FR2903590A1 - Dispositif de prelevement cellulaire par contact - Google Patents
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Abstract
Un dispositif microtechnologique (6) permet le prélèvement de cellules sur ou dans un tissu ou un autre élément corporel. Il comprend un support (12) ayant au moins une face d'intérêt (14) sur laquelle est présente au moins une zone de capture (10) constituée d'une paroi de fond (22) munie d'une pluralité de protubérances (24). De préférence, le dispositif microtechnologique comprend au moins une zone de capture recouverte d'un revêtement ayant un pouvoir attractif sur les cellules à prélever.
Description
DISPOSITIF DE PRELEVEMENT CELLULAIRE PAR CONTACT DESCRIPTION DOMAINE
TECHNIQUE L'invention concerne le domaine du diagnostic clinique et/ou du suivi thérapeutique non invasif. Plus particulièrement, l'invention se rapporte à un dispositif microtechnologique de prélèvement de cellules d'intérêt biologique par contact. ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE Il existe des outils de prélèvement de cellules, de type spatule, tels que les dispositifs de collecte de cellules cytologiques décrits dans le brevet US 6 607 494 et dans la demande de brevet PCT 99/25251. De tels dispositifs sont destinés à collecter des cellules en surface d'un tissu cellulaire directement accessible par des voies naturelles. Dans le cas où l'on souhaite recueillir des cellules d'un organe non accessible directement, on procède de façon générale à une biopsie. Les cellules recueillies sont ensuite analysées ex situ. Ces techniques altèrent donc l'intégrité biologique. De plus, elles ne peuvent pas toujours être utilisées, d'autant plus que l'insertion même d'un dispositif de prélèvement doit être minimale dans certaines régions, telles que le cerveau. De plus, même dans le cas où l'on réalise une biopsie ou un prélèvement d'organes sur un humain ou un animal, il est de façon générale souhaitable de 2903590 2 pouvoir récupérer une petite quantité de cellules sans dégrader le tissu ou l'organe prélevé. Ceci permet en effet de pouvoir procéder à d'autres traitements ou analyses du prélèvement effectué.
5 EXPOSÉ DE L'INVENTION L'invention sous l'un de ses aspects vise à pallier les inconvénients des dispositifs de prélèvement existants. Un objet de la présente invention est 10 notamment de pouvoir effectuer des prélèvements non-invasifs de petites quantités de cellules. Pour atteindre cet objet, la présente invention prévoit ainsi un dispositif microtechnologique de prélèvement de cellules par 15 contact avec un tissu ou un autre élément corporel comprenant un support ayant au moins une face d'intérêt sur laquelle est présente au moins une zone de capture constituée d'une paroi de fond munie d'une pluralité de protubérances.
20 Avantageusement, la hauteur des protubérances d'un dispositif selon l'invention est comprise entre 10 pm et 400 pm et la surface des protubérances est comprise entre 3 X 3 pm et 80 X 80 pm ; les protubérances, par exemple à section 25 hexagonale ou octogonale, peuvent être séparées par des espaces dont la largeur est inférieure à 50 pm. Il est possible qu'une zone de capture comprenne une cuvette, ladite paroi de fond correspondant au fond de la cuvette.
2903590 3 Selon un mode de réalisation avantageux, la paroi de fond et/ou les protubérances d'une zone de capture sont fonctionnalisées, par exemple par des molécules d'adhésion et/ou par des anti-corps, les 5 surfaces fonctionnalisées pouvant être de type anionique ou cationique. Par ailleurs, la paroi de fond et/ou les protubérances d'une zone de capture peuvent être recouvertes de microbilles, qui peuvent être 10 fonctionnalisées. La fonctionnalisation peut notamment comprendre la présence de ligands solidarisés à la surface par une fonction silylée. Avantageusement, le dispositif selon 15 l'invention comprend une pluralité de zones de capture sur une même face d'intérêt, les zones de capture étant séparées par des premières zones d'intervalle. Des moyens peuvent être présents dans les zones d'intervalle pour séparer les zones de capture, par 20 exemple des encoches sur une des faces dudit support. Selon un mode de réalisation préféré, le support du dispositif est sous forme de plaque ; il comprend des première et deuxième faces principales planes à l'exception des zones de capture et des 25 éventuels moyens pour les séparer. Le support peut être en plastique ou être un substrat microtechnologique, notamment en silicium. Il peut comprendre en outre une tige de manipulation dont une extrémité est associée au support. Un manchon de guidage peut également être prévu.
2903590 4 Sous un autre aspect, l'invention concerne un procédé de prélèvement de cellules sur ou dans un tissu ou un autre élément corporel au moyen d'un dispositif microtechnologique comprenant un support 5 ayant au moins une face d'intérêt sur laquelle est présente au moins une zone de capture constituée d'une paroi de fond munie d'une pluralité de protubérances, le prélèvement de cellules étant effectué par une mise en contact de ladite au moins une zone de capture avec 10 le tissu ou l'élément corporel. Selon l'invention, le prélèvement n'est pas du type chirurgical, c'est-à-dire par exemple qu'il concerne un tissu qui a été préalablement prélevé, par exemple par biopsie, ou qu'il concerne un corps mort.
15 Cependant, il est évident que le procédé peut également être adapté et utilisé chez un patient ou un animal vivant. En particulier, l'invention concerne un procédé de diagnostic et/ou d'analyse d'un tissu ou 20 d'un autre élément corporel comprenant une étape de prélèvement telle que définie précédemment. Une étape d'observation, au moyen d'un microscope, des cellules présentes sur le dispositif après prélèvement peut être prévue, et/ou une étape de mise en culture des cellules 25 présentes sur le dispositif après prélèvement. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS Les caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre et en référence aux dessins 2903590 5 annexés, donnés à titre illustratif et nullement limitatifs. La figure 1 représente un système de prélèvement par contact selon un mode de réalisation de 5 l'invention. La figure 2 montre un mode de réalisation d'une zone de capture pour un dispositif selon l'invention. La figure 3 illustre un exemple de 10 fonctionnalisation de la surface du dispositif selon l'invention. La figure 4 illustre une fonctionnalisation par billes. Les figures 5A à 5D illustrent différents 15 modes de réalisation de moyens pour séparer les zones de capture d'un dispositif selon l'invention. La figure 6 présente un procédé d'utilisation d'un dispositif selon l'invention. EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE L'INVENTION 20 La présente invention vise à prélever une petite quantité de cellules d'un tissu ou d'un élément corporel au moyen d'un dispositif de prélèvement microtechnologique décrit ci-après. Dans la présente description, on entend par 25 tissu ou autre élément corporel, n'importe quelle entité structurelle ou fonctionnelle d'un corps humain ou animal. C'est par exemple un organe, c'est-à-dire une entité fonctionnelle et structurelle différenciée qui est spécialisée pour une fonction 30 particulière (cerveau, poumons,...). Un tissu est par 2903590 6 exemple une tumeur. Le terme autre élément corporel fait référence entre autres à la peau, au système veineux-cardiaque, à l'appareil digestif. Le prélèvement de cellules sur un tissu ou 5 un élément corporel au moyen d'un dispositif selon la présente invention peut être effectué in vivo ou ex vivo, par exemple in situ. Le dispositif de prélèvement microtechnologique selon l'invention étant de très 10 petite taille, millimétrique ou moins, celui-ci est de préférence être associé à des moyens de manipulation. Divers systèmes de prélèvement incluant un tel dispositif de prélèvement microtechnologique peuvent être envisagés en fonction du type de prélèvement 15 prévu. La figure 1 illustre un exemple de système de prélèvement 1 permettant de prélever des cellules à l'intérieur d'un tissu ou d'un élément corporel ; le prélèvement peut concerner un corps, humain ou animal, 20 vivant ou mort, voire une biopsie extraite d'un animal ou d'un patient, ou tout autre tissu d'intérêt. Le système comprend un manchon de guidage 2, par exemple un cathéter : le guide 2 permet entre autres de définir la voie de passage du dispositif de prélèvement. On 25 peut en particulier le mettre en place, éventuellement sous contrôle optique ou radiologique, préalablement dans une zone cible 3 d'un tissu ou d'un autre élément corporel. Avantageusement, la partie d'extrémité 4 du guide 2 est munie de moyens d'obturation 5 qui 30 protègent le dispositif de prélèvement 6 lors de son insertion et permettent de le mettre en contact avec le 2903590 7 tissu ou l'élément corporel d'intérêt 3 une fois en place. Les moyens d'obturation 5 sont de préférence localisés le long de l'axe longitudinal du guide 2 dont l'extrémité distale est fermée. Les moyens d'obturation 5 5 peuvent par exemple être une fenêtre rotative ou coulissante, ou une membrane résorbable partiellement. Le dispositif de prélèvement 6 comprend avantageusement une tige de manipulation 7, dont la longueur dépend de l'utilisation et de la profondeur 10 d'insertion, et qui peut coulisser dans le guide 2. La partie d'extrémité 8 de la tige 7 est destinée au prélèvement proprement dit. Avantageusement, le guide 2 et donc la tige de manipulation 7 ont un diamètre très faible de façon à ne pas altérer le tissu ou l'élément 15 corporel 3, et de façon à permettre des interventions non invasives. Ainsi, la tige 7 peut avoir un diamètre restreint à quelques millimètres, voire 100 }gym ; le guide 2 a un diamètre externe voisin du diamètre de la tige 7. La tige peut, par exemple, être en acier 20 inoxydable chirurgical. La partie d'extrémité 8 du dispositif de prélèvement 6 possède au moins une zone de capture 10 dont la surface développée est très supérieure à la surface normale, de 3 à plus de 20 fois.
25 Le dispositif de prélèvement 6 comprend ainsi un support 12 qui est de préférence indépendant de la tige de manipulation 7 à l'extrémité de laquelle il peut être solidarisé, par exemple par collage de préférence par une colle biocompatible. Ceci permet 30 notamment de séparer les procédés de fabrication des deux parties de manipulation et de prélèvement, et 2903590 8 d'utiliser une tige biocompatible 7 classique de faible coût. Le support 12 est fabriqué de préférence en un matériau biocompatible, notamment le silicium tel que précisé plus loin ; les différents éléments composant 5 le manchon de guidage 2 sont eux aussi compatibles avec un usage biologique et/ou médical, par exemple en or ou en plastique,"" Le support 12 peut être de forme quelconque, mais avantageusement il est plan, sous 10 forme de plaque, tel qu'il apparaîtra à la description des procédés de fabrication. Quoi qu'il en soit, on peut définir sur le support 12 une première face 14 et une deuxième face opposée 16 : dans le cas d'un support 12 non plan, les termes face et face opposée 15 désignent des portions de la surface externe du support 12 qui sont symétriques par rapport à un plan sécant du support 12. Avantageusement, les faces 14, 16 sont comprises dans un support 12 qui fait de l'ordre de 1 à 3 cm de long (dans le sens de la tige) sur une largeur 20 de 300 à 800 }gym, pour une épaisseur de l'ordre de 200 à 400 }gym. La première face 14 du support 12 est munie d'une zone de capture 10 ; il est préférable que la zone de capture 10 laisse une partie proximale 25 d'extrémité 8 suffisamment longue, par exemple de 2 à 5 mm, pour permettre une solidarisation aisée avec la tige 7. Ainsi, un mode de réalisation préféré P concerne un support 12 en silicium, rectangulaire de dimensions 300 }gym x 600 }gym x 2 cm, la zone structurée 30 10 commençant à 3,2 mm du bord solidarisé à la tige 7.
2903590 9 De façon préférée, et tel que schématisé, plusieurs zones de capture 10a, 10b, 10c, 10d sont présentes sur la face 14 du support 12, séparées par des zones d'intervalle 18. Dans le cadre représenté, 5 quatre zones de capture sont présentes, mais il est clair que leur nombre dépend de l'utilisation, en particulier de la taille du dispositif 6, de la taille de la zone cible 3 et de la quantité de cellules d'intérêt dans cette zone 3, ainsi que du procédé de 10 fabrication. De même, les zones d'intervalle 18 peuvent n'être que virtuelles , c'est-à-dire que les zones de capture 10 sont confondues a priori au niveau macroscopique, mais que des moyens permettent de les distinguer au niveau microscopique, voire de les 15 séparer. Il est possible aussi que des zones de capture 20 soient placées sur la deuxième face 16. De façon préférée, et tel qu'il apparaîtra plus clairement plus loin, les deuxièmes zones de capture 20 sont 20 alignées et en opposition avec les premières zones 10. Les deuxièmes zones de capture 20 peuvent être de nature et géométrie identiques aux premières zones 10, ou différentes, tel que schématisé dans la figure 1 : les divers modes de réalisation présentés plus loin 25 peuvent être combinés. Selon un aspect du dispositif de prélèvement selon la présente invention, au moins une zone de capture du dispositif de prélèvement comprend un ensemble de protubérances ou picots. Comme cela est 30 décrit plus en détail ci-après, les picots sont destinés à venir en contact avec les cellules à 2903590 10 prélever, les cellules prélevées étant piégées entre les picots du dispositif. La figure 2 illustre un exemple de dispositif de prélèvement incluant un ensemble de 5 protubérances sur une zone de capture. La zone de capture 10 comprend une paroi de fond 22. Suivant le mode de fabrication, la paroi de fond 22 peut être placée au fond d'une cavité ouverte formée en surface du support 12 ou peut être une surface ouverte 10 latéralement, comme cela est représenté en figure 2. La paroi de fond 22 a une surface s, et presente une pluralité de protubérances 24. De préférence, si la zone de capture comprend une cavité, la hauteur des protubérances 24 est identique à la profondeur de la 15 cavité, mais il est possible qu'elles soient saillantes. Par ailleurs, il est préférable que la surface du support 12 soit uniforme, de préférence plane, à l'exception des zones de capture 10, et des éventuels moyens de séparation (décrits plus loin).
20 La surface développée S de la zone de capture 10 est donc égale à la surface s de la paroi de fond 22 à laquelle s'ajoute la surface de chacune des parois latérales des protubérances 24. Selon l'invention, les surfaces vérifient la relation : 25 S 3•s, le facteur 3 pouvant avantageusement prendre les valeurs 5 ou 10 par exemple. Les protubérances 24 peuvent prendre toute géométrie désirée, par exemple des colonnes carrées ou à section hexagonale. De préférence, les protubérances 30 24 sont arrangées de façon régulière, par exemple en réseau à mailles carrées ou hexagonales. Selon le mode 2903590 11 de réalisation préféré P, la structuration de surface se présente sous la forme de picots octogonaux 24 de silicium, de 50 }gym de hauteur et 20 ou 80 }gym de largeur.
5 Différents procédés de fabrication sont envisageables pour de telles zones de capture 10 : par exemple, si le support 12 est en plastique, il est possible d'utiliser des techniques d'injection ou d'empreinte à chaud ( hot embossing ), qui permettent 10 d'obtenir par réplication des pièces complémentaires de moules réalisés préalablement. On pourra ainsi fabriquer des protubérances 24 de 20 }gym de côté, sur une hauteur de 50 }gym à bas coût, sur un support 12 en polyéthylène, ou poly(méthyl)métacrylate (PMMA), ou 15 polycarbonate, ou polydiméthylsiloxane (PDMS), ou parylène, ou TéflonTM ; une option est également de déposer un de ces matériaux, notamment le parylène ou le TéflonTM, sur une surface plastique, voire métallique, quelconque afin de la rendre biocompatible.
20 Si un rapport surface/volume plus élevé est souhaité, il est possible d'utiliser des techniques de microtechnologie. Par exemple, le procédé décrit en référence aux figures 7 du document FR-A-2 846 957 peut être utilisé ; le procédé décrit dans ce document est 25 cependant simplifié car seul le support 12 est usiné : il n'y a pas de formation de canaux d'alimentation et/ou de scellement de capot. Un tel procédé permet d'obtenir des protubérances 24 de 5 }gym de côté sur une hauteur de 100 }gym sur un support 12 en silicium. Plus 30 généralement, les protubérances 24 peuvent faire de 5 à 20 }gym (même si des tailles jusque 80 ou 100 }gym peuvent 2903590 12 aussi être réalisées de cette manière) de côté pour 50 à 400 pm de profondeur ; l'usinage du support 12 est tel qu'en fin de procédé, le dispositif soit biocompatible. En particulier, un support 12 en 5 silicium est oxydé pour être revêtu de SiO2, de comportement biocompatible analogue au verre. Pour réaliser des zones de capture 10, 20 sur les deux faces opposées du support 12, il est possible par exemple de coller deux supports 12, 12' 10 réalisés comme précédemment (voir figure 5D), ou de fabriquer un module double face par les techniques microtechnologiques sur silicium ou de moulage plastique (figure 5C). Le prélèvement de cellules sur ou dans un 15 tissu ou un autre élément corporel au moyen d'un dispositif de prélèvement microtechnologique tel que celui décrit ci-dessus consiste à mettre en contact les zones de capture du dispositif avec le tissu ou l'élément corporel. Ce contact peut être plus ou moins 20 prononcé. Par un effet de micro-abrasion, il est possible de récuperer des cellules entre les protubérances ou picots du dispositif de prélèvement. Afin de pouvoir prélever des cellules avec un contact le plus léger possible, les zones de 25 capture sont de préférence recouvertes d'un revêtement ayant un pouvoir attractif sur les cellules. Ce pouvoir attractif peut être de nature électrique, chimique, physique... Les zones de capture recouvertes d'un tel revêtement sont dites fonctionnalisées .
30 Des exemples de revêtement sont décrits ci- après. Parmi ces exemples on peut définir deux familles 2903590 13 de revêtement. La première famille inclut des revêtements aptes à réagir ou interagir directement avec des cellules. La seconde famille inclut des revêtements aptes à réagir ou interagir avec des 5 éléments plus petits, tels que des protéines, présents autour des cellules ou dans la matrice extra-cellulaire des cellules. Dans le cas d'un revêtement de la seconde famille, l'attraction des cellules se fait par l'intermédiaire de l'attraction entre le dispositif et 10 les éléments cibles plus petits de la cellule. Dans la première famille, on citera notamment des revêtements constitués de molécules d'adhésion tels que des protéines d'adhésion ou des peptides, des revêtements constitués d'anti-corps ou 15 encore des revêtements anioniques ou cationiques. Dans la seconde famille de revêtements, on citera l'utilisation de sondes ADN. On citera en outre la possibilité d'utiliser un revêtement électriquement conducteur 20 éventuellement recouvert d'une fine couche isolante biocompatible. Un tel revêtement électrique peut être polarisé positivement ou négativement au moyen d'un dispositif de polarisation électrique. Un tel dispositif de polarisation électrique pourrait être 25 embarqué sur le dispositif de prélèvement et être éventuellement réalisé de façon monolithique avec ce dernier. Afin d'augmenter le pouvoir attractif d'une zone de capture, on pourra également augmenter la 30 surface développée d'une zone de capture 10, en recouvrant la paroi de fond 22 et éventuellement les 2903590 14 protubérances 24 avec des microbilles. On notera que les microbilles ne doivent pas remplir intégralement les espaces 26 entre les protubérances 24 afin de conserver un espace suffisant entre les protubérances 5 pour les cellules prélevées. Les microbilles sont utilisées de façon courante en microbiologie ; elles ont classiquement un diamètre de l'ordre d'une dizaine de nanomètres jusqu'à une centaine de microns, et peuvent être composées de 10 verre, poreux ou non, ce qui leur permet d'être fonctionnalisées et de rester biocompatibles. Un exemple de fonctionnalisation d'une zone de capture est décrit en relation avec la figure 3. Le procédé de fonctionnalisation s'effectue en deux ou 15 trois étapes. 1) Synthèse d'une molécule organique bifonctionnelle Y-E-A appelée agent de couplage qui va permettre l'adhésion interfaciale non covalente entre des protéines et le support organique. 20 2) Fixation de l'agent de couplage sur le support inorganique 12, qui peut avoir été préalablement traité pour présenter une fonction de couplage W (en particulier, il s'agit de la fonction W silylée 0-Si pour les substrats 12 en silicium recouvert 25 d'une couche d'oxyde de silice), par réaction d'une des deux fonctions Y avec la surface, l'autre fonction A réagissant avec la protéine en formant une liaison non covalente. 3) Si la fonction terminale A permettant l'adsorption 30 de la protéine n'a pu être synthétisée avec la fonction silylée pour cause d'incompatibilité 2903590 15 chimique, le support modifié va subir une ou plusieurs réactions post-silanisation jusqu'à l'obtention de cette dernière. La fonction de couplage A correspond à 5 l'ensemble des fonctions organiques et minérales existantes telles que les fonctions : CH3, alcènes, alcynes, dérivés aryles, halogènes (Br, Cl, I, F), dérivés organométalliques, alcools, phénols, diols, éthers, époxys, dérivés carbonylés (aldéhydes, cétones, 10 acides carboxyliques, carboxylates, esters, amides, chlorures d'acide, anhydrides d'acides), dérivés azotés (amines, dérivés nitrés, dérivés diazos, imines, énamines, oximes, nitriles), dérivés phosphorés (phosphines, phosphites, phosphates, phosphonates), 15 dérivés du silicium, dérivés du soufre (sulfures, dissulfures, thiols, thioéthers, sulfones, sulfites, sulfates, acides sulfoniques, sulfonates, azasulfoniums), dérivés du sélénium,.... Un groupe espaceur E, utilisé entre les 20 deux fonctions A,Y de l'agent de couplage, permet de conférer des propriétés particulières au film obtenu par la silanisation. Le groupe E est choisi parmi les radicaux permettant d'obtenir une monocouche organisée : un radical E de type alkylène à longue 25 chaîne permet une interaction interchaînes (parmi les radicaux E du type alkylène, on préfère tout particulièrement ceux qui ont de 8 à 24 atomes de carbone) ; un radical E comprenant deux triples liaisons -CC-permet une réticulation ; un radical E 30 comprenant une chaîne aromatique conjuguée confère des propriétés d'optique non linéaire (à titre d'exemple, 2903590 16 on peut citer les radicaux phénylène-vinylène et phénylène-acétylène) ; un radical E du type pyrrole, thiophène ou polysilane confère une conduction électronique ; un radical E du type polyaromatique 5 hétérosubstitué confère des propriétés de photo/électroluminescence (à titre d'exemple, on peut citer les quinones et les composés diazoïques) ; un groupe E du type alkyle ou fluoroalkyle, en particulier un groupe alkyle ou fluoroalkyle ayant de 3 à 24 atomes 10 de carbone, permet d'utiliser les couches obtenues en chromatographie ou en électrophorèse. En ce qui concerne la fonctionnalisation des billes, le même principe est utilisé. Par ailleurs, il est possible de déposer 15 différents types de billes selon les zones 10i de prélèvement, et ainsi d'obtenir un outil présentant un étagement de fonctions d'affinité A. Par exemple, pour un substrat 12 de surface hydrophile comme SiO2, silanisé, les fonctions esters 20 de surface situées sur l'outil vont réagir avec des billes fonctionnalisées porteuses de fonction hydroxyle primaire. Après l'immobilisation des billes, l'outil possède une surface développée hydrophile (figure 4). Un dispositif de prélèvement selon la 25 présente invention permet grâce aux picots présents sur les zones de capture de cellules de récupérer une ou plusieurs couches de cellules du tissu ou de l'élément corporel d'intérêt. Dans le cas de picots de quelques dizaines de microns de hauteur, il est possible de 30 récupérer jusqu'à une dizaine de couches cellulaires, en fonction de la taille des cellules recueillies.
2903590 17 Une fois le prélèvement de cellules effectué, il est possible d'analyser la composition spatiale des couches de cellules prélevées. On peut par exemple utiliser un microscope pour identifier 5 visuellement la nature des cellules prélevées. Un avantage du dispositif de prélèvement selon la présente invention est que la présence de multicouches de cellules permet d'obtenir une coupe histologique d'un tissu ou d'un autre élément corporel.
10 Après prélèvement, les cellules récupérées peuvent être mises en culture afin de disposer d'un plus grand nombre de cellules. A partir des cellules prélevées et/ou des cellules cultivées, il est possible de réaliser des 15 analyses génomiques ou transcriptomiques. Par ailleurs, un dispositif de prélèvement selon la présente invention permet de récupérer des agrégats de cellules et non des cellules dissociées . Or la mise en culture d'agrégats de 20 cellules permet d'obtenir de meilleurs rendements et une meilleure qualité des cellules cultivées. Il est ainsi possible d'envisager de pratiquer des thérapies cellulaires à partir de cellules, et notamment d'agrégats de cellules, prélevées par un dispositif 25 selon la présente invention. Une telle thérapie consisterait par exemple à prélever des cellules autologues malades , à les amplifier (notamment par culture), à modifier leur génome puis à les réintroduire dans le tissu ou 30 l'élément corporel que l'on souhaite guérir.
2903590 18 Par ailleurs, à partir des cellules prélevées au moyen d'un dispositif selon la présente invention, il est possible d'effectuer diverses analyses des molécules présentes dans les cellules ou 5 générées par ces dernières. Dans le cas où les zones de capture sont recouvertes d'un revêtement de la seconde famille, on pourra également éliminer les cellules présentes entre les protubérances d'une zone de capture, puis procéder 10 à des analyses des molécules piégées par le revêtement. Par ailleurs, dans le cas où le dispositif de prélèvement 6 possède plusieurs zones de capture 10i (voir figure 1), il est possible d'utiliser les mêmes 15 fonctions sur chaque zone de capture, ou d'opérer une différenciation spatiale, comme par exemple par le dépôt localisé par gouttes ( spotting ) connu pour les puces à ADN. Selon l'utilisation et notamment les 20 analyses des molécules prélevées, il peut être intéressant de séparer les zones de capture 10a-10d d'un même dispositif 6. En particulier, les supports 12 peuvent être sécables pour chacun des modes de réalisation précédents.
25 Afin de faciliter la section du support 12, avantageusement, les zones d'intervalle 18 entre les zones de capture 10 sont munies de moyens de séparation. Par exemple, des encoches peuvent avoir été gravées en même temps que la réalisation des 30 protubérances 24 et/ou des parois : figures 5. Les 2903590 19 zones d'intervalle 18 peuvent alors facilement être sectionnées. Différents modes de réalisation sont envisageables : par exemple, il est possible de 5 réaliser une amorce de clivage 42 par gravure du support 12 sur la face 16 opposée à la face 14 comprenant les zones de capture 10, par masque et gravure par exemple (figure 5A). On peut également réaliser cette encoche 44 sur la face avant 14, ou 10 choisir par exemple une gravure chimique isotrope, par exemple au KOH (figure 5B). Si des zones de capture 10, 20 sont présentes sur chaque face 14, 16, il est possible de ne positionner des moyens de séparation que sur l'une des 15 faces (figure 5C), ou sur les deux (figure 5D). On peut noter à cet égard deux modes de réalisation pour les dispositifs comprenant des zones de capture 10, 20 sur chacune de leurs faces opposées 14, 16 : un support 12 (figure 5C) ou collage de deux supports 12, 12' (figure 20 5D). Il est clair également que les différents modes de réalisation d'encoches 42, 44 peuvent être utilisés indifféremment et en combinaison. Selon le mode de réalisationpréféré P, une 25 plaquette de silicium de 100 mm de diamètre est usinée pour obtenir 142 dispositifs finaux après découpe. Le support 12 en silicium est avantageusement marqué : en particulier, le nom du dispositif, des croix d'alignement, des repères de découpe,... sont gravés, par 30 exemple à 500 nm, par photolithographie avec masque et gravure sèche.
2903590 20 La face arrière subit un traitement similaire (photolithographie avec masque aligné sur le précédent, gravure sèche de 5 à 10 }gym, retrait de la résine du masque) pour former des encoches. La face 5 avant est alors dessinée et gravée pour la microstructuration, avec photolithographie avec masque aligné, gravure sèche profonde à 50 }gym et retrait de la résine. Les surfaces sont ensuite préparées afin de permettre leur utilisation biologique et/ou médicale : 10 en particulier le polymère (par exemple C4F8) formé sur les flancs des cavités lors des gravures est éliminé, par désoxydation totale, suivi d'une oxydation humide sur 100 nm, puis d'une désoxydation totale ; une couche de SiO2 finale est obtenue par oxydation humide sur 15 500 nm. Selon un mode d'utilisation du dispositif selon l'invention schématisé en figure 6, le guide 2 est d'abord mis en place, de préférence sous contrôle dans la zone cible 3 ; le support 12 est collé en bout 20 de tige 7. La tige 7 est insérée dans le guide 2, sous contrôle optique également afin d'assurer la précision de son positionnement, et en particulier de déterminer les zones A, B, C, D de la tumeur 3 correspondant à chacune des zones de capture 10a-10d. Une fois les 25 zones de capture 10a-10d en place, les moyens d'obturation 5 sont ouverts, et le prélèvement est effectué par apposition ; aucune manipulation du dispositif lui-même n'est nécessaire, la surface de contact des zones de capture 10 étant directement 30 accessible (sans capot par exemple). Ceci permet par ailleurs une miniaturisation de l'ensemble, et 2903590 21 notamment du support 12. Les moyens d'obturation 5 peuvent ensuite éventuellement être refermés. La tige 7 est alors retirée du guide 2, le support 12 en est détaché, et les zones de capture 10a-10d peuvent être 5 analysées. Deux approches pour le traitement de l'échantillon prélevé peuvent être mises en oeuvre lors de l'analyse : 1) Le dispositif 6 est sécable, et chaque zone 10a-10d 10 est traitée de façon indépendante. De fait, une fois la tige 7 retirée, le support 12 est cassé et les différentes zones 10a-10d peuvent être traitées, analysées séparément. A titre d'exemple, les cellules A, B, C, D sont extraites puis 15 introduites dans des tubes 50a-50d et rincées par des solutions permettant d'extraire les cellules des zones de capture. 2) Il est possible également de ne pas couper le support 12, qui conserve ainsi la définition des 20 zones actives A-D étagées au sein de la tumeur 3. C'est le support 12 lui-même qui sert de substrat pour le dispositif 60 d'analyse finale, par exemple pour une observation sous microscope ou une culture des cellules.
25 Quelle que soit l'approche choisie, on peut obtenir une cartographie du tissu d'intérêt, et des résultats concernant la composition cellulaire et protéique en fonction de la profondeur dans la zone cible 3.
2903590 22 Le dispositif de prélèvement selon l'invention présente ainsi des caractéristiques particulièrement avantageuses : - le prélèvement est peu invasif : en 5 particulier, le diamètre apparent du dispositif 6, et même du système 1, est réduit, notamment à quelques millimètres, de préférence 1 mm, - le prélèvement est peu agressif : il se fait par contact (ou apposition ) sans section de 10 tissu 3, - la partie du dispositif usinée et servant réellement au prélèvement est réduite et ne couvre que le support 12, qui peut être associé à une tige de manipulation 7 de bas coût, 15 - l'usinage de la partie servant au prélèvement 12 est réduit à la fabrication des zones de contact 10, 20, sans autres éléments mécaniques ni étapes supplémentaires de scellement ou collage, - le dispositif 6 peut être utilisé en 20 geste opératoire in vivo ou en post-opératoire, ou être utilisé in vitro sur un tissu prélevé et demandeur d'analyse cellulaire et éventuellement moléculaire, - la présence de zones de capture 10a-10d étagées permet d'analyser après empreinte la 25 répartition des cellules d'intérêt dans la zone de prélèvement 3, chaque zone de capture 10 peut être fonctionnalisée selon les cellules ciblées et/ou le type d'analyse ou de traitement ultérieur, 2903590 23 - chaque zone de capture 10a-10d peut être séparée des autres et être analysée par une technique propre, - le support du dispositif 12 peut être 5 compatible avec tout équipement d'analyse ou de traitement ultérieur, une cartographie selon l'axe de profondeur de la zone 3 analysée peut être établie selon les zones actives A-D successives différentiées 10 le long du dispositif ; la méthode opératoire sous stéréoscopie permet en effet de guider précisément le dispositif 6 et de savoir exactement quelle région A-D a été sondée. EXEMPLE DE REALISATION 15 Un exemple de revêtement de type anionique est décrit ci-après. Le dispositif précédent P (support 12 en Si de 600 x 300 pin', avec protubérances 24 octogonales) a été silanisé puis fonctionnalisé pour donner la 20 fonction carboxylate. En effet, à pH physiologique, les systèmes biologiques sont naturellement chargés ; les interactions ioniques (basés sur les principes de la chromatographie) peuvent être utilisées pour absorber de façon spécifique des marqueurs protéiques. Pour les 25 surfaces anioniques (chargées négativement), les dérivés carboxylates sont les plus couramment utilisés. Les fonctions carboxylate et silane étant incompatibles, une stratégie de synthèse indirecte via l'ester de méthyle de l'acide triméthoxysilylundécan- 30 10-oique a été choisie. 2903590 24 o H7SO4CC) • MeOH O HSi(OMe)3 Cat. de Karstedt o La fonction acide est protégée sous la 5 forme d'un ester de méthyle après réaction de l'acide undécénoique avec de l'acide sulfurique et du méthanol ; l'incorporation du groupement silylié s'effectue classiquement par une réaction d' hydrosilylation.
10 Par exemple, un ester de méthyle de l'acide 10-undéc-l-ènoique est fabriqué pour former l'ester de méthyle de l'acide triméthoxysilylundécan-10-oique par le procédé suivant : A une solution d'acide undécènoique (98 %) 15 (10,47 g ; 11,5 mL ; 56 mmol) dissout dans 500 mL de méthanol, est additionné de l'acide sulfurique concentré (12,88 g ; 7 mL ; 131 mmol ; 2,3 éq.). La réaction se déroule à 0 C durant 4 heures. Après évaporation du méthanol et reprise à 20 l'acétate d'éthyle, le mélange réactionnel est lavé successivement avec de l'EDI (x 2) et avec une solution saturée de chlorure de sodium, séché sur du sulfate de magnésium anhydre puis concentré pour donner un liquide incolore (10,99 g ; 99 %). On 25 obtient les caractéristiques suivantes : o 2903590 25 8H (200 MHz ; CDC13) : 1,30 (10H ; m ; H5-9) 1,62 (2H ; m ; H4) 2,04 (2H ; m ; H1 ) 2,31 (2H ; t ; H3 ; 3JH-H = 7,4 Hz) 5 3,67 (3H ; s ; H1) 4,97 (2H ; m ; H12) 5,81 (1H ; m ; H11) 8c (200 MHz ; CDC13) : 25, 31 29,26 10 29,42 29,50 29,58 29,66 34,16 15 34,44 51,76 (Cl) 114,51 (C12) 139,46 (C11) 174,61 (C2) 20 L'ester méthylique de l'acide 10-undéc-l-ènoique (10,58 g ; 53 mmol) est mélangé avec du triméthoxysilane (95 %) (8,75 g ; 9,1 mL ; 68 mmol ; 1,3 éq.). Le catalyseur de Karstedt (0,13 g ; 0,13 mmol ; 0,0025 éq.) est additionné 25 très lentement. La réaction se déroule à température ambiante durant 16 heures. Le brut réactionnel est purifié par distillation pour donner un liquide incolore (120-125 C à 0,5 mbar ; 11,7 g ; 70 %) : 30 8H (200 MHz ; CDC13) : 0,65 (2H ; m ; H12) 1,27 (14H ; m ; H5-11) 2903590 26 1, 62 (2H ; m ; H4) 2, 30 (2H ; t ; H3 ; 3JH-H = 7,4 Hz) 3,57 (9H ; s ; H13) 3,67 (3H ; s ; H1) 5 8c (200 MHz ; CDC13) : 9,21 (C12) 22,68 25,04 29,23 29,38 (2C) 10 29,50 (2C) 33,17 34,19 50,55 (C13) 51,46 (Cl) 15 174,38 (C2) 8s (200 MHz ; CDC13) :-41,30 (s) L'hydroxylation du substrat en silicium recouvert d'une couche d'oxyde thermique de 500 nm est réalisée dans une solution de soude 3,5 M pendant 2 20 heures, avec une solution silanisante de concentration 10-2 M dans du trichloroéthylène anhydre, les réactions de silanisation étant effectuées à une température contrôlée de 2 C pendant 24 h. Le support modifié est mis au contact d'une 25 solution d'iodure d'aluminium afin de libérer la fonction acide carboxylique, qui va à son tour réagir avec une solution aqueuse de soude pour donner la fonction carboxylate correspondante. L'homme de l'art pourra imaginer d'autres 30 modes de réalisation d'un dispositif de prélèvement 2903590 27 selon la présente invention ainsi que d'autres utilisations d'un tel dispositif. 5
Claims (26)
1. Dispositif microtechnologique (6) de prélèvement de cellules par contact avec un tissu ou un autre élément corporel comprenant un support (12) ayant au moins une face d'intérêt (14) sur laquelle est présente au moins une zone de capture (10) constituée d'une paroi de fond (22) munie d'une pluralité de protubérances (24).
2. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel la paroi de fond (22) et/ou les protubérances (24) d'une zone de capture sont fonctionnalisées.
3. Dispositif selon la revendication 2, dans lequel la fonctionnalisation est effectuée par des molécules d'adhésion.
4. Dispositif selon la revendication 2, dans lequel la fonctionnalisation est effectuée par des anti-corps.
5. Dispositif selon la revendication 2, 25 dans lequel les surfaces fonctionnalisées sont de type anionique ou cationique.
6. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 5 dans lequel au moins une zone de 30 capture comprend une cuvette, ladite paroi de fond (22) correspondant au fond de la cuvette. 20 2903590 29
7. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 6 comprenant une pluralité de zones de capture (10a-10d) sur une même face d'intérêt (14), les zones de capture étant séparées par des premières 5 zones d'intervalle (18).
8. Dispositif selon la revendication 7 comprenant des moyens (42, 44) pour séparer les zones de capture (10a-10d, 30) dans les zones d'intervalle 10 (18).
9. Dispositif selon la revendication 8 dans lequel les moyens pour séparer comprennent des encoches sur une des faces (14, 16) dudit support (12).
10. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 9 dans lequel le support (12) est sous forme de plaque.
11. Dispositif selon la revendication 10 dans lequel le support (12) comprend des première et deuxième faces principales (14, 16) planes à l'exception des zones de capture (10, 20) et des éventuels moyens pour les séparer (42, 44).
12. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 11 dans lequel le support (12) est en plastique. 15 2903590
13. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 11 dans lequel le support (12) est un substrat microtechnologique, notamment en silicium.
14. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 13 dans lequel la hauteur des protubérances (24) est comprise entre 10 }gym et 400 }gym et la surface des protubérances (24) est comprise entre 3 x 3 }gym et 80 x 80 }gym.
15. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 14 dans lequel les protubérances (24) sont séparées par des espaces (26) dont la largeur est inférieure à 50 }gym.
16. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 15 dans lequel les protubérances (24) sont à section hexagonale ou octogonale. 20
17. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 16, dans lequel la paroi de fond (22) et/ou les protubérances (24) d'une zone de capture sont recouvertes de microbilles. 25
18. Dispositif selon la revendication 17, dans lequel les microbilles sont fonctionnalisées.
19. Dispositif selon l'une des revendications 2, 3, 4, 5 ou 18 dans lequel la 30 fonctionnalisation comprend la présence de ligands solidarisés à la surface par une fonction silylée. 5 10 15 2903590 31
20. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 19 comprenant en outre une tige de manipulation (7), le support (12) pouvant être associé à une extrémité de la tige.
21. Système de prélèvement (1) comprenant un dispositif (6) selon la revendication 20 et un manchon de guidage (2).
22. Procédé non chirurgical de prélèvement de cellules sur ou dans un tissu ou un autre élément corporel au moyen d'un dispositif microtechnologique comprenant un support (12) ayant au moins une face d'intérêt (14) sur laquelle est présente au moins une zone de capture (10) 15 constituée d'une paroi de fond (22) munie d'une pluralité de protubérances (24), le prélèvement de cellules étant effectué par une mise en contact de ladite au moins une zone de capture avec le tissu ou l'élément corporel. 20
23. Procédé de diagnostic comprenant une étape de prélèvement réalisée par le procédé selon la revendication 22 et une étape de diagnostic réalisée sur la base des cellules ainsi obtenues. 25
24. Procédé d'analyse d'un tissu ou d'un autre élément corporel comprenant une étape de prélèvement réalisée par le procédé selon la revendication 22 et une étape d'analyse des cellules ainsi obtenues. 30
25. Procédé selon la revendication 23 ou 24, comprenant une étape d'observation, au moyen d'un microscope, des cellules présentes sur le dispositif après prélèvement. 5 10 2903590 32
26. Procédé selon la revendication 23 ou 24, comprenant une étape de mise en culture des cellules présentes sur le dispositif après prélèvement. 5
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