FR2894983A1 - Test de caracterisation des anticorps. - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé pour mesurer la capacité d'une préparation d'anticorps à activer un récepteur Fc, ce procédé comprenant les étapes suivantes:a) l'agrégation desdits anticorps entre eux,b) la mise en contact de cellules exprimant un récepteur Fc avec lesdits anticorps agrégés, etc) la mesure de la réaction des cellules résultant de l'activation du récepteur Fc desdites cellules par la région Fc desdits anticorps.

Description

Introduction et art anterieur La presente invention se rapporte a un

procede pour mesurer la capacite d'une preparation d'anticorps a activer un recepteur Fc, ce procede comprenant les &tapes suivantes: a) 1'agregation desdits anticorps entre eux, b) la mise en contact de cellules exprimant un recepteur Fc avec lesdits anticorps agreges, et c) la mesure de la reaction des cellules resultant de 1'activation du recepteur Fc desdites cellules par la region Fc desdits anticorps.

De plus en plus utilises en recherche, les anticorps constituent egalement des outils de choix en diagnostic et en therapeutique, ou ils sont une alternative aux traitements conventionnels.

De nombreuses preparations d'anticorps a usage therapeutique, d'origine plasmatique ou biotechnologique, sont actuellement sur le march&, ou en phase de d&veloppement clinique. Leurs proprietes sont exploitees pour obtenir des outils therapeutiques capables de se her de maniere specifique a leur cible, et de recruter de maniere efficace les cellules de 1'immunit&.

Ces dernieres ann&es, la recherche s'est orient-6e sur 1'am&lioration de 1'efficacite des anticorps, et plus particulierement vers la manipulation de leur region constante Fc. C'est cette derniere qui est responsable des proprietes effectrices >> des anticorps, car elle permet la mobilisation des cellules immunitaires effectrices et des molecules du complement. Cette faculte est rendue possible par la presence, sur certaines cellules immunitaires, de glycoproteines, les recepteurs Fc ou RFc. Ces recepteurs sont capables de se her a la

2 region constante des anticorps, une fois que ces derniers ont fixe, par leur region variable, 1'antigene cible. Au contact des ces cellules, les anticorps declenchent differents mecanismes cellulaires comme la phagocytose et 1'ADCC (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity).

Ainsi se pose la question de savoir comment discriminer les anticorps pour leur efficacite >>, c'est-a-dire sur leur capacite a declencher les mecanismes cellulaires de 1'immunite, due a la liaison de la region Fc des anticorps sur les recepteurs Fc.

Le Demandeur, dans le document FR 02 11416, decrit un procede pour mesurer 1'activite fonctionnelle d'un anticorps. Ce procede consiste en une mise en contact de cellules exprimant le recepteur CD16 dans un milieu reactionnel, en presence de 1'anticorps et de 1'antigene dudit anticorps, et la mesure de la quantite d'au moms une cytokine produite par la cellule exprimant le recepteur CD16, cette mesure traduisant 1'activation de la cellule effectrice du systeme immunitaire par 1'anticorps. Ainsi, ce procede permet d'evaluer 1'activation de cellules effectrices par le complexe antigene-anticorps.

Toutefois, dans ce procede, 1'activation des cellules effectrices est a la fois dependante de 1'affinite de 1'anticorps pour sa cible et de la capacite de la region Fc a se her au recepteur Fc. Ce test ne permet donc pas d'evaluer 1'activation des cellules effectrices due a la seule region Fc de 1'anticorps.

Pour repondre a ce probleme, le document EP 1 298 219 propose un procede permettant de mesurer la fonctionnalite de la region Fc d'un anticorps, sans que cette mesure ne soit influencee par la capacite de -3 liaison de la region Fab de 1'anticorps. Ce procede consiste a immobiliser 1'anticorps a tester, a le mettre en presence de cellules effectrices exprimant des recepteurs Fc, et a mesurer la reaction dans la cellule effectrice resultant de 1'activation de la cellule effectrice par la region Fc de 1'anticorps. Dans ce procede, les anticorps sont immobilises par coating sur une plaque ou sur des billes. Or, le nombre d'anticorps ainsi immobilise n'est pas controlable, car it depend a la fois de la bonne fixation des anticorps sur la plaque, de leur orientation sur la plaque ou les billes, et de la charge electrique de 1'anticorps. En effet, la charge electrique des anticorps depend de leur degre d'amination, qui influe sur leur capacite a s'immobiliser sur des billes ou des plaques. Ainsi, ce parametre induit une variabilite du test en fonction de 1'anticorps a tester, et la fonctionnalite de la region Fc de deux anticorps de sequence et/ou de specificite differentes peut ainsi difficilement etre comparee. De plus, le test est realise au moyen d'une lignee monocytaire humaine (THP-l) qui doit etre activee par de 1'interferon y pour exprimer, en surface, de fawn consequente, le recepteur FcyRIIIa. Cette activation prealable est une source importante de variabilite du test et donc les experiences peuvent difficilement etre comparees entre elles.

Ainsi, les procedes de 1'etat de la technique proposant de discriminer les anticorps pour leur efficacite >>, sont soit peu adaptes a une evaluation de 1'activation des cellules effectrices due a la region Fc de 1'anticorps, soit peu reproductibles, et donc peu standardisables.

C'est pourquoi ii etait dans 1'intention du Demandeur de mettre au point un nouveau procede, permettant de mesurer la capacite d'une preparation d'anticorps a activer un recepteur Fc, qui soit a la fois reproductible, et qui permette d'evaluer specifiquement la capacite de la region Fc d'un anticorps a activer un recepteur Fc, sans que les caracteristiques de la region Fab de 1'anticorps ne viennent interferer dans cette evaluation.

Description detaillee de 1'invention

Ainsi, un premier objet de 1'invention se rapporte a un procede pour mesurer la capacite d'une preparation d'anticorps a activer un recepteur Fc, comprenant les etapes suivantes: a) 1'agregation desdits anticorps entre eux, b) la mise en contact de cellules exprimant un recepteur Fc avec lesdits anticorps agreges, et c) la mesure de la reaction des cellules resultant 20 de 1'activation du recepteur Fc desdites cellules par la region Fc desdits anticorps.

Aux fins de 1'invention, on entend par << agregation des anticorps entre eux 1'association entre eux des 25 anticorps disperses dans la solution les contenant, pour former un reseau exprimant un couplage fort entre les anticorps du reseau. Cette agregation des anticorps a pour fonction d'orienter les anticorps de facon maitrisee et homogene, dans le 30 sens adapte a une presentation adequate de la region Fc de tous les anticorps ou d'une grande majorite d'entre eux vers le recepteur Fc des cellules effectrices exprimant un recepteur Fc. En effet, le Demandeur a constate de maniere surprenante qu'une telle agregation a 35 pour effet le fait que les regions Fc de certains anticorps sont orientees de fawn particuliere et ce quelle que soit la specificite ou la sequence primaire des anticorps etudies. Le procede selon 1'invention a pour avantage de permettre 5 1'etude de la relation dose-reponse entre la quantite d'anticorps mise en Tuvre dans le procede et 1'activation de la cellule effectrice, et d'etre reproductible. De plus, le Demandeur a constate de maniere surprenante qu'un tel procede permet une activation des cellules effectrices via les recepteurs Fc, et ce sans presence d'antigene cible. En effet, les recepteurs Fc sont capables, in vivo, de se her a la region constante des anticorps une fois que ces derniers ont fixe, par leur region variable, 1'antigene cible. L'absence de cellules exprimant en surface 1'antigene cible presente 1'avantage majeur de s'affranchir de la presence de ces cellules, source de variabilite dans les tests biologiques, et donc de diminuer les parametres susceptibles d'induire une variabilite dans la mise en muvre du procede.

Ainsi, la variabilite biologique due a la presence, dans les procedes de fart anterieur, de cellules cibles, ainsi qu'a 1'influence de la specificite et de la sequence primaire de 1'anticorps, est limitee voire nulle dans he procede de 1'invention.

Pour la mise en Tuvre de 1'invention, les anticorps peuvent etre agreges en utilisant tous les moyens connus de 1'homme du metier pour agreger les anticorps, comme la chaleur ou les outils immunologiques, cette liste n'etant pas limitative.

Par ailleurs, le procede selon 1'invention possede 1'avantage d'etre mis en muvre avec des anticorps en solution. Aux fins de 1'invention, on entend par << recepteur Fc tout recepteur de la region Fc des anticorps, present sur -6 les cellules effectrices, comme le CD16 (FcgammaRlll) et le CD32 (FcgammaRll). Aux fins de 1'invention, on entend par << anticorps >> tout anticorps, quelle que soit sa specificite et son isotype, a condition quill comporte une region Fc ou une region possedant les memes fonctions que la region Fc. Ainsi, it peut s'agir d'un anticorps entier ou d'un fragment d'anticorps, par exemple un fragment Fc d'anticorps. De plus, les anticorps mis en oeuvre dans le procede selon 1'invention peuvent titre des IgG (IgGl ou IgG2 ou IgG3 ou IgG4), des IgM, des IgE, des IgA ou des IgD, ou encore un melange d'ente eux. De plus, les anticorps mis en Tuvre dans le procede de 1'invention peuvent titre monoclonaux et/ou polyclonaux. Dans le cas ou it s'agit d'anticorps monoclonaux, ces anticorps peuvent titre chimeriques, humanises, humains ou d'origine animale. Aux fins de 1'invention, on entend par << cellule exprimant un recepteur Fc >> toute cellule exprimant a sa surface un recepteur Fc, cette cellule pouvant exprimer un tel recepteur de maniere naturelle ou suite a une modification genetique. A titre d'exemple on peut citer les cellules NK, les monocytes actives, les granulocytes du sang peripherique, les macrophages, les neutrophiles, les lymphocytes CD8, les lymphocytes T76, les cellules NKT, les eosinophiles, les basophiles ou les mastocytes, cette liste n'etant pas limitative. Avantageusement, ces cellules sont capables de reagir lorsque la region Fc d'un anticorps se lie au recepteur Fc exprime a leur surface.

Aux fins de 1'invention, on entend par << reaction des cellules exprimant un recepteur Fc>> toute reaction cellulaire mesurable due a 1'interaction entre le recepteur Fc de ces cellules et la region Fc des anticorps. Cette reaction peut titre intracellulaire ou extracellulaire. On peut citer a titre d'exemple la -7 mesure d'une ou de plusieurs cytokines, la mesure du niveau de calcium intracellulaire, de la perforine, du granzyme ou du monoxyde d'azote, cette liste n'etant pas limitative.

De maniere avantageuse, 1'agregation est effectuee au moyen d'un fragment F(ab')2 anti-IgG. Ce moyen permet une agregation particulierement avantageuse en terme de maitrise de 1'orientation des regions Fc des anticorps.

En effet, chaque fragment F(ab')2 se lie a deux anticorps differents a tester, orientant ainsi les regions Fc des anticorps a tester de maniere adequate. Cette orientation est particulierement adaptee a 1'interaction avec les recepteurs Fc des cellules effectrices, et donc a 1'activation des cellules effectrices. Les fragments F(ab')2 anti-IgG susceptibles d'etre utilises dans ce mode de realisation peuvent etre diriges contre tout fragment, partie ou domaine des anticorps, par exemple la region Fc ou la region Fab ou la totalite de la molecule d'IgG. Les fragments F(Ab')2 peuvent aussi etre d'origine monoclonale ou polyclonale. Dans ce mode de realisation de 1'invention, on peut maitriser de maniere precise la concentration en anticorps a tester et la concentration en F(ab')2. Il est ainsi possible de calculer le rapport entre les deux ce qui permet de realiser des tests reproductibles et ceci quelle que soit la preparation d'anticorps a tester.

De maniere particulierement avantageuse, ce fragment F(ab')2 anti-IgG est un anti-Fab ou un anti-F(ab')2 dirige contre la preparation d'anticorps testee. Ce fragment peut etre un fragment de chevre ou de lapin. Dans ce mode de realisation particulier, chaque fragment F(ab')2 se lie aux parties Fab de deux molecules d'anticorps a tester, orientant ainsi les regions Fc des -8 anticorps a tester de maniere appropriee pour qu'ils puissent se her au RFc et activer les cellules exprimant ces RFc en surface.

Selon un autre mode de realisation, 1'agregation est une agregation par la chaleur. Les anticorps sont d'abord chauffes de maniere a ce qu'ils s'agregent entre eux (etape a) du procede de 1'invention), puis mis en contact avec les cellules exprimant un recepteur Fc (etape b)).

Toute methode de chauffage adaptee a 1'agregation des anticorps entre eux peut titre utilisee dans la mise en muvre du procede de 1'invention. On peut citer a titre d'exemple un chauffage a 60 C pendant 30 min des anticorps [1].

Selon un autre mode de realisation de 1'invention, 1'agregation est effectuee par cross-linking des regions Fab entre elles ou des chaines lourdes et legeres entre elles. Aux fins de 1'invention, on entend par << cross- linking >> tout pontage entre deux molecules d'anticorps, de maniere a orienter la region Fc de ces anticorps de facon homogene vers les recepteurs CD16 des cellules effectrices. De maniere avantageuse, un anticorps peut titre implique dans un ou plusieurs pontages. Ainsi, les anticorps sont susceptibles de former un reseau, dont 1'orientation est adequate pour her de maniere optimisee les recepteurs CD16 portes par les cellules effectrices. De maniere avantageuse, tout moyen permettant de cross-linker (c'est-a-dire de ponter) les anticorps entre eux est adapte a la realisation de 1'invention. On peut citer a titre d'exemple 1'etablissement de liaisons chimiques, ou un pontage par radiation au moyen d' W, cette liste n'etant pas limitative. -9 De maniere avantageuse, le recepteur Fc exprime par les cellules effectrices est selectionne parmi le CD16 (FcyRIIIa et FcyRIIIb), le CD32 (FcyRIIa et FcyRIIb), et le CD64. De maniere particulierement avantageuse, on choisit le CD16.

Dans un mode de realisation prefere, les cellules exprimant le recepteur Fc sont des cellules transfectees avec le gene codant pour ledit recepteur. Dans ce mode de realisation, it est possible de controler le ou les allotypes des recepteurs presentes par les cellules effectrices. En effet, it est possible de realiser le procede de 1'invention avec des cellules presentant uniquement un recepteur choisi en fonction de ses proprietes, ou bien une combinaison de ces recepteurs, en fonction du test souhaite. Par exemple, it est possible de mettre en muvre 1'invention en choisissant d'utiliser des cellules effectrices exprimant uniquement le CD16, en transfectant des cellules avec le gene codant pour le CD16. Ainsi, it est possible de s'affranchir d'un autre facteur de variabilite, a savoir la nature et la quantite de recepteur (s) Fc present (s) a la surface des cellules effectrices.

Dans un mode de realisation prefere de 1'invention, les cellules exprimant le recepteur Fc sont des cellules Jurkat exprimant le CD16, cette lignee etant cultivee en presence d'un activateur aspecifique de ces cellules comme le PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate). L'un des interets particulierement avantageux daps la mise en oeuvre du procede selon 1'invention avec cette lignee cellulaire tient au fait que cette lignee n'a pas besoin d'etre activee prealablement a la mise en contact des cellules effectrices avec les anticorps agreges. En effet, certaines lignees effectrices ont besoin d'etre

-10- activees au moyen d'une ou plusieurs cytokine(s) pour exprimer de facon suffisamment significative des recepteurs Fc (voir par exemple le document EP 1 298 219). Cette activation prealable avec des cytokines est souvent aleatoire, et a pour consequence a la fois une perte de temps, et une difficulte peu surmontable dans la standardisation des experimentations. De plus, la lignee Jurkat transfectee avec un vecteur d'expression codant pour le recepteur CD16 (<< lignee Jurkat CD16 >>) presente 1'avantage d'etre immortalisee et donc de se multiplier indefiniment dans les milieux de cultures. Ces cellules presentent 1'interet d'etre activables lorsqu'elles sont doublement stimulees. Dans le procede de 1'invention, 1'activation des cellules Jurkat CD16 se fait par le PMA (qui est un activateur aspecifique des cellules T) et la liaison du CD16 avec la region Fc d'un anticorps. L'activation des cellules Jurkat se traduit par une liberation d'IL-2 dans le surnageant de culture. Par consequent, plus la region Fc d'un anticorps est fonctionnelle vis-a-vis du CD16, et plus la quantite d'IL-2 liberee dans le surnageant sera elevee.

De maniere avantageuse, la mesure de la reaction des cellules resultant de 1'activation des recepteurs Fc desdites cellules par les regions Fc desdits anticorps est une mesure de la quantite d'au moins une cytokine produite par les cellules exprimant des recepteurs CD16. En effet, 1'activation des cellules effectrices se traduit, entre autres, par une liberation d'IL-2 dans le surnageant de culture. Par exemple, la concentration de cytokines dans le milieu de culture peut etre mesuree grace a un test ELISA disponible dans le commerce (bioassay). D'autres methodes peuvent permettre d'apprecier la synthese d'une cytokine telle que 1'IL-2 : ce sont les techniques de RT-PCT quantitative et de -11-Northern blot pour le dosage des ARN messagers de 1'IL-2 ou le Western blot et la cytometrie pour la quantification de 1'IL-2 intracellulaire et dans le surnageant de culture, cette liste n'etant pas limitative.

Dans un mode de realisation de 1'invention, la mesure de la quantite d'au moins une cytokine est realisee en effectuant un dosage des ARNm de ces cytokines, la quantite de ces ARNm etant correlee au niveau d'expression des cytokines correspondantes, ce qui traduit le niveau d'activation des cellules effectrices.

De maniere avantageuse, on quantifie au moins une cytokine selectionnee parmi IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, MCP-1, TNFalpha (TNFo) et IFNgamma (IFNy), cette liste n'etant pas limitative.

De maniere particulierement avantageuse, la mesure de la 20 reaction de la cellule est la quantification de 1'interleukine IL-2.

Le taux d'interleurkine IL-2 secretee est correle a une activite du type ADCC. En effet, it existe une forte 25 correlation entre la secretion de cytokines par les cellules effectrices et 1'activite ADCC mediee par le CD16 des cellules effectrices (Document FR 02 11416). Ainsi, le procede de 1'invention est particulierement avantageux pour selectionner des anticorps cytotoxiques, 30 notamment pour un usage therapeutique.

Dans un autre mode de realisation de 1'invention, la mesure de la reaction de la cellule est une mesure de 1'influx calcique, de la phosphorylation, des facteurs de 35 transcription ou de 1'apoptose. L'augmentation de ces

-12- parametres est correlee a une activation des cellules effectrices, ce qui montre la capacite des anticorps a activer les recepteurs Fc des cellules effectrices.

De maniere avantageuse, le procede est adapt& pour evaluer la capacite d'une cellule a produire un anticorps monoclonal capable d'interagir avec le recepteur CD16, c'est-a-dire a evaluer la cytotoxicite d'un anticorps ou d'une preparation d'anticorps. Dans la litterature, it a et& demontre que 1'affinite d'un anticorps pour le CD16 est dependante des caracteristiques du recepteur Fc comme par exemple du polymorphisme du CD16 [2, 3], mais aussi de la region Fc, ou le taux de fucose de 1'oligosaccharide present sur 1'asparagine en position 297 des chaines lourdes des immunoglobulines joue un role dans la liaison avec les recepteurs Fc [4, 5].

La lignee cellulaire produisant des anticorps peut etre toute lignee capable de se diviser, mais est plus particulierement choisie parmi les lignees cellulaires CHO, YB2/0, SP2/0, SP2/0-AG14, IR983F, le myelome humain Namalwa, PERC6, les lignees CHO, notamment CHO-K-1, CHOLeclO, CHO-Leci, CHO-Lecl3, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653, cette liste n'etant pas limitative.

De maniere avantageuse, le procede est adapte pour evaluer 1'efficacite et 1'integrite de la region Fc de preparations d'anticorps obtenues apres une ou plusieurs &tapes de purification. Une autre application du procede de l'invention est le suivi de la stabilite d'une preparation d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux, notamment therapeutique, place en condition d&naturante.

-13- Le procede de 1'invention est donc particulierement utile dans le suivi au cours du temps de preparations a usage therapeutique. En effet, le Demandeur a suivi sur plusieurs mois 1'activite d'une preparation d'anticorps conservee en conditions denaturantes et a montre que celle-ci decroit. Ainsi, une preparation therapeutique perd de son activite au cours du temps lorsqu'elle est conservee a temperature elevee, par exemple a 40 C. Par ailleurs, le procede de 1'invention permet de discriminer quelle est la partie de 1'anticorps impliquee dans cette perte d'activite, contrairement aux tests faisant intervenir les cellules portant les antigenes cible. On voit quill s'agit de la region Fc de 1'anticorps qui, une fois denaturee, perd de son affinite pour le CD16 (cf exemple 4).

Par ailleurs, le procede est, de maniere avantageuse, adapte pour mesurer la fonctionnalite de la region Fc d'un anticorps. Par << fonctionnalite de la region Fc d'un anticorps>, on entend aux fins de 1'invention la capacite de cette region Fc a activer les cellules effectrices par 1'intermediaire de sa liaison au recepteur Fc, notamment au recepteur CD16. Le procede de 1'invention etant hautement reproductible (cf exemple 2, paragraphe 5), it peut etre utilise en routine pour analyser la fonctionnalite des preparations d'anticorps, car 1'efficacite de la mesure est la meme pour des anticorps de sequence et/ou de specificite differente(s), ainsi que pour le criblage d'anticorps hautement cytotoxiques.

De maniere avantageuse, le procede est adapte pour evaluer la production d'anticorps monoclonaux par des plantes transgeniques ou des mammiferes transgeniques. Les anticorps ainsi produits pourront etre, grace a la mise en cuvre du procede selon 1'invention, caracterises -14- quant a la capacite de leur region Fc a activer un recepteur Fc.

De maniere avantageuse, le procede est adapte pour selectionner des anticorps efficaces pour un traitement therapeutique. A titre d'exemple, on selectionne les anticorps pour lesquels une augmentation superieure a 100%, ou 250%, avantageusement 500% ou de preference 1000% du taux de liberation de cytokine, par exemple d'IL-2, est observee par rapport au controle en absence d'anticorps ou par rapport a un anticorps donne comme reference negative.

De maniere avantageuse, le procede est adapte pour selectionner des compositions d'anticorps dont la teneur en fucose est inferieure a 65%, et de maniere preferentielle inferieure a 40%. En effet, it a ete demontre que 1'activite des preparations d'anticorps etait dependante de la teneur en fucose sur le motif glycannique en position 297 de la chaine lourde. Les anticorps sont constitues de chaines lourdes et de chaines legeres, liees entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaine est constituee, en position N-terminale, d'une region (ou domaine) variable specifique de 1'antigene contre lequel 1'anticorps est dirige, et en position C-terminale, d'une region constante, constituee d'un seul domaine CL pour les chaines legeres et de plusieurs domaines (CH1, CH2 et CH3) pour les chaines lourdes. L'association des domaines variables et des domaines CHI et CL des chaines lourdes et legeres forme les parties Fab de 1'anticorps, qui sont connectees a la region Fc par une region charniere tres flexible, permettant a chaque Fab de se fixer a 1'antigene cible. La region Fc, mediatrice des proprietes effectrices de 1'anticorps, reste accessible aux molecules effectrices

-15- telles que les recepteurs FcyR (FcgammaR). La region Fc, constituee de 2 domaines globulaires CH2 et CH3r est glycosylee au niveau du domaine CH2 avec la presence, sur chacune des 2 chaines, d'un N-glycanne biantenne, lie a 1'asparagine 297 (Asn 297). Un tel N-glycanne se presente sous la forme generale suivante (forme presentee << GO >>, a laquelle d'autres sucres peuvent s'ajouter): G1cNAc Mannose

Ainsi, dans la composition d'anticorps selon 1'invention, on entend par << fucose >> le fucose porte par ces N- 20 oligosaccharides. La molecule de fucose, lorsqu'elle est presente, est nee a la N-acetylglucosamine (G1cNAc) du N-oligosaccharide, cette G1cNAc etant elle-meme liee a 1'Asn 297. Chacun des 2 N-glycannes porte par chacune des 2 chaines 25 lourdes de chaque anticorps, peut porter une molecule de fucose ou ne pas en porter. Ainsi, chaque anticorps peut comporter 0, 1 ou 2 molecules de fucose, selon respectivement qu'aucun de ses N-glycannes ne porte de fucose, qu'un seul de ses N-glycannes porte une molecule 30 de fucose, ou que ses 2 N-glycannes portent chacun une molecule de fucose. Ainsi, on entend par << composition d'anticorps dont la teneur en fucose est inferieure a 65% >> une composition d'anticorps, dont, parmi la totalite des structures 35 glycanniques portees par chaque site de glycosylation E- liaison a 1'Asn297 2894983 - 16 - (Asn 297) des anticorps de la composition, moins de 65% comportent une molecule de fucose. 11 a ete demontre par le Demandeur que de telles compositions presentent une activite ADCC 5 particulierement avantageuse. Preferentiellement, on selectionne des compositions d'anticorps dont la teneur en fucose est comprise entre 20% et 45%, ou entre 25% et 40%. Grace au procede de 1'invention, it a ete montre une 10 relation quantitative entre 1'activite fonctionnelle et le taux de fucose dans le sens d'une augmentation de 1'activite fonctionnelle des anticorps vis-a-vis du CD16 lorsque le taux de fucose diminue dans la composition (preparation) d'anticorps. 15 Un autre objet de 1'invention se rapporte a un procede de preparation d'une composition d'anticorps monoclonaux comprenant les etapes suivantes : a) obtention d'anticorps a partir d'un hybridome, d'un heterohybridome, ou de toute lignee cellulaire animale, vegetale ou humaine transfectee a 1'aide d'un ou plusieurs vecteurs de maniere a exprimer ledit anticorps, b) agregation des anticorps obtenus a 1'etape a) par un fragment F(ab')2 anti-IgG, c) addition des anticorps obtenus a 1'etape b) dans un melange reactionnel comprenant : - des cellules effectrices comprenant des cellules exprimant le CD16, - du Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) d) mesure de la quantite d'au moins une cytokine produite par la cellule exprimant le CD16, e) selection de la ou des compositions d'anticorps pour lesquelles on mesure une augmentation superieure a 35 0, 5, 1, 2, 5, 10, 100 ou a 500 fois de la quantite -17de cytokine mesuree par rapport au controle en absence d'anticorps ou en presence d'un anticorps donne comme reference negative. De maniere avantageuse, les cellules effectrices 5 comprenant des cellules exprimant le CD16 sont des cellules Jurkat CD16. Dans un mode de realisation de 1'invention, la mesure de la quantite d'au moins une cytokine est realisee en effectuant un dosage des ARNm de ces cytokines, la 10 quantite de ces ARNm etant correlee au niveau d'expression des cytokines correspondantes, ce qui traduit le niveau d'activation des cellules effectrices. Par exemple, on quantifie au moins une cytokine selectionnee parmi IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, 15 MCP-1, TNFalpha (TNFu) et IFNgamma (IFNy), cette liste n'etant pas limitative. De maniere avantageuse, la mesure de la reaction de la cellule est la quantification de 1'interleukine IL-2. Le taux d'interleurkines, par exemple d'IL-2, secretees 20 est correlee a une activite du type ADCC. En effet, it existe une forte correlation entre la secretion de cytokines par les cellules effectrices et 1'activite ADCC mediee par le CD16 des cellules effectrices (Document FR 02 11416). 25 Dans un autre mode de realisation de 1'invention, la mesure de la reaction de la cellule est une mesure de 1'influx calcique, de la phosphorylation, des facteurs de transcription ou de 1'apoptose. L'augmentation de ces parametres est correlee a une activation des cellules 30 effectrices, ce qui montre la capacite des anticorps a activer les recepteurs Fc des cellules effectrices.

De maniere avantageuse, la mesure de la quantite d'au moins une cytokine produite par la cellule exprimant le -18- CD16 est une mesure de laquantite d'IL-2 produite par la cellule exprimant le CD16.

Un autre objet de 1'invention se rapporte a un kit pour la mise en oeuvre d'un test biologique de mesure de 1'activite d'anticorps therapeutiques comprenant les elements necessaires a la mise en muvre de l'un des procedes precedemment decrits.

D'autres aspects et avantages de 1'invention seront decrits dans les exemples qui suivent, qui doivent etre consideres comme illustratifs et ne limitent pas 1'etendue de 1'invention.

Description des figures Figure 1 : (A) Courbe de calibration definie par la mesure des intensites moyennes de fluorescence des 5 populations de billes, (B) Profil d'expression du CD16 de la population JCD16+ Val obtenu par analyse au FACS d'un marquage anti-CD16. Figure 2 : courbes de dose-reponse a un anticorps anti-D (lot CO29-025) agrege. Courbe specifique des cellules JCD16+ Phe. Le trait rouge vertical delimite la gamme de concentrations (0,625 a 10 g/ml) utilisee pour la suite des tests.

Figure 3 : cinetique de secretion en IL-2 pour les cellules JCD16+ Phe.

- 19 - Figure 4 : Influence du taux de fucose des anticorps sur leur activite. (A) test d'activite des anticorps anti-Gp120 VIH (100% de fucose), AD1 (100% de fucose), T125 CHO (81% de fucose), R270 ( 64% de fucose), R297 (40% de fucose) et R297 (25% de fucose) dans le test en presence de cellules cibles, (B) test d'activite des anticorps anti-Gp120 VIH (100% de fucose), AD1 (100% de fucose), T125 CHO (81% de fucose), R270 ( 64% de fucose), R297 (40% de fucose), CO29-025 (33% de fucose) et R297 {25% de fucose) dans le test sans cellules cibles. Figure 5 : Suivi de la stabilite du lot 05-081 a 40 C par mesure de son activite tous les moil. Exemples 1. Culture cellulaire 1.1 Lignees cellulaires 20 La lignee Jurkat, clone E6-1 (n ATCC TIB-152), a ete deposee a 1'ATCC par A. Weiss [6] en 1984. Le clone E6-1 a ete obtenu a partir de la lignee Jurkat dite sauvage >>. Celle-ci fut isolee en 1977 par Schneider et al. [7] a partir du sang peripherique d'un enfant age de 25 14 ans presentant une leucemie aigue lymphoblastique. Cette lignee, exprimant les marqueurs de cellules T, est capable de produire de 1'interleukine 2 (IL-2) lorsqu'elle est stimulee par deux signaux d'activation distincts. Toutefois, le taux d'IL-2 secrete varie selon 30 1'origine de la lignee et les conditions de manipulation. C'est pourquoi des clones Jurkat de differentes origines ont ete transfectes afin qu'ils expriment au niveau de15 -20- leur membrane le recepteur FcyRIIIa. Une lignee a ete obtenue par transfection par un vecteur d'expression codant pour un RFc^IIIa humain chimerique (domaine extracellulaire du CD16 associe aux domaines transmembranaire et intracellulaire de la chaine y) et le gene de selection de la neomycine. On nommera ces cellules JCD16+ Phe car elles expriment le CD16 humain presentant une phenylalanine en position 158. 1.2 Milieux de culture et repiquage Les cellules JCD16+ Phe sont maintenues en milieu IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium) + 4mM de LGlutamine + 25 mM de tampon HEPES (Gibco, Invitrogen) additionne de 10o SVF (Serum de Veau Foetal) irradie aux rayons y et decomplemente (Invitrogen), et d'un analogue de la neomycine (G418 sulfate) a 0,5 mg/ml (Promega). Cette lignee cellulaire est maintenue en culture a raison de deux repiquages par semaine avec un taux d'ensemencement de 0,2.106 cellules/ml. 2. Cytometrie en flux Les differents marquages sont analyses sur un cytometre EPICS XL (Beckman Coulter) 2.1 Phenotypage de la lignee cellulaire JCD16+ Phe Ce phenotypage porte sur 1'analyse de differents marqueurs membranaires qui sont le CD45 (marqueur des cellules leucocytaires), le CD19 (marqueur specifique des lymphocytes B), les CD2, CD3, CD4 et CD8 (marqueurs specifiques des lymphocytes T), le CD58 (ligand du CD2), mais aussi les differentes chaines du recepteur a 1'IL-2 (le CD25 ou IL-2 Ra, le CD122 ou IL-2 R,6 et le CD132 ou - 21 - IL-2 Ry). Les marquages sont realises sur 106 cellules dans 100 l de PBS (tampon phosphate) 1X. Les conditions sont les suivantes : > 10 l d'anti-CD2 FITC (2-fluorescein isothio- cyanate, Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 Al d'anti-CD3 RDl (R-phycoerythrin, Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 l d'anti-CD19 ECD (R-phycoerythrin/Texas Red tandem dye, Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 l d'anti-CD16 PC5 (R-phycoerythrin/cyanine 5 tandem dye, IOTest, Beckman Coulter). > 10 Al d'anti-CD45 FITC (Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 Al d'anti-CD3 RD1 (Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 Al d'anti-CD4 ECD (Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 Al d'anti-CD8 PC5 (Coulter Clone, Beckman Coulter). > 10 Al d'anti-CD58 PC5 (IOTest, Coulter Clone). > 5 l d'anti-CD122 FITC (Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 Al d'anti-CD132 PE (Phycoerythrin, BD Pharmigen) + 10 Al d'anti-CD25 PC5 (IOTest, Coulter Clone). En parallele de ces quatre marquages des controles isotypiques sont realises et correspondent respectivement a . > 10 l IgGl-FITC (Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 l IgGl-RDl (Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 Al IgG2b-ECD (Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 Al IgGl-PC5 (IOTest, Beckman Coulter). - 10 Al IgGl-FITC (Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 Al IgGl-RD1 (Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 l IgGl-CD4 ECD (Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 Al IgGl-PC5 (Coulter Clone, Beckman Coulter). - 10 Al IgG2a-PC5 (IOTest, Coulter Clone). -22-> 5 Al IgG1-FITC (Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 Al IgG1-PE (BD Pharmigen) + 10 pl IgG2a-PC5 (IOTest, Coulter Clone). Les cellules sont incubees en presence des differents anticorps monoclonaux pendant 30 minutes au noir, a temperature ambiante. Apres un lavage des cellules en PBS 1X et une centrifugation a 1200 rpm pendant 5 minutes, les marquages sont directement analyses au cytometre. 2.2 Determination du nombre de sites CD16 Le nombre de recepteurs RFc-yIIIa exprimes a la surface de cellules est evalue selon la technique QIFIKIT (Dako Cytomation). Cette technique requiert au prealable de determiner la dose saturante d'anticorps anti-CD16 (clone 3G8, IgGl anti-CD16 conjugue avec la fluoresceine, Immunotech) necessaire pour occuper tous les sites antigeniques a la surface des cellules. Les cellules (O,25.106/100 1 serum physiologique) sont incubees avec des doses croissantes d'anti-CD16 3G8 pendant 30 minutes a temperature ambiante. Apres un lavage en serum physiologique suivi d'une centrifugation a 1200 rpm pendant 5 minutes, les cellules sont alors incubees avec 50 Al de F(ab')2 anti-IgG de souris (H+L) marque PE dilue au 1/20eT1e (Beckman Coulter) pendant 30 minutes au noir. A la fin de 1'incubation, les cellules sont lavees et directement analysees par FACS (fluorescence-activated cell sorting). La determination du nombre de sites CD16 est realisee sur 2,5.105 cellules selon le protocole fourni Bans le kit (n K0078). Les cellules sont incubees avec 500 ng d'anticorps d'interet pendant 30 minutes a temperature ambiante. Apres un lavage et une centrifugation (5 minutes a 1200 rpm), les cellules sont incubees avec -23- 1041 de F(ab')2 anti-IgG de souris couple FITC dilue au 1/50e'e (Qifikit), pendant 30 minutes, a temperature ambiante et au noir. Les cellules sont ensuite lavees et analysees directement au FACS. 3. Test de production d'IL-2 par les cellules Jurkat 3.1 Test en presence d'hematies portant 1'antigene specifique 3.1.1 Preparation des echantillons a tester Des echantillons d'anticorps anti-D sont testes selon une gamme de concentrations definie en huit points qui sont : 3,125 ng/ml, 6,25 ng/ml, 9,4 ng/ml, 12,5 ng/ml, 18,75 ng/ml, 25 ng/ml, 37,5 ng/ml et 50 ng/ml. Chaque concentration est obtenue par dilution de 1'echantillon en IMDM + 5% SVF decomplemente. 3.1.2 Preparation des cellules cibles Les cellules cibles sont des hematies Rhesus D+ issues de donneurs preferentiellement 0+. Elles sont traitees a la papaine (Bio-Rad). Celle-ci est ajoutee volume a volume au culot globulaire et laissee incuber pendant 10 minutes a 37 C. La reaction est stoppee par 1'addition d'un grand volume de serum physiologique (NaCl 0,9%, Ecotainer, B BRAUN). Les cellules sont alors lavees trois fois en NaCl 0,9% et centrifugees a 3000 tr/min pendant 5 minutes pour les deux premiers lavages et 10 minutes pour le lavage final. Le culot globulaire est ensuite dilue en IMDM + 5% SVF afin d'obtenir une suspension cellulaire a la concentration de 8.106 cellules/ml (0,08%).

-24- 3.1.3 Preparation de la solution de PMA Une solution de PMA (10 g/ml, Sigma) a une concentration de 40 ng/ml est preparee par dilution au 1/250eme en IMDM + 5% SVF. 3.1.4 Preparation des cellules effectrices Les cellules Jurkat, repiquees entre 48 et 72 heures avant le test, sont denombrees sur lame de Malassez afin de definir le volume de suspension cellulaire a prelever pour disposer de 10' cellules (quantite necessaire pour une micro-plaque). Le volume de suspension cellulaire est centrifuge pendant 10 minutes a 1200 rpm. Le culot cellulaire obtenu est alors re-suspendu en IMDM + 5% SVF a la concentration de 2.106 cellules/ml. Une nouvelle numeration est effectuee afin de s'assurer de la concentration de la suspension et si besoin celle-ci est ajustee precisement par addition d'IMDM + 5% SVF. 3.1.5 Realisation du test En plaque de 96 puits a fond en U, it est depose pour chaque puits : - 50 Al d'anticorps anti-D a tester, - 50 l de la suspension globulaire (soit 4.105 hematies pour 50 l), Al de la suspension cellulaire (soit 105 cellules pour 50 l), - 5012l de PMA (soit 2ng pour 5O 1). Pour chaque plaque, une solution d'anti-D de reference est deposee ainsi qu'un echantillon temoin correspondant a un anticorps polyclonal anti-D (Rhophylac 300 TM, Biotest). Les puits sont homogeneises par agitation. La plaque est incubee pendant une nuit a 37 C. Le lendemain,

-25- les cellules sont decantees par centrifugation pendant 1 minute a 125g. Le surnageant est preleve et la concentration en IL-2 est determinee par dosage ELISA. 3.2 Test en absence de cible antigenique Les anticorps etudies sont testes comme precedemment selon une gamme de huit concentrations definies au chapitre 3.1.1. Dans ce test, les hematies sont substituees par un F(ab')2 anti-IgG fragment specifique (1,3 mg/ml, Jackson Immuno-Research Laboratories). Celui- ci est egalement dilue en IMDM + 5% SVF a huit concentrations differentes. Les anticorps anti-D et les F(ab')2 anti-IgG sont etudies selon un rapport 1/1,5. La solution de PMA est preparee a une concentration de 10 ng/ml. Les cellules Jurkat sont diluees en IMDM + 5% SVF a une concentration definie au chapitre 2.1.4. En plaque 96 puits a fond en U, it est depose pour chaque puits : - 50 l d'anticorps anti-D a tester, - 50 l de F(ab')2 anti-IgG fragment specifique, 20 - 50 l de suspension cellulaire, - 50 l de PMA (soit 0, 5ng pour 50 l). Les puits sont homogeneises par agitation. La plaque est incubee pendant une nuit a 37 C. Le lendemain, les cellules sont decantees par centrifugation pendant 1 25 minute a 125g. Le surnageant est preleve et la concentration en IL-2 est determinee par dosage ELISA. 3.3 Dosage de 1'IL-2 du surnageant cellulaire par technique ELISA La quantite d'IL-2 secretee est dosee selon le mode 30 operatoire du kit Duoset human IL-2 (DY202, R&D systems). Un anticorps de capture est distribue dans chaque puits d'une micro-plaque. Apres saturation au

-26- moyen d'une solution d'albumine bovine, les surnageants a doser sont deposes a differentes dilutions, ainsi qu'une gamme etalon d'IL-2. Un anticorps anti-IL-2 humaine biotinyle est ensuite ajoute suivi d'une solution de streptavidine peroxydase HRP. Apres addition du substrat (Tetramethylbenzidine), une coloration bleue se developpe. Apres avoir stoppe la reaction avec de 1'acide sulfurique (H2SO4), la densite optique de chaque puits est determinee par lecture de la plaque a 450 nm. La concentration en IL-2 pour chaque puits est calculee grace au logiciel biolise qui determine la courbe de regression de la gamme IL-2 ([IL-2]= a[anticorps]2 + b[anticorps] + c) et qui prend en compte le facteur de dilution de 1'echantillon dans chaque puits. 3.4 Interpretation des resultats Les concentrations d'IL-2 determinees par dosage ELISA permettent de determiner 1'activite de chaque anticorps anti-D teste. Celle-ci se calcule de la facon suivante : A partir d'un anticorps de reference, une courbe d'equation du second degre est etablie en reportant les concentrations en IL-2 mesurees en fonction de la gamme de concentration de 1'anticorps. Pour chaque concentration d'echantillon depose, it est calcule la concentration equivalente en anti-D de reference au moyen de 1'equation du second degre de la courbe. Chacune des valeurs equivalentes en anti-D est ramenee a la concentration theorique de 50ng/ml pour le test avec cellules cibles ou 10 g/ml pour le test sans cellules cibles en tenant compte de la dilution de 1'anticorps etudie. La moyenne des valeurs pour chaque echantillon est alors calculee. Pour determiner le pourcentage d'activite de 1'echantillon, on attribue de facon

- 27 - arbitraire une activite de 100% a la reference. I1 suffit alors de calculer le rapport suivant : moyenne des concentrations recalculees de 1'echantillon / moyenne des concentrations recalculees de la reference Ainsi, si le pourcentage d'activite est inferieur a 100 pour un anti-D inconnu, cela signifie que 1'activite de cet anticorps est inferieure a celle de 1'anticorps de reference. En revanche, si le pourcentage d'activite est superieur a 100, cela signifie que 1'anti-D etudie a une activite superieure a la reference. Exemple 1

1. Caracterisation des lignees cellulaires 1.1 Genotypage des lignees Prealablement a la mice au point de ce test, le genotypage de chaque lignee a ete realise par discrimination allelique par Q-PCR (Applied 7300). Le genotypage a ete verifie par RT-PCR. ADN ARN Jurkat CD16- T/G ND Jurkat CD16+ Phe ND T soft Phe Analyse du genotype des lignees par Q-PCR (ADN) et RT-PCR (ARN). La lignee Jurkat CD16- n'exprime pas a la surface de sa membrane le recepteur RFcyIII. La lignee Jurkat CD16+ dite Phe exprime bien le genotype T (Phe) 5 -28- 1.2 Phenotypage des lignees L'analyse des marqueurs membranaires par marquage FACS a permis d'obtenir les resultats suivants : Jurkat CD16+ Phe CD45 (B220) ++ CD19 Pan B (B4) CD2 Pan T ++ (LFA3-R) CD3 Pan T ++ CD4 ++ CD8 - CD 16 ++ FcyRIII CD58 + (LFA3) CD25 (IL-2 Ru ) CD122 (IL-2 R,6) CD132 (IL-2 + Ry) Analyse par cytometrie des marqueurs membranaires des deux lignees Jurkat transfectees. La lignee presente donc le phenotype suivant CD45+, CD2+, CD3+, CD4+, CD16+, CD58+ et CD132+. - 29 - 1.3 Determination du nombre de sites CD16 Cette experience a pour but de quantifier le nombre de sites antigeniques CD16 par un marquage indirect analyse en cytometrie. La technique est basee sur 1'utilisation de cinq populations de billes de 10 m de diametre recouvertes d'anticorps monoclonaux (anti-CD5 humain de souris) en quantites croissantes definies (103 a 106 Antibody-Binding Capacity ou ABC). Ces differentes populations permettent la construction d'une droite de calibration correspondant a la moyenne des intensites de fluorescence (MFI) versus la capacite de fixation des anticorps {ABC). Les cellules sont saturees avec 1'anticorps primaire d'interet (anti-CD16) qui est revele par un anticorps secondaire marque, egalement introduit en condition saturante. En respectant ces conditions, le nombre d'anticorps primaire fixe correspond au nombre de sites antigeniques presents a la surface des cellules. Par consequent, la fluorescence est correlee au nombre d'anticorps primaires fixes sur les cellules. L'ABC des cellules est determinee grace a la droite de calibration. Le tableau ci-dessous est le tableau recapitulatif de la determination du nombre de sites CD16 pour la lignee etudiee (etude realisee sur plusieurs repiquages) . Jurkat ~~~ P12~ ~~~~ ~ P13~~~ P16 ---- P23 P23 CD16+ Phe (0,5 mg/ml (0,5 mg/ml (0,5 mg/ml (0,5 mg/ml (1 mg/ml G418) G418) G418) G418) G416) Total 54000 68000 68000 89000 121000 10% inf 16000 19000 19000 27000 36000 10% sup 121000 _ 160000 163000 187000 25000025 -30- Apres decongelation d'une ampoule provenant d'une banque, chaque lignee est suivie sur plusieurs repiquages en milieu selectif afin de verifier le maintien de 1'expression du CD16.

Ainsi, it a pu etre constate qu'apres plusieurs passages, 1'expression du CD16 est maintenue et ne varie que tres faiblement dans des conditions de culture identiques d'un repiquage a 1'autre. Par ailleurs, la pression de selection et les resultats tendent a montrer qu'une selection des clones a fort potentiel d'expression s'opere. De plus, cette technique permet d'analyser precisement 1'heterogeneite de 1'expression du CD16 a la surface des cellules par la determination du nombre de sites pour les populations extremes (les 10% inferieurs et les 10% superieurs). Exemple 2 : Test d'activation du CD16 1 Specificite du test La specificite du test a ete verifiee de la maniere suivante : plusieurs temoins sont introduits dans le test de secretion d'IL-2 par les cellules Jurkat afin de confirmer le mecanisme d'activation des cellules. Un seuil limite de detection de 15 pg/ml est defini par le dernier point de la gamme etalon IL-2 fournie dans le kit de dosage. En dessous de ce seuil, la secretion d'IL-2 par les cellules est consideree comme non detectable. Le tableau ci-dessous est le tableau recapitulatif des taux moyens d'IL-2 sur n experiences et les ecart-types de chaque temoin introduit dans le test de production d'IL- 2. (< SL = inferieur au seuil limite de 15pg/ml) -31- Cellules JCD16+ Phe Cellules Nb n = 8 d'experiences seules Moyenne < SL F(ab')2 + Nb n = 8 d'experiences PMA Moyenne 52 Ecart-type 48 Anti-D + PMA Nb n = 9 d'experiences Moyenne 277 Ecart-type 124 Anti-D + Nb n = 8 d'experiences F(ab')2 Moyenne < SL Ecart-type Anti-D + Nb n = 9 d'experiences F(ab')2 + Moyenne 1347 PMA Ecart-type 772 PMA + Nb n = 8 d'experiences Ionomycine Moyenne 7970 Ecart-type 2736 PMA seul Nb n = 8 d'experiences Moyenne 66 Ecart-type 61 Ionomycine Nb n = 8 d'experiences seule Moyenne < SL -32-Ecart-type Le dosage du surnageant de culture des cellules seules permet de definir leur niveau de secretion basal qui s'avere donc non detectable. Ce temoin permet de verifier qu'en 1'absence de tout stimulus, les cellules ne secretent pas d'IL-2. Par ailleurs, ces temoins permettent de confirmer la necessite de deux stimuli (PMA et complexe anti-D/F(ab')2) pour entrainer 1'activation des cellules. En effet, la secretion d'IL-2 est minime voire nulle lorsque 1'un des deux stimuli est absent (temoins PMA + F(ab')2 ou F(ab')2 + anti-D). De meme, 1'activation du CD16 necessite 1'agregation des anticorps car en absence de F(ab')2, une secretion d'IL-2 est obtenue mais de maniere largement inferieure a une secretion obtenue en presence de PMA et d'agregats anti- D/F(ab')2. Par ailleurs, au cours de chaque experimentation, 1'activation maximum est verifiee par utilisation de PMA et de Ionomycine. Ces resultats permettent donc de demontrer la necessite d'une double stimulation des cellules JCD16+ afin d'obtenir une secretion en IL-2. 2. Effet dose et determination de la gamme de concentration d'anticorps Afin de determiner la gamme optimale de concentrations en anti-D pour la suite des experimentations, un test dose- reponse (represents par les deux courbes suivantes) a ete realise. Pour cela, une gamme de concentrations allant de 1 a 100 .g/ml d'anticorps R297 (lot CO29-025) a ete testee dans le milieu reactionnel. L'experience a ete realisee en quintuplate (voir figure n 2).30

-33- Pour les faibles concentrations en anti-D, la courbe de concentration en IL-2 dans le surnageant apres 24 heures de stimulation est proportionnelle a la concentration en anti-D introduite dans le test. Pour les fortes concentrations en anti-D, la courbe atteint un plateau. 3. Cinetique d'activation et determination du temps d'incubation Afin de determiner la duree optimale d'incubation, une etude cinetique de la secretion en IL-2 des deux lignees cellulaires a ete realisee. Pour cela, les cellules ont ete stimulees pendant 8, 24, 32, 48, 56 ou 72 heures par une gamme de concentrations en anti-D definie (de 0,625 a 10 g/ml du lot CO29-025). Les concentrations en IL-2 dans le surnageant ont ete dosees pour chaque concentration en anti-D, et pour chaque duree d'incubation permettant ainsi d'obtenir les droites de la figure 3. Cette etude permet de montrer qu'apres 8 heures de stimulation, les cellules ne secretent que tres peu d'IL- 2. A partir de 24 heures, les taux d'IL-2 atteignent des valeurs maximales. Apres 24 heures de stimulation, les courbes tendent meme a se superposer. La duree d'incubation optimale a ete fix-6e a 24 heures de facon a limiter la duree du test. 4. Effet de la concentration cellulaire dans le test I1 est relativement difficile de standardiser la concentration cellulaire dans un test biologique. L'objet de cette etude est de verifier si le pourcentage d'activite d'un echantillon donne est dependant ou non de la concentration cellulaire. Pour cela, au cours de trois .2894983 -34- experiences independantes, un echantillon d'anticorps monoclonal anti-D (lot R297 n 05-081, TO a ete teste avec cinq concentrations cellulaires differentes (C1=105 cellules/puits, C2=2,5.105 cellules/puits, C3=5.105 5 cellules/puits, C4=7,5.105 cellules/puits et C5=106 cellules/puits). Son pourcentage d'activite a ensuite ete determine par comparaison avec un anti-D de reference (lot CO29-025) dont le pourcentage d'activite est fixe arbitrairement a 100%. Les resultats obtenus pour chaque 10 concentration, lors des trois experiences, sont presentes dans les tableaux suivants. Cellules JCD16+ Phe Experience 1 Experience 2Exp~rience 3 concentrations % Activit~ CV o CV % CV Ech / Ref Activit~ o Ech / Ref Activit~ Ech / Ref Cl aucun resultat obtenu 14 3 7 13 5 11 C2 127 12 131 12 116 11 C3 88 5 127 9 138 9 C4 131 8 121 7 119 10 C5 120 3 123 6 115 9 Moyenne 117 7 129 8 125 10 Ecart-Type 20 4 9 2 11 1 CV 17 7 9 Pourcentage d'activite de 1'echantillon R297 n 05-081 teste au cours de trois experiences independantes regroupant cinq conditions de concentration cellulaire, 15 cellules Jurkat CD16+ Phe. Dans cette etude, 1'analyse des coefficients de variation (CV) montre que les trois experiences donnent une activite comparable de 1'echantillon n 05-081 quelle que soit la concentration cellulaire etudiee. -35- 5. Reproductibilite du test Une variabilite biologique est introduite lorsque des cellules sont utilisees dans un test, meme s'il s'agit de lignees cellulaires. Ainsi, dans le but de standardiser un test, it faut s'assurer que ce dernier est bien reproductible. Ceci est d'autant plus necessaire lorsque le test doit etre mis en muvre pour evaluer 1'influence du procede de purification sur 1'activite d'un anticorps, mais aussi lorsque des etudes de stabilite au cours du temps de preparations therapeutiques sont realise-es. L'activite d'un echantillon (lot CO29-025) a ainsi ete testee au cours de plusieurs experiences. Son pourcentage d'activite est calcule par rapport a une reference qui correspond au meme echantillon dont 1'activite est fixee arbitrairement a 100%. JCD16+ Phe CO29-025 taux IL-2 0,727 g/L ) a 10 Experience % g/ml activite CV d'anti-D Ech / Ref n 1 1276 92 7 2022 107 5 n 2 2182 106 6 2210 104 10 n 3 2096 103 8 1795 96 17 n 4 1975 101 13 2078 96 12 n 5 1704 105 11 -36- 1160 96 8 1309 98 4 419 105 5 n 6 313 96 10 Moyenne 1580 100 9 Ecart 644 5 4 type CV 41 5 Test de reproductibilite : determination du pourcentage d'activite d'un echantillon (lot CO29-025) au cours de n experiences. Dans le cas d'un test biologique, it est admis un coefficient de variation maximum de 15-20% pour que le test soit valide. Dans le cas de notre test, les CV obtenus (5% pour les cellules JCD16+ Phe) sont donc inferieurs a ce qui est admissible. L'utilisation de ce test est donc possible en routine pour le suivi de stabilite d'echantillons mais aussi lors de la verification du niveau d'activite d'un echantillon au cours de son procede de purification. Exemple 3 : Evaluation de la cytotoxicite d'un anticorps vis-a-vis du CD16 Dans la litterature, it a ete demontre que le taux de fucosylation des oligosaccharides presents au niveau des chaines lourdes des immunoglobulines influence les proprietes effectrices des anticorps. En effet, un faible taux de fucose augmenterait la capacite de fixation de 1'anticorps sur le CD16 [26]. Par ailleurs, ce mecanisme serait totalement independant du polymorphisme du CD16 [27]. Dans cette etude, nous nous sommes donc interesses a 1'impact du taux de fucose sur 1'activite fonctionnelle -37- des anticorps. Le LFB dispose de differentes preparations d'anticorps monoclonaux qui ont ete caracterisees par leur taux de fucose present sur les chaines glycaniques. Un anticorps 100% fucosyle correspond a une immunoglobuline dont les deux chaines glycaniques en position 297 de la chafne lourde sont totalement fucosylees. Differents echantillons ayant divers taux de fucose ont ete etudies dans le test en presence de cellules cibles et dans le test sans cellules cibles : - un anti-Gp120 VIH a 100% de fucose, - AD1 (anti-D) a 100% de fucose, - T125 CHO (anti-D produit dans des cellules CHO) a 81% de fucose, - R270 (anti-D) a 64% de fucose, - R297 a 40% de fucose, -CO29025 a 33% de fucose, - R297 a 25% de fucose. Les figures 4A et 4B representent respectivement les resultats obtenus en presence de cellules cibles dans le test (4A) et en 1'absence de cellules cibles mail avec des preparations d'anticorps agregees au moyen d'un F(ab')2. Quel que soft le test utilise pour determiner 1'activite des echantillons, it est constate une diminution de 1'activite fonctionnelle des anticorps vis a vis du CD16 lorsque le taux de fucose augmente. Un anticorps presentant un taux de fucose de 100% comme AD1 posse-de meme une activite totalement nulle vis-a-vis de ce recepteur. Cette etude permet de confirmer que le taux de fucose influence la fixation de 1'anticorps sur le CD16. Une immunoglobuline totalement fucosylee au niveau de 1'oligosaccharide de 1'asparagine en position 297 de la chafne lourde empeche toute interaction de 1'anticorps avec le CD16 n'entrafnant pas alors son activation.

-38- Exemple 4 : Etude du suivi de la stabilite d'un anticorps monoclonal Une autre application de ce test est le suivi accelere de la stabilite d'une preparation therapeutique placee en conditions denaturantes (cf figure 5). Ce suivi est fait sur plusieurs mois par une mesure tous les mois de 1'activite de 1'echantillon. Cette etude a ete realisee sur 1'echantillon n 05-081 place a 40 C. Son activite a ete testee a differents temps (TO, T+l mois et T+2mois) dans le test avec cellules cibles mais aussi dans le test sans cellules cibles appele aussi test generique. Le 100% d'activite est determine au moyen d'un anticorps de reference (le lot recherche R297 pour le test avec cellules cibles, et, le lot pilote CO29-025 pour le test generique). Cette etude permet de mettre en evidence une perte d'activite de 1'echantillon lorsqu'il est expose a une temperature elevee. Cette perte est proportionnelle a la duree d'exposition de l'echantillon a la chaleur. Cette etude montre egalement que des resultats semblables sont obtenus pour les deux tests. Ces deux tests peuvent donc etre utilises pour les suivis de stabilite au cours du temps de preparations a usage therapeutique.

Exemple 5 : Comparaison de la production specifique d'IL-2 par des anticorps agreges par la chaleur ou par un fragment F(ab)'2 dirige contre un fragment (Fab)'2IgG L'effet dose de preparations d'anticorps monoclonaux anti-D agreges soit par la chaleur (20 min a 63 C), soit par un fragment F(ab)'2 dirige contre un fragment (Fab)'2 IgG sur la production d'IL-2 par une lignee Jurkat -39- recombinee genetiquement pour exprimer le CD16 a ete etudie. Les anticorps monoclonaux agreges ont ete incubes avec les cellules Jurkat CD16+ pendant 16 heures a 37 C avant 5 de doser 1'IL-2 dans les surnageants.

Les resultats sont donnes dans le tableau 1 ci-dessous : Ac monoclonaux Production specifique d'IL-2 en pg/ml Anti-D (ng/ml) IgG agregees par la IgG agr~g~es avec chaleur des F(ab)'2 10 000 2965 8652 5000 897 8190 1000 102 856 500 22 171 0 < 12 <12 Tableau 1 10 Le tableau 1 montre qu'ilexiste une relation effet/dose entre la quantite d'IL-2 secretee par les cellules dans le surnageant et la concentration en anticorps monoclonal agrege presente dans le test, et ceci quelle que soit la 15 methode utilisee pour agreger 1'anticorps monoclonal. Cependant, on observe que la quantite d'IL-2 secretee par les anticorps monoclonaux agreges par la chaleur est plus faible que si les anticorps sont agreges par un anti-F(ab')2 IgG. 20 -40- BIBLIOGRAPHIE 1. Van Mirre et al. (2004). Monomeric IgG in intravenous Ig preparations is a functional antiagonist of FcgRII and FcgRIIIb. The journal of Immunology ; 332:339 2. Farag S. S., Flinn I. W., Modali R., Lehman T. A., Young D., and Byrd J. C. (2004) Blood, vol. 103, 10 n 4, 1472-1474. 3. Wu J., Edberg J. C., Redecha P. B., Bansal V., Guyre P. M., Coleman K., Salmon J. E., and Kimberly R. P. (1997) J. Clin. Invest. Vol. 100, n 5, 1059-1070. 4. Shields R. L., Lai J., Keck R., O'Connell L. Y., Hong K., Meng Y. G., Weikert S. H. A., and Presta L. G. (2002) J. Biol. Chem., vol. 277, n 30, 26733-26740. 20 5. Niwa R., Hatanaka S., Shoji-Hosaka E., Sakurada M., Kobayashi Y., Uehara A., Yokoi H., Nakamura K., and Shitara K. (2004), Clinical Cancer Research, 10, 6248-6255. 6. Weiss A., Wiskocil R.L., and Stobo J.D. (1984) J. Immunol., vol. 133, n l, 123-128. 7. Schneider U., Schwenk H. U., and Bornkamm G. (1977) 30 Int. J. Cancer., vol. 19, n 5, 621-626. 15 25

Claims (24)

Revendications

1. Procede pour mesurer la capacite d'une 5 preparation d'anticorps a activer un recepteur Fc, comprenant : a) 1'agregation desdits anticorps entre eux, b) la mise en contact de cellules exprimant un recepteur Fc avec lesdits anticorps agreges, et 10 c) la mesure de la reaction desdites cellules resultant de 1'activation du recepteur Fc desdites cellules par la region Fc desdits anticorps.

2. Procede selon la revendication 1, caracterise 15 en ce que ladite agregation se fait au moyen d'un fragment F(ab')2 anti-IgG.

3. Procede selon la revendication 2, caracterise en ce que ledit fragment F(ab')2 anti-IgG est un anti-Fab 20 ou un anti-F(ab')2 dirige contre la preparation d'anticorps test-6e.

4. Procede selon la revendication 1, caracterise en ce que ladite agregation est une agregation par la 25 chaleur.

5. Procede selon la revendication 1, caracterise en ce que ladite agregation est effectuee par cross-linking des regions Fab entre elles ou des chaines 30 lourdes et legeres entre elles.

6. Procede selon 1'une quelconque des revendications precedentes, caracterise en ce que ledit recepteur Fc est selectionne parmi le CD16 (FcyRIIIa et-42- FcyRIIIb), le CD32 (FcyRIIa et FcyRIIb), et le CD64 (FcyRI).

7. Procede selon 1'une quelconque des revendications precedentes, caracterise en ce que lesdites cellules exprimant ledit recepteur Fc sont des cellules transfectees avec le gene codant pour ledit recepteur.

8. Procede selon 1'une quelconque des revendications precedentes, caracterise en ce que lesdites cellules exprimant ledit recepteur Fc sont des cellules Jurkat exprimant le CD16 et que cette lignee est cultivee en presence d'un activateur aspecifique de ces cellules comme le PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate).

9. Procede selon 1'une quelconque des revendications precedentes, caracterise en ce que la mesure de la reaction des cellules resultant de 1'activation du recepteur Fc desdites cellules par la region Fc desdits anticorps est une mesure de la quantite d'au moins une cytokine produite par les cellules exprimant ledit recepteur Fc.

10. Procede selon la revendication 9, caracterise en ce que la mesure d'au moins une cytokine est realisee en effectuant un dosage des ARNm desdites cytokines.

11. Procede selon 1'une quelconque des revendications 9 ou 10, caracterise en ce que lion quantifie au moins une cytokine selectionnee parmi IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, MCP-1, TNFalpha (TNFa) et IFNgamma (I FNy) .-43-

12. Procede selon 1'une quelconque des revendications 9 a ii, caracterise en ce que l'on quantifie 1'interleukine IL-2.

13. Procede selon la revendication 12, caracterise en ce que le taux d'interleurkine IL-2 secretee est correle a une activite du type ADCC.

14. Procede selon 1'une quelconque des revendications 1 a 8, caracterise en ce que la mesure de la reaction de la cellule est une mesure de 1'influx calcique, de la phosphorylation, des facteurs de transcription ou de 1'apoptose.

15. Procede selon 1'une quelconque des revendications precedentes, pour evaluer la capacite d'une cellule a produire un anticorps monoclonal capable d'interagir avec le recepteur CD16.

16. Procede selon la revendication 15, caracterise en ce que ladite cellule produisant des anticorps est choisie parmi les cellules CHO, YB2/0, SP2/0, SP2/0-AG14, IR983F, le myelome humain Namalwa, PERC6, les lignees CHO, notamment CHO-K-1, CHO-Lecl0, CHO-Lecl, CHO-Lecl3, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653.

17. Procede selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14, pour evaluer 1'efficacite et 1'integrite de la region Fc d'anticorps apres une ou plusieurs etapes de purification, ou pour suivre la stabilite d'une preparation therapeutique placee en conditions denaturantes.35- 44 -

18. Procede selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14, pour mesurer la fonctionnalite de la region Fc d'un anticorps.

19. Procede selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14 pour evaluer la production d'anticorps monoclonaux par des plantes transgeniques ou des mammiferes transgeniques.

20. Procede selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14 pour selectionner des anticorps efficaces pour un traitement therapeutique.

21. Procede selon 1'une quelconque des revendications 1 a 14 pour selectionner des compositions d'anticorps dont la teneur en fucose est inferieure a 65%, et de maniere preferentielle inferieure a 40%.

22. Procede de preparation d'une composition 20 d'anticorps monoclonaux capable d'activer le recepteur CD16 (FcyRIII) comprenant les etapes suivantes : a) obtention d'anticorps monoclonaux a partir d'hybridome, d'heterohybridome, ou de toute lignee 25 cellulaire animale, vegetale ou humaine transfectee a 1'aide d'un ou plusieurs vecteurs de maniere a exprimer ledit anticorps, b) agregation des anticorps obtenus a 1'etape a) par un fragment F(ab')2 anti-IgG, 30 c) addition des anticorps obtenu a 1'etape b) Bans un melange reactionnel comprenant : a. des cellules effectrices comprenant des cellules exprimant le recepteur CD16 (FcyRIII), 35 b. du Phorbol 12-Myristate 13-Acetate-45- d) mesure de la quantite d'au moms une cytokine produite par la cellule exprimant le CD16, e) selection de la ou des compositions d'anticorps pour lesquelles on mesure une augmentation superieure a 0, 5, 1, 2, 5, 10, 100 ou a 500 fois de la quantite de cytokine mesuree par rapport au controle en absence d'anticorps ou en presence d'un anticorps donne comme reference negative.

23. Procede selon la revendication 22, caracterise en ce que la mesure de la quantite d'au moms une cytokine produite par la cellule exprimant is CD16 est une mesure de la quantite d'IL-2 produite par la cellule exprimant le CD16.

24. Kit pour la mise en oeuvre d'un test biologique de mesure de 1'activite d'anticorps therapeutiques comprenant les elements necessaires a la mise en oeuvre du procede selon 1'une quelconque des revendications precedentes.