CN101375165A - 抗体鉴定测试 - Google Patents

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CN101375165A CNA2006800528707A CN200680052870A CN101375165A CN 101375165 A CN101375165 A CN 101375165A CN A2006800528707 A CNA2006800528707 A CN A2006800528707A CN 200680052870 A CN200680052870 A CN 200680052870A CN 101375165 A CN101375165 A CN 101375165A
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Abstract

本发明涉及一种测量抗体制剂激活Fc受体的能力的方法，其中该方法包括如下步骤：a)将所述抗体彼此聚集，b)将表达Fc受体的细胞与所述聚集的抗体相接触，且c)测量由所述抗体的Fc区域激活所述细胞的Fc受体而导致的细胞反应。

Description

抗体鉴定测试
技术领域
本发明涉及一种测量抗体制剂激活Fc受体的能力的方法，该方法包括如下步骤:
a)将所述抗体彼此聚集，
b)将表达Fc受体的细胞与所述聚集的抗体相接触，且
c)测量由所述抗体的Fc区域激活所述细胞的Fc受体而导致的细胞反应。
背景技术
随着在研究中的应用逐渐增加，作为传统治疗的替代方法，抗体也构成了诊断和治疗的可选工具。
多种治疗用的血浆来源或生物技术来源的抗体制剂现在已经上市或者处于临床开发阶段。将其属性进行开发，用以获得可以特异性与其靶点结合、有效募集免疫细胞的治疗工具。
最近几年来，研究方向关注于提高抗体的效力，特别关注于对抗体的恒定Fc区域的操控。恒定Fc区域负责抗体的“效应物”属性，即其允许免疫效应细胞及补体分子的动员。这种能力由于某些免疫细胞上糖蛋白(Fc受体或称FcR)的存在而成为可能。一旦抗体通过其可变区与靶抗原结合，这些受体能够结合于抗体的恒定区。通过与这些细胞结合，抗体触发不同的细胞机制，例如吞噬作用及ADCC(抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用)。
这提出了如何基于其“效力”(即由于抗体Fc区域结合于Fc受体，触发免疫细胞机制的能力)对抗体进行区别的问题。
在文献FR 02 11416中，申请人描述了一种测量抗体功能活性的方法。该方法包括在抗体及所述抗体的抗原存在的情况下，将表达CD16受体的细胞与反应介质相接触，并测量至少一种由表达CD16受体的细胞产生的细胞因子，这种测量方法表示出由抗体所致的免疫系统效应细胞的激活。
因此，这种方法能够评价由抗原-抗体复合物所致的效应细胞激活。然而，这种方法中，效应细胞的激活同时依赖于抗体对其靶点的亲和力以及Fc区域与Fc受体结合的能力。因此，该测试并不能评价单独由抗体Fc区域导致的效应细胞激活。
为了解决这一问题，文献EP 1 298 219提出一种能够测量抗体Fc区域的功能性的方法，这种测量方法不会受抗体Fab区域结合能力的影响。这种方法包括固定待测试的抗体，将其引入表达Fc受体的效应细胞，并且测量由于效应细胞被抗体Fc区域激活所导致的效应细胞中的反应，在该方法中，所述抗体通过包被在平板或微球上而被固定。
由于同时依赖于抗体与平板的正确结合、其在平板或微球上的取向、以及抗体所带电荷，因此不能控制被固定的抗体数量。事实上，抗体电荷依赖于其氨基化程度，这影响其固定在微球或平板上的能力。因此，该参数与所测试的抗体功能导致了测试的差异性，这样使得难以对比具有不同序列和/或特异性的两种抗体的Fc区域的功能性。另外，该测试使用人单核细胞系(THP-1)进行，为了获得FcγRIIIa受体的持续性表面表达，THP-1必须被干扰素γ激活。这种预先激活为测试差异性的显著来源，因此难以对比实验。
因此，现有技术中提出的基于其“效力”区别抗体的方法，或者不是特别适合于评价由于抗体Fc区域所致的效应细胞激活，或者可重复性不够理想，因此难以标准化。
这就是申请人开发一种新方法的目的，本发明方法能够测量抗体制剂激活Fc受体的能力，所述方法不仅可重复性好，又特别能够评价抗体Fc区域激活Fc受体的能力，并且不会因抗体Fab区域的特性而干扰该评价。
发明内容
因此，本发明的第一个目标涉及一种测量抗体制剂激活Fc受体的能力的方法，包括以下步骤:
a)将所述抗体彼此聚集，
b)将表达Fc受体的细胞与所述聚集的抗体相接触，且
c)测量由所述抗体的Fc区域激活所述细胞的Fc受体而导致的细胞反应。
为本发明之目的，“将所述抗体彼此聚集”是指将分散在含有抗体的溶液中的抗体结合在一起形成网络，在该网络的抗体之间表现出很强的偶联。
这种抗体的聚集具有用可控及同质的方式将抗体定向的功能，使得所有抗体或大部分抗体的Fc区域适当呈现于朝向表达Fc受体的效应细胞的Fc受体的方向上。事实上，申请人惊异地注意到这种聚集的效果为:不论所研究抗体的特异性或一级序列如何，某些抗体的Fc区域会用特定的方式进行定向。
根据本发明的方法具有能够研究本方法中所用抗体的数量和效应细胞的激活之间的剂量-反应关系的优点，以及具有可重复的优点。
此外，申请人惊异地注意到，这种方法使得能够通过Fc受体激活效应细胞，而不需要靶抗原的存在。事实上，一旦抗体已经通过其可变区与靶抗原结合，Fc受体即能够在体内结合于抗体的恒定区。缺少在其表面表达靶抗原的细胞的主要优点为，消除了由于这些细胞的存在所致的生物测试中差异性的来源，并且因此减少了可能在使用本方法的过程中引入差异性的参数。
因此，现有技术的方法中因靶细胞的存在导致的生物差异性，以及抗体的特异性和一级序列的影响，在本发明的方法中是有限的，甚至为零。
为了实施本发明，可以使用本领域技术人员已知的所有用于抗体聚集的方法(例如聚集例如整个免疫球蛋白G的方法)进行抗体聚集，例如使用加热法或免疫学手段，这一列举并不构成任何形式的限制。
另外，根据本发明的方法具有利用溶液中的抗体实施的优点。
为本发明之目的，“Fc受体”是指存在于效应细胞上的、抗体Fc区域的任何受体，例如CD16(FcγRIII)及CD32(FcγRII)。
为本发明之目的，“抗体”是指无论其特异性及同种型，只要包括Fc区域或拥有与Fc区域相同功能的区域的任何抗体。因此，其可以是完整抗体或者抗体片段，例如Fc抗体片段。另外，在根据本发明的方法中使用的抗体可以是IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgM、IgE、IgA或IgD，或者也可以是它们的混合物。另外，在本发明的方法中使用的抗体可以是单克隆抗体和/或多克隆抗体。在其为单克隆抗体的情况下，这些抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体、来源于人类的抗体或来源于动物的抗体。为本发明之目的，“表达Fc受体的细胞”是指任何在其表面表达Fc受体的细胞，所述细胞可以天然地表达这一受体，或在经基因修饰后表达这一受体。通过示例性方式，可以提到NK细胞、激活的单核细胞、外周血粒细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、CD8淋巴细胞、Tγδ淋巴细胞、NKT细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞或肥大细胞，这一列举并不构成任何形式的限制。有利地，当抗体的Fc区域与在这些细胞表面表达的Fc受体相结合时，这些细胞能够产生反应。
为本发明之目的，“表达Fc受体的细胞的反应”是指由于这些细胞的Fc受体与抗体Fc区域的相互作用，导致的任何可测量的细胞反应。该反应可以是细胞内或细胞外的。通过示例的方式，可以提到一种或多种细胞因子的测量，细胞内钙离子、穿孔素、颗粒酶或一氧化氮水平的测量，这一列举并不构成任何形式的限制。
有利地，该聚集通过使用F(ab’)2抗-IgG片段得以实现。该方法在控制抗体Fc区域的定向方面可以实现特别有利的聚集。事实上，每个F(ab’)2片段结合两个待测试的不同抗体，因此用适合的方式定向了待测试抗体的Fc区域。这种定向特别适合于与效应细胞的Fc受体相互作用，因此适合于效应细胞的激活。
能够用于本实施方案的F(ab’)2抗-IgG片段可针对抗体的任何片段、部分或结构域，例如Fc区域、Fab区域或整个IgG分子。F(ab’)2片段也可以是单克隆来源或多克隆来源的。
在本发明的该实施方案中，待测试抗体的浓度及F(ab’)2的浓度可被精确地控制。因此能够计算两者之间的关系，这使得无论何种待测试的抗体制剂均能够实现可重复测试。
特别有利地，该F(ab’)2抗-IgG片段为针对被测试的抗体制剂的抗-Fab或抗-F(ab’)2。该片段可以为来源于羊或兔的片段。
在该具体实施方案中，每个F(ab’)2片段结合于两个待测试抗体分子的Fab部分，由此可以用一种合适的方式将待测试抗体Fc区域定向，使其能够与FcR结合，并激活在表面表达这些FcRs的细胞。
根据另一实施方案，该聚集为热聚集。抗体首先被加热以使其彼此聚集(本发明之方法的步骤a))，然后将其与表达Fc受体的细胞相接触(步骤b))。任何适于将抗体彼此聚集的加热方法均可以用于实施本发明的方法。通过示例性的方式，可以提到在60℃下加热抗体30分钟[1]。
根据本发明的另一实施方案，可通过将Fab区域彼此交联或者将重链和轻链彼此交联来实现聚集。为本发明之目的，“交联”是指两个抗体分子之间的任何桥接，例如将这些抗体的Fc区域朝向效应细胞的CD16受体同向地定向。有利地，一个抗体可以参与一个或多个桥接。因此，抗体能够形成网络，其定向适合于与效应细胞携带的CD16受体的最佳结合。有利地，任何允许抗体彼此交联(桥接)的方法均适于实施本发明。通过示例性的方式，可以提到形成化学键或通过UV照射进行桥接，这一列举不构成任何形式的限制。有利地，由效应细胞表达的Fc受体选自CD16(FcγRIIIa和FcγRIIIb)，CD32(FcγRIIa和FcyRIIb)，及CD64。特别有利地，选择CD16。
在一个优选实施方案中，表达Fc受体的细胞为用编码所述受体的基因转染的细胞。在该实施方案中，能够控制效应细胞递呈的受体的同种异型。事实上，根据所需要的测试，可以使用只含有依特性而选择的一种受体的细胞，或者含有这些受体的结合的细胞，来实现本发明的方法。例如，可以通过转染编码CD16的基因，选择使用只表达CD16的效应细胞来实现本发明。这样就能够消除另一个差异因子，即位于效应细胞表面的Fc受体的性质和数量的差异。
在本发明的一个优选实施方案中，表达Fc受体的细胞为表达CD16的Jurkat细胞，该细胞系在这些细胞的非特异性激活剂例如PMA(乙酸肉豆蔻酰佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate))存在的情况下进行培养。用该细胞系实现根据本发明的方法的一个特别有利的方面是基于这样的事实:不需要在将效应细胞与聚集的抗体接触之前对该细胞系进行激活。事实上，某些效应细胞系需要使用一种或多种细胞因子来激活，以使Fc受体充分地有效表达(例如参见文献EP1 298 219)。这种用细胞因子进行的预先激活经常是随机性的，导致了时间的浪费及难以克服的实验标准化的困难。另外，用编码CD16受体的表达载体转染的Jurkat细胞系具有永生化的优点，并且因此可以在培养基中无限增殖。
这些细胞具有在接受双重刺激的情况下可被激活的优点。在本发明的方法中，Jurkat CD16细胞的激活可由PMA(为T细胞的非特异激活物)及CD16与抗体Fc区域的结合而实现。Jurkat细胞的激活由培养上清液中IL-2的释放显示出来。结果，对应于CD16的抗体Fc区域的功能越强，释放到上清液中的IL-2的量就越高。
有利地，由所述抗体的Fc区域激活所述细胞Fc受体而导致的细胞反应的测量为对表达CD16受体的细胞产生的至少一种细胞因子的量的测量。事实上，除了由上清液中的IL-2的释放显示以外，效应细胞的激活还可其它指标显示。例如，培养基中细胞因子的浓度可通过商业上可用的ELISA(bioassay)测试的方式进行测量。其它的方法能够评价细胞因子(例如IL-2)的合成:这些方法为分析IL-2信使RNA的定量RT-PCR及Northern印迹杂交法(Northern blot)，或者对细胞内IL-2及培养上清液中IL-2定量的Western印迹杂交法(Western blot)及细胞计量术(cytometry)，这一列举并不构成任何形式的限制。
在本发明的一个实施方案中，测量至少一种细胞因子的量通过实行对这些细胞因子mRNA的分析而实现，这些mRNA的量与相应细胞因子的表达水平相关，这显示了效应细胞的激活水平。
有利地，选自IL-I、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、MCP-1、TNFalpha(TNFα)或IFNgamma(IFNγ)的至少一种细胞因子被定量测量，这一列举并不构成任何形式的限制。
特别有利地，细胞反应的测量为白细胞介素IL-2的定量测量。
分泌的白细胞介素IL-2的水平与ADCC型反应活性相关。事实上，在效应细胞的细胞因子分泌与效应细胞CD16介导的ADCC反应活性之间存在着很强的相关性(文献FR 02 11416)。因此，本发明的方法特别有利于筛选细胞毒性抗体，特别是为了治疗用途。
在本发明的另一实施方案中，细胞反应的测量为对钙内流、磷酸化、转录因子或凋亡的测量。这些参数的增加与效应细胞的激活相关，显示出抗体激活效应细胞Fc受体的能力。
有利地，该方法适用于评价细胞产生能够与CD16受体交互作用的单克隆抗体的能力，即，评价抗体或抗体制剂的细胞毒性。在文献中，已经证明抗体对CD16的亲和力依赖于Fc受体的特性例如CD16的多态性[2，3]，以及依赖于Fc区域的特性，或者依赖于在与Fc受体的结合中起作用的位于免疫球蛋白重链297位的天冬酰胺上的寡糖岩藻糖的水平[4，5]。
产生抗体的细胞系可以是任何能够分裂的细胞系，但是更特别地选自CHO、YB2/0、SP2/0、SP2/0-AG14、IR983F、Namalwa入骨髓瘤细胞、PERC6细胞系、CHO细胞系(特别是CHO-K-1、CHO-Lec10、CHO-Lec1、CHO-Lec13、CHO Pro-5、CHO dhfr-)、Wi1-2、Jurkat、Vero、Molt-4、COS-7、293-HEK、BHK、K6H6、NS0、SP2/0-Ag14及P3X63Ag8.653，这一列举并不构成任何形式的限制。
有利地，该方法适于评价一个或多个纯化步骤后获得的抗体制剂Fc区域的效力和完整性。
本发明的方法的另一个应用为监测置于变性条件下的单克隆或多克隆抗体制剂(特别为治疗用抗体)的稳定性。
本发明的方法因此特别适用于监测治疗用制剂的时间稳定性。事实上，申请人监测了存储在变性条件下几个月的抗体制剂的活性，并显示出活性在降低。因此，当存储在高温下例如40℃时，治疗用制剂随着时间推移丧失了其活性。另外，不同于包含有携带靶抗原的细胞的测试，本发明的方法能够区别抗体的哪一部分与活性丧失有关。显然，当变性时，是抗体的Fc区域失去了其对CD16的亲和力(参见实施例4)。
另外，该方法有利地适用于测量抗体Fc区域的功能性。为本发明之目的，“抗体Fc区域的功能性”是指该Fc区域通过与Fc受体(特别为CD16受体)的结合激活效应细胞的能力。本发明的方法为高度可重复的(参见实施例2第5段)，由于不同序列和/或特异性的抗体的测量效率是相同的，因此本发明方法可常规应用于分析抗体制剂的功能性，也可用于高细胞毒性抗体的筛选。
有利地，该方法适用于评价由转基因植物或转基因哺乳动物产生的单克隆抗体的产量。通过实施根据本发明的方法，可对这样产生的抗体的Fc区域激活Fc受体的能力进行鉴定。
有利地，该方法适用于选择治疗用的有效抗体。通过示例的方式，选出的抗体可使细胞因子释放水平(例如IL-2)增加大于100％，或250％，优选500％，更优1000％而选出，以上增加比率可针对无抗体的对照组或者针对给定抗体作为阴性参照物的对照组进行观察而得出。
有利地，该方法适用于选择岩藻糖含量小于65％，优选小于40％的抗体组合物。事实上，已证明抗体制剂的活性依赖于在重链297位的聚糖单元中的岩藻糖含量。
抗体由重链和轻链组成，重链和轻链通过二硫键连接在一起。每个链在N-末端位点由抗体所针对的抗原的特异性可变区(或结构域)组成；在C-末端由恒定区组成，恒定区由轻链的一个CL域和重链的多个结构域(CH1、CH2和CH3)构成。可变区和重链的CH1结构域以及轻链的CL结构域联合形成了抗体的Fab部分，该部分通过非常有弹性的铰链区连接至Fc区域，这使得每个Fab可以结合靶抗原。该Fc区域为抗体效应物属性的媒介，使得抗体可接近效应物分子例如FcγR受体(FcgammaR)。由两个球状结构域CH2和CH3构成的该Fc区域，在该两条链的每一条链上存在与天冬酰胺297(Asn297)相结合的双触角型N-聚糖的情况下，在CH2结构域的水平上被糖基化。
这种类型的N-聚糖表现为如下的一般形态(表现型“G0”，其它糖基可加于此):
Figure A200680052870D00121
与Asn297结合
Figure A200680052870D00122
GlcNAc 甘露糖
因此，根据本发明的抗体组合物中，“岩藻糖”是指由这些N-寡糖携带的岩藻糖。当存在岩藻糖分子时，该分子与N-寡糖中的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)结合，该GlcNAc自身可结合Asn297。
由每个抗体的两条重链各自携带的一个N-聚糖，可以携带或不携带一个岩藻糖分子。因此，根据是否没有N-聚糖携带岩藻糖分子、只有一个N-聚糖携带岩藻糖分子、或两个N-聚糖均携带岩藻糖分子，每个抗体可以分别包括0、1、2个岩藻糖分子。
因此，“抗体组合物岩藻糖的含量小于65％”是指一种抗体组合物，该组合物中抗体的每个糖基化位点(Asn297)携带的聚糖结构总量中，岩藻糖分子所占的比例少于65％。
申请人已经证明，这种组合物具有特殊有利的ADCC活性。
优选地，选择包括20-45％或者25-40％岩藻糖含量的抗体组合物。
在本发明的方法中显示出功能活性与岩藻糖水平之间的量化关系，即在抗体组合物(制剂)中的岩藻糖水平减少时，对应于CD16的抗体的功能活性增加。
本发明的另一目的涉及一种单克隆抗体组合物的制备方法，包含以下步骤:
a)从杂交瘤、异种杂交瘤、或者使用一种或多种表达所述抗体的载体转染的任何动物、植物或人的细胞系中，获得抗体；
b)通过F(ab’)2抗-IgG片段聚集步骤a)中获得的抗体；
c)将步骤b)中获得的抗体加入反应混合物，该混合物包括:
-包含表达CD16的细胞的效应细胞，
-乙酸肉豆蔻酰佛波酯(PMA)
d)测量表达CD16的细胞产生的至少一种细胞因子的量；
e)针对无抗体的对照组，或者针对以给定抗体作为阴性参照物的对照组，按照被测量的细胞因子量的增加大于0.5、1、2、5、10、100或500倍筛选抗体组合物。
有利地，包括表达CD16的细胞的效应细胞为Jurkat CD16细胞。
在本发明的一个实施方案中，至少一种细胞因子的量的测量通过对这些细胞因子的mRNA进行分析而实现。这些mRNA的量与相应细胞因子的表达水平相关，其显示出效应细胞激活的水平。
例如，对选自IL-I、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、MCP-1、TNFalpha(TNFα)或IFNgamma(IFNγ)的至少一种细胞因子进行定量测量，这一列举并不构成任何形式的限制。
有利地，细胞反应的测量为白细胞介素IL-2的定量测量。
分泌的白细胞介素(例如IL-2)的水平与ADCC型反应活性相关。事实上，在效应细胞的细胞因子分泌与效应细胞的CD16介导的ADCC反应活性之间存在着很强的相关性(文献FR 02 11416)。
在本发明的另一实施方案中，细胞反应的测量为对钙内流、磷酸化、转录因子或凋亡的测量。这些参数的增加与效应细胞的激活相关，显示出抗体激活效应细胞的Fc受体的能力。
有利地，由表达CD16的细胞产生的至少一种细胞因子的量的测量，为对表达CD16的细胞产生的IL-2的量的测量。
本发明的另一主题涉及一种用于实施测量治疗用抗体活性的生物测试的试剂盒，该试剂盒包括为实施一种前述方法而必需的要素，且特别包括:(1)聚集所述治疗用抗体的手段，(2)能够表达Fc受体的细胞，(3)当所述细胞的Fc受体被所述抗体的Fc区域激活时，测量能够表达Fc受体的所述细胞的反应的手段，和(4)实施根据前述任一权利要求的方法所必需的其它要素。
用于实施测量治疗用抗体活性的生物测试的试剂盒，包括:(1)聚集所述治疗用抗体的手段，(2)能够表达Fc受体的细胞，(3)当所述细胞的Fc受体被所述抗体的Fc区域激活时，测量所述能够表达Fc受体的细胞的反应的手段，和(4)实施根据前述任一权利要求的方法所必需的其它要素。
在本发明的一个优选实施方案中，在所述试剂盒内含有的测量所述细胞的反应的手段为定量测量由所述细胞产生的至少一种细胞因子的手段。
在本发明的一个优选实施方案中，所述试剂盒中定量测量至少一种细胞因子的手段为分析所述细胞因子的mRNA的手段。
在本发明的另一个实施方案中，所述试剂盒中测量所述细胞反应的手段为测量钙内流、磷酸化、转录因子或凋亡的手段。
本发明的其它方面及优点在下面的实施例中进行说明，其必须被认为是示例性的，并不限制本发明的范围。
附图说明:
图1:(A)由5个微球群体的平均荧光强度的测量值确定的校准曲线，(B)由抗-CD16标记物的FACS分析获得的JCD16+Val群体的CD16表达特征图。
图2:聚集的抗-D抗体(批号C029-025)剂量-反应曲线。曲线为JCD16+Phe细胞的特异性曲线。加粗的垂直线划定了用于以后的试验的浓度范围(0.625-10μg/ml)。
图3:JCD16+Phe细胞的IL-2分泌动力学图。
图4:抗体岩藻糖水平对其活性的影响。(A)在存在靶细胞的测试中，抗-Gp120HIV抗体(100％岩藻糖)、AD1(100％岩藻糖)、T125CHO(81％岩藻糖)、R270(64％岩藻糖)、R297(40％岩藻糖)及R297(25％岩藻糖)抗体活性的测试，(B)在无靶细胞的测试中，抗-Gp120HIV抗体(100％岩藻糖)、AD1(100％岩藻糖)、T125CHO(81％岩藻糖)、R270(64％岩藻糖)、R297(40％岩藻糖)、C029-025(33％岩藻糖)及R297(25％岩藻糖)抗体活性的测试。
图5:通过每月对其活性的测量，对批号05-081在40℃下的稳定性的监测。
图6:对应于其在10μg/ml和5μg/ml浓度下激活CD16的能力，通过ELISA测试测得的温度对抗-D单克隆抗体活性的影响。
图7:对应于其在10μg/ml和5μg/ml浓度下激活CD16的能力，通过定量RT-PCR测试测得的温度对抗-D单克隆抗体活性的影响。
实施例:
1.细胞培养
1.1 细胞系
Jurkat细胞系克隆E6-1(No.ATCC TIB-152)，由A.Weiss在1984年保藏于ATCC[6]。该克隆E6-1由野生型Jurkat细胞系获得。它由Schneider等[7]于1977年从一名患有急性淋巴细胞白血病的14岁儿童的外周血中分离出来。这种表达T细胞标记物的细胞系在受到两种不同的激活信号刺激时能够产生白细胞介素2(IL-2)。然而，所分泌的IL-2水平会根据细胞系的来源及处理条件而变化。这是已经转染不同来源的Jurkat克隆以使其在膜水平表达FcγRIIIa受体的原因。细胞系通过转染编码人嵌合FcγRIIIa(与γ链的跨膜结构域及胞内结构域相联合的CD16胞外结构域)与新霉素筛选基因的表达载体而获得。由于这些细胞表达在158位具有苯丙氨酸的人CD16，因此将它们称作JCD16+Phe。
1.2 培养基及传代培养基
将JCD16+Phe细胞置于下述培养基中培养:IMDM培养基(Iscove’sModified Dulbecco’s Medium)+4mM L-谷氨酰胺+25mM HEPES缓冲液(Gibco，Invitrogen)，并添加经γ射线照射并去补体的10％FCS(胎牛血清，Foetal Calf Serum)(Invitrogen)和0.5mg/ml的新霉素类似物(G418硫酸盐)(Promega)。该细胞系以每周两次传代培养的速度维持培养，接种率为0.2×106细胞/ml。
2 流式细胞术
不同的标记在EPICS XL细胞仪(Beckman Coulter)中进行分析。
2.1 JCD16 + Phe细胞系的表型分析
该表型分析涉及不同膜标记物的分析，所述膜标记物为CD45(淋巴细胞标记物)、CD19(B淋巴细胞的特异性标记物)、CD2、CD3、CD4及CD8(T淋巴细胞的特异性标记物)、CD58(CD2的配体)以及IL-2受体不同的链(CD25或IL-2Rα、CD122或IL-2Rβ、以及CD132或IL-2Rγ)。在100μ1的1X PBS(磷酸缓冲液)中对106细胞进行标记。其条件如下:
-10μl抗-CD2 FITC(2-异硫氰酸荧光素，Coulter Clone，BeckmanCoulter)+10μl抗-CD3 RD1(R-藻红蛋白，Coulter Clone，BeckmanCoulter)+10μl抗-CD19E CD(R-藻红蛋白/Texas Red混合染料(tandem dye)，Coulter Clone，Beckman Coulter)+10μl抗-CD16PC5(R-藻红蛋白/花青素5混合染料，IOTest，Beckman Coulter)。
-10μl抗-CD45 FITC(Coulter Clone，Beckman Coulter)+10μl抗-CD3 RD1(Coulter Clone，Beckman Coulter)+10μl抗-CD4 ECD(Coulter Clone，Beckman Coulter)+10μl抗-CD8 PC5(CouterClone，Beckman Couter)。
-10μl抗-CD58 PC5(IOTest，Coulter Clone)。
-5μl抗-CD122 FITC(Coulter Clone，Beckman Coulter)+10μl抗-CD132 PE(藻红蛋白，BD Pharmigen)+10μl抗-CD25 PC5(IOTest，Coulter Clone)。
同上述四个标记相并行实施同型对照，并分别相应为:
-10μl IgG1-FITC(Coulter Clone，Beckman Coulter)+10μlIgG1-RD1(Coulter Clone，Beckman Coulter)+10μl IgG2b-ECD(Coulter Clone，Beckman Coulter)+10μl IgG1-PC5(IOTest，Beckman Coulter)。
-10μl IgG1-FITC(Coulter Clone，Beckman Coulter)+10μlIgG1-RD1(Coulter Clone，Beckman Coul ter)+10μl IgG1-CD4 ECD(Coulter Clone，Beckman Coulter)+10μl IgG1-PC5(CoulterClone，Beckman Coulter)。
-10μl IgG2a-PC5(IOTest，Coulter Clone)。
-5μl IgG1-FITC(Coulter Clone，Beckman Coulter)+10μlIgG1-PE(BD Pharmigen)+10μl IgG2a-PC5(IOTest，CoulterClone)。
环境温度下，将细胞与各种不同的单克隆抗体在黑暗中孵育30分钟。将细胞在1X PBS中洗涤后，在1200rpm离心5分钟，用细胞术直接分析标记。
2.2 CD16位点数量的确定
在细胞表面表达的FcγRIIIa受体数量根据QIFIKIT(Dako Cytomation)技术进行评估。该技术需要提前确定占据这些细胞表面的所有抗原位点所必需的抗-CD16(克隆3G8，与荧光素偶联的抗-CD16 IgG1，Immunotech)的饱和剂量。将该细胞(0.25×106/100μl生理盐水)与增加剂量的抗-CD16 3G8在环境温度下孵育30分钟。在生理盐水中洗涤后在1200rpm离心5分钟，然后将这些细胞与50μl稀释至1/20的PE标记的抗小鼠IgGF(ab’)2(H+L)(Beckman Coulter)在黑暗中孵育30分钟。在孵育结束后，洗涤这些细胞并通过FACS(fluorescence-activated cell sorting，荧光活化细胞分选)直接分析。
根据试剂盒(No.K0078)中提供的实验方案，对2.5×105个细胞进行CD16位点数量的测定。将这些细胞与500ng所研究的抗体在环境温度下孵育30分钟。洗涤及离心(1200rpm，5分钟)后，将这些细胞与100μl稀释至1/50的FITC偶联的抗小鼠IgG F(ab’)2(Qifikit)在环境温度下黑暗中孵育30分钟。然后洗涤这些细胞并用FACS直接分析。
3.Jurkat细胞产生IL-2的测试
3.1 存在携带特异性抗原的红细胞的测试
3.1.1 测试样品的制备
抗-D抗体样品按照八个浓度数值进行测试，所述浓度为:3.125ng/ml、6.25ng/ml、9.4ng/ml、12.5ng/ml、18.75ng/ml、25ng/ml、37.5ng/ml和50ng/ml。每种浓度通过将样品稀释于IMDM+5％去补体FCS而获得。
3.1.2 靶细胞的制备
靶细胞为从供体获得的猕猴D+红细胞，优选为0+。将它们用木瓜蛋白酶(Bio-Rad)进行处理，将其按体积/体积加入到球状微球，并在37℃孵育10分钟。该反应通过加入大量的生理盐水(0.9％NaCl，Ecotainer，B BRA1M)而停止，然后将细胞用0.9％的NaCl洗涤三次，前两次洗涤后分别在3000rpm离心5分钟，最后一次洗涤后离心10分钟。然后该球状微球稀释于IMDM+5％去补体FCS中，以获得浓度为8×106细胞/ml(0.08％)的细胞悬液。
3.1.3 PMA溶液的制备
40ng/ml浓度的PMA溶液(10μg/ml，Sigma)通过在IMDM+5％FCS中稀释至1/250而制备。
3.1.4 效应细胞的制备
将在测试前经过48-72小时传代培养的Jurkat细胞在Malas Sez玻片上计数，以确定每份样品的细胞悬液体积内具有107个可用细胞(一个微孔平板所必需的数量)。将该体积的细胞悬液在1200rpm离心10分钟。然后将所得的细胞微球以2×106细胞/ml的浓度重新悬浮在IMDM+5％FCS之中。重新进行计数以确认悬液的浓度，如果需要的话则通过加入IMDM+5％FCS来调准。
3.1.5 实施测试
在有96个U形孔的平板的每个孔中置入如下成份:
-50μl待测试的抗-D抗体，
-50μl微球悬液(即每50μl 4×105红细胞)，
-50μl细胞悬液(即每50μl 4×105细胞)，
-50μl PMA(即每50μl 2ng)。
向每个平板均加入抗-D参照物溶液以及对应于抗-D多克隆抗体(Rhophylac 300IM，Biotest)的对照样品。这些孔通过搅拌混匀。将该平板在37℃孵育过夜。次日，通过在125g离心1分钟使细胞沉降。除去上清液，通过ELISA分析确定IL-2的浓度。
3.2 无靶抗原的测试
将所研究的抗体根据3.1.1章节中确定的八个浓度数值预先进行测试。在本测试中，用特异性的F(ab’)2抗-IgG片段(1.3mg/ml，JacksonImmuno-Research Laboratories)代替红细胞。将上述抗体片段也在IMDM+5％FCS中稀释为八个浓度。抗-D与F(ab’)2抗-IgG抗体在1/1.5的比率下进行研究。PMA溶液制备为10ng/ml的浓度。Jurkat细胞以2.1.4章节限定的浓度稀释于IMDM+5％ FCS中。
在有96个U形孔的平板中的每个孔中置入如下成份:
-50μl待测试的抗-D抗体，
-50μl F(ab’)2抗-IgG片段，
-50μl细胞悬液，
-50μl PMA(即每50μl 0.5ng)。
这些孔通过搅拌混匀。将该平板在37℃孵育过夜。次日，通过在125g离心1分钟使细胞沉降。除去上清液，通过ELISA分析或者对编码IL-2的信使RNA(mRNA)的分析，来确定IL-2的浓度。
3.3 通过ELISA技术分析的细胞上清液IL-2剂量
3.3.1 材料和方法
分泌的IL-2的量根据人IL-2试剂盒(DY202，R&D Systems)的操作方法进行分析。将俘获抗体分配在微孔平板的各个孔中。在牛白蛋白溶液中饱和后，待分析的上清液以及IL-2的参照溶液以不同的稀释浓度进行应用。然后加入生物素化人抗-IL-2抗体，随之加入链亲和素过氧化物酶HRP溶液。在加入底物(四甲基联苯胺)后，产生蓝色的显色。用硫酸(H2SO4)将反应终止后，经在450nm波长下对平板读数而确定每个孔的光密度。每个孔的IL-2浓度应用Biolise软件进行计算，该软件确定了IL-2数值的回归曲线([IL-2]＝a[抗体]2+b[抗体]+c)，并且考虑到每个孔中样品的稀释倍数。
3.3.2 结果的解释
由ELISA分析确定的IL-2浓度能够确定每个被测试的抗-D抗体的活性。这用如下方式计算:
从参照物抗体开始，通过绘制被测量的IL-2浓度作为抗体浓度范围的函数，建立二度方程曲线。对于每个应用的样品浓度，通过该曲线的二度方程的方式计算出等价参照物抗-D的浓度。考虑到所研究抗体的稀释度，每个等价抗-D值采用的理论浓度为:有靶细胞的测试为50ng/ml，无靶细胞的测试为10μg/ml。然后计算每个样品的平均值。为确定样品的活性百分比，人为地将参照物规定为100％活性。然后只需要计算如下关系:
重新计算的样品平均浓度/重新计算的参照物平均浓度
因此，如果未知抗-D的平均活性百分数小于100，这意味着该抗体的活性低于参照物抗体的活性。另一方面，如果活性百分数大于100，这意味着所研究的抗-D具有大于参照物的活性。
3.4 通过分析编码IL-2的mRNA分析IL-2
该技术依赖于对编码IL-2的信使RNA(mRNA)的分析。首先，从细胞提取总RNA。将RNA利用一种叫做逆转录酶的酶转换为互补DNA(cDNA)。与IL-2相对应的该基因序列经定量多聚酶链式反应(PCR)通过特异性引物被检测。为了互相对比样品，将该分析标准化是必需的。这通过同时分析编码遍在基因或结构基因的mRNA来实现，所述遍在基因或结构基因的表达水平在所有细胞中都是相同的，而与培养及刺激条件无关。在这些测试中选择的遍在基因为b-肌动蛋白，它是细胞的细胞骨架的一种组成成分。细胞被激活的程度越高，IL-2cDNA/b-肌动蛋白的比率越高。编码IL-2的mRNA为暂时的，因此，在实验条件下刺激后测定了基因表达最高峰的时间(4-6小时)。
3.4.1 材料和方法
1)细胞培养
该测试在以下条件下实施:
-200μl浓度为107细胞/ml的JURKAT CD16+细胞悬液；
-抗-D单克隆抗体mAb与F(ab’)2:
-200μl浓度为10μg/ml的抗-D单克隆抗体mAb及200μl浓度为15μg/ml的F(ab’)2特异性抗体片段(JacksonImmuno-Research)；或
-200μl浓度为5μg/ml的抗-D单克隆抗体mAb及200μl浓度为7.5μg/ml的F(ab’)2特异性抗体片段(Jackson Immuno-Research)；-200μl浓度为40ng/ml的PMA。
所有这些使用的溶液均制备于IMDM+5％FCS中。
该细胞随后在受控空气条件下(95％空气+5％CO2)，于37℃在孵育器中孵育。
2)总RNA的提取
使用两种商用试剂盒提取总RNA:
(QIAGEN):
-QIAshredder试剂盒；
-RNeasy Protect微型试剂盒；
然后被提取的RNA在260nm波长下通过分光光度计分析。
3)逆转录步骤
cDNA通过在42℃孵育1小时获得:
-1μg线性RNA(加热至65℃，随后立即冷却到4℃)；
-寡聚dT引物；
-dATP，dCTP，dGTP和dTTP；
-二硫苏糖醇(DTT)；
-RNA酶抑制物；
-逆转录酶。
4)PCR步骤
PCR步骤通过使用下述的特异性引物进行:
对于IL-2
IL-2 H1:AAC AGT GCA CCT ACT TCA AG
IL-2 H2:GTT GAG ATG ATG CTT TGA CA
b-肌动蛋白
BACT H1:GGG TCA GAA GGA TTC CTA TG
BACT H2:GGT CTC AAA CATGAT CTG GG
定量PCR通过使用Applied Biosystems 7300仪器及使用Power SyberGreen master mix试剂盒(Applied Biosystems)来实现。
用于两个引物对的程序为:
-95℃下1个去杂交循环10分钟；
-40个循环:
-95℃下去杂交10秒钟；
-60℃下“退火”(引物配对)15秒；
-72℃下延伸60秒。
在PCR结束后，扩增的产物缓慢变性，并逐渐确定游离曲线，以及对扩增产物特异性的用℃表示的Tm(解链温度)。
3.4.2 结果
对比两种不同浓度(5μg/ml及10μg/ml)的抗-D mAb制剂。一种制剂储存在5℃，而另一种在40℃存储三个月。
为了定量RT-PCR技术的需要，样品在细胞测试培养开始后4小时提取RNA。
为了通过ELISA分析培养物上清液中IL-2的技术的需要，样品在培养开始后16小时进行分析。
1)ELISA结果
在测试开始16小时后，上清液中的IL-2浓度使用一种分析试剂盒(R&D Systems)进行定量测量。获得的结果显示在图6中。
2)定量RT-PCR结果
在测试开始4小时后，Jurkat CD16+细胞中IL-2基因的表达通过实时RT-PCR进行评估。该结果已经相对于b肌动蛋白遍在基因进行了标准化。该结果显示在图7中。
3.4.3 结论
在被刺激的Jurkat CD16+细胞上清液中细胞因子IL-2浓度的直接分析方法，和通过定量RT-PCR对其基因表达的分析方法之间，具有相关性。
至于ELISA测试，IL-2基因表达的强度依赖于被研究的mAb的性质及其浓度。该技术因此能够用于研究mAb的Fc区域和CD16受体的相互作用。
实施例1
1、细胞系的鉴定
1.1 细胞系的基因分型
在本测试开发前，用Q-PCR(Applied 7300)通过等位基因分型(allelic discrimination)对每个细胞系进行了基因分型。该基因分型通过RT-PCR被证实。
Figure A200680052870D00221
通过Q-PCR(DNA)和RT-PCR(RNA)分析细胞系的基因型。
Jurkat CD16+细胞系在其膜表面不表达FcγRIII。被称作Phe的JurkatCD16+细胞系表达T(Phe)基因型。
1.2 细胞系的表型
通过FACS标记分析膜标记物能够获得下列结果:
Figure A200680052870D00222
经细胞术分析两种转染的Jurkat细胞系的膜标记物。
因此，细胞系具有如下表型:CD45+、CD2+、CD3+、CD4+、CD16+、CD58+和CD132+。
1.3 CD16位点数量的确定
本实验的目的是通过由细胞术分析的间接标记定量CD16抗原位点的数量。该技术基于使用五个群体的10μm直径的微球，所述微球用确定的增加量(103到106的抗体结合能力或ABC)的单克隆抗体(小鼠抗-人CD5)包被。使用这些不同的群体可以构建平均荧光强度(MFI)与抗体结合能力(ABC)的相应的校准曲线(calibration line)。这些细胞用相应的一抗(抗-CD16)饱和，用饱和的标记二抗进行显示。当使用上述条件时，结合的一抗数量相当于位于细胞表面的抗原位点数量。结果，荧光强度与结合至细胞的一抗数量相关。细胞的ABC通过校准曲线确定。
下表为测定的所研究细胞系CD16位点的数量的概括表(研究在若干次传代培养后进行):
 
JurkatCD16+Phe P12(0.5mg/mlG418)    P13(0.5mg/mlG418)    P16(0.5mg/mlG418)    P23(0.5mg/mlG418)    P23(1mg/mlG418) 
全体 54000 68000 68000 89000 121000
下端10％ 16000 19000 19000 27000 36000
上端10％ 121000 160000 163000 187000 250000
从库中获得的小瓶解冻后，每个细胞系在选择的培养基中通过若干次传代培养进行监测，以证实CD16表达的保持。
因此，注意到经过数次传代后，CD16的表达被保持，而且从一次传代培养到另一传代培养时，在相同的培养条件下只有微小变化。另外，选择压力和其结果倾向于显示出具有高表达潜力的克隆选择正在发生。另外，通过确定端值群体(下端10％及上端10％)位点的数量，该技术能够精确分析细胞表面CD16表达的异质性。
实施例2:CD16激活测试
1、测试的特异性
测试的特异性证实如下:在Jurkat细胞IL-2分泌的测试中引入若干对照，以确认细胞激活机制。由分析试剂盒提供的IL-2参照剂量的最后一点确定了阈值检出限为15pg/ml。低于这个阈值，细胞的IL-2分泌被认为是不可检出的。下表为引入IL-2产生测试的每一对照组经过n次实验的IL-2平均水平与标准差的一览表(<LT＝低于15pg/ml的极限阈值)
Figure A200680052870D00231
Figure A200680052870D00241
对仅有细胞的培养上清液的分析能够确定细胞的基础分泌水平，发现该水平是检测不到的。该对照能够证实在缺少任何刺激时该细胞不分泌IL-2。另外，这些对照能够确认需要两种刺激物(PMA和抗-D/F(ab’)2复合物)导致该细胞的激活。事实上，当缺少这两种刺激物之一(对照组PMA+F(ab’)2或F(ab’)2+抗-D)时，IL-2的分泌很少，甚至为零。相似地，CD16的激活需要抗体的聚集，例如在缺少F(ab’)2时可获得IL-2的分泌，但是却大大低于PMA和抗-D/F(ab’)2聚集体存在时所获得的IL-2分泌。另外，在每个实验中，证实通过使用PMA和离子霉素可达到最大激活。这些结果因此能够证明需要对JCD16+细胞双重刺激以获得IL-2的分泌。
2、剂量效应和抗体浓度范围的确定
为了确定抗-D浓度的最佳范围用于以后的实验，进行了剂量-反应测试(由以下两个曲线代表)。为此目的，在反应介质中测试了浓度范围为1-100μg/ml的R297抗体(批号c029-025)。该实验一式五份进行实施(参见图2)。
对于低抗-D浓度，刺激后24小时上清液中的IL-2浓度曲线同在本测试中加入的抗-D浓度成正比。对于高抗-D浓度，曲线达到平台区。
3、激活动力学及孵育时间的确定
为了确定最佳孵育时间，对两个细胞系的IL-2分泌进行了动力学研究。为此目的，该细胞由确定的抗-D浓度范围(0.625-10μg/ml，批号C029-025)刺激8、24、32、48、56或72小时。对相应于每个抗-D浓度、每次孵育的时间的上清液中的IL-2浓度进行分析，从而能够获得图3中的直线。
该研究能够显示经过8小时的刺激后，细胞仅分泌非常少的IL-2。从24小时开始，IL-2水平达到最大值。经过24小时的刺激后，该曲线甚至倾向于互相重叠。该最佳孵育持续时间固定在24小时以限制测试时间。
4、测试中细胞浓度的效应
在生物测试中，将细胞浓度标准化是相对困难的。本研究的目的是证实给定样品的活性百分比是否依赖于细胞浓度。为此目的，在三次独立的实验中，抗-D单克隆抗体样品(批号R297 No.05-081，T0)在五个不同的细胞浓度(C1＝105细胞/孔，C2＝2.5×105细胞/孔，C3＝5×105细胞/孔，C4＝7.5×105细胞/孔及C5＝106细胞/孔)下进行测试。然后通过与参照物抗-D(批号C029-025)对比来确定其活性百分比，人为地将参照物的活性百分比设定为100％。在三次实验中对应每个浓度获得的结果显示在下表中。
Figure A200680052870D00251
Figure A200680052870D00261
对于Jurkat CD16 + Phe细胞，包括五个细胞浓度条件的三次独立实验 中，被测试样品R297No.05-081的活性百分比。
在该研究中变异系数(CV)的分析显示，无论所研究的细胞浓度如何，该三次实验得出的样品No.05-081的活性相近。
5.测试的可重复性
当使用细胞甚至是细胞系进行测试时，会引入生物差异性。因此，为将测试标准化之目的，保证测试的良好的可重复性是必要的。当该测试被用于评价纯化方法对抗体活性的影响时，以及当进行治疗用制剂的时间稳定性研究时，这点更为必要。
因此，在若干次实验中测试了样品(批号C029-025)的活性。其活性百分比相对于与相同样品对应的参照物进行计算，参照物的活性人为地设定为100％。
Figure A200680052870D00262
Figure A200680052870D00271
 
平均值 1580 100 9
标准差 644 5 4
CV 41 5
重复性测试:在n次实验中，样品(批号C029-025)活性百分比的测定。
对于生物测试，15-20％的最大变异系数对于有效的测试而言是可以接受的。因此就我们的测试来说，获得的CV(Jurkat CD16+Phe为5％)在接受水平之下。因此，本测试可以作为常规测试用于监测样品的稳定性，以及用于验证样品在其纯化方法的过程中的活性水平。
实施例3:CD16相关抗体细胞毒性的评价
在文献中已经证明，位于免疫球蛋白重链层面的寡糖的岩藻糖基化水平会影响抗体的效应物属性。事实上，低岩藻糖水平会增加抗体与CD16结合的能力[2，6]。另外，该机制与CD16的多态性完全无关[2，7]。因此在本研究中，我们关注的是岩藻糖水平对抗体功能活性的影响。LFB具有不同的单克隆抗体制剂，并已经鉴定了它们的位于多聚糖链上的岩藻糖水平。100％岩藻糖化的抗体对应于两条多聚糖链的重链297位已经完全岩藻糖化的免疫球蛋白。在存在靶细胞的测试以及无靶细胞的测试中，研究了具有不同岩藻糖水平的不同样品:
-含有100％岩藻糖的抗-HIV Gp120，
-含有100％岩藻糖的 AD1(抗-D)，
-含有81％岩藻糖的T125 CHO(CHO细胞产生的抗-D)，
-含有64％岩藻糖的 R270(抗-D)，
-含有40％岩藻糖的 R297，
-含有33％岩藻糖的 C029-025，
-含有25％岩藻糖的 R297。
图4A和4B分别代表着在测试中有靶细胞存在的情况下获得的结果(4A)，以及无靶细胞但含有用F(ab’)2聚集的抗体制剂的情况下所得的结果。无论是何种用于确定样品性的测试，当岩藻糖水平增加时，注意到了CD16相关抗体功能活性的减少。含有100％岩藻糖水平的抗体例如AD1，甚至完全缺乏对于该受体的活性。该研究能够确认岩藻糖水平会影响抗体与CD16的结合。在重链297位天冬酰胺寡糖层面完全岩藻糖化的免疫球蛋白阻止了该抗体与CD16的所有相互作用，因此不会导致其激活。
实施例4:监测单克隆抗体稳定性的研究
本测试的另一个应用是方便地监测置于变性条件下的治疗性制剂的稳定性(参见图5)。通过在每月测量样品的活性，该监测经过数月完成。通过将样品No.05-081置于40℃来进行这一研究。在有靶细胞的测试以及无靶细胞的测试(也称为通用测试)中，在不同的时间(T0，T+1月和T+2月)进行测试其活性。通过使用参照抗体确定100％活性(具有靶细胞的测试中的参照为研究批号R297的抗体，通用测试中的参照为试验批号C029-025的抗体)。
该研究能够探测样品暴露在高温下时的活性丧失。该活性丧失与样品在高温中暴露的持续时间成正比。该研究也显示两种测试可获得相似结果。因此可将这两种测试用于监测治疗性制剂的时间稳定性。
实施例5:经热聚集的抗体或经针对F(ab’) 2 IgG片段的F(ab’) 2 片段聚 集的抗体特异性产生的IL-2的比较
研究经热聚集的(63℃下20分钟)或者经针对F(ab’)2IgG片段的F(ab’)2片段聚集的抗-D单克隆抗体制剂，对经过基因重组以表达CD16的Jurkat细胞系的IL-2产生的剂量效应。
在对上清液中的IL-2进行定量测试之前，先将聚集的单克隆抗体与Jurkat CD16+细胞在37℃孵育16小时。
结果在下表1给出:
Figure A200680052870D00281
        表1
表1显示，无论使用何种聚集单克隆抗体的方法，上清液中细胞分泌的IL-2量与测试中使用的聚集的单克隆抗体的浓度之间均存在剂量/效应关系。
然而，可观察到经热聚集的单克隆抗体所导致的IL-2分泌量，低于由IgG抗-F(ab’)2聚集的该抗体所导致的IL-2分泌量。
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Claims (27)

1.测量抗体制剂激活Fc受体的能力的方法，包括：
a)将所述抗体彼此聚集，
b)将表达Fc受体的细胞与所述聚集的抗体相接触，且
c)测量由所述抗体的Fc区域激活所述细胞的Fc受体而导致的细胞反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述聚集通过使用抗-IgGF(ab’)2片段而实现。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述抗-IgG F(ab’)2片段为针对所测试的抗体制剂的抗-Fab或抗-F(ab’)2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述聚集为热聚集。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述聚集通过将Fab区域彼此交联或将重链与轻链彼此交联的方式实现。
6.根据前述任一权利要求所述的方法，其特征在于所述Fc受体选自CD16(Fc γ RIIIa和Fc γ RIIIb)、CD32(Fc γ RIIa和Fcy RIIb)和CD64(Fcγ RI)。
7.根据前述任一权利要求所述的方法，其特征在于表达所述Fc受体的所述细胞为用编码所述受体的基因转染的细胞。
8.根据前述任一权利要求所述的方法，其特征在于表达所述Fc受体的所述细胞为表达CD16的Jurkat细胞，并且所述细胞系在存在这些细胞的非特异性激活剂例如PMA(乙酸肉豆蔻酰佛波酯)的情况下进行培养。
9.根据前述任一权利要求所述的方法，其特征在于对由所述抗体的Fc区域激活所述细胞的Fc受体而导致的细胞反应的测量为对表达CD16受体的细胞产生的至少一种细胞因子的量的测量。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于至少一种细胞因子的量的测量通过进行对所述细胞因子mRNA的分析而实现。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于选自IL-I、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、MCP-1、TNFa1pha(TNFα)或IFNgamma(IFNγ)的至少一种细胞因子被定量测量。
12.根据权利要求9-11任一项所述的方法，其特征在于白细胞介素IL-2被定量测量。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于分泌的白细胞介素IL-2的水平与ADCC型活性相关。
14.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于对细胞反应的测量为对钙内流、磷酸化、转录因子或凋亡的测量。
15.根据前述任一权利要求所述的方法，用于评价细胞产生能够与CD16受体相互作用的单克隆抗体的能力。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述产生抗体的细胞选自CHO、YB2/0、SP2/0、SP2/0-AG14、IR983F、Namalwa人骨髓瘤细胞、PERC6细胞系、CHO细胞系(特别为CHO-K-1、CHO-Lec10、CHO-Lec1、CHO-Lec13、CHO Pro-5、CHO dhfr-)、Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、COS-7、293-HEK、BHK、K6H6、NS0、SP2/0-Ag14及P3X63Ag8.653。
17.根据权利要求1-14任一项所述的方法，用于评价一个或多个纯化步骤后抗体Fc区域的效力和完整性，或用于监测置于变性条件下的治疗性制剂的稳定性。
18.根据权利要求1-14任一项所述的方法，用于评价抗体Fc区域的功能性。
19.根据权利要求1-14任一项所述的方法，用于评价由转基因植物或转基因哺乳动物产生的单克隆抗体的产量。
20.根据权利要求1-14任一项所述的方法，用于筛选治疗用的有效抗体。
21.根据权利要求1-14任一项所述的方法，用于筛选抗体组合物，所述组合物的岩藻糖含量小于65％，优选小于40％。
22.一种制备能够激活CD16(FcγRIII)受体的单克隆抗体组合物的方法，包含以下步骤：
a)从杂交瘤、异种杂交瘤、或者使用一种或多种表达所述抗体的载体转染的任何动物、植物或人的细胞系中，获得单克隆抗体；
b)通过抗-IgG F(ab’)2片段聚集步骤a)中获得的抗体；
c)将步骤b)中获得的抗体加入反应混合物，该混合物包括:
a.包含表达CD16(FcγRIII)受体的细胞的效应细胞，
b.乙酸肉豆蔻酰佛波酯
d)测量表达CD16的细胞产生的至少一种细胞因子的量；
e)针对无抗体的对照组，或者针对以给定抗体作为阴性参照物的对照组，按照被测量的细胞因子量的增加大于0.5、1、2、5、10、100或500倍筛选抗体组合物。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于对表达CD16的细胞所产生的至少一种细胞因子的量的测量为对表达CD16的细胞产生的IL-2的量的测量。
24.实施测量治疗用抗体活性的生物测试的试剂盒，包括：(1)聚集所述治疗用抗体的手段，(2)能够表达Fc受体的细胞，(3)当所述细胞的Fc受体被所述抗体的Fc区域激活时，测量能够表达Fc受体的所述细胞的反应的手段，和(4)实施根据前述任一权利要求的方法所必需的其它要素。
25.根据权利要求24所述的实施测量治疗用抗体活性的生物测试的试剂盒，其特征在于测量所述细胞的反应的手段为定量测量由所述细胞产生的至少一种细胞因子的手段。
26.根据权利要求25所述的实施测量治疗用抗体活性的生物测试的试剂盒，其特征在于定量测量至少一种细胞因子的手段为分析所述细胞因子mRNA的手段。
27.根据权利要求24所述的实施测量治疗用抗体活性的生物测试的试剂盒，其特征在于测量所述细胞的反应的手段为测量钙内流、磷酸化、转录因子或凋亡的手段。
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