FR2900155A1 - Hydrolisat de cartilage aviaire, procede d'obtention et utilisations - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un hydrolysat de cartilage aviaire comprenant 45 à 70 % en poids de collagène de type II hydrolysé, 9 à 15 % en poids de chondroïtine sulfate, 0,5 à 2% en poids d'acide hyaluronique ; ayant une composition en acides aminés où la valine représente 2,7 % à 3,3 % l'isoleucine représente 2,0 à 2,4 % , la phénylalanine représente 2,2 % à 2,6 % , la lysine représente 3,8 à 4,2 %,, le tryptophane représente 0,4% à 0,6%, l'hydroxyproline représente 5,5 à 8,7 %, l'hydroxylysine représente 0,7 à 1,8 %, et où le ratio molaire entre hydroxyproline et hydroxylysine est compris entre 5,0 et 8,0 ; et possédant un poids moléculaire moyen de la fraction peptidique compris entre 500 et 1000 daltons. L'invention concerne également un procédé de préparation dudit hydrolysat, et son utilisation en tant que complément alimentaire, et/ou en tant que médicament, notamment pour le traitement ou la prévention des douleurs articulaires.
Description
La présente invention concerne un hydrolysat de cartilage aviaire
comprenant 45 à 70 % en poids de collagène de type II hydrolysé, 9 à 15 % en poids de chondroïtine sulfate, 0,5 à 2% en poids d'acide hyaluronique ; ayant une composition en acides aminés où la valine représente 2,7 % à 3, 3 % l'isoleucine représente 2,0 à 2,4 % , la phénylalanine représente 2,2 % à 2,6 % , la lysine représente 3,8 à 4,2 %, le tryptophane représente 0, 4% à 0,6%, l'hydroxyproline représente 5,5 à 8,7 %, l'hydroxylysine représente 0,7 à 1,8 %, et où le ratio molaire entre hydroxyproline et hydroxylysine est compris entre 5,0 et 8,0 ; et possédant un poids moléculaire moyen de la fraction peptidique compris entre 500 et 1000 daltons. L'invention concerne également un procédé de préparation dudit hydrolysat, et son utilisation en tant que complément alimentaire, et/ou en tant que médicament, notamment pour le traitement ou la prévention des douleurs articulaires.
Les cartilages sont des tissus complexes qu'on trouve dans de nombreux organes des humains et des animaux. Ainsi, on peut prélever des cartilages au niveau des cloisons nasales, du larynx, de la trachée artère, des bronches, des surfaces articulaires, des cartilages de conjugaison des os longs, de la pointe xyphoïde du sternum, etc... Les cartilages sont constitués de nombreuses molécules utilisées comme principes actifs en alimentation diététique humaine et animale, en pharmacie humaine et vétérinaire ou en cosmétologie. Parmi les molécules les plus connues on peut citer: les collagènes, les hexosamines et les glycosaminoglycanes (chondroïtine sulfate, kératane sulfate, acide hyaluronique). En particulier, le collagène de type II hydrolysé la chondroïtine sulfate et l'acide hyaluronique, qui font partie des constituants des articulations, ont été suggérés comme pouvant servir au traitement des douleurs articulaires. Les douleurs articulaires sont traditionnellement traitées par des anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), et éventuellement des antalgiques, mais ces traitements symptomatiques sont souvent accompagnés d'effets secondaires, et il serait donc très utile de disposer de traitements qui, via une action prolongée au niveau des articulations, permettraient secondairement d'atténuer la douleur et d'améliorer la motricité. La majorité de ces molécules ont été longtemps extraites. de cartilages de bovins. Cependant, depuis l'apparition de l'encéphalite spongiforme bovine (ESB), les industries alimentaire, pharmaceutique et cosmétique s'inquiètent d'une éventuelle contamination de ces extraits par les prions responsables de l'ESB, qui ne sont pas inactivés à la chaleur et sont difficiles à détecter. L'emploi de squelettes de poissons chondrichtyens peut être une solution de substitution aux produits d'origine bovine. Mais les ressources marines ont des limites à la fois quantitatives., économiques et environnementales. II est donc utile de trouver une autre source de cartilages provenant d'animaux abondants et reconnus comme indemnes de maladies à prions. Les volailles domestiques (poulets, dindons, canards, pintades, cailles, pigeons) répondent a ces critères de sécurité sanitaire. Le brevet US 6025327 décrit un matériau dérivé de cartilage du sternum de poulet comprenant du collagène de type II hydrolysé possédant un poids moléculaire moyen d'environ 1500 à environ 2500 daltons. Le brevet US 6323319 décrit un procédé d'obtention du matériau du brevet US 6025327. Le brevet US 6780841 décrit un hydrolysat de collagène de type II permettant d'induire la formation de cartilage chez un individu, ledit hydrolysat étant obtenu à partir de cartilage de sternum de poulet, comprenant au moins 20% de chondroïtine sulfate dépolymérisée, au moins 10% d'acide hyaluronique et possédant un poids moléculaire moyen d'environ 5500 à environ 10000 daltons. Aucun résultat démontrant une quelconque activité de formation de cartilage chez un individu, ni de diminution de la douleur articulaire, ou d'augmentation de la mobilité n'est présenté. Par ailleurs, il est expressément indiqué dans le brevet US 6780841 que les proportions de chondroïtine sulfate dépolymérisée et d'acide hyaluronique sont essentielles, et que des proportions les plus élevées possibles sont fortement préférées, suggérant ainsi qu'un produit comprenant des quantités faibles de chondroïtine sulfate dépolymérisée et d'acide hyaluronique serait inefficace in vivo pour induire la formation de cartilage, diminuer la douleur articulaire, ou augmenter la mobilité chez un individu.
En outre, dans les trois brevets US 6025327, US 6323319 et US 6780841, les hydrolysat sont préparés uniquement à partir de cartilage de sternum de poulet, des précautions particulièrement minutieuses étant prises pour ne pas inclure d'os, les cartilages articulaires étant laissés de côté pour ne pas risquer d'inclure de fragments d'os. En effet, ces deux brevets indiquent très clairement que les précautions à prendre concernant la matière première très spécifique utilisée sont cruciales pour la pureté du produit final de façon à éviter la contamination par du collagène de type I ou III et permettre ainsi la plus haute proportion possible en protéoglycarLes. Le fait d'écarter les cartilages autres que le sternum conduit immanquablement à un rendement total en hydrolysat beaucoup plus faible que si les autres cartilages étaient aussi utilisés. De plus, les précautions particulières à prendre compliquent fortement la mise en oeuvre du procédé de préparation de la matière première et résultent notamment dans l'impossibilité d'une mise en oeuvre à l'échelle industrielle. Il serait donc souhaitable de disposer d'un hydrolysat de cartilage de volaille, notamment le poulet, capable d'induire la formation de cartilage, de diminuer la douleur articulaire, ou d'augmenter la mobilité chez un individu, et pouvant être obtenu par un procédé de préparation approprié à une mise en oeuvre industrielle.
Contrairement à ce que suggèrent les brevets US 6025327, US 6323319 et US 6780841, les inventeurs ont démontré qu'il est possible d'obtenir une biodisponibilité in vitro et une efficacité in vivo chez des patients souffrant de douleurs articulaires satisfaisantes avec un hydrolysat de cartilage de poulet comprenant des proportions significativement plus faibles de chondroïtine sulfate dépolymérisée et d'acide hyaluronique, ledit hydrolysat possédant par ailleurs un poids moléculaire moyen significativement plus faible, et une composition en acides aminés significativement différente. De plus, un tel hydrolysat possédant une bonne efficacité in vivo peut être obtenu par un procédé amélioré conduisant à des gains en terme de rendement, de coût et de temps particulièrement appréciables. Notamment, l'hydrolysat mis au point par les inventeurs est obtenu non pas à partir d'une matière première spécifique ne comprenant que le sternum, mais à partir d'une matière première comprenant l'ensemble des cartilages récupérables à partir d'une carcasse de poulet. En effet, la matière première utilisée est un mélange composé de 70-100% en poids d'os (dont le sternum) et de cartilage articulaire et de 0-30% en poids de cartilage de sternum. Un telle matière première peut être obtenue sans avoir à mettre en oeuvre toutes les précautions indispensables dans les brevets US 6025327, US 6323319 et US 6780841, et peut donc être générée de façon industrielle. De plus, le rendement global par carcasse de poulet est beaucoup plus élevé. En outre, le procédé d'obtention de l'hydrolysat mis au point par les inventeurs est nettement plus rapide que celui décrit dans les brevets US 6025327, US 6323319 et US 6780841. En effet, il ne comporte pas d'étape d'incubation de la matière première dans l'eau, et la durée de l'étape d'hydrolyse est réduite.
Enfin, dans le procédé d'obtention de l'hydrolysat mis au point par les inventeurs, contrairement au procédé décrit dans les brevets US 6025327, US 6323319 et US 6780841, l'étape de stérilisation est réalisée en fin de protocole, ce qui permet de garantir une meilleur sécurité sanitaire.
L'invention concerne donc un hydrolysat de cartilage aviaire caractérisé en ce que : a) il comprend : - 45 à 70 % en poids de collagène de type II hydrolysé, 9 à 15 % en poids de chondroïtine sulfate, 0,5 à 2% en poids d'acide hyaluronique ; b) parmi les acides aminés totaux : - la valine représente 2,7 % à 3,3 %, - l'isoleucine représente 2,0 à 2,4 %, la phénylalanine représente 2,2 % à 2,6 %, - la lysine représente 3,8 à 4,2 %, - Le tryptophane représente 0,4 à 0,6%, - l'hydroxyproline représente 5,5 à 8,7 %, - l'hydroxylysine représente 0,7 à 1,8 %, - le ratio molaire entre hydroxyproline et hydroxylysine est compris entre 5,0 et 8,0 ; c) le poids moléculaire moyen de sa fraction peptidique est compris entre 500 et 1000 daltons. 25 30
La composition de l'hydrolysat de cartilage aviaire selon l'invention est donc significativement différente de l'hydrolysat décrit dans le brevet US 6780841. D'une part, les proportions en chondroïtine sulfate (9-15% contre au moins 20% dans le brevet US 6780841) et en acide hyaluronique (0,5 à 2% contre au moins 10% dans le brevet US 6780841) sont très réduites par rapport à l'hydrolysat décrit dans le brevet US 6780841. Une telle diminution des proportions de chondroïtine sulfate et d'acide hyaluronique va à l'encontre de ce qui est suggéré dans le brevet US 6780841, puisqu'il y est explicitement indiqué que non seulement les proportions minimales sont respectivement de 20 % et 10 %, mais aussi que les concentrations les plus élevées possibles sont préférées (voir colonne 6, lignes 49-57 du brevet US 6780841). Contrairement à ce qu'on pourrait attendre de ce qui est décrit dans le brevet US 6780841, l'hydrolysat selon l'invention possède une efficacité bénéfique in vivo chez des patients souffrant de douleurs articulaires, et ce à des doses de chondroïtine sulfate nettement plus faibles que ce qui est généralement administré. Les résultats détaillés obtenus chez des patients souffrant de douleurs articulaires sont décrits dans l'exemple 2.
De plus, la composition en acides aminés de l'hydrolysat selon l'invention est significativement différente de celle de l'hydrolysat décrit dans le brevet US 6780841. Le tableau 1 suivant représente comparativement les pourcentages moyens en acides aminés de l'hydrolysat selon l'invention et de l'hydrolysat décrit dans le brevet US 6780841.25 Tableau 1. Comparaison des compositions en acides aminés. Les données sont exprimées en pourcentage du produit brut. Hydrolysat brevets Hydrolysat selon % US 6780841 l'invention Différence* Acides aminés aa Totaux aa Totaux Acide aspartique 5,29 5,5 0,5 3,8 Thréonine** 2,6 2,7 f 0,3 3,0 Serine 2,45 2,4 f 0,2 -1.0 Acide glutamique 8,75 9,4 + 0,9 7,6 Proline 5,25 6,0 + 0,6 13,5 Glycine 8,93 10,2 1 12,9 Alanine 4,51 5,6 + 0,6 20, 9 Cystéine 0,46 0,5 0,1 10,3 Valine*** 2,43 f 22,4 3,0 0,3 Méthionine 1, 38 1,5 0,2 11,1 Isoleucine 1,9 2,2 0,2 15,8 Leucine 4,2 4,3 f 0,4 2,6 Tyrosine 1,16 1,6 f 0,2 29,3 Phénylalanine 2,14 2,4 f 0,2 12,5 Histidine 2,05 1,6 0,2 -24,8 Lysine 3,54 4,2 f 0,4 17,5 Arginine 4,42 5,4 + 0,5 20,0 Tryptophane 0,37 0,5 f 0,1 36,0 Hydroxyproline 3,9 6,5 1,8 50,0 Hydroxylysine absent 1,2 t 0,7 * % différence = (valeur moyenne hydrolysat selon l'invention-valeur brevet US 6780841)/(moyenne des deux valeurs) *100 ** En gras: acides aminés essentiels *** En grisé: acides aminés essentiels présents en proportion significativement plus importante dans l'hydrolysat selon l'invention
Ainsi, notamment les proportions en valine (+22,4%), isoleucine (+15,8%), phénylalanine (+12,5%), lysine (+17,5%), tryptophane (+36%), hydroxyproline (+50%) et hydroxylysine (absente dans l'hydrolysat des brevets US 6025327, US 6323319 et US 6780841) sont significativement différentes.
La valine, 1'isoleucine, la phénylalanine, la lysine, et le tryptophane sont des acides aminés essentiels, c'est-à-dire qu'ils ne sont pas synthétisables par l'organisme et doivent donc être apportés par l'alimentation. Parmi les 9 acides aminés essentiels, tous à l'exception de :l'histidine sont au moins présents en proportions égales dans l'hydrolysat selon l'invention. De plus, 5 de ces acides aminés essentiels (valine, isoleucine, phénylalanine, lysine, et tryptophane) sont présents en proportions significativement plus importantes dans l'hydrolysat selon l'invention. Celui-ci étant notamment utilisé comme complément alimentaire, cela confère un autre avantage à l'hydrolysat selon l'invention.
L'hydroxyproline et l'hydroxylysine sont des acides aminés modifiés particulièrement présents dans le collagène où ils jouent un rôle dans la formation de liaisons covalentes entre différentes chaînes polypeptidiques voisines, renforçant ainsi la structure tridimensionnelle du collagène.
L'administration orale d'un produit qui en contient offre donc une source utile en ces acides aminés pour la formation du collagène (1). De plus, une étude (2) démontre l'effet bénéfique du tripeptide de collagène Gly-Pro-Hyp (contenant donc l'hydroxyproline) sur le processus de réparation des os et des tendons, chez des modèles animaux. L'étude mentionne aussi que la teneur en hydroxyproline après deux semaines s'établit à un niveau significativement plus proche de la normale dans le groupe traité par rapport à celui qui ne reçoit pas d'hydrolysat de collagène.
De plus, l'hydrolysat selon l'invention présente un ratio molaire entre hydroxyproline et hydroxylysine compris entre 5,0 et 8,0. Le ratio molaire entre hydroxyproline et hydroxylysine permet de différencier le collagène de type II des collagènes de type I et III (3). En effet, le rapport est d'environ 5 pour le collagène de type II, tandis qu'il est supérieur à 10 pour les collagènes de type I et III. Ici, la valeur moyenne du rapport démontre la présence très majoritaire de collagène de type II hydrolysé. Le fait que l'hydroxylysine n'ait pas été détectée dans les hydrolysats des brevets US 6025327, US 6323319 et US 6780841 indiquerait que le ratio molaire entre hydroxyproline et hydroxylysine est sans doute assez élevé, en tout cas supérieur à celui de l'hydrolysat selon l'invention, sans quoi cet acide aminé aurait été détecté.
Ainsi, bien que les mécanismes n'aient pas été clairement élucidés, différentes études ont montré que le collagène de type II et ses constituants élémentaires (dont l'hydroxyproline et l'hydroxylysine) présentent un intérêt dans le traitement des douleurs articulaires (4-7). Au vu de l'analyse précédente de la composition de l'hydrolysat selon l'invention, il apparaît donc que celui-ci présente une composition riche en collagène de type II (rapport des pourcentages en hydroxyproline et en hydroxylysine proche de 5), et présente des proportions significativement plus élevées des deux constituants élémentaires que sont l'hydroxyproline et l'hydroxylysine que les hydrolysats des brevets US 6025327, US 6323319 et US 6780841. L'intérêt d'une telle composition de l'hydrolysat selon l'invention a d'ailleurs été démontré par les inventeurs dans une étude en double aveugle chez des patients souffrant de douleurs articulaires (voir Exemple 2).
Enfin, le poids moléculaire moyen de la fraction peptidique de l'hydrolysat selon l'invention (environ 700 daltons) est significativement plus faible que celui de l'hydrolysat revendiqué dans les brevets US 6025327 et US 6323319 (entre 1500 et 2500 daltons) et dans le brevet US 6780841 (entre 5500 et 1.0000 daltons). Dans le brevet US 6780841, bien que la description donne une gamme de poids moyen très étendue (de 50 à 10000 daltons), et bien qu'un poids moléculaire moyen assez faible soit dit être préféré (colonne 3, lignes 61-65), le poids moléculaire moyen optimal est fixé à 5500 dalton, ce qui suggère que bien qu'un poids moléculaire faible soit préférable, il convient cependant de ne pas descendre en dessous d'environ 5500 dalton. Ce poids moléculaire moyen préféré est significativement plus élevé que celui de l'hydrolysat selon l'invention (environ 700 daltons). Ce plus faible poids moléculaire pourrait être impliqué dans l'amélioration de la biodisponibilité de l'hydrolysat selon l'invention, notamment par un meilleur passage de la barrière intestinale. En effet, les inventeurs ont démontré que l'hydrolysat selon l'invention avait, dans un modèle in vitro, une biodisponibilité environ trois fois supérieure à un produit non hydrolysé (voir Exemple 1). Le poids moléculaire de la fraction peptidique de l'hydrolysat selon l'invention a été mesuré en utilisant une méthode permettant d'obtenir la distribution en poids moléculaire (PM) dans des hydrolysats de protéines et d'autres produits alimentaires. La distribution en poids moléculaire (PM) a été obtenue par analyse chromatographique en phase liquide (perméation de gel) . Cette méthode analytique est calibrée avec un mélange de standards : - bêta lactoglobuline (PM = 18 300 Da) - alpha-lactalbumine (PM = 14 000 Da) -insuline (PM = 5730 Da) - bacitracine (PM = 1450 Da) - trytophane (PM = 204 Da) Le produit à analyser est dilué dans le tampon d'élution et ensuite injecté sur la colonne après filtration (0.45 m). Un logiciel (CPG plus, TSP) spécialement conçu pour les distributions de poids moléculaires est utilisé pour obtenir directement la distribution en poids moléculaire du produit.
En outre, l'hydrolysat selon l'invention présente l'avantage très important qu'il est obtenu à partir d'une matière première beaucoup moins spécifique que les hydrolysats décrits dans les brevets US 6025327, US 6323319 et US 6780841, qui n'utilisent exclusivement que du cartilage de sternum de poulet (voir colonne 5, lignes 6-7). Au contraire, l'hydrolysat selon l'invention peut être obtenu à partir d'un mélange d'os (dont le sternum) et de cartilage articulaire (environ 70%-100% en poids) et éventuellement de cartilage de sternum (environ 0-30% en poids) de poulet. Cela permet d'utiliser l'ensemble de la carcasse de poulet, et donc d'augmenter le rendement de la fabrication, mais aussi d'éviter les précautions minutieuses requises dans le protocole décrit dans le brevet US 6780841 (colonne 4, lignes 60-66), et donc de rendre possible un traitement industriel des carcasses, permettant ainsi des économies en coût et en temps. Dans un mode de réalisation avantageux, l'hydrolysat selon l'invention est donc préparé à partir d'un mélange d'os et de cartilage articulaire (70%-100% en poids) et éventuellement de cartilage de sternum (0-30% en poids). Le mélange d'os et de cartilage articulaire, qui représente 70%-100% en poids de la matière première utilisée dans l'invention peut être obtenu à partir d'une carcasse entière de poulet dont les tissus musculaires ont été ôtés, qui est ensuite broyée. Ensuite, du cartilage de sternum est éventuellement ajouté dans une proportion de 0 à 30% en poids de la matière première totale pour obtenir la matière première, sans que le cartilage de sternum utilisé soit prélevé avec les mêmes précautions minutieuses que dans les brevets US 6025327, US 6323319 et US 6780841. En effet, du fait de la présence déjà majoritaire du mélange d'os et de cartilage articulaire, une faible contamination du cartilage de sternum par de l'os ou un autre type de cartilage est sans incidence sur le produit obtenu. Par exemple, on peut utiliser environ 75% d'un mélange d'os et de cartilage articulaire et environ 25% de cartilage de sternum, mais ces pourcentages peuvent être ajustés librement dans les gammes de 70-100% et 0-30% respectivement de façon à ce que le total fasse 100%, sans que cela affecte significativement le produit obtenu.
Outre la matière première, les inventeurs ont également mis au point un procédé permettant d'obtenir l'hydrolysat selon l'invention avec toutes ses caractéristiques particulières (proportions en collagène de type II, en chondroïtine sulfate, en acide hyaluronique ; composition en acides aminés ; poids moléculaire moyen), tout en réduisant la durée de fabrication par rapport aux procédés décrits dans brevets US 6025327, US 6323319 et US 6780841. L'invention concerne donc également un procédé de préparation d'un hydrolysat de cartilage aviaire selon l'invention, comprenant : a) la fourniture d'une matière première composée de 70-100% en poids d'os et de cartilage articulaire (dont sternal) et de 0-30% en poids de cartilage de sternum, b) Le mélange de cette matière première avec une solution aqueuse de pH compris entre 5,5 et 7,5, c) L'hydrolyse du mélange de matière première dans l'eau avec une enzyme protéolytique pendant 1h à 2h, de préférence pendant 1h30 à 2h, à une température comprise entre 65 et 75 C, de préférence entre 70 et 72 C, d) L'inactivation de l'enzyme protéolytique pendant 10 à 20 minutes à au moins 85 C, e) La filtration du mélange réactionnel contenant l'hydrolysat, f) La concentration du mélange réactionnel, g) La stérilisation finale du mélange réactionnel à environ 130 C pendant au moins environ 30 secondes, et h) Le séchage du mélange réactionnel pour obtenir l'hydrolysat sous forme de poudre.
Ce procédé présente plusieurs avantages par rapport aux procédés décrits dans les brevets US 6025327, US 6323319 et US 6780841. Premièrement, la durée totale de fabrication est significativement réduite. En effet, dans le procédé décrit dans le brevet US 6780841, la matière première est mélangée à une solution aqueuse, dans laquelle elle est ensuite incubée pendant environ une heure (colonne 5, lignes 55-56). Au contraire, dans le procédé selon l'invention, la matière première est mélangée à une solution aqueuse de pH compris entre 5,5 et 7,5, telle que notamment de l'eau ou l'eau salée, mais l'étape d'hydrolyse est réalisée sans nécessité d'une incubation préalable dans la solution aqueuse. Avantageusement, l'hydrolyse est réalisée immédiatement, ou bien moins de 15 minutes après le mélange. De plus, l'étape d'hydrolyse elle-même est réalisée en au plus 2 heures, alors que dans le protocole décrit dans le brevet US 6780841, l'hydrolyse nécessite 2 à 10 heures, de préférence environ 6 heures (colonne 5, lignes 59-63). Cette étape d'hydrolyse est cruciale dans le procédé selon l'invention. En effet, elle permet non seulement de gagner du temps, mais aussi d'obtenir les caractéristiques particulières de l'hydrolysat selon l'invention. De tels effets (gain de temps et obtention d'un hydrolysat particulier), sont obtenus grâce à l'utilisation d'une enzyme protéolytique à une température comprise entre 65 et 75 C, de préférence entre 70 et 72 C. Avantageusement, l'enzyme protéolytique est une protéase à large spectre, telle que par exemple la papaïne, la ficine, la bromélaïne ou l'alcalase, de préférence la papaïne ou l'alcalase. De telles enzymes sont normalement utilisées dans des gammes de températures de 35 à 55 C, tel que décrit dans le brevet US 6780841 (colonne 5, ligne 63), températures où leur activité est en principe maximale. Le fait d'utiliser cette enzyme à 65-75 C (préférentiellement 70-72 C) devrait donc diminuer son activité et l'obtention d'un hydrolysat selon l'invention, avec un poids moléculaire moyen plus faible, devrait a priori nécessiter un temps d'hydrolyse encore plus long que les 6 heures préférées dans le brevet US 6780841. Au contraire, les inventeurs ont trouvé de façon surprenante que l'utilisation de la papaïne à 70-72 C permet d'obtenir l'hydrolysat selon l'invention avec une durée d'hydrolyse maximale de 2 heures. En effet, les inventeurs ont trouvé que, dans leurs conditions de réaction (matière première et solution aqueuse de pH compris entre 5,5 et 7,5 utilisés), l'augmentation de la température conduit à la fois à une dénaturation plus rapide de l'enzyme, mais aussi à une augmentation de sa vitesse d'action. L'intervalle de température utilisé (65-75 C, préférentiellement 70-72 C) correspond au meilleur rapport possible entre vitesse d'action et vitesse de dénaturation de l'enzyme dans ces conditions d'utilisation. Cela permet de réaliser l'hydrolyse en une durée qui peut être aussi courte que 1h00.
Avantageusement, la durée de l'hydrolyse est comprise entre 1 h30 et 2h, de préférence égale à 2h00. Par ailleurs, le fait de réaliser l'hydrolyse à une température plus élevée et en un temps plus court (1 à 2 h à 65-75 C contre 2 à 10h, idéalement 6h, à 35-55 C dans les brevets US 6025327, US 6323319 et US 6780841) permet, outre un gain de temps au cours du procédé, de garantir une bonne qualité microbiolagique du produit. Cela permet en particulier d'éviter de travailler à des températures critiques (< 55 C) pendant des temps longs propices au développement de micro-organismes pathogènes. En outre, une autre différence avec les procédés décrits dans les brevets US 6025327, US 6323319 et US 6780841, est que l'étape de stérilisation, qui est réalisée avant les étapes de filtration et de concentration dans ces brevets, est ici réalisée juste avant le séchage du produit. Cela conduit également à une plus grande sécurité sanitaire de l'hydrolysat selon l'invention.
Les collagènes, les hexosamines et les glycosaminoglycanes (chondroïtine sulfate, kératane sulfate, acide hyaluronique) sont utilisées comme principes actifs en alimentation diététique humaine et animale, en pharmacie humaine et vétérinaire ou en cosmétologie. L'hydrolysat selon l'invention peut donc être utilisé dans ces différentes applications. Notamment, l'invention concerne également un hydrolysat selon l'invention, éventuellement obtenu par le procédé selon l'invention, pour son utilisation en tant que complément alimentaire. L'invention concerne également un hydrolysat selon l'invention, éventuellement obtenu par le procédé selon l'invention, pour son utilisation en tant que médicament. Plus particulièrement, l'hydrolysat selon l'invention, éventuellement obtenu par le procédé selon l'invention, est avantageusement utilisé dans le traitement ou la prévention des douleurs articulaires. De telles douleurs articulaires peuvent avoir des origines diverses, telles que notamment une dégénérescence du cartilage liée à l'âge, une sollicitation trop poussée des articulations liée à la pratique intensive d'un sport, une sollicitation trop poussée des articulations liée à l'obésité, une maladie dégénérative des articulations, telle que l'arthrite rhumatoïde, des défauts articulaires, une ostéoarthrite, une lésion de cartilage, ou une maladie auto-immune impliquant des auto-anticorps dirigés contre un tissu connectif. Avantageusement, l'hydrolysat selon l'invention, éventuellement obtenu par le procédé selon l'invention, est avantageusement utilisé dans le traitement ou la prévention des douleurs articulaires ayant pour origine une dégénérescence du cartilage liée à l'âge, une sollicitation trop poussée des articulations liée à la pratique intensive d'un sport, ou une sollicitation trop poussée des articulations liée à l'obésité. Avantageusement également, l'hydrolysat selon l'invention est utilisé à la fois comme complément alimentaire, source notamment d'acides aminés essentiels et de constituants du collagène de type II, et pour le traitement et/ou la prévention des douleurs articulaires chez des sujets souffrant déjà de telles douleurs, ou présentant un risque de développement de telles douleurs, du fait notamment de leur âge, de leur pratique sportive intensive passée ou présente, ou de leur obésité.
Dans toutes les applications précédemment décrites, l'hydrolysat peut être présenté sous différentes formes, pour différentes voies d'administration. Pour les applications médicales ou en tant que supplément alimentaire,l'hydrolysat est préférentiellement présenté sous la forme d'une poudre, soit dans des gélules, soit aggloméré dans des comprimés, soit à dissoudre dans une solution aqueuse, l'ensemble de ces formulations étant adaptées à une prise par voie orale.
Les avantages de l'invention sont présentés avec davantage de détails dans la figure 1 et dans les exemples suivants.
DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1. Biodisponibilité de l'hydrolysat selon l'invention par rapport à du cartilage non hydrolysé (sternum de poulet séché et broyé, encore appelé cartilage natif). La quantité (en g) d'hydroxyproline détectée dans le compartiment se trouvant de l'autre côté du tapis cellulaire par rapport au compartiment dans lequel les produits sont déposés est représentée en fonction du temps (heures) pour l'hydrolysat selon l'invention et pour le cartilage non hydrolysé. EXEMPLES EXEMPLE 1. Etude de biodisponibilité de l'hydrolysat de cartilage de poulet selon l'invention Une étude de biodisponibilité in vitro sur une couche de cellules CaCo2 mimant la paroi de l'intestin a été réalisée. L'objectif de cette étude est de montrer que les composés actifs de l'hydrolysat de cartilage de poulet selon l'invention passent bien la barrière intestinale. 1.1 Protocole utilisé Le test utilisé mime l'hydrolyse subie par les produits lors de l'ingestion (action protéasique et/ou arnylasique). L'hydrolysat de cartilage de poulet selon l'invention est comparé dans ce test à du cartilage non hydrolysé (sternum de poulet séché et broyé, encore appelé cartilage natif). Pratiquement, une quantité connue de produit (hydrolysat selon l'invention, cartilage non hydrolysé) est déposée d'un coté d'un tapis de cellules CaCo2 mimant la paroi de l'intestin. La quantité de produit passée de l'autre coté du tapis cellulaire est ensuite évaluée à différents temps à partir du dépôt. L'évaluation du passage est réalisée par dosage de l'hydroxyproline (composant traceur du collagène qui est un des constituants majeur du cartilage).
Afin de pouvoir comparer les biodisponibilités des produits entre eux, un calcul de perméabilité apparente (Papp) en cm/s est ensuite réalisé pour chaque extrait. 1.2 Résultats Les résultats obtenus montrent clairement que l'hydrolysat selon l'invention 5 présente une biodisponibilité in vitro presque 3 fois plus importante que le cartilage non hydrolysé, tel qu'indiqué dans le Tableau 2 suivant et sur le Figure 1.
Tableau 2. Perméabilité apparente (Papp) en cm/s de l'hydrolysat selon l'invention et du cartilage non hydrolysé. Produit Papp (cm/s) hydrolysat selon l'invention 3.99 10-6 cartilage non hydrolysé 1.46 10-6 La valeur de Papp de l'hydrolysat selon l'invention suggère une biodisponibilité acceptable in vivo, puisque Grès et al (8) considère qu'avec la lignée CaCo2, une Papp supérieure à 2.106 cm/s permet d'espérer une biodisponibilité humaine jusqu'à 100%.
15 EXEMPLE 2. Etude de l'efficacité thérapeutique in vivo de l'hydrolysat de cartilage de poulet selon l'invention chez des patients souffrant de douleurs articulaires Une étude en double aveugle de l'hydrolysat selon l'invention contre produit contrôle a été réalisée auprès d'un groupe de volontaires se plaignant de douleurs 20 articulaires depuis au moins 6 mois. Les deux produits (hydrolysat selon l'invention ou produit contrôle placebo) ont été consommés pendant 3 mois et leur efficacité sur la réduction de la gêne articulaire a été étudiée. 10 .1 Matériels et méthodes 2.1.1 Substance test 2.1.1.1.1 Produit à l'essai Le produit à l'essai est l'hydrolysat de cartilage de poulet selon l'invention tel que décrit dans la description. L'hydrolysat est conditionné en gélules. 2.1.1.1.2 Produit contrôle Un deuxième produit sans substance active (composé de : cellulose microcristalline, amidon de riz, vitamine B2, stéarate de magnésium) présenté sous la même forme (gélules) a été utilisé comme produit contrôle. 2.1.1.1.3 Dose journalière La dose journalière de produit consommé a été fixée pour le test à 1500 mg, apportant dans le cas de l'hydrolysat selon l'invention 180 mg de chondroïtine sulfate et 975 mg de collagène type II. La dose journalière de chondroïtine sulfate habituellement recommandée est de 1200 mg. 2.1.2 Volontaires 2.1.2.1.1 Principe de recrutement Une procédure de recrutement et de sélection des volontaires a été élaborée pour garantir à ceux-ci une information claire et précise sur l'étude. 2.1.2.1.2 Critères d'inclusion Les volontaires ont été inclus par le médecin rhumatologue selon les critères suivant : -Personne ayant donné un consentement libre, éclairé et exprimé par écrit, - Personne coopérante, avertie de la nécessité et de la durée des contrôles, - Personne d'âge compris entre 50 et 75 ans, - Personne se plaignant de gênes articulaires depuis au moins 6 mois. 16 2.1.2.1.3 Critères de non inclusion Les critères de non inclusion étaient les suivants : - Personne suivant un traitement de fond anti-arthrosique, -Personne suivant un autre traitement médicamenteux systémique, en cours ou terminé depuis moins d'un mois, susceptible d'influencer l'intensité des gênes articulaires, - Personne utilisant un complément alimentaire susceptible d'influencer les gênes articulaires : utilisation en cours ou terminée depuis moins d'un mois, - Personne atteinte d'une maladie grave ou évolutive, - Personne consommant de façon immodérée de l'alcool ou du tabac. 2.1.2.1.4 Traitements associés Les traitements anti-inflammatoires non stéroïdiens ainsi que les antalgiques étaient autorisés pendant toute la durée du test et leur consommation exacte était rapportée dans le cahier d'observation.
Les traitements topiques cutanés étaient autorisés pour de courtes durées et leur prise était notée dans le cahier d'observation. Les infiltrations locales étaient proscrites. 2.1.3 Critères d'évaluation 2.1.3.1.1 Consommation d'anti-inflammatoires non stéroïdiens Les volontaires ayant la possibilité de consommer librement des anti-inflammatoires non stéroïdiens et des antalgiques, ils ont naturellement adapté leur consommation de manière à maintenir leur douleur à un niveau toujours acceptable. Une baisse de la consommation d'anti-inflammatoires indique donc une diminution de la douleur à corriger. Aucun autre traitement n'étant autorisé, cette diminution peut alors être attribuée à une action du produit testé sur les cartilages, conduisant à une réduction de l'inflammation et des douleurs articulaires. C'est donc par le suivi de la prise de ce type de traitement que l'efficacité de l'hydrolysat de cartilage de poulet selon l'invention a été évaluée. 2.1.3.1.2 Etat de santé général et mouvements usuels quotidiens A la fin de chaque période de test, les volontaires décrivaient leur état de santé général et la facilité à produire leurs mouvements usuels quotidiens, via une échelle visuelle analogique (traduite ensuite sur une échelle allant de 0 à 10). 2.1.4 Plan expérimental Le test s'est déroulé sur une période totale de 9 mois répartis en deux périodes de test de 3 mois chacune séparées par une période de repos de 3 mois. L'étude s'est faite en cross over, c'est à dire que les personnes du groupe 1 ont testé le produit contrôle en première période et l'hydrolysat de cartilage de poulet selon l'invention en deuxième période tandis que les personnes du groupe 2 ont testé l'hydrolysat de cartilage de poulet selon l'invention en première période et le produit contrôle en deuxième période. L'étude s'est faite en double aveugle, c'est à dire que ni l'expérimentateur, ni le volontaire ne connaissait l'identification des produits. 2.2 Résultats 2.2.1 Description de l'échantillon 37 volontaires ont été inclus dans l'étude à l'issue d'un examen médical avec la localisation des gênes et la mesure de l'intensité en plusieurs points. 5 volontaires sont sortis de l'étude (protocole non commencé ou prise de médicaments interdits). 32 volontaires ont donc suivi complètement et correctement le protocole : 25 femmes et 7 hommes, d'un âge moyen de 60 ans +/- 6. 2.2.2 Consommation de traitements non stéroïdiens L'analyse des cahiers d'observation révèle que la consommation d'anti-inflammatoires non stéroïdiens est nettement supérieure lors de la période de prise du produit contrôle (consommation moyenne = 18,1 jours (+/- 21,7)), comparée à la période de prise de l'hydrolysat de cartilage de poulet selon l'invention (consommation moyenne = 4,9 jours (+/- 8,3)).
Les distributions du nombre de jours de traitement par volontaire et par produit testé, ont été traitées par le test non paramétrique des rangs de Wilcoxon. Le seuil de significativité obtenu est p = 0,006 0, 05 (5% étant la valeur classiquement retenue pour le risque maximum que l'on s'autorise à prendre, de conclure à une différence alors qu'elle n'existe pas). L'analyse statistique a donc mis en évidence que la consommation d'AINS durant la période de prise de l'hydrolysat de cartilage de poulet selon l'invention est significativement inférieure à la consommation d'AINS durant la période de prise du produit contrôle, par volontaire. 2.2.3 Etat de santé général et mouvements usuels quotidiens Les volontaires ont en moyenne mieux évalué leurs mouvements usuels quotidiens et leur état de santé général, suite à la consommation de l'hydrolysat de cartilage de poulet selon l'invention. 21% des volontaires ont même indiqué que leur état de santé s'était beaucoup amélioré suite à la prise de l'hydrolysat de cartilage de poulet selon l'invention contre 9% seulement pour ceux ayant consommé le produit contrôle. 2.2.4 Acceptabilité et tolérance de l'hydrolysat de cartilage décrit dans l'invention Les volontaires ont trouvé le produit pratique d'utilisation avec une note moyenne de 4,3 sur 5 (+i-0,8), et pensent que la forme du produit (gélules) est adaptée à une utilisation de type complément alimentaire : note moyenne de 3,8 sur 5 (+/-1,0). Durant la période de consommation de l'hydrolysat de cartilage de poulet selon l'invention, seuls 7 volontaires ont eu à se plaindre d'effets secondaires mineurs. 2. 3 Conclusion Cette étude avait pour objectif d'évaluer l'efficacité de l'hydrolysat de cartilage de poulet selon l'invention, auprès de personnes se plaignant de gênes articulaires. Un test à domicile a été réalisé pendant une période de 9 mois auprès d'un groupe de 32 volontaires. L'étude s'est déroulée en double aveugle contre un produit contrôle, avec 2 périodes de test d'une durée de 3 mois chacune, séparées par une période de repos de 3 mois. La dose quotidienne d'hydrolysai de cartilage de poulet • 2900155 20
selon l'invention prise par les volontaires était de 1500 mg. Les volontaires devaient voir un rhumatologue au début et à la fin de chaque période de test. Les performances de l'hydrolysat de cartilage de poulet selon l'invention ont été évaluées via le suivi de la consommation de traitements par anti-inflammatoires non 5 stéroïdiens. L'acceptabilité et la tolérance ont été recueillies à la fin de chaque période de test via un questionnaire. Le contrôle de la consommation d'anti-inflammatoires non stéroïdiens lors du test a révélé que cette consommation durant la période de prise de l'hydrolysat de cartilage de poulet selon l'invention était significativement inférieure à celle relevée 10 durant la période de prise du produit contrôle, démontrant ainsi une action de l'hydrolysat de cartilage de poulet selon l'invention sur les cartilages, conduisant à une réduction de l'inflammation et des douleurs articulaires. De plus, compte tenu de la faible dose journalière de chondroïtine sulfate apportée par l'hydrolysat de cartilage de poulet selon l'invention (180 mg, à comparer 15 aux 1200 mg habituellement recommandés), les résultats obtenus laissent supposer un effet synergique du collagène type II hydrolysé ayant les caractéristiques définies dans la description (poids moléculaire moyen et composition en acides aminés) et de la chondroïtine sulfate. L'évaluation par les volontaires, via une échelle visuelle analogique, de leurs 20 mouvements usuels quotidiens et de leur état de santé général, à chaque fin de période, a révélé qu'ils se sentaient mieux sur ces deux points suite à la prise de l'hydrolysat de cartilage de poulet selon l'invention, qu'à la suite du produit contrôle. L'hydrolysat de cartilage de poulet selon l'invention a été bien jugé par les volontaires pour sa praticité d'emploi (note de 4,3 sur 5) et aucun effet secondaire 25 majeur n'a été ressenti. L'hydrolysat de cartilage de poulet selon l'invention permet donc de réduire la gêne articulaire et d'améliorer la mobilité des articulations chez des patients souffrant de douleurs articulaires chroniques, et ce sans conduire à des effets secondaires importants du type de ceux induits par les anti-inflammatoires non stéroïdien.30 BIBLIOGRAPHIE 1. Eggersgluss, B. (1999). "Gelatine hydrolyste and its health aspects." The European Food & Drink Review (Autumn 1999): 45-49. 2. Yamato, R. and Y. Sakai (2005). "Effets bénéfiques du collagène Tripeptide (HACP) sur les os et les tendons [traduction d'un article japonais]." Foods and Foods Ingredients Journal of Japan 210 (9): 854-858. 3. Blumenkrantz, N. and G. Asboe-Hansen (1978). "Hydroxyproline to hydroxylysine molar ratio indicates collagen type." Acta Dermatovener (Stockolm) 58: 111-115. 4. Barnet M.L., Combitchi D., Trentham D.E. A pilot trial of oral type II collagen in the treatment of juvenile rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatism. 1996 ; 39 [4] : 623 ù 628. 5. Barnet, Kremer J.M., St. Clair E.W., Clegg D.O. et al. Treatment of rheumatoid arthritis with oral type II collagen. Arthritis & Rheumatism, 1998 ; 41 [2] : 290-297. 6. Sieper J. et al. Oral type II collagen treatment in early rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatism. 1996 ; 39 [1] : 41 ù 51. 7. Trentham DE, Dynesius-Trentham RA, Orav EJ, Combitchi D, Lorenzo C, Sewell KL, Hafler DA, Weiner HL. Effects of Oral Administration of Type II Collagen on Rheumatoid Arthritis. Science. 1993 ; 261 : 1727-1930. 8. Grès, M. C., B. Julian, et al. (1998). "Correlation between oral drug absorption in humans, and apparent drug permeability in TC-7 cells, a human epithelial intestinal cell fine : comparison with the parental Caco-2 cell line." Pharmaceutical research 15: 726-733.30
Claims (7)
1. Hydrolysat de cartilage aviaire caractérisé en ce que : a) il comprend : 45 à 70 % en poids de collagène de type II hydrolysé, 9 à 15 % en poids de chondroïtine sulfate, 0,5 à 2% en poids d'acide hyaluronique ; b) parmi les acides aminés totaux : la valine représente 2,7 % à 3,3 %, l'isoleucine représente 2,0 à 2,4 %, la phénylalanine représente 2,2 % à 2,6 %, la lysine représente 3,8 à 4,2 %, Le tryptophane représente 0,4 à 0,6%, l'hydroxyproline représente 5,5 à 8,7 %, I'hydroxylysine représente 0,7 à 1,8 %, le ratio molaire entre hydroxyproline et hydroxylysine est compris entre 5,0 et 8,0 ; c) le poids moléculaire moyen de sa fraction peptidique est compris entre 500 et 1000 daltons.
2. Hydrolysat selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est préparé à partir d'un mélange d'os et de cartilage articulaire (70%-100% en poids) et éventuellement de cartilage de sternum (0-30% en poids). 25
3. Procédé de préparation d'un hydrolysat de cartilage aviaire selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, comprenant : a) la fourniture d'une matière première composée de 70-100% en poids d'os et de cartilage articulaire (dont sternal) et de 0-30% en poids de cartilage de sternum, 30 b) Le mélange de cette matière première avec une solution aqueuse de pH compris entre 5,5 et 7,5, 10 15 20 c) L'hydrolyse du mélange de matière première dans l'eau avec une enzyme protéolytique pendant l h à 2 h, à une température comprise entre 65 et 75 C, d) L'inactivation de l'enzyme protéolytique pendant 10 à 20 minutes à au moins 85 C. e) La filtration du mélange réactionnel contenant l'hydrolysat, f) La concentration du mélange réactionnel, g) La stérilisation finale du mélange réactionnel à environ 130 C pendant au moins environ 30 secondes, et h) Le séchage du mélange réactionnel pour obtenir l'hydrolysat sous forme de poudre.
4. Hydrolysat selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 ou obtenu par le procédé selon la revendication 3, pour son utilisation en tant que complément alimentaire.
5. Hydrolysat selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 ou obtenu par le procédé selon la revendication 3, pour son utilisation en tant que médicament.
6. Hydrolysat selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 ou obtenu par le procédé selon la revendication 3, pour son utilisation en tant que médicament dans le traitement ou la prévention des douleurs articulaires. 25
7. Utilisation d'un hydrolysat selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 ou obtenu par le procédé selon la revendication 3 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des douleurs articulaires ayant pour origine une dégénérescence du cartilage liée à l'âge, une sollicitation trop poussée des articulations liée à la pratique intensive d'un sport, ou une 30 sollicitation trop poussée des articulations liée à l'obésité.20
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