FR2897872A1 - Procede d'analyse microbiologique rapide. - Google Patents

Abstract

Le procédé d'analyse microbiologique rapide d'un support adapté à retenir des micro-organismes comporte l'étape de sélectionner un réactif adapté à révéler la présence d'ATP, l'étape d'agir sur lesdits micro-organismes pour rendre accessible l'ATP desdits micro-organismes audit réactif, puis l'étape de déposer sur ledit support ledit réactif adapté à révéler la présence d'ATP, et l'étape de détecter la réponse dudit support audit réactif, ledit procédé comportant, préalablement à l'étape d'agir sur lesdits micro-organismes, une étape de prétraitement comportant l'étape de sélectionner un réactif adapté à consommer l'ATP parasite présent sur ledit support, et successivement, l'étape de déposer ledit réactif adapté à consommer l'ATP sur ledit support et l'étape d'éliminer ledit réactif adapté à consommer l'ATP une fois l'ATP parasite consommé.

Description

1

La présente invention concerne un procédé d'analyse microbiologique rapide. Dans le cadre d'activités industrielles ou médicales, le contrôle de la qualité microbiologique de liquides, de gaz ou encore de surfaces, répond aujourd'hui à des normes strictes. De ce fait, les acteurs industriels et les autorités sanitaires doivent pouvoir disposer d'outils permettant de détecter le plus tôt possible les contaminations microbiologiques, afin de pouvoir y remédier dans les meilleurs délais et à coût réduit.

En pratique, le suivi microbiologique est réalisé sur un milieu gélosé où des micro-organismes, après avoir été recueillis sur une membrane microporeuse, sont mis en culture jusqu'à ce qu'ils soient rendus visibles à l'oeil nu. Les durées d'incubation varient d'un micro- organisme à l'autre mais sont en général d'au moins 24 heures et parfois davantage pour des micro-organismes à croissance plus lente (comme les mycobactéries par exemple) ou parce que les germes ont été stressés par les conditions environnementales. Pour rendre la détection plus rapide, une autre approche consiste à réduire la durée minimale de culture (voire, pour certains micro-organismes, à la supprimer complètement) en basant la détection des micro-organismes sur leur activité métabolique. Un marqueur métabolique universel, le plus souvent l'adénosine triphosphate (ATP) contenu dans les micro-organismes vivants, est mesuré en le mettant au contact d'un réactif révélant la présence d'ATP par luminescence ( Bio Luminescence Reagent en anglais) ce qui permet de rendre compte de la présence de micro-organismes sans avoir à attendre que des colonies se forment sur un milieu gélosé et deviennent visibles à l'oeil nu. La quantité de lumière émise est fonction de la masse d'ATP et donc du nombre de micro-organismes.

On connaît déjà, notamment par le brevet européen 0 529 084, un procédé pour compter le nombre de micro-organismes vivants dans une solution d'essai comportant les étapes de : 2

- filtrer la solution au travers d'une membrane microporeuse afin de retenir les micro-organismes vivants contenus dans la solution ; -pulvériser un agent adapté à rendre accessible l'ATP des microorganismes à un réactif, pulvérisé ultérieurement, adapté à révéler la présence 5 d'ATP par luminescence ; - pulvériser ensuite sur cette membrane ce réactif ; et - détecter la présence des micro-organismes à partir de la quantité de lumière émise en réponse au dépôt du réactif. L'invention vise à accroître la fiabilité de résultat d'une telle analyse tout 10 en restant simple et commode à mettre en oeuvre. Elle propose à cet effet, un procédé d'analyse microbiologique rapide d'un support adapté à retenir des micro-organismes, comportant l'étape de sélectionner un réactif adapté à révéler la présence d'ATP ; et : - l'étape d'agir sur lesdits micro-organismes pour rendre accessible 15 l'ATP desdits micro-organismes audit réactif ; puis - l'étape de déposer sur ledit support ledit réactif adapté à révéler la présence d'ATP ; et - l'étape de détecter la réponse dudit support audit réactif ; caractérisé en ce que ledit procédé comporte, préalablement à l'étape 20 d'agir sur lesdits micro-organismes, une étape de prétraitement comportant : - l'étape de sélectionner un réactif adapté à consommer l'ATP parasite présent sur ledit support ; et successivement : - l'étape de déposer ledit réactif adapté à consommer l'ATP sur ledit support ; et 25 - l'étape d'éliminer ledit réactif adapté à consommer l'ATP une fois l'ATP parasite consommé. L'étape de prétraitement permet d'éliminer l'ATP parasite présent sur le support, c'est-à-dire l'ATP provenant non pas des micro-organismes mais éventuellement contenu dans le produit à analyser ou bien issu de 30 contaminations externes (qui se produisent par exemple lors de la fabrication du support, de son transport ou pendant l'étape de filtration). 3

L'ATP parasite est consommé par le réactif sans que ne soit consommé l'ATP des micro-organismes, protégé de l'action du réactif au cours du prétraitement par les enveloppes des micro-organismes. C'est seulement après avoir éliminé ce réactif que l'on agit sur les micro- organismes pour que l'ATP des micro-organismes puisse ensuite être atteint par un réactif révélant l'ATP par luminescence. L'ATP parasite étant supprimé grâce au prétraitement, seule sera analysée au cours du traitement la masse d'ATP provenant des micro-organismes, les risques de détection de faux positifs (détection de présence erronée de micro-organismes) sont ainsi considérablement diminués. Selon des caractéristiques préférées pour des raisons de simplicité et de commodité tant à la fabrication qu'à l'utilisation : - ladite étape de déposer ledit réactif adapté à consommer l'ATP comporte au moins une étape de pulvérisation dudit réactif sur ledit support.

Selon d'autres caractéristiques préférées, pour les mêmes raisons que celles indiquées ci-dessus : - ladite étape d'agir sur lesdits micro-organismes comporte une étape de lyse desdits micro-organismes ; et - ladite étape de sélectionner ledit réactif adapté à consommer l'ATP et ladite étape de dépôt dudit réactif sont adaptées à ce que ladite étape d'élimination dudit réactif et ladite étape de lyse soient mises en oeuvre par une seule étape de chauffage dudit support. Bien que cela soit surprenant, il est possible de réaliser en une seule étape l'élimination du réactif et la lyse des micro-organismes par chauffage du support sans qu'une interaction significative entre le réactif encore non éliminé et l'ATP des micro-organismes ne se produise. Cela s'explique par le fait que les réactifs consommant l'ATP parasite sont en général éliminés par chauffage avant que la lyse des micro-organismes ne soit effectuée. L'ATP des micro-organismes n'est alors libéré qu'après élimination du réactif.

Selon d'autres caractéristiques préférées, pour les mêmes raisons que celles indiquées ci-dessus : - ladite étape de chauffage comporte l'étape de faire prendre à la température de chauffage une valeur comprise entre 50 C et 150 C ; 4

- ladite étape de chauffage comporte l'étape de faire prendre à ladite température de chauffage une valeur comprise entre 70 C et 100 C ; - ledit chauffage dudit support est mis en oeuvre par émission de micro-ondes ; -ladite étape d'agir sur lesdits micro-organismes comporte l'étape de perméabiliser lesdits micro-organismes ; - ladite étape de perméabilisation comporte l'étape de pulvériser sur ledit support un réactif adapté à perméabiliser lesdits micro-organismes ; - ledit réactif adapté à révéler la présence d'ATP est sélectionné parmi les réactifs adaptés à révéler l'ATP par luminescence ; - ledit réactif adapté à consommer l'ATP est sélectionné parmi les réactifs adaptés à révéler l'ATP par luminescence ; et/ou - ladite étape de déposer ledit réactif adapté à consommer l'ATP sur ledit support comporte : l'étape de pulvériser ledit réactif ; ^ l'étape de mesurer au cours de ladite étape de pulvérisation la quantité de lumière émise par la mise en contact dudit réactif avec l'ATP parasite ; et ^ l'étape d'arrêter ladite étape de pulvérisation dès que ladite quantité de lumière mesurée est inférieure à un seuil prédéterminé. La mise au contact de l'ATP parasite et du réactif le consommant, lorsque ce réactif est sélectionné parmi ceux révélant la présence d'ATP par luminescence, entraîne l'émission d'une lumière qui indique si une masse non négligeable d'ATP parasite est encore présent et non consommé sur le support.

La mesure de cette quantité de lumière au cours de la pulvérisation permet ainsi de doser avec précision la juste quantité de réactif à pulvériser sur le support pour consommer la totalité de l'ATP parasite. Selon encore d'autres caractéristiques préférées, pour les mêmes raisons que celles indiquées ci-dessus : - ledit réactif adapté à révéler la présence d'ATP et ledit réactif adapté à consommer l'ATP sont à base de luciférine-luciférase ; - ledit réactif adapté à révéler la présence d'ATP et ledit réactif adapté à consommer l'ATP sont identiques ; - ladite étape de détection comporte : • l'étape d'enregistrer la quantité de lumière émise par ledit support en fonction du temps entre un instant ti antérieur à un instant to auquel ladite étape de dépôt est réalisée et un instant t2 postérieur audit instant to ; 5 • l'étape d'extrapoler, à partir dudit enregistrement, la quantité de lumière en fonction du temps qui aurait été émise par ledit support entre ledit instant t, et ledit instant t2 sans le dépôt dudit réactif ; et ^ l'étape de déterminer à partir de ladite quantité de lumière enregistrée et de ladite quantité de lumière extrapolée, un ensemble de valeurs représentatif de la quantité de lumière émise en fonction du temps à partir dudit instant to par la seule mise en contact de l'ATP avec ledit réactif ; - ladite étape de détermination dudit ensemble de valeurs comporte l'étape de déterminer la différence entre ladite quantité de lumière enregistrée et ladite quantité de lumière extrapolée ; - après l'étape de détermination dudit ensemble de valeurs, l'étape de détection comporte en outre : ^ l'étape d'intégrer ledit ensemble de valeurs en fonction du temps ; et • l'étape de comparer le résultat de cette intégration à une valeur prédéterminée pour en déduire la présence de micro-organismes ; et/ou - après l'étape de détermination dudit ensemble de valeurs, l'étape de détection comporte en outre : ^ l'étape de sélectionner la valeur maximale dudit ensemble de valeurs ; l'étape de comparer le résultat de cette sélection à une valeur prédéterminée pour en déduire la présence de micro-organismes ; et/ou -ledit support est une membrane microporeuse. Les caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description qui suit, donnée à titre d'exemple préféré, mais non limitatif, en référence aux dessins annexés, sur lesquels : - la figure 1 est une vue en perspective d'un dispositif d'analyse microbiologique rapide où un chariot mobile que comporte ce dispositif est dans une position où il reçoit une unité de filtration ; 6

- la figure 2 est une vue en perspective-coupe et en agrandissement par rapport à la figure 1 de ce dispositif prise selon un plan vertical centré sur le trajet du chariot ; - les figures 3 et 4 sont deux vues similaires à la figure 2 mais illustrant respectivement la position qu'occupe le chariot mobile lorsqu'il est placé à une première et à une deuxième position de traitement d'une membrane que comporte l'unité de filtration ; - les figures 5 et 6 sont deux vues en perspective-coupe et en agrandissement par rapport à la figure 3 prises sous des angles différents ; - la figure 7 est un chronogramme montrant respectivement avec une échelle de temps commune portée en abscisse et une échelle de pourcentage commune portée en ordonnée comment varient en fonction du temps, lorsque la membrane que comporte l'unité de filtration est portée à une température de 90 C, le taux d'activité rémanente d'un réactif ayant été préalablement déposé sur cette membrane ainsi que le taux de lyse d'un premier et d'un second type de micro-organismes présents sur cette membrane ; - la figure 8 est un chronogramme montrant, avec une échelle de temps commune, portée en abscisse, comment varient respectivement la quantité de lumière relative émise par la membrane et son voisinage immédiat avant, pendant et après le dépôt d'un réactif révélant la présence d'ATP par luminescence et la quantité de lumière qui aurait été émise sans le dépôt de ce réactif ; - la figure 9 est un chronogramme similaire à ceux représentés en figure 8 mais illustrant isolément comment varie en fonction du temps la quantité de lumière émise par la seule mise en contact du réactif révélant par luminescence la présence de l'ATP des micro-organismes que contient la membrane ; - la figure 10 est un schéma-bloc du dispositif illustré dans lequel est notamment représenté un micro-calculateur que comporte ce dispositif ; - la figure 11 est un organigramme illustrant les opérations effectuées par le microcalculateur sur les données fournies par un photomultiplicateur que comporte ce dispositif ; et 7

- la figure 12 est un chronogramme montrant, avec une échelle de temps commune, portée en abscisse, comment varie pour différentes masses initiales d'ATP parasite, la quantité de lumière émise par la membrane et son environnement immédiat avant, pendant et après le dépôt du réactif révélant la présence d'ATP par luminescence. Le dispositif d'analyse rapide 1 d'une unité de filtration 15 comporte un poste de pulvérisation 2, un poste de lyse 3 et un poste de mesure de quantité de lumière 4. Le poste de pulvérisation 2 et le poste de mesure 4 sont disposés en 10 regard l'un de l'autre tandis que le poste de lyse 3 est placé au voisinage des postes 2 et 4. Le poste de pulvérisation 2 comporte une buse de pulvérisation 21 reliée par un conduit 22 à un flacon non représenté. La buse de pulvérisation 21 comporte une tête conique 25 et est reliée 15 par une platine 23 à un bâti général du dispositif non représenté. Le flacon auquel est relié le conduit 22 contient un réactif révélant la présence d'ATP par luminescence, à base d'eau, d'un complexe luciférineluciférase et de magnésium. Sur le flacon est placée une puce RFID dans laquelle sont stockées des informations relatives au réactif telles que le volume 20 initial de réactif contenu dans le flacon, la date d'expiration de ce réactif ou encore le nombre de cycles pouvant être réalisés avec le volume de réactif restant dans le flacon. Le poste de lyse 3 comporte une enceinte 30 de forme générale parallélépipédique et un magnétron 31 (représenté en figure 1 avec sa platine 25 électronique de commande) relié par un câble coaxial (non représenté) à une antenne (non visible) disposée à l'intérieur de l'enceinte 30. Le magnétron 31 et sa platine de commande sont, comme pour le platine 23 de la buse 21, montés sur le bâti général (non représenté) du dispositif. L'enceinte 30 comporte un corps d'enceinte supérieur 28, un corps 30 d'enceinte inférieur 29 et une bride en U 32. Chaque corps d'enceinte est de forme générale parallélépipédique et présente une face ouverte. 8

Le corps d'enceinte 28 (respectivement 29) présente autour de sa face ouverte un flasque 41 (respectivement 42) à contour rectangulaire relié transversalement au reste du corps d'enceinte. La bride en U 32 présente deux grandes branches 43 reliées entre elles par une petite branche transversale 45. A l'état assemblé, chaque flasque 41, 42 coopère avec les branches de la bride 32 afin que les faces ouvertes des corps 28 et 29 soient disposées l'une en face de l'autre. Les corps 28, 29 et la bride 32 de l'enceinte 30 sont dimensionnés pour 10 que les ondes émises par le magnétron 31 restent confinées en régime stationnaire dans la cavité délimitée par l'enceinte 30. A l'état assemblé, du côté de l'enceinte opposé à la branche 45, l'espace situé entre les branches 43 et entre les flasques 41 et 42 débouche par une fenêtre 39 vers les postes de pulvérisation 2 et de mesure 4. 15 Au voisinage de la fenêtre 39 se situe un clapet 68 adapté à occulter cette fenêtre pour isoler les postes de pulvérisation 2 et de mesure 4 des perturbations électromagnétiques engendrées lors du fonctionnement du magnétron 31. Le poste de mesure 4 comporte un photomultiplicateur 50 traversant une 20 tablette 51 et un obturateur 52 (figure 6). Le photomultiplicateur 50 est ici un photomultiplicateur commercialisé par la société Electron Tubes sous la référence 9266B. L'obturateur 52 représenté en détail en figure 6 comporte une plaque opaque 53, une tige 56, une bielle 55 et un moteur 54. 25 La plaque 53 est mobile, logée dans une cavité ménagée dans la tablette 51 et reliée par la tige 56 à la bielle 55. Le dispositif 1 comporte également un chariot 5 présentant un plateau 12 et un portoir 9 (figures 2 à 4). Le plateau 12 est maintenu au portoir 9 par deux vis 7 (figure 1). 30 Dans le plateau 12 est ménagé un orifice cylindrique débouchant de chaque côté du plateau. Cet orifice est bordé par une collerette annulaire 13 en renfoncement par rapport à chaque côté du plateau 12. 9

Dans le renfoncement situé du côté du plateau 12 qui regarde le photomultiplicateur 50 se loge une vitre en verre 17. L'unité de filtration 15 comporte un corps 18 entourant une membrane microporeuse 19 présentant deux faces opposées 10 et 11.

Le portoir 9 du chariot 5 est relié par un ruban 64 (fixé par une vis 8 à ce portoir) et par un jeu de poulies 62, 63 et 67 à un moteur 65 (figures 1 et 2) situé à l'extérieur de l'enceinte 30, au voisinage de la branche 45 de la bride 32. Le ruban 64 présente une section incurvée afin de présenter une résistance à la flexion lui permettant de transmettre un effort de poussée tout en l'autorisant à s'enrouler autour d'une poulie. Le ruban 64 traverse l'enceinte 30 par la fenêtre 39 et par un trou oblong 46 (figures 2 à 4) ménagé dans la petite branche 45 de la bride 32. Le chariot 5 est fixé à ce ruban de façon à rendre le chariot mobile entre une position de réception (figures 1 et 2), une première position de traitement (figures 3, 5 et 6) et une seconde position de traitement (figure 4). Le dispositif 1 comporte également à l'opposé du moteur 65 une fenêtre 60 et un capot 61 adapté à rendre étanche à la lumière la fenêtre 60 lorsqu'il est refermé. Dans la position de réception, le plateau 12 fait saillie du reste du dispositif par la fenêtre 60 avec le capot 61 qui est en position ouverte. Dans la première position de traitement, le chariot 5 est disposé entre la buse 21 et le photomultiplicateur 50 de sorte que dans cette position, le poste de pulvérisation 2 regarde la face 10 de la membrane 19 en étant aligné avec elle tandis que le poste de mesure 4 regarde la face 11 de cette membrane au travers de la vitre 17 en étant également aligné avec elle. Dans la position de réception et dans la première position de traitement, le ruban 64 traverse totalement l'enceinte 30. Dans la seconde position de traitement, le chariot 5 est disposé au sein de l'enceinte 30 du poste de lyse 3 de sorte que la membrane 19 est entièrement située dans cette enceinte, le portoir 9 étant alors disposé entre les flasques 41 et 42. Plusieurs capteurs sont disposés au niveau des différents postes de traitement pour s'assurer de l'état de fonctionnement du dispositif, notamment 10

un lecteur/enregistreur RFID à côté du flacon contenant le réactif, plusieurs capteurs de position du chariot et plusieurs capteurs de température (au niveau du photomultiplicateur et du magnétron par exemple). Le poste de pulvérisation 2, le poste de lyse 3, le poste de mesure 4, les moteurs 54 et 65 ainsi que les différents capteurs sont reliés à un micro-calculateur 82 suivant le schéma-bloc représenté en figure 10. Le micro-calculateur 82 est adapté notamment à gérer les instructions de lancement ou d'arrêt d'un cycle d'analyse, à recevoir les instructions de l'opérateur par une interface homme-machine 85 ou encore à enregistrer dans une mémoire les données provenant du photomultiplicateur. Le micro-calculateur 82 est également capable d'afficher sur un écran 83 et/ou d'imprimer sur une imprimante à étiquettes 84 les informations destinées à l'opérateur (par exemple l'état d'avancement du cycle en cours, le nombre de cycles encore disponibles dans le flacon, le résultat des analyses précédentes ou encore différents états d'alerte et de maintenance du dispositif). On va maintenant décrire le fonctionnement du dispositif 1. Avant de réaliser un cycle d'analyse, l'opérateur recueille sur une membrane microporeuse 19 d'une unité de filtration 15 les micro-organismes éventuellement présents dans un liquide, un gaz ou sur une surface.

Ensuite l'opérateur, après avoir préalablement choisi le plateau 12 convenant pour coopérer avec le corps 18 de l'unité de filtration et l'avoir vissé au portoir 9, place l'unité de filtration 15 sur le chariot mobile 5 (qui occupe alors la position de réception représentée en figures 1 et 2) en le centrant par rapport à la collerette 13, le corps 18 de l'unité 15 prenant alors appui par son bord inférieur contre cette collerette. L'opérateur commande alors à l'aide d'une interface homme-machine le lancement d'un cycle d'analyse de cette membrane. Il choisit en particulier parmi trois cycles différents, à savoir un mode sans prétraitement (ce paramétrage est mentionné à titre de simple information mais bien entendu ne concerne pas l'invention décrite), un mode prétraitement manuel et un mode prétraitement automatique. On va maintenant décrire les différentes étapes du procédé dans le cas du prétraitement manuel. 11

Dans un premier temps, le module de commande actionne le moteur 65 de façon à faire tourner les poulies 62, 63 et 67 pour mettre en translation le chariot mobile 5. Le chariot se déplace alors de sa position de réception à sa première position de traitement (figure 3), entre les modules de pulvérisation 2 et de mesure 4. Au cours de ce déplacement, lorsque le chariot 5 a entièrement franchi la fenêtre 60, le capot 61 du dispositif se referme par rappel élastique pour que les étapes suivantes soient réalisées en milieu clos et obscur. Dans la première position de traitement, le poste 2 est commandé pour pulvériser un volume prédéterminé du réactif. La buse de pulvérisation 21 est conçue pour déposer de façon homogène et régulière des micro-gouttelettes du réactif sur toute la membrane 19. La pulvérisation par micro-gouttelettes permet de diviser suffisamment le volume de liquide déposé pour éviter tout risque de dilution.

Ce réactif est ainsi mis en contact avec l'ATP parasite présent sur la membrane provenant non pas des micro-organismes qu'elle retient mais de contaminations externes, par exemple lors du transport ou lors de l'étape de filtration. La mise en présence du réactif avec l'ATP parasite entraîne une réaction chimique qui génère de la lumière et qui consomme l'ATP parasite. L'ATP parasite ainsi consommé n'interfèrera pas au cours des étapes suivantes du cycle d'analyse. Le réactif n'interagit pas avec l'ATP des micro-organismes, celui-ci étant, à ce stade du cycle, encore protégé du réactif par les enveloppes des micro- organismes. Une fois le réactif pulvérisé, le module de commande actionne ensuite le moteur 65 pour déplacer le chariot mobile 5 afin qu'il pénètre par la fenêtre 39 dans l'enceinte 30 pour atteindre la seconde position de traitement, au sein de la cavité micro-ondes du poste de lyse 3.

Lorsque le chariot 5 est introduit dans l'enceinte 30, le clapet 68 se referme par rappel élastique pour isoler l'enceinte 30 du reste du dispositif et minimiser les perturbations électromagnétiques engendrées par l'émission de micro-ondes. 12

Le magnétron 31 est alors commandé pour émettre un champ mono-onde afin que se propage une onde incidente au sein de la cavité micro-onde formée par l'enceinte 30. Il s'établit alors dans cette enceinte (par réflexion de l'onde incidente sur les surfaces de l'enceinte 30) un régime à ondes stationnaires. Les tronçons des flasques 41 et 42 situés au voisinage de la fenêtre 39 et de l'ouverture 46 contribuent également à minimiser les fuites de champ magnétique par ces ouvertures. Les molécules polarisées (notamment l'eau contenue dans la membrane après filtration et/ou apportée par la première pulvérisation du réactif), excitées par le champ micro-onde, font chauffer la membrane 19 jusqu'à atteindre une température d'environ 90 C. A cette température, le réactif présent sur la membrane est rapidement éliminé comme le montre la courbe 75 sur la figure 7 qui représente le taux de réactif encore actif (taux d'activité rémanente) en fonction du temps. Après 6 secondes d'exposition à cette température, 20% du réactif a déjà été éliminé tandis qu'après 15 secondes, 90% du réactif a été éliminé et après 17 secondes tout le réactif a été éliminé. La cinétique de lyse des micro-organismes à cette température est plus lente. Les courbes 76 et 77 de la figure 7 représentent pour deux types de micro-organismes (saccharomyces cerevisae pour la courbe 76 et cryptococcus pour la courbe 77), le pourcentage de micro-organismes lysés en fonction du temps. On remarque ainsi qu'à l'instant où tout le réactif a été éliminé, seule une faible quantité de micro-organismes a été détruit.

L'enveloppe de la majorité des micro-organismes n'est ainsi détruite (et I'ATP de ces micro-organismes n'est donc rendu accessible) qu'une fois que le réactif préalablement déposé a été éliminé de sorte que la majeure partie de I'ATP des micro-organismes n'est pas consommée par ce réactif. De plus, l'élimination du réactif est accélérée par le fait que la montée en 30 température entraîne un séchage partiel de la membrane 19 rendant la chaleur plus efficace pour éliminer le réactif. Le chauffage par micro-ondes permet de n'apporter que la quantité d'énergie nécessaire dosée en fonction de la quantité d'eau présente sur la 13

membrane sans produire de chaleur résiduelle pouvant perturber les étapes suivantes du procédé. Après cette étape de chauffage, l'ATP des micro-organismes ayant subi la lyse est rendu accessible pour être analysé. Le moteur 65 est alors commandé pour que le chariot 5 quitte l'enceinte 30 et retourne à la première position de traitement puis le moteur 54 de l'obturateur 52 du poste de mesure est commandé pour faire tourner la bielle 55 et déplacer la plaque opaque 53 dans une position où elle est à l'écart du photomultiplicateur 50 (figure 3). Le photomultiplicateur mesure alors la quantité de lumière qu'il reçoit au travers de la vitre 17. Cette lumière est émise par les matériaux situés dans le champ de vision du photomultiplicateur (ici la membrane 19 et son voisinage immédiat). On va maintenant décrire les différentes opérations réalisées par le micro-calculateur, une fois l'obturateur ouvert, à partir de l'organigramme représenté en figure 11. A l'opération 90, le micro-calculateur enregistre entre un instant t, (ici 30s) et un instant t2 (ici 300s), les données mesurées transmises par le photomultiplicateur. A l'instant to postérieur à t, et antérieur à t2 (figure 8) le poste de pulvérisation 2 est de nouveau commandé pour déposer une seconde fois de façon régulière et homogène sur toute la membrane 19 des micro-gouttelettes du réactif contenu dans le flacon pendant que l'enregistrement de la quantité de lumière se poursuit. La lumière produite en conséquence est émise des deux côtés de la membrane 19 et du plateau 12 grâce à la faible épaisseur de la membrane et à l'orifice ménagé dans le plateau 12 à cet effet. La quantité de lumière enregistrée est représentée en unité de lumière relative (ULR) en fonction du temps par la courbe 78 de la figure 8. Comme le montre cette courbe, la quantité de lumière décroît régulièrement selon une fonction logarithmique jusqu'à l'instant to correspondant à l'instant où est pulvérisé sur la membrane le réactif. 14

Cette phase de décroissance correspond à la désexcitation par émission phosphorescente de photons émis naturellement par la matière située dans le champ de vision du photomultiplicateur. Au delà de l'instant to, il se produit un à-coup d'émission de lumière en raison de la mise en contact du réactif avec l'ATP des micro-organismes rendu accessible par l'étape delyse. Après cet à-coup la quantité de lumière décroît de nouveau selon une fonction logarithmique. A partir des données enregistrées, le micro-calculateur réalise l'opération 91 et extrapole la quantité de lumière en fonction du temps qui aurait été émise si le réactif n'avait pas été déposé sur la membrane. Dans l'exemple illustré, cette opération est réalisée à partir des données enregistrées entre t1 (50s) et to (100s) et à partir des données enregistrées entre t3 = to-Ex et t2 (300s), où x est choisi afin que t3 soit suffisamment éloigné de to pour que l'on puisse considérer qu'au-delà de t3 l'influence de l'ajout du réactif devient négligeable (ici t3 = 250s). Le micro-calculateur déduit de ces données enregistrées les coefficients d'une fonction logarithmique variant globalement entre t1 et to et entre t3 et t2 comme la quantité de lumière représentée par la courbe 78.

Dans l'exemple illustré cette fonction est Q(t) = -16518.In(t) + 120334 et est représentée par la courbe 79 sur la figure 8, le coefficient de corrélation entre les données enregistrées et celles provenant de la fonction extrapolée est ici de 0.9994 dans les intervalles [t1, to] et [t3, t2]. Les courbes 78 et 79 diffèrent significativement l'une de l'autre dans un intervalle de temps (ici l'intervalle [100s, 150s]) dont la borne inférieure est l'instant to (100 s) où a été pulvérisé le réactif. Le micro-calculateur détermine alors par l'opération 92, à partir des quantités de lumière enregistrées et extrapolées respectivement représentées par les courbes 78 et 79, un ensemble de valeurs en fonction du temps représentatif de la quantité de lumière provenant de la seule mise en contact de I'ATP des micro-organismes avec le réactif. Cet ensemble de valeurs est représenté par la courbe 80 sur la figure 9. 15

Dans l'exemple illustré le micro-calculateur fait la différence, pour chaque instant entre t, et t2 où une valeur de quantité de lumière a été enregistrée, entre cette valeur et la valeur donnée par la fonction d'extrapolation Q(t) au même instant.

Cette soustraction point par point permet de filtrer numériquement le bruit de fond lumineux parasite (encore appelée décroissance du blanc ) afin d'obtenir l'ensemble de valeurs correspondant à la quantité de lumière provenant exclusivement de l'ATP des micro-organismes. Le filtrage du bruit de fond permet ainsi de s'affranchir des conditions de stockage (dont l'influence est importante sur l'émission de lumière naturelle), de la nature du produit déposé ou filtré sur la membrane (elle-même émettant une lumière dépendant de sa composition) et des conditions expérimentales d'analyse (étanchéité à la lumière, perturbations thermiques, efficacité du photomultiplicateur).

La quantité de lumière ainsi filtrée est ensuite intégrée (opération 93) entre t, et t2 et le test 94 compare le résultat de cette intégration à un seuil correspondant au niveau de sensibilité souhaité par l'utilisateur pour détecter la présence des micro-organismes. La valeur de ce seuil est choisie notamment en fonction du type de micro-organismes à détecter, la masse d'ATP contenue par les micro-organismes pouvant varier de façon significative d'un type de micro-organismes à un autre. Si le résultat de cette intégration est supérieur à cette valeur de seuil, on considère alors que la masse d'ATP à l'origine de cette lumière provient de la 25 présence de micro-organismes sur la membrane. A l'inverse, si ce résultat est inférieur à la valeur de seuil, on estime alors que l'ATP n'est pas contenu en masse suffisamment importante pour considérer que des micro-organismes sont présents (ou sont présents en quantité suffisamment importante) sur la membrane. 30 Le micro-calculateur commande alors l'affichage de l'information appropriée sur l'écran du dispositif en réalisant l'opération 95 ou l'opération 96 en fonction du test 94. 16

Une fois l'analyse réalisée le module de commande fait passer le chariot 5 de la première position de traitement à la position de réception où l'opérateur peut alors retirer l'unité de filtration 15 analysée pour y placer l'unité suivante à analyser.

La disposition du poste de mesure 4 et du poste de pulvérisation 2 par rapport à la membrane 19 dans la première position de traitement font que le photomultiplicateur 50 est placé au plus près de la membrane 19, transversalement par rapport à celle-ci, sans être gêné par le poste de pulvérisation et sans le gêner non plus. Cette conformation permet de recueillir un maximum de lumière et donc d'optimiser la sensibilité de détection du photomultiplicateur. De plus, l'utilisation d'un obturateur présentant une plaque opaque fine et d'une mécanique d'ouverture et de fermeture déportée permet de réduire encore la distance séparant le photomultiplicateur 50 de la membrane 19 et donc d'augmenter la sensibilité de détection. La conformation du dispositif, l'étape de prétraitement ainsi que le traitement du signal lumineux enregistré offrent une grande sensibilité de détection au dispositif. Un tel dispositif peut ainsi détecter la présence de seulement une dizaine 20 de femtogrammes d'ATP. Un tel niveau de sensibilité permet de détecter pour une grande variété de micro-organismes et sans incubation la présence d'un seul micro-organisme sur la membrane. On va maintenant décrire les différentes étapes du prétraitement dans le 25 cas d'un cycle automatique. Le cycle d'analyse automatique permet de s'assurer que tout l'ATP parasite a été consommé. En effet, comme on peut l'observer sur la figure 12 qui représente les quantités de lumière enregistrées avant et après le dépôt d'un réactif à l'instant 30 to pour différentes masses d'ATP parasite n'ayant pas été consommées (170 fg pour la courbe 78A, 66 fg pour la courbe 78B, 52 fg pour la courbe 78C et 18 fg pour la courbe 78D), l'ATP parasite non consommé peut être présent en masse importante et à l'origine d'analyses erronées (détection de faux positifs : on 17

détecte la présence de micro-organismes alors que le membrane n'en contient aucun). Il est donc utile de mettre à la disposition de l'utilisateur un cycle dans lequel on s'assure que l'étape de prétraitement a bien consommé tout I'ATP parasite. Avant d'effectuer la lyse des micro-organismes, lorsque le chariot 5 se situe au niveau de la première position de traitement, simultanément à la pulvérisation du réactif, on ouvre l'obturateur 52 pour que le photomultiplicateur 50 mesure en continu la quantité de lumière émise par la membrane et par son voisinage immédiat pendant l'étape de pulvérisation. Le microcalculateur compare cette mesure à une valeur de seuil prédéterminée et la pulvérisation du réactif se poursuit ainsi tant que la quantité de lumière mesurée par le photomultiplicateur est supérieure à ce seuil. Quand la quantité de lumière mesurée passe sous ce seuil, on considère alors que la masse ATP parasite encore présente à l'état non consommé sur la membrane devient négligeable et la pulvérisation est stoppée. Le chariot est alors déplacé vers la seconde position de traitement pour poursuivre le cycle d'analyse. Dans une variante, le micro-calculateur, au lieu d'intégrer l'ensemble de valeurs correspondant à la quantité de lumière représentée par la courbe 80, sélectionne la valeur maximale parmi cet ensemble pour la comparer à une valeur de seuil préalablement fixée. Dans encore une autre variante, le chauffage de la membrane est réalisé par infrarouges.

Dans encore une autre variante, l'étape de lyse par chauffage est remplacée par une étape de pulvérisation d'un réactif permettant soit de réaliser une lyse chimique des micro-organismes, soit de rendre perméable la membrane de ces micro-organismes afin de rendre accessible I'ATP qu'ils contiennent au réactif révélant I'ATP par luminescence pulvérisé ultérieurement.

Dans encore une autre variante, le dispositif est utilisé pour effectuer un dénombrement des micro-organismes présents sur la membrane soit en remplaçant le photomultiplicateur par une caméra CCD soit en traitant et/ou en analysant en plusieurs fois, par zone élémentaire, la membrane. 18

La présente invention n'est pas limitée aux modes de réalisation décrits et représentés mais englobe toute variante d'exécution.

Claims (12)

REVENDICATIONS

1. Procédé d'analyse microbiologique rapide d'un support (19) adapté à retenir des micro-organismes, comportant l'étape de sélectionner un réactif adapté à révéler la présence d'ATP ; et : - l'étape d'agir sur lesdits micro-organismes pour rendre accessible l'ATP desdits micro-organismes audit réactif ; puis - l'étape de déposer sur ledit support (19) ledit réactif adapté à révéler la présence d'ATP ; et -l'étape de détecter la réponse dudit support audit réactif ; caractérisé en ce que ledit procédé comporte, préalablement à l'étape d'agir sur lesdits micro-organismes, une étape de prétraitement comportant : l'étape de sélectionner un réactif adapté à consommer l'ATP parasite présent sur ledit support (19) ; et successivement : - l'étape de déposer ledit réactif adapté à consommer l'ATP sur ledit support (19) ; et -l'étape d'éliminer ledit réactif adapté à consommer l'ATP une fois l'ATP parasite consommé.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite étape 20 de déposer ledit réactif adapté à consommer l'ATP comporte au moins une étape de pulvérisation dudit réactif sur ledit support (19).

3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite étape d'agir sur lesdits micro-organismes comporte une étape de lyse desdits micro-organismes. 25

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ladite étape de sélectionner ledit réactif adapté à consommer l'ATP et ladite étape de dépôt dudit réactif sont adaptées à ce que ladite étape d'élimination dudit réactif et ladite étape de lyse soient mises en oeuvre par une seule étape de chauffage dudit support (19). 30

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite étape de chauffage comporte l'étape de faire prendre à la température de chauffage une valeur comprise entre 50 C et 150 C. 20

6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite étape de chauffage comporte l'étape de faire prendre à ladite température de chauffage une valeur comprise entre 70 C et 100 C.

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que ledit chauffage dudit support (19) est mis en oeuvre par émission de micro-ondes.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite étape d'agir sur lesdits micro-organismes comporte l'étape de perméabiliser lesdits micro-organismes.

9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite étape de perméabilisation comporte l'étape de pulvériser sur ledit support (19) un réactif adapté à perméabiliser lesdits micro-organismes.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que ledit réactif adapté à révéler la présence d'ATP est sélectionné parmi les réactifs adaptés à révéler l'ATP par luminescence.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que ledit réactif adapté à consommer l'ATP est sélectionné parmi les réactifs adaptés à révéler l'ATP par luminescence.

12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce ladite étape de déposer ledit réactif adapté à consommer l'ATP sur ledit support (19) comporte : - l'étape de pulvériser ledit réactif ; - l'étape de mesurer au cours de ladite étape de pulvérisation la quantité de lumière émise par la mise en contact dudit réactif avec l'ATP parasite ; et - l'étape d'arrêter ladite étape de pulvérisation dès que ladite quantité de lumière mesurée est inférieure à un seuil prédéterminé. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que ledit réactif adapté à révéler la présence d'ATP et ledit réactif adapté à consommer l'ATP sont à base de luciférine-luciférase 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que ledit réactif adapté à révéler la présence d'ATP et ledit réactif adapté à consommer l'ATP sont identiques. 21 15. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que ladite étape de détection comporte : - l'étape d'enregistrer (90) la quantité de lumière émise par ledit support (19) en fonction du temps entre un instant t, antérieur à un instant to auquel ladite étape de dépôt est réalisée et un instant t2 postérieur audit instant to ; - l'étape d'extrapoler (91), à partir dudit enregistrement, la quantité de lumière en fonction du temps qui aurait été émise par ledit support (19) entre ledit instant t, et ledit instant t2 sans le dépôt dudit réactif ; et -l'étape de déterminer (92) à partir de ladite quantité de lumière enregistrée et de ladite quantité de lumière extrapolée, un ensemble de valeurs représentatif de la quantité de lumière émise en fonction du temps à partir dudit instant to par la seule mise en contact de l'ATP avec ledit réactif. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que ladite étape de détermination dudit ensemble de valeurs comporte l'étape de déterminer la différence (92) entre ladite quantité de lumière enregistrée et ladite quantité de lumière extrapolée. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 ou 16, caractérisé en ce qu'après l'étape de détermination dudit ensemble de valeurs, l'étape de détection comporte en outre : - l'étape d'intégrer (93) ledit ensemble de valeurs en fonction du temps ; et - l'étape de comparer (94) le résultat de cette intégration à une valeur prédéterminée pour en déduire la présence de micro-organismes. 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 ou 16, caractérisé en ce qu'après l'étape de détermination dudit ensemble de valeurs, l'étape de détection comporte en outre : - l'étape de sélectionner la valeur maximale dudit ensemble de valeurs ; - l'étape de comparer le résultat de cette sélection à une valeur prédéterminée pour en déduire la présence de micro-organismes. 19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que ledit support est une membrane microporeuse (19).