réacteur (1) est configuré pour permettre un écoulement de la culture (4) en flux constant ou en flux discontinu à intervalle de temps donné.
- 18. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisé en ce que la particule magnétique (3) est une particule revêtue d'un couche magnétique.19. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisé en ce que la particule magnétique est une particule magnétisable.
- 20. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 13 à 19, caractérisé en ce que la particule magnétique (3) est génératrice d'un signal détectable par ledit dispositif de détection du mouvement.
- 21. Dispositif selon la revendication précédente, caractérisé en ce que ladite particule (3) est de type fluorescente ou radioactive.
- 22. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 13 à 21, caractérisé en ce que la particule magnétique (3) est configurée pour présenter une position stable au repos dans ledit réacteur (1).23. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 13 à 22, caractérisé en ce que ladite particule magnétique (3) présente une taille sensiblement identique à la taille des microorganismes (5).
- 24. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 13 à 23, caractérisé en ce que le dispositif de détection du mouvement est constitué d'un dispositif de détection optique.
- 25. Dispositif selon la revendication précédente, caractérisé en ce que ledit dispositif de détection optique comporte une source lumineuse émettant en direction de ladite particule (3), et des moyens de détection permettant de détecter le mouvement de ladite particule (3) dans le milieu de culture (4).26. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 13 à 25, ledit dispositif permettant de détecter la formation et le développement de biofilms (6) dans le milieu de culture (4), caractérisé en ce qu'il comprend : des moyens de mesure pour mesurer la viscosité du milieu de culture à des intervalles de temps donnés,- des moyens de comparaison permettant de comparer les mesures obtenues.
- 27. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 13 à 26, caractérisé en ce que la culture(4) est non homogène.
- 28. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 13 à 27, caractérisé en ce que le champ appliqué est un champ magnétique.
Priority Applications (19)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0401791A FR2866706B1 (fr) | 2004-02-23 | 2004-02-23 | Procede et dispositif permettant de detecter la formation et le developpement de biofilms dans un milieu de culture |
| FR0407062A FR2866707A1 (fr) | 2004-02-23 | 2004-06-28 | Procede et dispositif permettant de detecter la formation et le developpement de biofilms dans un milieu de culture |
| KR1020067019504A KR101166947B1 (ko) | 2004-02-23 | 2005-02-23 | 배양 배지 내 바이오필름의 형성 및 발달을 탐지하기 위한방법 및 장치 |
| NZ549949A NZ549949A (en) | 2004-02-23 | 2005-02-23 | Method and device for detecting the formation and development of biofilms in a culture medium |
| EP05730804A EP1718950B1 (fr) | 2004-02-23 | 2005-02-23 | Procede et dispositif permettant de detecter la formation et le developpement de biofilms dans un milieu de culture |
| PCT/FR2005/000427 WO2005090944A1 (fr) | 2004-02-23 | 2005-02-23 | Procede et dispositif permettant de detecter la formation et le developpement de biofilms dans un milieu de culture |
| CA2557202A CA2557202C (fr) | 2004-02-23 | 2005-02-23 | Procede et dispositif permettant de detecter la formation et le developpement de biofilms dans un milieu de culture |
| DE602005012367T DE602005012367D1 (de) | 2004-02-23 | 2005-02-23 | Verfahren und vorrichtung zum nachweis der bildung und entwicklung von biofilmen in einem kulturmedium |
| AU2005224414A AU2005224414B2 (en) | 2004-02-23 | 2005-02-23 | Method and device for detecting the formation and development of biofilms in a culture medium |
| JP2006553626A JP4909743B2 (ja) | 2004-02-23 | 2005-02-23 | 培養基中でバイオフィルムの形成および発育を検出することを可能にする方法および装置 |
| RU2006131782/28A RU2006131782A (ru) | 2004-02-23 | 2005-02-23 | Способ и устройство, позволяющие обнаруживать образование и развитие биопленок в культуральной среде |
| DK05730804T DK1718950T3 (da) | 2004-02-23 | 2005-02-23 | Fremgangsmåde og indretning til detektering af dannelsen og udviklingen af biofilm i et dyrkningsmedium |
| AT05730804T ATE421086T1 (de) | 2004-02-23 | 2005-02-23 | Verfahren und vorrichtung zum nachweis der bildung und entwicklung von biofilmen in einem kulturmedium |
| CN2005800090859A CN1934435B (zh) | 2004-02-23 | 2005-02-23 | 用于检测生物膜在培养基中形成与生长的方法和装置 |
| BRPI0507209A BRPI0507209B1 (pt) | 2004-02-23 | 2005-02-23 | processo para detecção da formação e desenvolvimento de um biofilme de microrganismos em uma superfície de um meio de cultura líquido e dispositivo que permite detectar a formação e o desenvolvimento de um biofilme em um meio de cultura líquido |
| MXPA06009620A MXPA06009620A (es) | 2004-02-23 | 2005-02-23 | Metodo y dispositivo para detectar la formacion y el desarrollo de biopeliculas en un medio de cultivo. |
| ES05730804T ES2321960T3 (es) | 2004-02-23 | 2005-02-23 | Procedimiento y dispositivo para la deteccion de la formacion y desarrollo de biopeliculas en un medio de cultivo. |
| US10/590,159 US7955818B2 (en) | 2004-02-23 | 2005-02-23 | Method for detecting the formation of biofilms |
| NO20064292A NO339400B1 (no) | 2004-02-23 | 2006-09-25 | Fremgangsmåte og anordnning for å detektere dannelsen og utviklingen av biofilmer i et kulturmedium |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0401791A FR2866706B1 (fr) | 2004-02-23 | 2004-02-23 | Procede et dispositif permettant de detecter la formation et le developpement de biofilms dans un milieu de culture |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2866706A1 true FR2866706A1 (fr) | 2005-08-26 |
| FR2866706B1 FR2866706B1 (fr) | 2014-04-18 |
Family
ID=34833978
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR0401791A Expired - Lifetime FR2866706B1 (fr) | 2004-02-23 | 2004-02-23 | Procede et dispositif permettant de detecter la formation et le developpement de biofilms dans un milieu de culture |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2866706B1 (fr) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008102218A1 (fr) * | 2007-02-23 | 2008-08-28 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Détecteur et procédé associé permettant de détecter des particules magnétiques |
| FR2916761A1 (fr) * | 2007-05-30 | 2008-12-05 | Biofilm Control Soc Par Action | Test antibiogramme utilisant des microbilles |
| WO2012001312A1 (fr) * | 2010-07-02 | 2012-01-05 | Biofilm Control | Procede de detection d'interactions moleculaires |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3635678A (en) * | 1969-06-13 | 1972-01-18 | Baxter Laboratories Inc | Clot-timing system and method |
| US5072610A (en) * | 1987-12-30 | 1991-12-17 | Servio | Device for measuring the modification time of the physical state of a fluid medium |
| WO2001086255A1 (fr) * | 2000-05-08 | 2001-11-15 | Trustees Of Tufts College | Procede et dispositif de determination de la visco-elasticite locale |
-
2004
- 2004-02-23 FR FR0401791A patent/FR2866706B1/fr not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3635678A (en) * | 1969-06-13 | 1972-01-18 | Baxter Laboratories Inc | Clot-timing system and method |
| US5072610A (en) * | 1987-12-30 | 1991-12-17 | Servio | Device for measuring the modification time of the physical state of a fluid medium |
| WO2001086255A1 (fr) * | 2000-05-08 | 2001-11-15 | Trustees Of Tufts College | Procede et dispositif de determination de la visco-elasticite locale |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008102218A1 (fr) * | 2007-02-23 | 2008-08-28 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Détecteur et procédé associé permettant de détecter des particules magnétiques |
| US8190372B2 (en) | 2007-02-23 | 2012-05-29 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Sensor device for and a method of sensing magnetic particles |
| FR2916761A1 (fr) * | 2007-05-30 | 2008-12-05 | Biofilm Control Soc Par Action | Test antibiogramme utilisant des microbilles |
| WO2012001312A1 (fr) * | 2010-07-02 | 2012-01-05 | Biofilm Control | Procede de detection d'interactions moleculaires |
| FR2962221A1 (fr) * | 2010-07-02 | 2012-01-06 | Biofilm Control | Procede de detection d'interactions moleculaires |
| FR2962222A1 (fr) * | 2010-07-02 | 2012-01-06 | Biofilm Control | Procede de detection d'interactions moleculaires |
| AU2011273229B2 (en) * | 2010-07-02 | 2014-09-18 | Biofilm Control | Method for detecting molecular interactions |
| AP3750A (en) * | 2010-07-02 | 2016-07-31 | Biofilm Control | Method for detecting molecular interactions |
| US9746407B2 (en) | 2010-07-02 | 2017-08-29 | Biofilm Control | Method for detecting molecular interactions |
| EA028391B1 (ru) * | 2010-07-02 | 2017-11-30 | Биофильм Контроль | Способ детекции молекулярных взаимодействий |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2866706B1 (fr) | 2014-04-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1718950B1 (fr) | Procede et dispositif permettant de detecter la formation et le developpement de biofilms dans un milieu de culture | |
| Zheng et al. | Correlation of carotenoid accumulation with aggregation and biofilm development in Rhodococcus sp. SD-74 | |
| Massad-Ivanir et al. | Trap and track: designing self-reporting porous Si photonic crystals for rapid bacteria detection | |
| EP3252455A1 (fr) | Dispositif et procede d'acquisition d'une particule presente dans un echantillon | |
| Mitik-Dineva et al. | Bacterial attachment on optical fibre surfaces | |
| Fletcher | 8 Methods for studying adhesion and attachment to surfaces | |
| Yuan et al. | Microfluidics for biofilm studies | |
| Pitruzzello et al. | Nanophotonics for bacterial detection and antimicrobial susceptibility testing | |
| FR2916761A1 (fr) | Test antibiogramme utilisant des microbilles | |
| FR2866706A1 (fr) | Procede et dispositif permettant de detecter la formation et le developpement de biofilms dans un milieu de culture | |
| EP2596351B1 (fr) | Procédé et dispositif d'analyse d'interactions moléculaires, et leurs utilisations | |
| EP1994167B1 (fr) | Procede de releves d'images, notamment pour l'etude du developpement d'un biofilm dans un milieu de culture | |
| WO2014155020A1 (fr) | Antibiogramme rapide | |
| Xia et al. | Imaging the separation distance between the attached bacterial cells and the surface with a total internal reflection dark-field microscope | |
| CA2601366A1 (fr) | Procede et dispositif permettant d'isoler des microorganismes | |
| Kanematsu et al. | Biofilm evaluation methods outside body to inside-Problem presentations for the future | |
| Faluweki | Structural mechanics and collective self-organisation in filamentous cyanobacteria | |
| WO2017121964A1 (fr) | Procédé de détection rapide de sensibilité de microorganismes aux drogues | |
| Miño | Study of the diffusion, rheology and microrheology of complex mixtures of bacteria and particles under flow confined in thin channels. | |
| Krishnan | Laser and optical based methods for detecting and characterising microorganisms | |
| Peterson et al. | Applications of high resolution surface plasmon resonance imaging to adherent cells: single mammalian cells to bacterial biofilms | |
| Paramonova | Compressive strength of fungal and oral biofilms: biological and environmental influences | |
| WO2015170021A1 (fr) | Procede de determination de l'activite enzymatique d'une enzyme et dispositif pour sa mise en œuvre | |
| Nivens | Non-destructive monitoring of microbial biofilms using on-line devices |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TP | Transmission of property |
Owner name: BIOFILM CONTROL, FR Effective date: 20121022 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 13 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 14 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 15 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 17 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 18 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 19 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 20 |