CN103403176B - 用于测量薄膜的抗性的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及用于测量力,如机械力或流体力对薄膜(例如,由微生物形成的生物膜)完整性的影响的方法,所述方法在于观测力对合并至薄膜中的微珠的影响。优选地,微珠是磁性的或可磁化的。该方法尤其适用于生物学、化学和生物技术或农产品加工领域。
Description
技术领域
本发明涉及用于测量作用(action)对薄膜的影响的方法。具体地,本发明涉及用于测量作用,例如机械的、流体的、物理的、化学的或者生物的作用对薄膜完整性的影响的方法。
本发明尤其在生物学、化学和生物技术领域中找到应用。
在以下的描述中,括号中的参考文献([Ref.])是指在本文结尾处给出的参考文献清单。
背景技术
存在大量的惰性或者活的(生物学的)物质的沉积物或薄层,其结合至载体:例如涂料(paint)、油漆(varnish)、由高分子组成的薄膜、由微生物和各种细胞,例如细菌、酵母、海藻、和多细胞有机体的细胞组成的生物膜。在下文中,将借助于术语“薄膜”表示在载体上的这些层和沉积物。
在这些薄膜中,随着时间的推移逐渐形成大量的薄膜,例如通过单体的聚合、通过高分子的积聚或者相互渗透、通过微生物的生物膜的生长、通过细胞增殖和/或彼此结合细胞的物质的产生。
通常可以通过各种的物理参数或者物质来调节这种形成,了解该形成的影响是有用的。在物理化学处理,例如洗涤剂、溶剂、辐射如热作用等的作用下形成薄膜之后还可以对该薄膜进行改性。
可以关注在薄膜中可以产生的所有这些作用,以了解对于流体作用(如喷射(jet)、流股(stream)或者覆盖薄膜的溶液的震动)的抗性。例如,还可以简单地关注于了解该薄膜是否仍然能够形成或者是否已经破碎。在本文件的剩余部分中将借助于术语“完整性”表示这些性能。
已知一些方法使得能够比较各种天然的、通过各种形成方法获得的和从各种处理中得到的薄膜的完整性。
例如,在一个已知方法中,使用其颜色不同于薄膜颜色的载体。因此,当薄膜在该载体上形成时,例如,在流体作用、物理化学处理和/或调节其形成之后,本领域技术人员容易通过分析获得的图像测量其完整性。
然而,还存在透明的或者不被染色的薄膜,例如活的薄膜、由微生物形成的薄膜、由聚合或者积聚得到的薄膜,对此所使用的用于染色的物质可能干扰薄膜的形成。
例如,现有技术中存在一些方法,用于由其物理性能,如其折射率来测量薄膜完整性的方法,例如在Singh等,Physica Scripta.Vol.65,167-180(2002):“Refractive IndexMeasurement and its Applications”[Ref.1]中和在等Biophysical Journal,Vol.87,553-561(2004):“The Density and Refractive Index of Adsorbing ProteinLayers”[Ref.2]中。
然而,这些方法是昂贵的方法并需要训练的且有资格的人员以及复杂且昂贵的仪器。
存在一些情形,例如在医学领域或生物学领域中,其中,需要在化合物、生物分子、热力学改性等存在下测量大量不同薄膜的完整性。例如,评估化合物对生物膜的有效性或者酶对聚合膜的作用如降解、改性(修饰)或有效性是一个难题。
在这些情形中,例如在对于生物膜有活性的分子或者酶的筛选操作(screeningrun)的情况下,例如在医疗护理领域内评估抗生素对生物膜的有效性,上述所描述的技术并不令人满意,因为这些技术并不能够使本领域技术人员足够快速地进行测量。
此外,这些已知的方法需要使用大量的仪器,而在筛选过程中不能同时使用这些仪器。此外,所使用的仪器是昂贵的,并且需要有资格的人员在场。
此外,使用已知方法来获得该结果的时间很漫长并且可能需要加入反应物,该反应物能够更改该结果并且因此导致结果的可变性并且缺乏可再现性。
因此真正需要找到一种用于测量作用对薄膜的影响的方法,该方法克服现有技术的这些失败、缺点和阻碍,尤其是一种能够控制时间、降低用于该方法所需的仪器、降低成本和改善对影响的检测的方法。
发明内容
本发明的方法使得能够解决现有技术的上述的失败、缺点和阻碍。
具体地,本发明的一个目的是一种用于测量至少一种作用对薄膜的影响的方法,包括以下步骤:
a.向溶液中引入能够形成薄膜的至少一种物质,
b.向在(a)中获得的溶液中引入至少两种颗粒,所述颗粒放置在所述溶液中浸没的表面S上,
c.重新聚集(regrouping)所述浸没的表面S上的所述颗粒,所述颗粒在所述表面上形成斑点(spot)或标记(mark),
d.由所述物质形成所述薄膜,
e.观测表面S上的斑点或标记,
f.将机械和/或物理作用施加至所述溶液,
g.通过观测表面S上的斑点或标记来观测在步骤(e)中施加的作用对薄膜的影响,以及
h.通过比较来自上述步骤(e)和步骤(g)的观测结果来测定施加至薄膜上的作用的影响。
根据本发明,能够形成薄膜的物质可以是,例如微生物、粮食(食物)、化学物质、合成的高分子、生物学的高分子、胶体和乳液、显微(微米)尺寸的物体和纳米尺寸的物体。
这些可以是,例如,真核细胞,如动物真核细胞,如血细胞,如白细胞,如粒细胞,中性白细胞;嗜酸性白细胞;嗜碱性白细胞;B淋巴细胞,T淋巴细胞,NK淋巴细胞,单核细胞,红细胞,血小板。它们也可以是植物真核细胞,例如植物表皮细胞、木质部细胞、韧皮部细胞、薄壁组织细胞、厚角细胞和厚壁组织细胞。它们还可以是真菌或酵母。它们可以是,例如念珠菌属(Candida)、隐球菌属(Cryptococcus)、马拉色氏霉菌属(Malassezia)、瓶形酵母属(糠疹癣菌属,Pityrosporum)、肺孢子虫属(Pneumocystis)、表皮癣菌属(Epidermophyton)、小孢子菌属(Microsporum)、发癣菌属(Trichophyton)。它们还可以是原生动物,例如痢疾内变形虫(Entamoeba histolytica)、卡氏棘阿米巴(Acanthamoebacastellanii)、福氏耐格里原虫(Naegleria fowleri)。
它们还可以是原核细胞,例如任何本领域技术人员已知的任何细菌,如在下组中包括但不限于此的细菌,该组由以下组成:橙黄弗拉托菌(Acetobacter aurantius)、放线共生放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、棕色固氮菌(维涅兰德固氮菌,Azotobacter vinelandii)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、梭状杆菌(Bacillus fusiformis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、龈拟杆菌(Bacteroides gingivalis)、产黑素拟杆菌(Bacteroides melaninogenicus)、汉赛巴尔通体(Bartonella henselae)、五日热巴尔通体(Bartonella quintana)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、卡他布兰汉球菌(Branhamella catarrhalis)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、马尔他布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏菌(Brucellasuis)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)、类鼻疽伯霍尔德杆菌(Burkholderiapseudomallei)、肉芽肿荚膜杆菌(Calymmatobacterium granulomatis)、结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、空肠弯杆菌(Campylobacter jejuni)、幽门弯杆菌(Campylobacter pylori)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae)、鹦鹉衣原体(Chlamydophila psittaci)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、难辨梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风杆菌(Clostridium tetani)、韦氏梭菌(Clostridiumwelchii)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、梭形棒状杆菌(Corynebacteriumfusiforme)、伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii)、沙费埃里希体(Ehrlichiachaffeensis)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、耐久肠球菌(Enterococcus durans)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)、Enterococcus maloratus、大肠杆菌(Escherichia coli)、土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、阴道加德那菌(Gardnerella vaginalis)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、流感嗜血菌(Haemophilus influenza)、副流感嗜血菌(Haemophilus parainfluenzae)、百日咳嗜血杆菌(Haemophilus pertussis)、阴道嗜血杆菌(Haemophilus vaginalis)、幽门螺杆菌(Helobacter pylori)、克雷白氏杆菌(肺炎克雷伯菌,Klebsiella pneumoniae)、鼻硬结克雷白氏杆菌(Klebseilla rhinoscleromatis)、催产克雷白杆菌(Klebsiella oxytoca)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乳乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、Methanobacteriumextroquens、多形微杆菌(Microbacterium multiforme)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、牛结核杆菌(Mycobacterium bovis)、白喉分枝杆菌(Mycobacterium diphtheriae)、细胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、鼠麻风分枝杆菌(Mycobacterium lepraemurium)、脉状菌状杆菌(草分枝杆菌,Mycobacterium phlei)、解皂菌状杆菌(耻垢分枝杆菌,Mycobacterium smegmatis)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、发酵支原体(Mycoplasma fermentans)、生殖器支原体(Mycoplasmagenitalium)、人型支原体(Mycoplasma hominis)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、星状诺卡氏菌(Nocardia asteroids)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、土拉巴斯德菌(Pasteurella tularensis)、龈紫单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、铜绿色极毛杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia)、放射根瘤菌(Rhizobium radiobacter)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、莫氏立克次氏体(Rickettsia mooseri)、鹦鹉热立克次氏体(Rickettsia psittaci)、五日热立克次体(Rickettsia quintana)、立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)、沙眼立克次体(Rickettsia trachomae)、亨氏巴尔通体(henselae罗克利巴体菌,Rochalimaeahenselae)、五日热罗卡利马体菌(Rochalimaea quintana)、龋齿罗菌(Rothiadentocariosa)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、灵杆菌(粘质沙雷菌,Serratiamarcescens)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、鸟链球菌(Streptococcus avium)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、大鼠链球菌(Streptococcus cricetus)、屎链球菌(Streptococcus faceium)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、野生链球菌(Streptococcus ferus)、鹑鸡链球菌(Streptococcus gallinarum)、乳链球菌(Streptococcus lactis)、轻型链球菌(Streptococcus mitior)、草绿色链球菌(轻型链球菌,Streptococcus mitis)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、鼠链球菌(Streptococcus rattus)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、血链球菌(Streptococcus sanguis)、龋齿链球菌(Streptococcus sobrinus)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、逗号弧菌(Vibrio comma)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)、嗜盐弧菌(Vibrio vulnificus)、嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia)、小肠结肠子尔赞氏菌(小肠结肠炎耶尔森菌,Yersiniaenterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)和假结核耶尔森氏菌(Yersiniapseudotuberculosis)等。
表述“胶体和乳液”被理解为指液体或半-固体形式的物质,其包含用于混合物均匀的足够小的颗粒。它可以是本领域技术人员已知的任何胶体和乳液。例如,它可以是包含两种不同相的任何物质和/或组合物。例如,可以是悬浮液形式的液体,其包含颗粒,例如脂质体、液滴、聚集物,例如它们可以具有例如从2nm至200nm,例如从201nm至5μm的粒径。例如,它可以是纳米乳液、奶、精制奶油、黄油、蛋黄酱、增加水分的奶油(moisturizingcream)、粘土、胶态金或者胶态银、和水包油型、水包铁磁流体型和油包水型合成乳液。
根据本发明,表述“合成的高分子”被理解为指具有高分子量的改性的化学分子和/或天然分子,例如1kDa至1000kDa的分子量,例如聚苯乙烯磺酸酯和聚乙二醇。
根据本发明,表述“生物学高分子(biological macromolecules)”被理解为指具有高分子量的任何生物学的高分子,例如5kDa至1000kDa的分子量。例如,它们可以是组装的(assembling)生物学高分子,例如它们是通过共价结合天然分子,核酸(如DNA和RNA),多糖(如葡聚糖、纤维素、淀粉)和蛋白质(如肌动蛋白、纤维蛋白原和血纤维蛋白)组合的高分子。
根据本发明,表述“显微尺寸的物体(微米尺寸的物体,objects of microscopicsize)”被理解为指本领域技术人员已知的任何物质和/或物体,其尺寸从1μm至1000μm,优选从1μm至100μm。
根据本发明,表述“纳米尺寸的物体”被理解为指本领域技术人员已知的任何颗粒,其尺寸是小于1μm和/或1000nm,例如从50nm至950nm,从1nm至100nm。
根据本发明,薄膜可以通过以下形成,例如通过经由共价键的单体聚合,通过经由共价键(如二硫键、肽键),经由非共价键(如盐桥、氢键、范德瓦耳斯力)的蛋白质多聚化,通过微生物的沉积,通过表面上微生物的增殖、通过这些微生物的聚合物的分泌(如核酸、蛋白质和多糖),通过蛋白质的聚合(如血浆蛋白质或者细胞蛋白质的聚合)。
薄膜还可以通过以下形成:通过单体例如丙烯酰胺、双丙烯酰胺、乙烯、丙烯、乙烯基和氨基酸的聚合;通过在表面上,如涂料或者油漆上的乳液沉积;通过水凝胶或者气凝胶的形成如琼脂糖凝胶、琼脂凝胶或者明胶凝胶,如二氧化硅、氧化铝、氧化铬(III)或氧化锡的气凝胶或者SEAgelTM的气凝胶。
根据本发明,薄膜还可以通过溶液的蒸干/冻干形成,如蛋白质的溶液、DNA的溶液、稀释于溶剂中的脂肪的溶液,如乳液,如涂料、油漆,如通过温度变化诱导的液-固相的变化,如具有熔化的奶油、增加水分的奶油或者脂肪的溶液。
根据本发明,施加的该作用可以是,例如,机械的、流体的或者物理的作用。
根据本发明,施加可以进行,例如,1小时至24小时、1分钟至60分钟、1分钟至5分钟或者1秒至60秒。
根据本发明,例如,表述“机械作用”被理解为指沿着表面经受往复运动、经受旋转或圆周运动或者经受压力的刷子、刮铲或圆盘的施用。
根据本发明,例如,表述“流体作用”被理解为指,例如以0.1rpm至1000rpm、5rpm至300rpm的角速度使用搅拌器的旋转,和/或例如使用泵施加喷射的液体或气体的,并且如可以以1.01巴至10巴、优选从1.1巴至2巴的压力喷射液体或者气体。
根据本发明,例如,表述“物理作用”被理解为指辐射,如通过电磁辐射,如施加具有10nm至10μm、从100nm至1μm波长的光束。例如,该光束可以具有0.01W至100W、从0.1W至10W的强度。例如,还可以是粒子轰击,如使用核粒子,如由粒子加速器或者由放射源产生的中子、电子、加速粒子,如材料的颗粒,如具有50μm至500μm直径的沙子颗粒,如具有50μm至500μm直径的盐颗粒,如金属颗粒,如具有10μm至500μm的铜、铁、锌或铝颗粒。
优选地,在本发明的方法中施加的所述至少一种作用是流体作用。
根据本发明,该方法可以独立地包括,施加上面描述的至少两种或者至少三种作用。例如,本发明的方法可以包括施加流体作用和电磁作用,如利用紫外线辐射随后,例如,旋转,或者用β粒子辐射随后,施加水的喷射。
在本发明中能够使用的溶液可以是,例如,液体溶液或者气体。溶液可以是本领域技术人员已知的任何溶液。例如,它可以是培养基,如真核细胞和/或原核细胞的培养基;缓冲溶液(缓冲介质,buffer medium),如本领域技术人员已知的任何缓冲溶液,如商业可获得的缓冲溶液,如磷酸盐缓冲溶液(PBS);生物样品,如血液样品、血浆样品、尿液样品或者脑脊髓液样品;盐溶液,如生理溶液;培养基,例如商业可获得的脑心浸液;溶剂,如丙酮、二甲亚砜、乙醇、甲醇、丙醇、乙腈、乙酸乙酯、乙醚、苯酚、氯仿、四氢呋喃、或二氟乙烯;和/或烃,如己烷、环己烷、苯、辛烷、癸烷、石油、汽油、和柴油。
根据本发明,气体可以是,例如空气、氧、氮、氖、氩、二氧化碳、甲烷或臭氧。
根据本发明,液体溶液可以具有0.1kg/l至4kg/l、0.3kg/l至3kg/l的密度;气态溶液可以具有10-15kg/m3至1000kg/m3、10-10kg/m3至30kg/m3、10-5kg/m3至3kg/m3的密度。
本领域技术人员依据其常识,将容易地知道如何测定溶液的密度。例如,如通过测量质量与体积的比率,如通过称量已知体积的溶液,可以进行溶液密度的测量。
根据本发明,该溶液可以是预处理的,如可以纯化、稀释或者浓缩该溶液。
根据本发明,溶液可以通过本领域技术人员已知的任何方法纯化,如通过渗析、过滤、超滤、净化和离心。例如,过滤法可以包括使溶液通过具有0.2μm至100μm孔的滤网,例如超滤法可以包括以1rpm至3000rpm的速度离心0.1分钟至30分钟的时间段,例如渗析法可以是包括在渗析膜(例如具有500Da的截止阈(截断阈))上沉积溶液步骤的方法,所述膜漂浮在容纳在容器中的蒸馏水上。例如,净化法可以是包括向溶液加入0.1%(重量/重量)的牛血清蛋白的方法。
根据本发明,溶液的纯化可以有利地使得可以从溶液中除掉任何能够妨害影响测定的污染物和/或分子,例如纯化可以使得可以独立地除去细菌、病毒、蛋白质、化学分子、盐、材料的颗粒和聚集的分子。当然,本领域技术人员依据其常识,会知道如何使净化过程适应溶液的变化。
根据本发明,例如,还可以通过本领域技术人员已知的任何方法,如通过连续稀释来稀释溶液。可以使用本领域技术人员已知的任何稀释液进行稀释。例如,它可以是缓冲溶液,如磷酸盐缓冲液、盐溶液,如生理血清、乙醇、DMSO、丙酮、己烷和/或上面描述的任何溶剂、烃或者溶液。
例如,可以以2比20000、5比500或5比50的系数来稀释溶液。
溶液的稀释可以有利地使得能够改变存在于溶液中的组分的浓度,如降低其浓度,如稀释使得能够降低蛋白质浓度。因此该稀释使得能够降低可能的干扰物化合物的浓度并且因此有利地提高本发明的方法的特异性和/或灵敏度。
根据本发明,例如,还可以通过本领域技术人员已知的任何方法,如通过超速离心、超滤、蒸干或冻干来浓缩溶液。
根据本发明,所述溶液的纯化、稀释和/或浓缩可以有利地使得能够调节所述溶液的密度。
溶液密度的调节使得能够有利地提高本发明的方法的灵敏度,尤其是通过提高、通过降低或者通过抵消推动颗粒朝向表面的重力的影响。
根据本发明,在该方法中使用的溶液的体积可以是,例如,0.3μl至100ml、3μl至10ml、30μl至1ml。
根据本发明,例如,可以在-10℃至90℃、0℃至40℃或15℃至25℃的温度下进行溶液的温育。
根据本发明,例如,温育时间可以进行1小时至72小时、2小时至48小时、1小时至24小时或1分钟至60分钟。
根据本发明,术语“影响”被理解为,例如,是指磨损、撕裂(如完全或者部分的撕裂)、变性、破坏、撕开、分离、穿透,外观的裂纹,裂缝、孔洞或细孔、溶胀、收缩和/或抑制薄膜形成。
根据本发明,可以使用许多颗粒进行本发明的方法,例如使用至少2个颗粒,如使用2至10000000、1000至1000000、10000至1000000、100000至1000000或10000至100000个颗粒。大量的颗粒使得能够有利地在无需复杂的显示装置以及无需染料的情况下,直接检测所述物质之间的相互相用,这不同于现有技术方法(其使用单一颗粒并且需要复杂的显示器装置或者染料来检测相互作用)。
根据本发明,所述至少两种颗粒可以选自包括以下各项的组中:带电颗粒,磁性颗粒,涂覆至少一个磁性层的颗粒,可磁化的颗粒,涂覆可磁化层的颗粒,电的、电磁的或者可带电的颗粒,其带有一种电荷,或者这些颗粒中两种或更多种的混合物。事实上,它可以是使得能够实现本发明的任何颗粒。
有利地,所述颗粒可以是适用于实现本发明的任何形状的颗粒,例如以珠粒(bead)或圆盘(disk)的形式,以不对称的几何形状的形式,如使用平面等。
可以使用任何合适尺寸的磁性颗粒。例如,可以选择的尺寸与溶液的容器尺寸有关。例如,颗粒的尺寸可以小于容器尺寸的十分之一,优选小于百分之一,更优选还要小于容器尺寸的千分之一。例如,如该颗粒可以具有10nm至100μm、0.1μm至10μm的尺寸。
根据本发明,例如可以借助于光源照亮颗粒。该照明有利地使得能够提高颗粒与溶液之间的对比度。
本发明有利地使得能够通过使用多个颗粒来检测由施加于薄膜的作用所引起的小的劣化。单一磁性或可磁化的颗粒和/或珠粒的应用不能够检测这些劣化。此外,存在检测非特异现象的重要风险,如薄膜的部分形成。
根据本发明,可以通过本领域技术人员已知的任何装置进行该观察。例如,可以是光学装置,如显微镜、照相机、文件扫描仪,如Epson Perfection V750扫描仪,或目视观测。
根据本发明,观测可以使得能够测量,例如,图像的强度、对比度、或变化(方差,variance),如通过本领域技术人员已知的任何方法,如成像软件,如ImageJ软件,其使得能够测量如相应于例如区域中的颗粒从一个图像到另一个的对比度和强度的差异,并且因此测量从一个观测到另一个的差异。例如通过在图像之间进行减法运算,如通过测量图像之间的相关系数,例如,来比较在施加机械、流体或者物理作用的前后所获得的图像是个问题。
根据本发明,使用颗粒如彩色的、荧光的、磷光的、发光的或放射性的颗粒来发射信号可以,例如允许自动化的观察。
根据本发明,可以通过观察颗粒的分布测定影响。例如,不含颗粒的区域可以是如薄膜中的裂缝(撕裂,tear),颗粒的非色散(non-dispersion)使得能够测定薄膜对作用的抗性。
根据本发明,可以使用本领域技术人员已知的任何方法来进行重新聚集(regrouping)。例如,可以当该颗粒是如磁性或者可磁化的时,磁场或电场或电磁场使得能够,例如将所述颗粒重新聚集在一个斑点处。
根据本发明,例如术语“斑点”被理解为指多个颗粒重新聚集在一个位置处,因此在浸没的表面上形成斑点,圆盘,环,杆,一致的几何形状(如正方形、菱形或三角形),或标记。
根据本发明,例如术语“标记”被理解为指在浸没的表面上由多个颗粒形成的暗区。
根据本发明,在可以表示观测表面的表面Si上可以进行步骤(e)中的观测,如在第一图像上,如在1像素至10000像素、10像素至900像素、50像素至700像素或100像素至500像素的表面上。
根据本发明,由像素的宽度×高度来定义像素的尺寸,如0.018mm至0.660mm的高度,0.018mm至0.660mm的宽度。
根据本发明,在可以表示观测表面的表面S2上可以进行步骤(g)中的观察,如在第二图像上,如表面相当于Si,该表面是Si的1.1至2.5倍、或是Si的0.5至0.9倍。
有利地,上述的比较可以使得能够测量作用的影响程度,如它可以使得能够测量被作用改变的薄膜的百分比和量。
根据本发明,比较观测可以有利地使得能够测量在浸没的表面上颗粒分散的百分比并且因此测量作用对薄膜的影响的值。
此外,本发明的方法使得能够获得具有比现有技术方法更好的灵敏度的可靠结果。
此外,本发明的方法使得能够在没有化学试剂或生物学试剂的情况下测定作用对薄膜的影响,另外,使得能够在短时间内以可重复的和可靠的方式定量该影响并且其不取决于特定的操作人员和/或装置。
根据本发明,场可以应用于薄膜形成的开始和/或中间。
根据本发明,磁场或电场或电磁场可以是使得能够在所述溶液中的所述浸没的表面上移动所述至少两个颗粒的任何场,如电磁场或磁场。例如,可以通过磁铁或通过螺线管产生磁场或电场或电磁场。例如该磁铁可以是棒、针或板(pièce)等形式或是适于实施本发明的任何形状。例如可以通过本领域技术人员已知的任何方法施加场,如通过脉冲、通过逐渐提高的电磁场、通过电磁场变化或通过这些施加的组合。
根据本发明,颗粒可以以含有结合物质的液滴形式(其溶于溶液中)沉积在表面上或者颗粒可以在施加作用的过程中破碎。
根据本发明,在施加该作用之后该方法还可以有利地使得能够定量所观测的标记和/或斑点的表观。
本发明的方法,在步骤(f)之后,可以包括通过测量平均标准偏差D1来定量化(Q)标记和/或斑点的表观的步骤(i)。可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行平均标准偏差的测定。例如可以使用ImageJ软件(Image Processing and Analysis in Java,http://rsb.info.nih.gov.ij)进行测量,如通过测量在步骤(g)中观测的图像,该图像包含在,例如在步骤(c)中获得的在斑点和/或标记周围的椭圆中心中,通过计算,通过在步骤(g)中观测的斑点或标记的形状变化的近似价值等于:
Q=(D*D-D0*D0)/(I*I),
其中I是如上述定义的标记强度的对比度的度量(测量值,measurement)以及D0是使用ImageJ软件测量的标记周围的孔的背景平均标准偏差,例如以椭圆形位于与标记接触处但不包括标记本身。
有利地,本发明使得能够测定微生物的生物膜的形成和破坏,测定如通过涂料、通过粮食、通过天然或工业培养基(介质,media)的样品、通过生物样品形成的薄膜的形成和破坏,例如微生物的生物膜,其可以是由微生物(细菌、真菌、海藻或原生动物)的一种或多种物种构成的薄膜,粘附在一起并粘附至表面,并且不分泌、分泌很少或可变量的通常由多聚糖构成的粘合性和保护性的基质。
此外,本发明的方法使得能够获得具有比现有技术方法更好的灵敏度与更好的特异性的可靠结果。
此外,本发明的方法使得能够获得可重复的结果,并且因此使用本发明的方法进行的测量能够进行有效和有用的比较。
本领域技术人员在阅读通过经由示意图给出的附图进行说明的以下实施例时,其它的优点将再次变得显而易见。
附图说明
-图1A显示了标记为1至6的6个板条(strip)的图片,在柱A和柱E的孔中分别包含水和顺磁性微珠,在柱B和柱F的孔中分别包含37g/l的BHI和顺磁性微珠,在柱C和柱G的孔中分别包含5g/l的蛋白胨和顺磁性微珠,在柱D和柱H的孔中分别包含5g/l的胰蛋白胨和顺磁性微珠。在37℃下温育2小时30分钟之后,相应于孔观测的各行,分别是在震动之前观测行1和行2,在20秒震动之后观测行3和行4,在60秒震动之后观测行5和行6并且在240秒震动之后观测行7和行8。
-图1B显示了各标记的可归因的(attribuable)强度(Iatt)的变化(在x-轴上)作为以秒计的流体作用时间(T)的函数(y-轴)的图。实心方形表示针对包含大脑心脏浸出液(BHI)培养基的孔所获得的值,实心三角形表示针对包含蛋白胨的孔所获得的值,实心圆形表示针对包含胰蛋白胨的孔所获得的值以及实心菱形表示针对包含水的孔所获得的值。
-图2A和图2B是板条的孔的照片。
-图2A显示了在流体作用之前标记为sw1至sw4的4个板条的照片,分别包含以下细菌:单核细胞增生利斯特氏菌、大肠杆菌DH5α、木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌和磁性颗粒。
-图2B显示了在流体作用之后标记为sw1至sw4的4个板条的照片,分别包括以下细菌:单核细胞增生利斯特氏菌、大肠杆菌DH5α、木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌和磁性颗粒。
-图3A是显示强度(I)(y轴)作为细菌(x轴)的函数的结果的柱状图,BHI表示该没有细菌的孔,Lm:单核细胞增生利斯特氏菌,Ec:大肠杆菌DH5α,Sx:木糖葡萄球菌,Se:肉葡萄球菌。黑色柱:震动之前的值,白色柱:震动之后的值。
-图3B是显示在图3A中获得的标准化的值的柱状图,对应于在流体作用之后未破坏的生物膜部分(PBNB)(y轴)作为细菌的函数(x轴)。BHI表示没有细菌的孔,Lm:单核细胞增生利斯特氏菌,Ec:大肠杆菌DH5α,Sx:木糖葡萄球菌,Se:肉葡萄球菌。
-图3C是显示定量化Q(y轴)作为细菌的函数。BHI表示没有细菌的孔,Lm:单核细胞增生利斯特氏菌,Ec:大肠杆菌DH5α,Sx:木糖葡萄球菌,Se:肉葡萄球菌。
-图4A表示标记为sw0、sw2、sw4、sw6、sw8和sw24的6个板条(分别在37℃下培养0、2h、4h、6h、8h和24h之后)在流体作用之前的照片,在孔E中包含BHI培养基和磁性颗粒,在孔F、孔G和孔H中包含在具有磁性颗粒的BHI培养基中的细菌单核细胞增生利斯特氏菌。
-图4B表示标记为sw0、sw2、sw4、sw6、sw8和sw24标注的6个板条(分别在37℃下培养0、2h、4h、6h、8h和24h之后)在流体作用之后的照片,在孔E中包含BHI培养基和磁性颗粒,在孔F、孔G和孔H中包含在具有磁性颗粒的BHI培养基中的细菌单核细胞增生利斯特氏菌。
-图5A是显示强度(I)(y轴)作为0、2h、4h、6h、8h或24h的时间(x轴)的函数结果的柱状图。空白柱对应于使用单核细胞增生利斯特氏菌(Lm)获得的结果,黑色柱对应于未使用细菌(BHI)的结果。
-图5B是显示在流体作用之后生物膜未破坏部分(PBNB)(y轴)作为0、2h、4h、6h、8h或24h的时间(x轴)的函数的柱状图。空白柱对应于使用单核细胞增生利斯特氏菌(Lm)获得的结果,黑色柱对应于未使用细菌(BHI)的结果。
-图5C是显示定量化Q(I)(y轴)作为0、2h、4h、6h、8h或24h的时间(x轴)的函数的柱状图。空白柱对应于使用单核细胞增生利斯特氏菌(Lm)获得的结果,黑色柱对应于未使用细菌(BHI)的结果。
-图6A显示在流体作用之前标记为1至9的9个8孔板条照片,包括金黄色葡萄球菌CIP76.25A细菌(接种于柱B、C、D、E、F和G的孔的培养基中)在培养基中分别包括氨苄西林(行1)、头孢他啶(行2)、氯霉素(行3)、红霉素(行4)、哌拉西林(行5)、四环素(行6)、庆大霉素(行7)、环丙沙星(行8)或甲氧苄啶(行9),作为浓度的函数:没有抗生素(柱A=不含细菌含有磁性颗粒的培养基的无菌对照,以及柱G=含有磁性颗粒含有细菌的培养基的对照)、4倍基础浓度的抗生素(柱F和柱H)、2倍基础浓度的抗生素(柱G)、基础浓度的抗生素(柱D)、0.5倍基础浓度的抗生素(柱C)或0.25倍基础浓度的抗生素(柱B)和磁性颗粒。
-图6B显示来自图6A的构造但是在流体作用之后。
实施例
实施例1:测量流体作用对蛋白质薄膜的影响
在该实施例中,该方法应用于研究由富含蛋白质的溶液形成的薄膜的抗性。
分别制备水、37g/l的BHI(BD-DIFCO,法国)、5g/l的蛋白胨(Fluka)和5g/l的Bacto(商标)胰蛋白胨(BD-DIFCO,法国)的2.4mL的溶液。使用以10μl/ml比例的顺磁性微珠(Ton006N,Biofilm Control,法国)的溶液补充这些溶液。然后将这些溶液以100μl/孔的比例置于平底孔的2个板条的各个孔中,分别是A和E,B和F,C和G,D和H(参考文献:MSW002B,BioFilm Control,法国)。将该板条放置在磁化的试验台上(BKT-MSW002 BioFilmControl,法国),并且将整个组件放置在恒温箱中(参考文献BC240,Firelabo,法国)在37℃下固定2小时30分钟。
然后将这些板条放置在定轨摇床上(Variomag Monoshake,H+P Labortechnik,德国),将其最大角速度调节为30%+/-10%,以便使它们连续经受流体作用0s、5s、5s、10s、10s、10s、10s、10s、20s、20s、20s、30s、30s、30s、30s,因此总计达0s、5s、10s、20s、30s、40s、50s、60s、80s、100s、120s、150s、180s、210s和240s的总震动时间。
在每一个震动作用之后,将该板条放置在文件扫描仪(Perfection V-750 PRO,Epson,USA)上,使用该扫描仪带有的EpsonScan软件(Epson,美国)进行图像采集。
在图1A中对于0s、20s、60s和240s的震动时间的复制图像是通过以下而获得的:通过加入使用ImageJ软件(http://rsb.info.nih.gov.ij)的扫描仪获得的彩色图像的红、绿和蓝组分并且切断(découpage)所获得的具有不同对比度设置的图像。在所有的孔中清晰界定的斑点是可见的。
使用ImageJ软件,通过进行两个测量来定量斑点和标记,分别是包含在表面斑点或标记周围的椭圆中心中图像的平均强度,I1和I2,分别是,Si=100像素至500像素和S2=1.1×Si至2.5×Si。
通过进行以下计算获得在图像中观察的归因于黑点或标记的强度(Iatt)的近似测量:
Iatt=Si×(I2×Si–I1×Si)/(S2–S1)–I1×Si
因此将获得的强度的平均值复制在图1B和以下表1中。
表1:强度测量的测量结果
如在图1B和上述表中显示的,图像强度作为震动时间的函数而变化并且使得能够测量如薄膜的抗性。如在该实施例中表明的,本发明的方法使得能够测定作用,如流体作用对薄膜的影响。尤其是,本发明的方法使得能够测定彼此相关的薄膜的抗性。
实施例2:测量流体作用对不同物种的生物膜的影响
在该实施例中,本发明的方法使得能够研究由不同细菌物种形成的生物膜的抗性。
将以下4种微生物:单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、大肠杆菌DH5α(Escherichia coli DH5 α)、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)在大脑-心脏浸出液培养基(BHI,BD-DIFCO(法国))中的16小时培养物,通过使用无菌的BHI稀释,调节为在600nm的波长下DO600nm=0.004的光密度,用10μl/ml浓度的顺磁性微珠(Ton005N,BioFilm Control,法国)的溶液补充。使用分光光度计(Biomate,Thermo Scientific,法国)进行光密度的测量。将包含顺磁性微珠的调节的培养物以200μl/孔的比例沉积在平底孔中(参考文献:MSW 002B,BioFilm Control,法国),在4个半条的标记为F、G和H的孔中,分别标记为sw1、sw2、sw3和sw4。补充有顺磁性微珠(Ton006N,Biofilm Control,法国)的溶液的200μl无菌BHI以10μl/ml的比例沉积在每一板条的孔E中。
在以下表2中显示了各种沉积物的分布。
表2
将每一板条独立地放置在磁化的试验台上(BKT-MSW002 BioFilm Control,法国),该试验台放置在容纳有两个含有20ml水的25ml烧杯的18×12×7cm的带盖矩形盒子中。然后将组件放置在恒温炉中(参考文献BC240,Firelabo,法国)在30℃下稳定板条sw1和sw2并且在37℃下稳定板条sw3和sw4持续8小时。
然后将该板条独立地放置在文件扫描仪(Perfection V-750 PRO,Epson,USA)上,使用该扫描仪带有的EpsonScan软件(Epson,美国)进行图像采集。在图2A中复制的最终图像是通过以下而获得的:通过加入使用ImageJ软件(Image Processing and Analysis inJava,http://rsb.info.nih.gov.ij)的扫描仪获得的彩色图像的红、绿和蓝组分并且切断(découpage)所获得的具有不同对比度设置的图像。在所有的孔中清晰界定的斑点是可见的。
然后将这些板条放置在定轨摇床上(Variomag Monoshake,H+P Labortechnik,德国),将其调节至60%+/-20%的最大角速度持续10秒。该步骤对应于在培养基中形成的薄膜经受流体作用。
与在第一图像相同的条件下进行第二图像的采集。因此获得的图像对应于图2B。在该图中,大致上清晰界定的斑点和标记是可见的,并且它们的表观取决于形成生物膜的菌株。在行E中的斑点是强度显著较低,这相应于在流体作用下顺磁性微颗粒的最大分散。
使用ImageJ软件,通过进行两个测量来定量斑点和标记,分别是包含在表面斑点或标记周围的椭圆中心中图像的平均强度,I1和I2,分别是,Si=100像素至500像素和S2=1.1×S1至2.5×S1。
通过进行以下计算获得在图像中观察的归因于黑点或标记的强度(Iatt)的近似测量:
Iatt=Si×(I2×S2–I1×Si)/(S2–Si)–I1×Si
因此将获得的强度的平均值复制在图3A和以下表3中,该误差线对应于已得到的测量的标准偏差。
表3:强度测定的测量结果
通过将磁化后的原始强度除以磁化前的原始强度将原始强度标准化并且使得能够获得未被流体作用破坏的生物膜部分(PBNB)的近似测量。将针对该实施例获得的结果复制在图3B和以下表4中,该误差线对应于测量的标准偏差。
表4
培养基 | 平均值 | 标准偏差 |
BHI | 0.16393578 | 0.05648906 |
Lm | 0.63556509 | 0.12167536 |
Ec | 0.08963821 | 0.0269836 |
Sx | 0.24868618 | 0.2345908 |
Sc | 0.1874682 | 0.08374593 |
还可以通过从使用ImageJ软件测量的图像的平均标准偏差D1中推导来定量斑点和标记的表观(Q值),该图像包含在斑点或标记周围的椭圆中心中,通过计算斑点或标记的形状变化(方差,variance)的近似价值等于:
Q=(D1*D1–D0*D0)/(I*I),
其中I是如上文描述的计算的强度以及D0是使用ImageJ软件测量的标记周围的斑点背景的平均标准偏差。
将针对该实施例获得的结果复制在图3C和以下表5中,误差线对应于测量的标准偏差。
表5
如在该实施例中表明的,本发明的方法使得能够测定作用,如流体作用对生物膜的影响。尤其是,本发明的方法使得能够测定彼此相关的薄膜的抗性。
此外,本发明的方法使得能够非常敏感和快速地检测颗粒的偏差和作用对薄膜的影响。
实施例3:测量流体作用对形成过程中的生物膜的影响
在该实施例中,使用的装置和产品和那些来自上述实施例的相同。
将在BHI培养基(BD-DIFCO(法国))中单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)的16小时培养物通过使用无菌BHI稀释调节至DO600nm=0.004,用以10μl/mL比例的顺磁性微珠(Ton 005N,BioFilm Control,法国)的溶液补充,然后以200μl/孔沉积在6板条的标记为F、G和H的平底孔中(参考文献:MSW 002B,BioFilm Control,法国),分别是sw0、sw2、sw4、sw6、sw8和sw24。将补充有10μl/ml的顺磁性微珠(Ton006N,BiofilmControl,法国)溶液的200μl无菌BHI沉积在每一板条的孔E中。
在以下表6中显示了各种沉积物的分布。
表6
将这些板条放置在磁化的试验台(BKT MSW002 BioFilm Control,法国)上,该试验台放置在容纳有两个包含20ml水的25ml烧杯的18×12×7cm的有盖矩形盒子中,将整个组件放置在恒温炉(参考文献BC240,Firelabo,法国)中在30℃下分别稳定0h、2h、4h、6h、8h和24h。
然后将该板条放置在文件扫描仪(Perfection V-750PRO,Epson,USA)上,使用该扫描仪带有的EpsonScan软件(Epson,美国)进行图像采集。在图4A中复制的最终图像通过以下获得:通过加入使用ImageJ软件(http://rsb.info.nih.gov.ij)的扫描仪获得的彩色图像的红、绿和蓝组分并且切断(découpage)所获得的具有不同对比度设置的图像。获得的该图像在图4A中显示。在所有的孔中清晰界定的斑点是可见的。
然后将该板条放置在定轨摇床上(Variomag Monoshake,H+P Labortechnik,德国),将其调节至60%+/-20%的最大角速度持续10秒以使它们经受流体作用。
如在第一图像的相同条件下进行第二图像获取并且将最终图像复制在图4B中。大致上清晰界定的斑点和标记是可见的,并且它们的形状取决于形成生物膜的菌株。
使用ImageJ软件,通过进行两个测量来定量斑点和标记,分别是包含在表面斑点或标记周围的椭圆中心中图像的平均强度,I1和I2,分别是,
S1=100至500像素并且S2=1.1×S1至2.5×S1
通过进行以下计算获得在图像中观察的归因于黑点或标记的强度(Iatt)的近似测量:
Iatt=Si×(I2×S2–I1×Si)/(S2–Si)–h×S1
因此将获得的强度的平均值复制在图5A和以下表7中,误差线对应于已得到测量的标准偏差。
表7
时间 | BHI | Lm | 标准偏差Lm |
0h | -1.72E+01 | -5.82E+00 | 3.55E+01 |
2h | 3.74E+02 | 7.94E+02 | 9.81E+01 |
4h | 8.14E+02 | 6.02E+02 | 1.95E+02 |
6h | 6.64E+02 | 2.54E+03 | 3.29E+02 |
8h | 7.52E+02 | 2.44E+03 | 1.79E+02 |
24h | 8.26E+02 | 2.07E+03 | 2.19E+01 |
通过将磁化后的原始强度除以磁化前的原始强度将原始强度标准化并且使得能够获得未被流体作用破坏的生物膜部分(PBNB)的近似测量。将这些结果复制在如下图5B和表8中。
表8
时间 | BHI | Lm | 标准偏差Lm |
0h | -0.00360422 | -0.0011256 | 1.04E-03 |
2h | 0.06975705 | 0.13379324 | 1.05E-01 |
4h | 0.15521974 | 0.11969938 | 1.34E-01 |
6h | 0.11833857 | 0.533572 | 1.52E-01 |
8h | 0.1325017 | 0.5516224 | 2.17E-01 |
24h | 0.16997323 | 0.5647522 | 1.72E-01 |
还可以通过从使用ImageJ软件测量的图像的平均标准偏差D1中推导来定量Q斑点和标记的表观,该图像包含在斑点或标记周围的椭圆中心中,通过计算斑点或标记的形状变化(方差,variance)的近似价值等于:
Q=(D1*D1–D0*D0)/(I*I),
其中I是如上文描述的计算的强度以及D0是使用ImageJ软件测量的标记或斑点周围的斑点背景的平均标准偏差。
将针对该实施例获得的结果复制在图5C中,误差线对应于测量的标准偏差。
表9
时间 | BHI | Lm | 标准偏差Lm |
0h | -4.25E-03 | -3.30E-03 | 0.003635176 |
2h | 1.06E-03 | 3.20E-04 | 0.000216958 |
4h | 5.36E-03 | 6.81E-04 | 0.000686718 |
6h | 4.35E-04 | 9.43E-05 | 1.33109E-05 |
8h | 4.63E-04 | 1.08E-04 | 3.16769E-05 |
24h | 6.71E-04 | 1.64E-04 | 3.72707E-05 |
如在该实施例中表明的,本发明的方法使得能够测定作用,如流体作用对生物膜的影响。尤其是,本发明的方法能够测定彼此相关的薄膜的抗性。
此外,本发明的方法使得能够非常敏感和快速地检测颗粒的偏差和作用对薄膜的影响。
实施例4:测量抗菌作用和流体作用对生物膜的影响
在该实施例中,使用的装置和产品和那些来自上述实施例的相同。
在BHI培养基中金黄色葡萄球菌CIP 76.25A的16小时培养物通过使用无菌BHI的稀释调节至DO600nm=0.004,用含有10μl/mL顺磁性微珠(Ton 005N,BioFilm Control,法国)溶液补充,将其并且以200μl/孔沉积在平底孔中,分别是行1至行9,并且分别是平板的柱G至柱B(参考文献:MMB002B BioFilm Control,法国)。每个溶液用各种浓度(分别是0×C、4×C、2×C、C、0.5×C和0.25×C)下的抗生素来补充,分别是,氨苄西林C=0.5μg/ml、头孢他啶C=16μg/ml、氯霉素C=16μg/ml、红霉素C=0.5μg/ml、哌拉西林C=1μg/ml、四环素C=2μg/ml、庆大霉素C=16μg/ml、环丙沙星C=2μg/ml、甲氧苄啶C=64μg/ml,。
分别在行1至行9的柱H的孔中沉积200μl的BHI,该BHI补充有10μl/mL的顺磁性微珠的溶液(Ton005N,BioFilm Control,法国)并且分别使用在4×C浓度下的抗生素:氨苄西林C=0.5μg/ml、头孢他啶C=16μg/ml、氯霉素C=16μg/ml、红霉素C=0.5μg/ml、哌拉西林C=1μg/ml、四环素C=2μg/ml、庆大霉素C=16μg/ml、环丙沙星C=2μg/ml、甲氧苄啶C=64μg/ml。
柱A对应于仅补充有顺磁性微珠的溶液的无菌BHI对照孔。
柱G对应于金黄色葡萄球菌CIP 76.25a生存性对照。柱H对应于在最大剂量抗生素存在下补充有顺磁性微珠溶液的无菌BHI对照孔。
在以下表10中显示了各种沉积物的分布。
表10
H | G | F | E | D | C | B | A | |
金黄色葡萄球菌 | - | + | + | + | + | + | + | - |
1氨苄表霉素 | 4×C | 0×C | 4×C | 2×C | C | 0.5×C | 0.25×C | 0×C |
2头孢他啶 | 4×C | 0×C | 4×C | 2×C | C | 0.5×C | 0.25×C | 0×C |
3氯霉素 | 4×C | 0×C | 4×C | 2×C | C | 0.5×C | 0.25×C | 0×C |
4红霉素 | 4×C | 0×C | 4×C | 2×C | C | 0.5×C | 0.25×C | 0×C |
5哌拉西林 | 4×C | 0×C | 4×C | 2×C | C | 0.5×C | 0.25×C | 0×C |
6四环素 | 4×C | 0×C | 4×C | 2×C | C | 0.5×C | 0.25×C | 0×C |
7庆大霉素 | 4×C | 0×C | 4×C | 2×C | C | 0.5×C | 0.25×C | 0×C |
8环丙沙星 | 4×C | 0×C | 4×C | 2×C | C | 0.5×C | 0.25×C | 0×C |
9甲氧苄啶 | 4×C | 0×C | 4×C | 2×C | C | 0.5×C | 0.25×C | 0×C |
将每一板条放置在磁化的试验台上(BKT-MWS002 BioFilm Control,法国),该试验台放置在容纳有两个含有20ml水的25ml烧杯的18×12×7cm的有盖矩形盒子中。将该组件放置在恒温炉中(参考BC240,Firelabo,法国)在37℃下稳定16小时。
然后将板条放置在文件扫描仪(Perfection V-750 PRO,Epson,USA)上,使用该扫描仪带有的EpsonScan软件(Epson,美国)进行图像采集。
获得的最终图像在图6A中显示。它们通过以下获得:通过加入使用ImageJ软件(http://rsb.info.nih.gov.ij)的扫描仪获得的彩色图像的红、绿和蓝组分并且切断(découpage)所获得的具有不同对比度设置的图像。
如在图6A中显示的,该斑点是清晰界定的并且在所有的孔中是可见的。
然后将该板条放置在定轨摇床上(Variomag Monoshake,H+P Labortechnik,德国),将其调节至60%+/-20%的最大角速度持续10秒以使它们经受流体作用。
在与第一图像相同的条件下进行第二图像采集并且将获得的最终图像显示在图6B中。
如在图6B中显示的,大致上清晰界定的斑点和标记是可见的,并且它们的表观取决于抗生素和所用抗生素的浓度。
如在该实施例中表明的,本发明的方法使得能够测定作用,如流体作用对生物膜的影响。尤其是,本发明的方法使得能够在药剂存在或不存在下测定彼此相关的薄膜的抗性。
参考文献清单
1.Physica Scripta.,Vol.65,167-180(2002):“Refractive Index Measurementand its Applications”
2.Voros et al.,Biophysical Journal,Vol.87,553561(2004):“The Densityand Refractive Index of Adsorbing Protein Layers”。
Claims (3)
1.一种用于测量流体作用对薄膜的影响的方法,包括以下步骤:
a)向溶液中引入能够形成薄膜的至少一种物质,
b)向在(a)中获得的所述溶液中引入至少两种颗粒,所述颗粒放置在所述溶液中浸没的表面S上,
c)重新聚集所述浸没的表面S上的所述颗粒,所述颗粒在所述表面上形成斑点或标记,
d)由所述物质形成所述薄膜,
e)观测所述表面S上的所述斑点或标记,
f)将所述流体作用施加至所述溶液,
g)通过观测所述表面S上的所述斑点或标记来观测在步骤(f)中施加的所述流体作用对所述薄膜的影响,以及
h)通过比较来自上述步骤(e)和步骤(g)的观测结果来测定施加至所述薄膜上的所述流体作用的影响,
其中所述至少两种颗粒独立地是磁性或可磁化的带电颗粒或由至少一种磁性或可磁化的层覆盖的颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述薄膜是生物膜,并且能够形成所述生物膜的所述物质选自微生物、粮食和化学物质。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述至少两种颗粒借助于光源照亮以便增加所述颗粒与所述溶液之间的对比度。
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