KR20080094777A - 항체 특성 시험 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Fc 수용체(Fc receptor)를 활성화시키기 위한 항체 제조(antibody preparation)의 능력을 측정하기 위한 방법에 관한 것으로서, 여기에서 이 방법은 a) 상기 항체들을 서로 응집시키는 단계; b) Fc 수용체를 발현하는 세포들을 상기 응집된 항체들과 접촉시키는 단계; 및 c) 상기 항체들의 Fc 영역(Fc region)에 의한 상기 세포들의 상기 Fc 수용체의 활성화로부터 야기되는 상기 세포들의 반응을 측정하는 단계;를 포함한다.
Fc 수용체, 항체, 특성, 응집, 세포, 발현, 활성화, 응집
Description
본 발명은 Fc 수용체(Fc receptor)를 활성화시키기 위한 항체 제조(antibody preparation)의 능력을 측정하기 위한 방법에 관한 것으로서, 여기에서 이 방법은 a) 상기 항체들을 서로 응집시키는 단계; b) Fc 수용체를 발현하는 세포들을 상기 응집된 항체들과 접촉시키는 단계; 및 c) 상기 항체들의 Fc 영역(Fc region)에 의한 상기 세포들의 상기 Fc 수용체의 활성화로부터 야기되는 상기 세포들의 반응을 측정하는 단계;를 포함한다.
연구분야에서의 사용의 증가와 함께, 항체들은 또한 통상의 처치들의 대안으로서 진단 및 치료에서 선택의 도구를 제공한다. 혈장 또는 생명공학 유래의, 치료적인 용도를 위한 여러가지 항체 조제품이 현재 상용화 또는 임상개발단계에 있다. 이들의 특성들은 그들의 목표(target)들에 특이적으로 결합하고, 그리고 면역세포들을 효과적으로 회복시키는 능력을 갖는 치료적 도구들을 얻기 위하여 활용되었다.
최근 몇 년간, 항체들의 유효성을 개선시키고, 특히 그들의 일정한 Fc 영역의 조작에 대하여 연구들이 수행되고 있다. 후자는 효과기 면역세포(effector immune cells)들 및 보체 분자(complement molecules)의 유동(mobilization)을 허 용하기 때문에, 상기 항체들의 "효과기(effector)" 특성들을 좌우하는 것은 후자이다. 이러한 능력은 특정의 면역세포들에 대한 당단백질, Fc 수용체들 또는 FcRs들의 존재에 의해 가능하게 된다. 일단 항체가 결합되면, 이들 수용체들은 항체들의 가변성 영역 즉, 목표 항원 근처의 항체들의 일정한 영역에 결합될 수 있다. 이들 세포들과의 접촉에 의하여, 상기 항체들은 식세포작용(phagocytosis) 및 항체-의존성 세포 매개성 세포독성(ADCC ; Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity) 등과 같은 서로 다른 세포 메카니즘들을 촉발시킨다.
이는 항체들의 "유효성" 즉, 상기 항체들의 상기 Fc 영역의 상기 Fc 수용체들에의 결합으로 인하여, 면역 세포 메카니즘들을 촉발(trigger)시키는 항체들의 능력에 기초하여 어떻게 항체들을 구별할 것인지를 문제점으로 제기한다.
FR 02 11416 문헌에서, 출원인은 항체의 기능적 활성을 측정하기 위한 방법을 기술하고 있다. 이 방법은 반응 매질 중에서 항체와 상기 항체의 항원의 존재 중에서 CD16 수용체를 발현하는 세포들을 접촉시키는 단계 및 상기 CD16 수용체를 발현하는 상기 세포에 의해 생성된 적어도 하나의 사이토카인(cytokine)의 양을 측정하는 단계로 이루어지며, 이 측정은 상기 항체에 의한 상기 면역 시스템의 상기 효과기 세포의 활성을 나타낸다.
따라서, 이 방법은 상기 항원-항체 복합체에 의한 효과기 세포들의 활성화를 평가하는 것을 가능하게 한다. 그러나, 이 방법에서, 상기 효과기 세포들의 활성화는 그의 목표에 대한 상기 항체의 친화도 및 상기 Fc 수용체에 결합하는 상기 Fc 영역의 능력 둘 다에 의존적이다. 따라서 이 시험은 상기 항체의 상기 단일의 Fc 영역으로 인하여 상기 효과기 세포들의 활성화를 평가하는 것을 가능하게 하지 못한다.
이러한 문제에 대응하기 위하여, EP 1 298 219 문헌은 이 측정이 항체의 Fab 영역의 결합 능력에 의해 영향을 받음이 없이 항체의 상기 Fc 영역의 기능성을 측정하는 것을 가능하게 하는 방법을 제안하고 있다. 이 방법은 시험될 항체를 부동태화(immobilizing) 시키는 단계; 이를 Fc 수용체들을 발현시키기는 효과기 세포들의 존재 내로 도입하는 단계; 및 상기 항체의 상기 Fc 영역에 의한 상기 효과기 세포의 활성화로부터 야기되는 효과기 세포에서의 반응을 측정하는 단계;로 이루어진다. 이 방법에 있어서, 상기 항체들은 플레이트(plate)나 비드(beads) 상에의 코팅에 의해 부동태화 된다.
상기 플레이트에의 상기 항체들의 정확한 결합과 상기 플레이트 또는 비드들 상에의 그들의 배향 및 상기 항체의 전기적 하전 둘 다에 의존적이기 때문에, 부동태화 됨에 따라 항체들의 수는 계수될 수 없다. 실제로, 상기 항체들의 상기 전기적 하전은 그들의 아민화(amination)의 수준에 의존적이며, 이는 상기 비드들 또는 플레이트들 상에서 부동태화 되기 위한 그들의 능력에 영향을 미친다. 따라서, 이 인자(parameter)는 시험될 상기 항체들의 기능에 대한 시험의 다양성을 야기하며, 따라서 서로 다른 서열(sequence) 및/또는 특이성의 두 항체들의 상기 Fc 영역의 기능성을 비교하는 것을 어렵게 만든다. 더욱이, 상기 시험은 인간 단핵구 세포주(human monocyte line ; THP-1)을 사용하여 수행되며, 이는 반드시 상기 Fc IIIa 수용체의 일관된 표면 발면을 위하여는 감마 인터페론에 의해 활성화되어야 한다. 그러나, 활성화가 선행되어야 하므로 이는 시험의 일관성을 해치는 원인이 되며, 그에 따라, 실험결과들을 비교하기 어렵게 만든다.
따라서, 그들의 "유효성"에 기초하여 항체들 사이를 구분하는 것을 제안하는 당해 기술분야에서의 상기 방법은 상기 항체들의 상기 Fc 영역으로 인하여 상기 효과기 세포들의 활성화의 평가가 매우 적절하지 않고 또한 매우 재현적이지도 않으며, 따라서 표준화하기가 곤란하다. 이것이 재현성 있고 그리고 특히 이러한 평가에서 간섭하는 항체의 Fab 영역의 특징들을 배제하고 Fc 수용체를 활성화시키기 위한 항체의 상기 Fc 영역의 능력을 평가하는 것을 허용하는 Fc 수용체를 활성화시키기 위한 항체 제조의 능력을 측정하는 것을 가능하게 하는 신규한 방법을 개발하고자 하는 본 출원인의 의도의 이유이다.
따라서 본 발명의 첫 번째의 목적은
a) 항체들을 서로 응집시키는 단계;
b) Fc 수용체를 발현하는 세포들을 상기 응집된 항체들과 접촉시키는 단계; 및
c) 상기 항체들의 Fc 영역(Fc region)에 의한 상기 세포들의 상기 Fc 수용체의 활성화로부터 야기되는 상기 세포들의 반응을 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 Fc 수용체를 활성화시키기 위한 항체의 제조의 능력을 측정하기 위한 방법에 관련된 것이다.
본 발명의 상기 목적에 대하여, "항체들을 서로 응집시키는"은 이들을 포함하는 용액들 내에 분산된 항체들을 서로 결합시켜 네트워크(network)의 항체들 사이에 강한 결합을 나타내는 네트워크를 형성시키는 것을 의미한다.
상기 항체들의 이러한 응집은 상기 항체들을 제어되고 그리고 균질한 방법으로 그리고 모든 항체들의 Fc 영역의 적절한 제공에 적합한 방향으로 또는 그 대부분이 Fc 수용체를 발현하는 효과기 세포들의 상기 Fc 수용체 쪽으로 지향되도록 안내하는 기능을 갖는다. 실제로, 본 출원인은 이러한 응집의 효과가 놀랍게도 특정의 항체들의 상기 Fc 영역들이 조사된 상기 항체들의 특이성 또는 1차 시퀀스에 무관하게 특정의 방법으로 지향된다는 사실에 주목하였다.
본 발명에 따른 상기 방법은 상기 방법에서 활용된 항체들의 양과 상기 효과기 세포의 활성화 사이의 용량-대응 관계(dose-response relationship) 및 재현성에 대한 연구를 허용하는 잇점을 갖는다.
더욱이, 본 출원인은 이러한 방법이 놀랍게도 목표 항원의 존재 없이, 상기 Fc 수용체들을 경유하는 상기 효과기 세포의 활성화를 허용한다는 사실에 주목하였다. 실제로, 상기 Fc 수용체들은 생체 내에서 상기 항체들의 일정한 영역에 결합하는 능력이 있으며, 일단 후자가 그들의 가변성의 영역에 의해 목표 항원과 결합한다. 표면에서 상기 항원 목표를 발현하는 세포들의 부재는 이들 세포들, 생물학적 시험들에서의 공급원의 다양성의 존재의 분산(dispensing)이라는 주요 잇점을 가지며, 따라서 상기 방법의 사용에서 다양성을 도입할 수 있는 인자들을 감소시킨다.
따라서, 상기 항체의 특이성 및 1차 시퀀스의 영향과 마찬가지로 선행기술들에서의 상기 방법들에서의 목표 세포들의 존재로 인한 상기 생물학적 다양성이 본 발명의 상기 방법에서는 제한되거나 또는 심지어 0이 된다.
본 발명을 실행하기 위해서는, 항체들을 응집하기 위한 것으로서 가열 또는 예를 들어 전체 면역글로불린 지(immunoglobulins G) 등과 같은 면역학적 도구들 등과 같은 당해 기술분야에서 숙련된 자에게 공지된 모든 수단들을 사용하여 상기 항체들이 응집될 수 있으나, 본 발명이 이들에 제한되는 의미로 나열된 것은 아니다. 더욱이, 본 발명에 따른 상기 방법은 용액 내의 항체들에 대해서도 실행될 수 있다는 장점을 갖는다.
본 발명의 목적들에 대하여, "Fc 수용체"는 CD16(FcgammaRIII) 및 CD32 (FcgammaRII) 등과 같은 상기 효과기 세포들 상에 존재하는 상기 항체들의 상기 Fc 영역의 임의의 수용체를 의미한다.
본 발명의 목적들에 대하여, "항체"는 Fc 영역 또는 상기 Fc 영역과 동일한 기능들을 소유하는 영역을 포함한다고 가정하는 한 그의 특이성 및 그의 아이소타이프(isotype)에 무관하게 임의의 항체를 의미한다. 따라서, 전항체(whole antibody) 또는 예를 들어 하나의 Fc 항체 단편 등과 같은 하나의 항체의 단편이 될 수 있다. 더욱이, 본 발명에 따른 상기 방법에서 활용되는 상기 항체들은 IgGs(IgG1 또는 IgG2 또는 IgG3 또는 IgG4), IgMs, IgEs, IgAs 또는 IgDs 또는 이들의 혼합물이 될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 상기 방법에서 활용되는 상기 항체들은 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체가 될 수 있다. 이들이 모노클로날 항체인 경우, 이들 항체들은 이종혼합(chimeric), 인간화된(humanized), 인간 또는 동물 유래의 항체들이 될 수 있다. 본 발명의 목적들에 대하여, "Fc 수용체를 발현하는 세포"는 그의 표면에서 Fc 수용체를 발현하는 임의의 세포를 의미하며, 이 세포는 이러한 수용체를 자연적으로 또는 후속하는 유전자 변형 수용체를 발현시킬 수 있는 것이다. 한 예를 들면, NK세포, 활성화된 단핵구, 말초혈액 과립구(peripheral blood granulocytes), 마크로파지, 중성호구(neutrophiles), CD8 림프구(CD8 lymphocytes), Tγδ 림프구(Tγδ lymphocytes), NKT 세포, 호산구(eosinophiles), 호염기구(basophiles) 또는 비만세포(mastocytes) 등이 언급될 수 있으나, 이 목록이 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 유리하게, 이들 세포들은 항체의 상기 Fc 영역이 그들의 표면에서 발현되는 상기 Fc 수용체에 결합하는 경우에 반응하는 능력을 갖는다.
본 발명의 목적들에 대하여, "Fc 수용체를 발현하는 세포들의 반응"은 이들 세포들의 상기 Fc 수용체와 상기 항체들의 상기 Fc 영역 사이의 상호작용으로 인한 임의의 측정가능한 세포 반응을 의미한다. 이 반응은 세포내(intracellular) 또는 세포외(extracellular) 반응이 될 수 있다. 한 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 사이토카인(cytokines)의 측정, 세포내 칼슘, 창 단백질(perforin), 단백질 분해효소(granzyme) 또는 일산화질소의 수준의 측정이 언급될 수 있으나, 이 목록이 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
유리하게도, 상기 응집은 F(ab')2 항-IgG 단편을 사용하여 수행된다. 이는 상기 항체들의 상기 Fc 영역들의 배향을 제어한다는 관점에서 특히 유리한 응집을 허용하는 것을 의미한다. 실제로, 각 F(ab')2 단편은 2개의 시험될 서로 다른 항체들에 결합하며, 따라서 시험될 상기 항체들의 상기 Fc 영역들을 적절한 방법으로 배향시킨다. 이러한 배향은 상기 효과기 세포들의 상기 Fc 수용체들과의 상호작용에 특히 적절하며, 따라서 상기 효과기 세포들의 활성화에 특히 적절하다.
이 실시예에서 사용될 수 있는 상기 F(ab')2 항-IgG 단편들이 임의의 단편들, 상기 항체들의 일부 또는 도메인(domain), 예를 들면, 상기 IgG 분자의 상기 Fc 영역 또는 상기 Fab 영역 또는 전체에 대하여 지향될 수 있다. 상기 F(ab')2 단편들은 또한 모노클로날 또는 폴리클로날 유래가 될 수 있다.
본 발명의 이 실시예에 있어서, 시험될 항체들의 농도 및 상기 F(ab')2 농도는 정확하게 제어될 수 있다. 따라서 상기 2가지들 사이의 관계를 계산하는 것이 가능하며, 시험될 항체 제조에 무관하게 재현성 있는 시험들을 수행하는 것을 가능하게 한다.
특히 유리하게, 이 F(ab')2 항-IgG 단편은 상기 시험된 항체 제조에 대향하는 항-Fab 또는 항-F(ab')2 이다. 이 단편은 염소 또는 토끼의 단편이 될 수 있다.
이 특정의 실시예에 있어서, 각 F(ab')2 단편은 시험될 2개의 항체 분자들의 상기 Fab 부분들에 결합하고, 그에 따라 상기 시험될 항체들의 상기 Fc 영역들을 적절한 방법으로 배향시켜 이들이 상기 FcR에 결합하도록 하고 그리고 그 표면에서 이들 FcRs를 발현하는 상기 세포들을 활성화시키는 것을 허용하도록 한다.
다른 실시예에 따르면, 상기 응집은 열에 의한 응집이다. 본 발명의 상기 방법에서 상기 항체들은 먼저 가열되어 이들이 서로 응집되도록 하고(단계 a), 계속해서 Fc 수용체를 발현하는 세포들과 접촉하도록 한다(단계 b). 상기 항체들을 서로 응집시키기에 적절한 임의의 가열 방법이 본 발명의 상기 방법의 실행에서 사용될 수 있다. 한 예를 들면, 상기 항체들을 60℃에서 30분간 가열시키는 것이 언급될 수 있다(문헌 Van Mirre et al. (2004). Monomeric IgG in intravenous Ig preparations is a functional antiagonist of FcgRII and FcgRIIIb. The journal of Immunology; 332:339을 참조하시오).
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 응집은 상기 Fab 영역들을 서로 가교결합(cross-linking)시키는 것에 의해 또는 서로 중연쇄(heavy chain ; 重連鎖) 또는 경연쇄(light chain ; 輕連鎖)에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 목적들에 대하여, "가교결합"은 이들 항체들을 균질하게 상기 효과기 세포들의 상기 CD16 수용체들 쪽으로 향하도록 하여 두 항체분자들 사이의 임의의 가교화(bridging) 시키는 것을 의미한다. 유리하게도, 하나의 항체가 하나 또는 그 이상의 가교화들에 포함될 수 있다. 따라서, 상기 항체들은 네트워크를 형성할 수 있으며, 그의 배향은 상기 효과기 세포들에 의해 운반되는 상기 CD16 수용체들의 최적의 결합에 적절하다. 유리하게도, 상기 항체들의 서로의 가교결합(즉, 가교화)을 허용하는 임의의 수단들이 본 발명의 실행에 적절하다. 한 예를 들면, 화학적 결합들 또는 자외선 방사에 의한 가교화들이 언급될 수 있으나, 이 목록이 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 유리하게도, 상기 효과기 세포들에 의해 발현된 상기 Fc 수용체는 CD16(FcγRIIIa and FcγRIIIb), CD32 (FcγRIIa and FcγRIIb) 및 CD64 으로부터 선택된다. 특히 유리하게 CD16이 선택된다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 Fc 수용체를 발현하는 상기 세포들은 상기 수용체를 엔코딩(encoding)하는 유전자로 감염된 세포들이다. 이 실시예에 있어서, 상기 효과기 세포들에 의해 제공되는 수용체들의 알로타입(allotype)을 제어하는 것이 가능하다. 실제로, 원하는 시험들을 고려하여 그의 특성들에 대하여 선택된 단 하나의 수용체 또는 이들 수용체들의 조합을 갖는 세포들로 본 발명의 방법을 실행하는 것이 가능하다. 예를 들면, CD16을 코딩(coding) 하는 유전자로 세포들을 감염시키는 것에 의하여 단지 CD16 만을 발현하는 효과기 세포들을 사용하는 것을 선택하는 것에 의하여 본 발명을 실행하는 것이 가능하다. 따라서, 다른 다양한 인자들 즉, 상기 효과기 세포들의 표면에 존재하는 Fc 수용체의 속성(nature) 및 양(quantity)을 분산시키는 것이 가능하다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 Fc 수용체를 발현하는 상기 세포들은 CD16을 발현하는 유르카트 세포(Jurkat cells ; 혈액암세포)들이며, 이 세포주는 PMA(포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 ; Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) 등과 같은 이들 세포들의 비-특이성 활성화제의 존재 중에서 배양된다. 이 세포주로의 본 발명에 따른 상기 방법의 실행의 특히 유리한 관점들 중의 하나는 이 세포주가 상기 응집된 항체들과의 접촉에 상기 효과기 세포들을 위치시키기 전에 활성화를 필요로 하지 않는다는 사실에 기초하고 있다는 것이다. 실제로, 특정의 효과기 세포주들은 상기 Fc 수용체들의 충분히 명백한 발현을 위해서는 하나 또는 그 이상의 사이토카인을 사용하여 활성화시킬 것을 필요로 한다(EP 1 298 219 서류를 참조하시오). 이러한 사이토카인으로의 선행의 활성화는 종종 무작위이고, 시간의 손실 및 실험들의 표준화를 곤란하게 하는 두 가지의 결과를 가져오며, 이는 쉽게 극복되기 어렵다. 더욱이, 상기 CD16 수용체("Jurkat CD16 line")를 코딩하는 발현 벡터로 감염된 상기 유르카트 세포주는 불멸화(immortalize)되는 잇점이 있고, 따라서 배양 매질 중에서 무한하게 복제된다.
이들 세포들은 이들이 이중으로 자극되는 경우에 활성화될 수 있다는 잇점을 갖는다. 본 발명의 방법에 있어서, 상기 유르카트 CD16 세포들의 활성화는 PMA(이는 T-세포들의 비특이성 활성화제임) 및 CD16의 상기 항체의 상기 Fc 영역에의 결합에 의해 실행된다. 상기 유르카트 세포들의 활성화는 배양 상층액(culture supernatant) 내로의 IL-2의 방출에 의해 나타난다. 그 결과로서, 상기 CD16와 마주하는 상기 항체의 상기 Fc 영역이 보다 기능적일수록, 상기 상층액 내로 방출된 IL-2의 양은 더 증가한다.
유리하게도, 상기 항체들의 상기 Fc 영역들에 의한 상기 세포들의 상기 Fc 수용체들의 활성화의 결과로의 상기 세포들의 상기 반응의 측정은 CD16 수용체들을 발현하는 상기 세포들에 의해 생성된 적어도 하나의 사이토카인의 양을 측정하는 것이 된다. 실제로, 다른 무엇 보다도, 상기 효과기 세포들의 상기 활성화는 상기 배양 상층액 내의 IL-2의 방출에 의해 나타난다. 예를 들면, 상기 배양 매질 내의 사이토카인의 농도는 상용적으로 획득가능한 엘리사 시험(ELISA test ; 생물검정)의 수단에 의해 측정될 수 있다. 다른 방법들도 IL-2 등과 같은 사이토카인의 합성을 평가하는 것을 가능하게 하며, 이들은 IL-2의 전령 RNA들의 분석을 위한 정량 역전사 중합효소 연쇄반응법(RT-PCT ; Revers-transcriptase polymerase chain reaction) 및 노던 블럿 테크닉(Northern blot techniques) 또는 세포내 IL-2 및상기 배양 상층액 내의 IL-2의 정량을 위한 웨스턴 블럿(Western blot) 및 세포분석(cytometry)들이 될 수 있으나, 이 목록이 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 하나의 실시예에 있어서, 적어도 하나의 사이토카인의 양의 측정은 이들 사이토카인들의 mRNA들의 분석을 실행하는 것에 의해 유효하게 될 수 있으며, 이들 mRNA들의 양은 대응하는 사이토카인들의 발현의 수준에 관련되며, 이는 상기 효과기 세포들의 활성화 수준을 나타낸다.
유리하게도, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, MCP-1, TNFalpha (TNFα) 및 IFNgamma (IFNγ)로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인이 정량되나, 이 목록이 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
특히 유리하게도, 상기 세포 반응의 측정은 인터루킨 IL-2의 정량화(quantification)이다.
분비된 인터루킨 IL-2의 수준은 ADCC-형 활성에 상관이 있다. 실제로, 상기 효과기 세포들에 의한 사이토카인의 분비와 상기 효과기 세포들의 상기 CD16에 의해 조정된 상기 ADCC 활성 사이에는 강한 상관관계가 존재한다(FR 02 11416 서류를 참조하시오). 따라서, 본 발명의 상기 방법은 세포독성 항체들, 특히 치료적인 용도를 선택하는 데 특히 유리하다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 세포 반응의 측정은 칼슘 유입(calcium influx), 포스포릴화(phosphorylation), 전사 또는 세포사(apoptosis) 인자들의 측정이 된다. 이들 인자들의 증가는 상기 효과기 세포들의 활성화와 관련되며, 이는 상기 효과기 세포들의 상기 Fc 수용체들을 활성화시키는 상기 항체들의 능력을 나타낸다.
유리하게도, 상기 방법은 상기 CD16 수용체와 상호작용할 수 있는 모노클로날 항체를 생성하는 세포의 능력을 평가, 즉 항체의 세포독성 또는 항체 제조를 평가하는 데 적절하다. 문헌에서, CD16에 대한 항체의 친화도는 예를 들면 CD16의 다형성(polymorphism) 등과 같은 상기 Fc 수용체의 특성들에 의존적이라는 것이 입증되었으며(Method according to claim 1, characterized in that said aggregation is carried out by means of an anti-IgG F(ab')2 fragment 및 Method according to claim 2, characterized in that said anti-IgG F(ab')2 fragment is an anti-Fab or a anti-F(ab')2 directed against the antibody preparation tested 문헌들을 참조하시오), 또한 면역글로블린의 상기 중연쇄들의 위치 297 내의 아스파라긴 상에 존재하는 올리고당의 Fc 영역 또는 푸코스 수준이 상기 Fc 수용체들의 결합에 중요한 역할을 한다는 것이 입증되었다(Shields R. L., Lai J., Keck R., O'Connell L: Y., Hong K., Meng Y. G., Weikert S. H. A., and Presta L. G.: (2002)J. Biol. Chem., vol. 277, n[.]30, 26733-26740 및 Niwa R., Hatanaka S., Shoji-Hosaka E., Sakurada M., Kobayashi Y., -Uehara A., Yokoi H., Nakamura K., and Shitara K. (2004), Clinical Cancer Research, 10, 6248-6255. 문헌들을 참조하시오).
항체들을 생성하는 상기 세포주는 구분될 수 있는 임의의 세포주가 될 수 있으나, 바람직하게는 CHO, YB2/0, SP2/0, SP2/0-AG14, IR983F, 나말바 인간 골수종(the Namalwa human myeloma), PERC6 세포주, the CHO 세포주, 특히 CHO-K-1, CHO-Lec10, CHO-Lec1, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, 유르카트(Jurkat), 베로(Vero), Molt-4, COS-7, 293 -HEK, BHK, K6H6, NS0, SP2/0-Ag 14 및 P3X63Ag8.653들로부터 선택된 것이 될 수 있으나, 이 목록이 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
유리하게도, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 정제 단계들 이후에 수득된 항체 제제들의 상기 Fc 영역의 유효성 및 일체성(integrity)를 평가하는 데 적절하다.
본 발명의 상기 방법의 또 다른 응용은 변성 조건(denaturing conditions)들 하에 놓여진 제제, 특히 치료용의 모노클로날 또는 폴리클로날 항체들의 안정성을 감시하는 것이다.
따라서 본 발명의 상기 방법은 오랜 시간에 걸친 치료용의 제제들을 감시하는 데 특히 유용하다. 실제로, 본 출원인은 수개월에 걸쳐 변성 조건 하에서 저장된 항체 제제의 활성을 감시하였고, 그리고 활성이 감소함을 입증했다. 따라서, 치료용 제제가 고온, 예를 들면 40℃에서 저장된 경우 오랜 시간에 걸쳐 그의 활성을 손실한다. 더욱이, 상기 목표 항원들을 수반하는 상기 세포들을 포함하는 시험들과는 달리, 본 발명의 상기 방법은 상기 항체의 어느 부분이 활성의 손실에 포함되었는 지를 구분하는 것을 가능하게 한다. 일단 변성되면, 상기 항체들의 상기 Fc 영역이 CD16에 대한 그의 친화도를 손실한다는 것은 명백하다(실시예 4를 참조하시오).
더욱이, 상기 방법은 상기 항체의 상기 Fc 영역의 상기 기능성을 측정하는 데 유리하게 적절하다. "항체의 Fc 영역의 기능성"은 본 발명의 목적에 대하여는 이 Fc 영역이 그의 상기 Fc 수용체, 특히 상기 CD16 수용체에의 결합을 경유하여 상기 효과기 세포들을 활성화시키는 능력을 의미한다. 본 발명의 상기 방법은 고도로 재현성이며(예를 들면, 실시예 2의 단락 5를 참조), 효율성 측정이 고도로 세포독성인 항체들을 스크리닝(screening) 하기 위한 것과 마찬가지로 서로 다른 시퀀스 및/또는 특이성의 항체들에 대하여도 동일하기 때문에, 이 방법은 항체 제제들의 기능성을 기계적으로 분석하는 데 사용될 수 있다.
유리하게도, 상기 방법은 이식유전자 식물(transgenic plants) 또는 이식유전자 포유동물들에 의한 모노클로날 항체들의 생산을 평가하는 데 적절하다. 본 발명에 따른 상기 방법의 실행에 의하여, 그에 따라 생산된 상기 항체들은 Fc 수용체를 활성화시키기 위한 그들의 Fc 영역의 능력에 대하여 특정될 수 있다.
유리하게도, 상기 방법은 치료적 처치를 위한 유효한 항체들을 선택하는데 적절하다. 한 예를 들면, 항체들이 없는 대조군 또는 부의 대조군(negative reference)로서 주어진 항체애 대하여 관측된 것 보다 100% 또는 250%, 유리하게는 500% 또는 바람직하게는 1000% 이상의 사이토카인, 예를 들면 IL-2의 방출수준의 항체들이 선택된다.
유리하게도, 상기 방법은 그의 푸코스 함량이 65% 이하, 바람직하게는 40% 이하인 항체 조성물을 선택하는 데 적절하다. 실제로, 항체 제제들의 활성이 상기 중연쇄 위치 297 내의 글리칸 단위(glycannic unit) 상의 푸코스 함량에 의존적임이 입증되었다.
상기 항체들은 중연쇄들 및 경연쇄들로 이루어지며, 이황화 다리(disulphide bridges)들로 서로 연결된다. 각 사슬은 N-말단 위치에서 상기 항체가 지향되는 상기 항원의 특정의 가변 영역(또는 도메인)으로 이루어지며, 또한 C-말단 위치에서 일정한 영역에 의하여 상기 경연쇄들에 대하여 단일의 CL 도메인으로 그리고 상기 중연쇄들에 대하여 여러 도메인들(CH1, CH2 및 CH3)로 이루어진다. 상기 중연쇄와 상기 경연쇄들의 상기 가변의 도메인들과 상기 CH1 및 CL 도메인들의 결합은 상기 항체의 상기 Fab 부분들을 형성하며, 이는 매우 유연한 힌지 영역(hinge region)에 의해 상기 Fc 영역에 연결되어 각 Fab가 상기 목표 항원에 결합하는 것을 허용한다. 상기 항체의 상기 효과기 특성들의 중개자(mediator)인 상기 Fc 영역은 FcγR 수용체들(FcgammaR) 등과 같은 상기 효과기 분자들에 접근가능하게 남게 된다. 2개의 구형 도메인들(globular domains) CH2 및 CH3로 이루어진 상기 Fc 영역은 상기 2개의 연쇄들 각각 위에서 아스파라긴 297(Asn 297)에 결합된 이중안테나-형의 N-글리칸(biantenna-type N-glycan)의 존재 중에서 상기 CH2 도메인의 수준에서 글리코실화 된다.
이 형태의 N-글리칸이 하기의 일반적인 형태(제공된 형태("G0)이고 여기에 다른 당들이 첨가될 수 있음)로 제공된다.
따라서, 본 발명에 따른 항체 조성물 중에서, "푸코스"는 이들 N-올리고당에 의해 수반되는 푸코스를 의미한다. 그것이 존재하는 경우에, 상기 푸코스 분자는 상기 N-올리고당의 N-아세틸글루코사민(GIcNAc)에 결합되고, 이 GIcNAc는 그 자체로 상기 Asn 297에 결합된다. 각 항체의 상기 2개의 중연쇄들 각각에 의해 수반되는 상기 2개의 N-글리칸들 각각은 푸코스 분자를 수반하거나 또는 수반하지 않을 수 있다. 따라서, 그의 N-글리칸들 어느 것도 푸코스를 수반하지 않거나, 그의 N-글리칸들의 단 하나가 하나의 푸코스 분자를 수반하거나 또는 그의 N-글리칸 둘다 각각 하나의 푸코스 분자를 수반하는 가에 따라, 각 항체는 각각 0, 1 또는 2개의 푸코스 분자들을 포함할 수 있다. 따라서, "그의 푸코스 함량이 65% 이하인 항체 조성물"은 상기 조성물의 상기 항체들의 각 글리코실화 자리(Asn 297)에 의해 수반되는 상기 글리칸 구조들의 전체로부터 65% 이하의 푸코스 분자를 포함하는 항체 조성물을 의미한다.
이러한 조성물들이 ADCC 활성에 특히 유리하다는 것이 본 출원인에 의해 입증되었다.
바람직하게는, 그의 푸코스 함량이 20 내지 45% 또는 25 내지 40% 사이로 포함되는 항체들의 조성물들이 선택된다. 본 발명의 상기 방법의 수단들에 의해, 상기 항체 조성(제제)에서의 상기 푸코스 수준이 감소되는 경우에서 상기 CD16에 대한 상기 항체들의 기능상의 활성이 증가한다는 의미에서 기능상의 활성과 푸코스 수준 사이의 정량적인 관계가 나타났다.
본 발명의 또 다른 목적은
a) 항체를 발현시키기 위한 하나 또는 그 이상의 벡터들을 사용하여 감염된 하이브리도마(hybridoma), 헤테로하이브리도마(heterohybridoma) 또는 임의의 동물, 식물 또는 인간 세포주로부터 항체들을 수득하는 단계;
b) 단계 a)에서 수득된 항체들을 F(ab')2 항-IgG 단편으로 응집시키는 단계;
c) 단계 b)에서 수득된 항체들을 CD16을 발현하는 세포들을 포함하는 효과기 세포들 및 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)를 포함하는 반응 혼합물에 첨가하는 단계;
d) 상기 CD16 발현 세포에 의해 생산된 적어도 하나의 사이토카인의 양을 측정하는 단계;
e) 항체들이 존재하지 않거나 또는 부의 대조군으로서 주어진 항체의 존재 중에서의 대조군과 비교하여 0.5배, 1배, 2배, 5배, 10배, 100배 또는 500배 이상의 사이토카인의 양의 증가가 측정된 항체 조성물을 선택하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 모노클로날 항체 조성물의 제조를 위한 방법에 관한 것이다.
유리하게도, CD16 발현 세포들을 포함하는 상기 효과기 세포들은 유르카트 CD16 세포들이다.
본 발명의 하나의 실시예에 있어서, 상기 적어도 하나의 사이토카인의 양의 측정은 이들 사이토카인들의 상기 mRNA들의 분석을 실행하는 것에 의해 유효하게 되며, 이들 mRNA들의 양은 대응하는 사이토카인들의 발현의 수준에 상관되며, 이는 상기 효과기 세포들의 활성화의 수준을 나타낸다.
예를 들면, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, MCP-1, TNFalpha (TNFα) 및 IFNgamma (IFNγ)로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인이 정량되나, 이 목록이 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
유리하게도, 상기 세포 반응의 측정은 인터루킨 IL-2의 정량화이다.
분비된 인터루킨, 예를 들면 IL-2는 ADCC-형의 활성에 상관관계가 있다. 실제로, 상기 효과기 세포들에 의한 상기 사이토카인들의 분비와 상기 효과기 세포들의 상기 CD16에 의해 중재된 상기 ADCC 활성 사이에는 강한 상관관계가 존재한다(FR 02 11416 문서를 참조하시오).
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 세포 반응의 측정은 칼슘 유입, 포스포릴화, 전사 또는 세포사의 측정이다. 이들 인자들의 증가는 상기 효과기 세포들의 활성화에 상관관계가 있으며, 이는 상기 효과기 세포들의 상기 Fc 수용체들을 활성화시키는 상기 항체들의 능력을 나타낸다.
유리하게도, CD16 발현 세포에 의해 생산된 적어도 하나의 사이토카인의 양의 측정은 상기 CD16 발현 세포에 의해 생산된 IL-2의 양의 측정이 된다.
본 발명의 또 다른 목적은 앞서 기술된 방법들 중의 어느 하나의 실행을 위해 필요한 구성요소들을 포함하는 치료적 항체들의 활성을 측정하기 위한 생물학적 시험의 실행을 위한 키트(kit)에 관련된 것이며, 이는 특히 (i) 상기 치료적 항체들을 응집시키기 위한 수단, (ii) Fc 수용체를 발현할 수 있는 세포들, (iii) 상기 세포들의 상기 Fc 수용체가 상기 항체들의 상기 Fc 영역에 의해 활성화되는 경우에 Fc 수용체를 발현할 수 있는 상기 세포들의 상기 반응을 측정하기 위한 수단들 및 (iv) 상기한 바에 따른 방법들의 실행을 위해 필요한 다른 구성요소들을 포함한다.
치료적 항체들의 활성을 측정하기 위한 생물학적 시험의 실행을 위한 키트는 (i) 상기 치료적 항체들을 응집시키기 위한 수단, (ii) Fc 수용체를 발현할 수 있는 세포들, (iii) 상기 세포들의 상기 Fc 수용체가 상기 항체들의 상기 Fc 영역에 의해 활성화되는 경우에 Fc 수용체를 발현할 수 있는 상기 세포들의 상기 반응을 측정하기 위한 수단들 및 (iv) 상기한 바에 따른 방법들의 실행을 위해 필요한 다른 구성요소들을 포함한다.
본 발명의 하나의 유리한 실시예에 있어서, 상기 키트 내에 포함된 상기 세포들의 상기 반응을 측정하기 위한 수단은 상기 세포들에 의해 생산된 적어도 하나의 사이토카인을 정량하기 위한 수단이 된다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 키트 내의 상기 세포들의 상기 반응의 측정을 위한 수단은 칼슘 유입, 포스포릴화, 전사 인자들 또는 세포사를 측정하는 수단들이 된다.
본 발명의 다른 관점들 및 잇점들은 이하의 실시예들에서 기술되나, 이는 설명을 위한 것으로 고려되어야 하며, 본 발명의 관점을 제한하는 것은 아니다.
도 1a는 5개 분포의 비드들의 형광의 평균 강도의 측정에 의해 정의된 보정 곡선이다.
도 1b는 항-CD16 표지의 FACS 분석에 의해 얻어진 JCD16+ Val 분포의 CD16 발현 프로파일이다.
도 2는 응집된 항-D 항체(C029-025)의 배치 용량-응답 곡선이다. JCD16 + Phe 세포들에 특이적인 곡선이다. 적색 수직선은 상기 시험들의 잔여물들에 사용된 농도들의 범위의 한계(0.625 내지 10㎍/㎖)를 정한다.
도 3은 상기 JCD16+ Phe 세포들에 대한 IL-2 분비의 동역학적 다이아그램(kinetic diagram)이다.
도 4는 항체들의 활성에 대한 항체들의 푸코스 수준의 영향을 나타내는 도면으로서, 도 4a는 목표 세포들의 존재 중에서의 시험에서 항-Gp120 항체들 VIH (100% 푸코스), AD1 (100% 푸코스), T125 CHO (81% 푸코스), R270 ( 64% 푸코스), R297 (40% 푸코스) 및 R297 (25% 푸코스)의 활성의 시험결과이고, 도 4b는 목표 세포들의 부재 중의 시험에서의 항-Gp120 HIV 항체들(100% 푸코스), AD1 (100% 푸코스), T125 CHO (81% 푸코스), R270 ( 64% 푸코스), R297 (40% 푸코스), C029-025 (33% 푸코스) 및 R297 (25% 푸코스)의 활성의 시험결과이다.
도 5는 개월 단위의 활성의 측정에 의한 40℃에서의 배치 05-081의 안정성에 대한 감시의 결과의 그래프이다.
도 6은 10㎍/㎖ 및 5㎍/㎖에서의 항-D 모노클로날 항체의 활성 대 CD16을 활성화시키기 위한 활성에 대한 온도의 영향을 측정한 그래프이며, 측정은 엘리사 시험법으로 실행하였다.
도 7은 10㎍/㎖ 및 5㎍/㎖에서의 항-D 모노클로날 항체의 활성 대 CD16을 활성화시키기 위한 활성에 대한 온도의 영향을 측정한 그래프이며, 측정은 정량 역전사 중합효소 연쇄반응법(RT-PCT)으로 실행하였다.
1. 세포 배양
1.1 세포주
1984년에 A. Weiss에 의해 유르카트 세포주, 클론 E6-1(No. ATCC TIB-152)이 ATCC(미합중국 유전자은행)에 기탁되었다(Weiss A., Wiskocil R.L., and Stobo J.D. 1984, J. Immunol., vol. 133, n[.]l, 123-128.을 참조하시오). 상기 클론 E6-1은 야생형(wild-type)의 유르카트 세포주로부터 수득되었다. 이는 1977년에 슈나이더(Schneider)와 그의 동료들에 의해 급성 임파아구 백혈병(lymphoblastic leukaemia)을 앓고 있는 14세된 아이의 말초혈액으로부터 단리되었다(Schneider U., Schwenk H. U., and Bornkamm G. (1977) Int. J. Cancer., vol. 19, n[.]5, 621-626.을 참조하시오). T 세포 마커(T cell markers)를 발현하는 이 세포주는 2개의 서로 다른 활성화 신호들로 자극되는 경우에 인터루킨 2(IL-2)를 생성할 수 있다. 그러나, 분비된 IL-2의 수준은 세포주의 근원 및 취급 조건들에 따라 변한다. 이것이 서로 다른 근원들의 유르카트 클론들이 감염되어 이들이 막 수준에서 FcγIIIa 수용체를 발현하기 때문이다. 인간 이종혼합 FcγIIIa(human chimeric FcγIIIa ; γ연쇄의 막투과 및 세포내 도메인들과 관련된 CD16의 세포외 도메인)를 인코딩하는 발현 벡터 및 및 네오마이신 선택 유전자(neomycin selection gene)에 의한 감염에 의해 하나의 세포주가 수득되었다. 이들이 위치 158에 페닐알라닌을 갖는 인간 CD16을 발현하기 때문에, 이들 세포들을 JCD16+ 로 칭하기로 한다.
1.2 배양 및 2차 배양 매질
상기 JCD16+ Phe 세포들을 감마선으로 조사하고 보충하지 않은(decomplemented) 10% 우태혈청(FCS ; Foetal Calf Serum)(인비트로겐) 및 0.5㎎/㎖의 네오마이신 유사체(G418 설페이트)(프로메가)를 첨가한, IMDM 매질(이스코브 변형 둘베코의 매질) + 4mM 엘-글루타민 + 25mM HEPES 완충제(기브코, 인비트로겐) 내에 저장하였다. 이 세포주를 0.2*10 세포/㎖의 식종율(seeding rate)로 주당 2회의 2차배양의 속도로 배양을 유지하였다.
2. 유세포측정(
Flow
cytometry
)
EPICS XL 세포분석기(cytometer)(베크만 쿨터(Beckman Coulter) 상에서 서로 다른 표지들을 분석하였다.
2.1
JCDl6
+
Phe
세포주의 표현형 검사(
Phenotyping
)
이 표현형 검사는 CD45 (백혈구 세포들의 마커(marker of the leucocyte cells)), CD19 (B 림프구 특이의 마커(specific marker of the B lymphocytes)), CD2, CD3, CD4 및 CD8 (T-림프구 특이의 마커(specific markers of T-lymphocytes)), CD58 (CD2의 리간드) 들의 서로 다른 막 마커들의 분석 및 또한 IL-2 수용체(CD25 또는 IL-2 Rα, CD122 또는IL-2 Rβ 및 CD132 or IL-2 Rγ)의 서로 다른 연쇄들에 관련된다. 상기 표지들은 100㎕의 PBS 1X(인산염 완충제) 내의 106 세포들에 대하여 실행되었다. 조건들은 다음과 같이 하였다.
10㎕의 항-CD2 FITC(2-플루오레세인 이소티오-시아네이트, 쿨터 클론, 베크만 쿨터사(2-fluorescein isothio-cyanate, Coulter Clone, Beckman Coulter)) + 10㎕의 항-CD3 RD1(R-피코에리쓰린/텍사스 레드 탠덤 다이, 쿨터 클론, 베크만 쿨터사(R-phycoerythrin, Coulter Clone, Beckman Coulter)) + 10㎕의 항-CDl9 ECD(R-피코에리쓰린/텍사스 레드 탠덤 다이, 쿨터 클론, 베크만 쿨터사) + 10㎕의 항-CD16 PC5(R-피코에리쓰린/시아닌 5 탠덤 다이, IO테스트, 베크만 쿨터사).
10㎕의 항-CD45 FITC(쿨터 클론, 베크만 쿨터 사) + 10㎕의 항-CD3 RD1(쿨터 클론, 베크만 쿨터 사) + 10㎕의 항-CD4 ECD(쿨터 클론, 베크만 쿨터 사) + 10㎕의 항-CD8 PC5(쿨터 클론, 베크만 쿨터 사).
- 10㎕의 항-CD58 PC5(IO테스트, 쿨터 클론).
- 5㎕의 항-CD122 FITC(쿨터 클론, 베크만 쿨터 사) + 10㎕의 항-CD132 PE(피코에리쓰린, BD 파미젠(BD Pharmigen)) + 10㎕의 항-CD25 PC5(IO테스트, 쿨터 클론).
이들 4가지 표지들과 나란히, 동형의 대조군들을 실행하였으며, 각각은 다음에 대응한다.
- 10㎕의 IgG1-FITC(쿨터 클론, 베크만 쿨터 사) + 10㎕의 IgG1-RD1(쿨터 클론, 베크만 쿨터 사) + 10㎕의 IgG2b-ECD(쿨터 클론, 베크만 쿨터 사) + 10㎕의 IgG1-PC5(IO테스트, 베크만 쿨터 사).
- 10㎕의 IgG1-FITC(쿨터 클론, 베크만 쿨터 사) + 10㎕의 IgG1-RD1(쿨터 클론, 베크만 쿨터 사) + 10㎕의 IgG1-CD4 ECD(쿨터 클론, 베크만 쿨터 사) + 10㎕의 IgG1-PC5(IO테스트, 베크만 쿨터 사).
- 10㎕의 IgG2a-PC5(IO테스트, 쿨터 클론).
- 5㎕의 IgG1-FITC(쿨터 클론, 베크만 쿨터 사) + 10㎕의 IgG1-PE(BD 파미젠) + 10㎕의 IgG2a-PC5(IO테스트, 쿨터 클론).
상기 세포들을 서로 다른 모노클로날 항체들의 존재 중에서 암실, 실온, 주변 대기 중에서 30분 동안 배양시켰다. PBS 1배(1X) 중에서 상기 세포들을 세척하고 1200rpm에서 5분간 원심분리한 후, 세포분석기로 상기 표지들을 직접적으로 분석하였다.
2.2
CD16
자리들의 수의 결정
상기 세포 표면에서 발현된 FcγRIIIa 수용체들의 수를 QIFIKIT(다코 사이토메이션(Dako Cytomation)) 기술에 따라 평가하였다. 이 기술은 상기 세포들의 상기 표면에서의 모든 상기 항원성 자리들을 점유하는 데 필요한 항-CD16 항체( 플루 오레세인으로 공액화(conjugated)된 클론 3G8, 항-CD16 IgG1, 임뮤노테크(Immunotech))들의 포화 용량의 사전 결정을 필요로 한다. 상기 세포(0.25*106/100㎕ 생리식염수)들을 실온에서 30분 동안 항-CD16 3G8의 용량을 증가시키면서 배양시켰다. 생리식염수 내에서의 세척하고, 1200rpm에서 5분간 원심분리한 후에, 계속해서 상기 세포들을 1/20회로 희석된, 50㎕의 PE 표지화된 항-마우스 IgG F(ab')2 (H+L)(베크만 쿨터)와 함께 암실에서 30분간 배양시켰다. 상기 배양의 종료에서, 상기 세포들을 세척하고 그리고 FACS(형광-활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting))에 의해 직접적으로 분석하였다.
CD16 자리들의 개수의 결정은 상기 키트(No. K0078) 내에 공급된 안내서(protocol)에 따라 2.5*105 세포들에 대해 실행되었다. 상기 세포들은 실온에서 30분간 대상 항체들 500ng을 배양시켰다. 세척 및 원심분리(1200rpm에서 5분간) 후에, 상기 세포들을 1/50회로 희석된, 100㎕의 FITC-결합 항-마우스 IgG F(ab')(키피키트(Qifikit))와 함께 암실, 실온에서 30분간 배양시켰다. 계속해서 상기 세포들을 세척하고 그리고 FACS(형광-활성화 세포 분류)에 의해 분석하였다.
3.
유르카트
세포들에 의한
IL
-2 생산 시험
3.1
특헝의
항원을 수반하는 적혈구(
erythrocytes
)의 존재 중에서의
시험
3.1.1 시험을 위한 시료의 제조
항-D 항체들의 시료들을 3.125ng/㎖, 6.25ng/㎖, 9.4ng/㎖, 12.5ng/㎖, 18.75ng/㎖, 25ng/㎖, 37.5ng/㎖ 및 50ng/㎖의 8개의 규모의 농도들에 따라 시험하 였다. 각 농도는 상기 시료의 IMDM + 5% 보충되지 않은 우태혈청 내의 희석에 의해 수득되었다.
3.1.2 목표 세포들의 제조
목표 세포들은 기증자들, 바람직하게는 O+로부터 수득된 Rhesus D+ 적혈구들이다. 이들을 파파인(바이오-라드(Bio-Rad))로 처리하였다. 이는 구형의 펠렛(globular pellet)에 용적/용적으로 첨가되고 그리고 37℃에서 10분간 배양되도록 방치하였다. 대량의 생리식염수(NaCl 0.9%, 에코테이너, 비 브라운(Ecotainer, B BRAUN))를 첨가하는 것에 의해 상기 반응을 정지시켰다. 계속해서 상기 세포들을 0.9% NaCl에서 3회 세척하고 처음 2회의 세척들에 대해서는 3000rpm에서 5분간 원심분리시키고 그리고 최종 세척에 대해서는 10분간 원심분리시켰다. 계속해서 상기 구형의 펠렛들을 IMDM + 5% 우태혈청 내에서 희석시켜 8*10 세포/㎖(0.08%)의 농도의 세포 현탁액을 수득하였다.
3.1.3
PMA
용액의 제조
IMDM + 5% 우태혈청 내에서의 1/250회로의 희석에 의해 40ng/㎖의 농도의 PMA 용액(10㎍/㎖, 시그마)을 제조하였다.
3.1.4 효과기 세포들의 제조
시험에 앞서 48 내지 72시간 동안 2차배양된 유르카트 세포들을 말라세즈 슬라이드(Malassez slides) 상에서 계수하여 시험될 세포 현탁액의 용적이 획득가능한 107 세포들(하나의 마이크로플레이트에 필요한 양)을 갖는다는 것을 규정하였다. 세포 현탁액의 상기 용적을 1200rpm에서 10분간 원심분리시켰다. 계속해서 상기 수득된 세포 펠렛을 IMDM + 5% 우태혈청에서 2*106 세포/㎖의 농도로 재현탁시켰다. 새로이 계수를 수행하여 상기 현탁액의 농도를 입증하고 그리고 필요한 경우 IMDM + 5% 우태혈청을 첨가하는 것에 의하여 정밀하게 조정하였다.
3.1.5 시험의 실시
96개의 U자형의 웰들을 갖는 플레이트에서, 각 웰 내에 하기의 것들을 위치시켰다:
50㎕의 시험될 항-D 항체들,
50㎕의 상기 구형 현탁액(즉, 50㎕ 당 4*106 개의 적혈구),
50㎕의 상기 세포 현탁액(즉, 50㎕ 당 105 개의 세포),
50㎕의 PMA(즉, 50㎕ 당 2ng).
각 플레이트에 대하여, 항-D 폴리클로날 항체(Rhophylac 300 상품명, 바이오테스트)에 대응하는 대조 시료와 마찬가지로 항-D 대조 용액을 위치시켰다. 상기 웰들을 교반에 의해 균질화시켰다. 상기 플레이트를 37℃에서 밤새도록 배양시켰다. 다음날, 상기 세포들을 125g에서 1분 동안 원심분리시키는 것에 의해 옮겼다. 상층액을 제거하고 그리고 엘리사 분석에 의해 IL-2 농도를 결정하였다.
3.2 항원 목표의 부재 중에서의 시험
시험된 항체들을 상기 3.1.1. 절에서 정의된 8개의 농도의 규모에 따라 앞서 와 같이 시험하였다. 이 시험에서, 상기 적혈구들을 특정의 F(ab')2 항-IgG 단편(1.3㎎/㎖, 잭슨 임뮤노-리서치 라보레토리즈(Jackson Immuno-Research Laboratories))로 치환하였다. 또한 이를 IMDM + 5% 우태혈청 내에서 8개의 서로 다른 농도들로 희석시켰다. 상기 항-D 및 상기 F(ab')2 항-IgG 항체들을 1/1.5의 비율에서 조사하였다. 상기 PMA 용액은 10ng/㎖의 농도로 준비하였다. 상기 유르카트 세포들을 IMDM + 5% 우태혈청 내에 2.1.4. 절에 정의된 농도로 희석시켰다.
96개의 U자형의 웰들을 갖는 플레이트에서, 각 웰 내에 하기의 것들을 위치시켰다:
50㎕의 시험될 항-D 항체들,
50㎕의 특이의 F(ab')2 항-IgG 단편
50㎕의 세포 현탁액,
50㎕의 PMA(즉, 50㎕ 당 0.5ng).
상기 웰들을 교반에 의해 균질화시켰다. 상기 플레이트를 37℃에서 밤새도록 배양시켰다. 다음날, 상기 세포들을 125g에서 1분 동안 원심분리시키는 것에 의해 옮겼다. 상층액을 제거하고 그리고 엘리사 분석에 의해 또는 IL-2를 코딩하는 메신저 RNAs(mRNAs)의 분석에 의해 IL-2 농도를 결정하였다.
3.3
엘리사
기술에 의한 세포
상층액의
IL
-2의 용량
3.3.1 재료들 및 방법들
듀오셋® 인간 IL-2 키트(Duoset® human IL-2 kit ; DY202, 알앤디 시스템 즈(R&D Systems))의 작동 방법에 따라 분비된 IL-2의 양을 분석하였다. 포획한 항체를 마이크로플레이트의 각 웰 내에 분포시켰다. 소혈청 알부민 용액으로 포화시킨 후, IL-2의 대조 규모와 마찬가지로 분석될 그 상층액들을 서로 다른 희석들에 적용시켰다. 계속해서 비오티닐화된 인간 항-IL-2 항체(biotinylated human anti-IL-2 antibody)를 첨가하고, 후속하여 스트렙타비딘 퍼옥시다아제 HRP(streptavidine peroxydase HRP)의 용액을 첨가하였다. 기질(테트라메틸벤지딘(Tetramethylbenzidine))의 첨가 후, 청색의 착색(blue colouration)을 전개하였다. 상기 반응을 황산(H2SO4)으로 종료시킨 후, 450㎚에서 각 플레이트를 판독하는 것에 의해 각 웰의 광학 밀도(optical density)를 결정하였다. 각 웰에 대한 IL-2 농도를 IL-2 규모의 회귀곡선을 결정하고([IL-2] = a[항체들]2 + b[항체] + c) 그리고 각 웰에서의 상기 시료의 희석 인자를 고려하는 바이오리스 소프트웨어(Biolise software)의 수단에 의해 계산하였다.
3.3.2 결과들의 해석
엘리사 분석에 의해 결정된 상기 IL-2 농도들은 시험될 각 항-D 항체의 활성을 결정하는 것을 가능하게 한다. 이는 다음과 같은 방법으로 계산되었다 :
대조 항체로부터 시작하여, 상기 항체 농도 범위의 함수로 측정된 상기 IL-2 농도들을 제도(plotting)하는 것에 의하여 2차 방정식의 곡선을 세웠다. 적용된 각 시료 농도에 대하여는, 상기 등가의 대조 항-D 농도를 상기 곡선의 상기 2차 방정식의 수단들에 의해 계산하였다. 조사된 항체의 희석을 고려하여, 등가의 항-D 값들 각각을 목표 세포들과 함께수행하는 시험에 대하여 50ng/㎖ 또는 목표 세포들 없이 수행하는 시험에 대하여 10㎍/㎖의 이론적인 농도에로 가져갔다. 계속해서 각 시료에 대한 평균값을 계산하였다. 상기 시료의 활성의 백분율을 결정하기 위하여, 100%의 활성을 임의로 대조에로 돌렸다. 계속해서 이는 다음의 관계식에서의 계산에 필요한 것이다:
상기 시료의 재계산된 농도들의 평균 / 상기 대조의 재계산된 농도들의 평균.
따라서, 만일 미지의 항-D에 대하여 상기 활성의 백분율이 100 미만인 경우, 이는 이 항체의 활성이 상기 대조 kdcp의 활성보다 낮다는 것을 의미한다. 반면에, 만일 활성의 백분율이 100을 넘는 경우, 이는 조사된 그 항-D가 상기 대조 보다 더 큰 활성을 갖는 다는 것을 의미한다.
3.4
IL
-2를 코딩하는
mRNAs
의 분석에 의한 상기
IL
-2의 분석
이 기술은 IL-2를 코딩하는 메신저 RNA들(mRNAs)의 분석에 기초하고 있다. 먼저, 상기 세포들로부터 전체 RNA를 추출하였다. 상기 RNA를 역전사 효소(reverse transcriptase)라 불리우는 효소를 사용하여 보족 DNA(cDNA)로 전환시켰다. 정량의 중합효소연쇄반응(PCR ; Polymerase Chain Reaction) 기술에 의한 특이의 프라이머들의 수단들에 의해 IL-2에 대응하는 유전자 시퀀스를 검출하였다. 시료들을 서로에 대해 비교하기 위하여, 상기 분석을 표준화할 필요가 있다. 이는 상존하거나 또는 구조성의 유전자를 코딩하는 mRNAs들의 동시적인 분석에 의해 실행되었으며, 그의 발현 수준은 배양 및 자극 조건들에 불구하고 상기 세포들 전부 에서 동일하다. 이들 시험들에서 선택된 상기 상존하는 유전자는 비-액틴(b-actine)이며, 이는 상기 세포들의 세포골격(cytoskeleton)의 구성요소들의 하나이다. 상기 세포가 보다 더 활성화될수록, IL-2 cDNA/비-액틴 cDNA 비율은 더 높아질 것이다. 상기 IL-2를 코딩하는 상기 mRNAs은 일시적인 것이다. 따라서, 실험적인 조건 하에서의 자극 후의 유전자 발현이 최대가 되는 것에 대하여 시간이 결정되었다(4 내지 6시간).
3.4.1 재료들 및 방법들
1) 세포 배양
이 시험은 다음의 조건들 하에서 실행되었다:
- 200㎕의 유르카트 CD16+ 세포 현탁액(107 세포/㎖);
- F(ab')2를 갖는 항-D 모노클로날 항체;
- 200㎕의 F(ab')2(잭슨 임뮤노-리서치(Jackson Immuno-Research)) 특이의 항-단편(15㎍/㎖)을 갖는 200㎕의 항-D mAb(10㎍/㎖); 또는
- 200㎕의 F(ab')2(잭슨 임뮤노-리서치) 특이의 항-단편(7.5㎍/㎖)을 갖는 200㎕의 항-D mAb(5㎍/㎖);
- 40ng/㎖의 PMA 200㎕.
사용된 상기 용액들 모두는5% 우태혈청을 갖는 IMDM 매질 내에서 준비되었다.
계속해서 상기 세포들을 37℃에서 제어된 대기(95% 공기 + 5% CO2) 하의 인큐베이터 내에서 배양시켰다.
2) 상기 전체 RNA의 추출
2개의 상용화된 키트(키아젠(QIAGEN)의 키아슈레더 키트(QIAshredder kit) 및 알니아시 프로텍트 미니 키트(RNeasy Protect mini kit))들을 사용하여 전체 RNA를 추출하고; 계속해서 그 추출된 RNA를 260㎚에서의 분광분석기에 의해 분석하였다.
3) 역전사효소 단게(Reverse transcriptase step)
42℃에서 1시간 동안 배양시키는 것에 의해 cDNA를 수득하였다;
- 1㎍의 선형화된 RNA(65℃에서의 가열 후, 후속하여 4℃의 즉각적인 냉각);
- 올리고 dT 프라이머;
- dATP, dCTP, dGTP 및 and dTTP;
- 디티오쓰레이톨(DTT ; Dithiothreitol);
- RNA분해효소 저해제(RNAase inhibitor);
- 역전사효소(Reverse transcriptase)
4) 중합효소연쇄반응 단계
중합효소연쇄반응 단계는 이하에서 기술된 특이의 프라이머들을 사용하여 실행되었다:
IL-2에 대하여는
IL-2 H1: AAC AGT GCA CCT ACT TCA AG
IL-2 H2: GTT GAG ATG ATG CTT TGA CA
b-actin에 대하여는
BACT H1: GGG TCA GAA GGA TTC CTA TG
BACT H2: GGT CTC AAA CAT GAT CTG GG
정량적인 중합효소연쇄반응은 어플라이드 바이오시스템즈 7300 장치(Applied Biosystems 7300 apparatus) 및 파워 사이버 마스터 믹스 키트(Power Syber Green master mix kit ; 어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 실행되었다. 상기 2개의 프라이머 쌍들에 대해 사용되는 프로그램은
- 95℃에서 10분 동안의 1 탈혼성화 사이클(dehybridization cycle)
- 40 사이클;
- 95℃에서 10초 동안의 탈혼성화;
- 60℃에서 15초 동안의 "열처리(Annealing)"(프라이머 커플링);
- 72℃에서 60초 동안의 연신(Elongation).
상기 중합효소연쇄반응의 마지막에서, 상기 증폭된 생성물들을 천천히 그리고 점진적으로 변성시켜 상기 증폭된 생성물에 특이적인 해리곡선과 온도(℃) 단위의 Tm(융점)을 정의하였다.
3.4.2 결과들
서로 다른 농도(5 및 10㎍/㎖)의 2개의 항-D mAb 제제들을 대조하였다. 상기 제제들 중의 하나는 5℃에서 저장하는 한편으로 다른 하나는 40℃에서 3개월간 저장하였다.
정량-중합효소연쇄반응을 위하여는, 상기 세포 시험 배양의 개시 4시간 후에 상기 시료들을 취하여 RNA를 추출하였다.
엘리사 시험에 의한 상기 배양 상층액 내의 IL-2의 분석을 위하여는, 배양의 개시 16시간 후에 상기 시료들을 취하였다.
1) 엘리사 시험 결과들
상기 시험의 착수 16시간 후의 상층액 내에 존재하는 상기 IL-2 농도를 분석 키트(알앤디 시스템즈(R&D Systems))를 이용하여 정량하였다. 그 결과들을 도 6에 나타내었다.
2) 정량 역전사-중합효소연쇄반응 결과들
상기 시험의 착수 4시간 후에 상기 유르카트 CD16+ 세포들 내의 상기 IL-2 유전자의 발현을 역전사-중합효소연쇄반응에 의하여 실시간으로 평가하였다. 그 결과들을 비-액틴 상존 유전자에 대하여 표준화하였다. 그 결과들을 표 7에 나타내었다.
3.4.3 결론
자극된 유르카트 CD16+ 세포들의 상층액 내의 사이토카인 IL-2 농도의 직접 분석 방법과 정량 역전사-중합효소연쇄반응에 의한 그의 유전자의 발현의 분석 방법 사이에는 상관관계가 있다.
상기 엘리사 시험에 대하여는, 상기 IL-2 유전자의 발현의 강도는 시험된 상 기 mAb의 속성과 그의 농도에 의존적이다. 따라서 이 기술은 mAb의 상기 Fc 영역과 상기 CD16 수용체 사이의 상호작용을 연구하는 데 사용될 수 있다.
실시예
1
1. 세포주들의 특정화
1.1 상기 세포주들의 유전자형 분석
이 시험의 전개에 앞서, 큐-피씨알(Q-PCR ; 어플라이드 7300(Applied 7300))에 의한 대립형질의 판별(allelic discrimination)에 의해 각 세포주의 유전자형 분석을 실행하였다.
DNA | RNA | |
유르카트 CD16- | T/G | 불검출 |
유르카트 CD16+ Phe | 불검출 | T 즉 Phe |
정량-중합효소연쇄반응(DNA) 및 역전사-중합효소연쇄반응(RNA)에 의한 세포주들의 유전자형 분석.
상기 유르카트 CD16+ 세포주는 그의 막 표면에서 FcγRIII 수용체를 발현하지 않았다. Phe로 불리우는 상기 유르카트 CD16+ 세포주는 T(Phe) 유전자형을 나타내었다.
1.2 상기 세포주들의 유전자형 분석
FACS 마킹에 의한 상기 막 마커들의 분석은 다음의 표 2의 결과들을 수득하는 것을 가능하게 하였다:
유르카트 CD16+ Phe | |
CD45 (B220) | ++ |
CD19 Pan B(B4) | - |
CD2 Pan T (LFA3-R) | ++ |
CD3 Pan T | ++ |
CD4 | ++ |
CD8 | - |
CD16 FcγRIII | ++ |
CD58 (LFA3) | + |
CD25 (IL-2 Rα) | - |
CD122 (IL-2 Rβ) | - |
CD132 (IL-2 Rγ) | + |
2개의 감염된 유르카트 세포주들의 막 마커들의 세포분석에 의한 분석.
따라서 상기 세포주들은 CD45+, CD2+, CD3+, CD4+ CD16+, CD58+ 및 CD132+.들의 표현형(phenotype)을 갖는다.
1.3
CD16
자리들의 개수의 결정
이 실험의 목적은 세포분석에 의한 간접 마킹 분석에 의한 CD16 항원의 수를 정량하는 것이다. 상기 기술은 증가하는 양(103 내지 106 항체-결합 능력 또는 ABC)으로 정의된 모노클로날 항체(생쥐 항-인간 CD5(mouse anti-human CD5))들로 코팅된 10㎛ 직경의 5개의 군의 비드들의 사용에 기초하고 있다. 이들 서로 다른 분포들은 항체 결합 능력(ABC)에 대한 평균 형광 강도(MFI ; mean fluorescence intensities)에 대응하는 보정선(calibration line)의 구축을 허용한다. 상기 세포들을 표지된 2차 항체로 노출되고 또한 포화 조건들 하에 도입된, 대상이 되는 1차 항체들(항-CD16)으로 포화시켰다. 이들 조건들을 고려하면, 결합된 1차 항체들의 수는 상기 세포들의 표면에 존재하는 항원 자리들의 수에 대응한다. 그 결과, 형광은 상기 세포들에 결합된 1차 항체들의 수와 상관관계에 있다. 상기 세포들의 상기 ABC는 상기 보정선의 수단에 의해 결정된다.
하기 표 3은 조사(여러 2차배양들에 대해 실시된 조사)된 상기 선에 대한 CD16 자리들의 수의 결정을 요약한 표이다.
유르카트 CD16+Phe | P12 (0.5 ㎎/㎖ G418) | P13 (0.5 ㎎/㎖ G418) | P16 (0.5 ㎎/㎖ G418) | P23 (0.5 ㎎/㎖ G418) | P23 (1 ㎎/ G418) |
전체 | 54000 | 68000 | 68000 | 89000 | 121000 |
하한 10% | 16000 | 19000 | 19000 | 27000 | 36000 |
상한 10% | 121000 | 160000 | 163000 | 187000 | 250000 |
생물자료관(library)으로부터 수득한 바이알(vial)을 해동한 후, 상기 CD16 발현이 유지되는 것을 입증하기 위하여 선택된 매질 중에서 여러 2차배양들에 걸쳐서 각 세포주를 감시하였다.
따라서, 수회의 통과(passages)들 후에, 상기 CD16 발현을 유지하고 그리고 하나의 2차 배양에서 다른 하나에로 동일한 배양 조건들 하에서 단지 매우 작은 변화만을 가하였다. 더욱이, 선택의 압력 및 그 결과들은 높은 발현 잠재력(potential)을 갖는 클론의 선택이 작용한다는 것을 나타내는 경향이 있다. 더욱이, 극도의 분포들(하한 10% 및 상한 10%)에 대한 자리들의 수의 결정에 의하여, 이 기술은 상기 세포들의 상기 표면에서의 상기 CD16 발현의 이질성(heterogeneity)을 정확하게 분석하는 것을 가능하게 한다.
실시예
2:
CD16
활성화 시험
1. 시험의 특이성
상기 시험의 특이성은 다음과 같이 입증하였다: 세포 활성화 메카니즘을 확인하기 위한 상기 유르카트 세포들에 의한 IL-2의 분비의 시험에 여러 대조군들을 도입하였다. 상기 분석 키트에서 제공된 IL-2 대조 규모의 종말점에 의하여 15pg/㎖의 검출 문턱 하한을 한정하였다. 이 문턱 이하에서는, 상기 세포들에 의한 IL-2의 분비는 검출불가능한 것으로 간주하였다. 하기 표 4는 n회 실험에 걸친 평균 IL-2 수준들 및 상기 IL-2 생산 시험 내로 도입된 각 대조의 표준편차들의 개요 도표이다(< LT = 15pg/㎖의 한계 문턱 이하) .
JCD16 + Phe 세포 | ||
세포 단독 | 실험 횟수 | n = 8 |
평균 | < LT | |
F( ab' ) 2 + PMA | 실험 횟수 | n = 8 |
평균 | 52 | |
표준편차 | 48 | |
항-D + PMA | 실험 횟수 | n = 9 |
평균 | 277 | |
표준편차 | 124 | |
항-D + F(ab')2 | 실험 횟수 | n = 8 |
평균 | < LT | |
표준편차 | ||
항-D + F(ab')2 + PMA | 실험 횟수 | n = 9 |
평균 | 1347 | |
표준편차 | 772 | |
PMA + 이오노마이신(Ionomycin) | 실험 횟수 | n = 8 |
평균 | 7970 | |
표준편차 | 2736 | |
PMA 단독 | 실험 횟수 | n = 8 |
평균 | 66 | |
표준편차 | 61 | |
이오노마이신 단독 | 실험 횟수 | n = 8 |
평균 | < LT | |
표준편차 |
상기 세포들 단독의 배양 상층액의 분석은 감지할 수 없는 것으로 밝혀진 그들의 기저의 분비 수준을 정의하는 것을 가능하게 한다. 이 대조는 임의의 자극의 부재를 입증하는 것을 가능하게 하며, 상기 세포들은 IL-2를분비하지 않는다. 더욱이, 이들 대조들은 상기 세포들의 활성화의 결과를 가져오는 2개의 자극(PMA 및 항-D/F(ab')2 복합체)에 대한 요구를 확정하는 것을 가능하게 한다. 실제로, 상기 2개의 자극 중 하나가 부재인 경우(대조 PMA + F(ab')2 또는 F(ab')2 + 항-D), IL-2의 분비는 최소이거나 또는 0이다. 유사하게, F(ab')2 의 부재 중에서 IL-2의 분비가 얻어지기는 하나, PMA 및 항-D/F(ab')2 응집물들의 존재 중에서 얻어지는 분비에 비해 크게 열등한 방법으로 되기 때문에, 상기 CD16의 활성화는 항체들의 응집을 요구한다. 더욱이, 각 실험 동안에, PMA 및 이오노마이신의 사용에 의하여 최대 활성화가 입증되었다. 따라서 이들 결과들은 IL-2 분비를 수득하기 위하여는 상기 JCD16+의 이중 자극을 필요로 한다는 것을 증명하는 것을 가능하게 한다.
2. 용량 효과 및 항체 농도 범위의 결정
상기 실험들의 잔여부에 대한 항-D 농도들의 최적 범위를 결정하기 위하여, 용량-응답 시험(후속하는 2개의 곡선들로 표현됨)이 실시되었다. 이 목적을 위하여, 상기 반응 매질 내에서 R297 항체(배치 C029-025)의 1 내지 100㎍/㎖의 범위의 농도를 시험하였다. 상기 실험은 5배수로 실시하였다(도 2를 참조하시오).
낮은 항-D 농도들에 대하여는, 자극 24시간 후의 상층액 내의 IL-2 농도 곡선은 상기 시험 내로 도입된 상기 항-D 농도에 비례한다. 높은 항-D 농도들에 대하여는, 상기 곡선은 편평한 부분(plateau)에 도달된다.
3. 동적 활성화(
kinetic
activation
) 및 배양 시간의 결정
배양의 최적의 기간을 결정하기 위하여, 상기 2개의 세포주들의 상기 IL-2 분비의 키네틱 조사(kinetic study)를 실시하였다. 이 목적을 위하여, 상기 세포들을 항-D 농도들의 정해진 범위(배치 C029-025의 0.625 내지 10㎍/㎖)에 의하여 8, 24, 32, 48, 56 또는 72시간 동안 자극하였다. 각 항-D 농도에 대하여 상층액 내의 IL-2 농도들 및 배양의 각 기간에 대하여 분석하였으며, 따라서 도 3에서의 직선들을 얻는 것이 가능하였다.
이 조사는 자극 8시간 후에 상기 세포들이 단지 매우 적은 IL-2를분비하는 것을 나타내는 것을 가능하게 하였다. 24시간부터, 상기 IL-2 수준들이 최대 값들에 도달하였다. 자극 24시간 후, 상기 곡선은 심지어 중첩되어 가는 경향이 있다. 시험의 기간을 한정하기 위하여 배양의 최적의 기간은 24시간으로 고정시켰다.
4. 상기 시험에서의 상기 세포 농도의 효과
생물학적 시험에서 세포 농도를 표준화하는 것은 상대적으로 어렵다. 이 조사의 목적은 주어진 시료의 활성 백분율이 상기 세포 농도에 의존적인지 그렇지 않은 것인지를 입증하는 것이다. 이 목적을 위하여, 3개의 독립적인 실험들 동안에, 항-D 모노클로날 항체(배치 R297 No.05-081, T0)의 시료를 5개의 서로 다른 세포 농도들(C1=105 세포/웰, C2=2.5.105 세포/웰, C3=5.105 세포/웰, C4=7.5.105 세포/웰 및 C5=106 세포/웰)에 대하여 시험하였다. 계속해서 그 활성 백분율이 임의로 100%로 설정된 대조 항-D(배치 C029-025)와 비교하는 것에 의하여 그의 활성 백분율을 결정하였다. 상기 3개의 실험들 동안에 각 농도에 대하여 수득된 결과들을 하기 표 5에 나타내었다.
JCD16 + Phe 세포들 | |||||||
실험 1 | 실험 2 | 실험 3 | |||||
농도 | 활성 백분율 시료/대조 | CV | 활성 백분율 시료/대조 | CV | 활성 백분율 시료/대조 | CV | |
C1 | 결과가 얻어지지 않음 | 143 | 7 | 135 | 11 | ||
C2 | 127 | 12 | 131 | 12 | 116 | 11 | |
C3 | 88 | 5 | 127 | 9 | 138 | 9 | |
C4 | 131 | 8 | 121 | 7 | 119 | 10 | |
C5 | 120 | 3 | 123 | 6 | 115 | 9 | |
평균 | 117 | 7 | 129 | 8 | 125 | 10 | |
표준편차 | 20 | 4 | 9 | 2 | 11 | 1 | |
변동계수(CV) | 17 | 7 | 9 |
유르카트
CD16
+
Phe
세포들에 대하여 5개의 세포 농도 조건들을 포함하는 3개의 서로 다른 실험들에서
시험된
시료
R297
No
.05-081의 활성 백분율.
이 조사에 있어서, 상기 변동계수(coefficients of variation ; CV)의 분석은 상기 3개의 실험들이 상기 조사된 세포 농도에 무관하게 상기 시료 No. 05-081의 상당한 활성을 제공한다는 것을 나타내고 있다.
5. 시험의 재현성
세포들이 시험에 사용된 경우에 심지어 세포주의 경우에서 생물학적 변이성(variability)들이 도입되었다. 따라서, 시험의 표준화의 목표에 대하여, 후자가 양호한 재현성임을 확실하게 할 필요가 있다. 상기 시험이 항체의 활성에 대한 정제 방법의 영향을 평가하기 위하여 실시되는 경우에서 또한 치료용 제제들에 대한 시간 경과에 대한 안정성 조사들이 실시되는 경우에 보다 더 필요하다.
따라서 여러 실험들에서 시료(배치 C029-025)의 활성을 시험하였다. 그의 활성 백분율은 상기 시료에 대응하는 대조(그의 활성이 임의로 100%로 설정됨)에 대하여 계산되었다.
JCD16 + Phe | |||
실험 | 항-D 10㎍/㎖에서의 IL-2 수준 | C029-025 (0.727g/ℓ) | |
시료/대조 %활성 | 변동계수(CV) | ||
1번 | 1276 | 92 | 7 |
2번 | 2022 | 107 | 5 |
2182 | 106 | 6 | |
3번 | 2210 | 104 | 10 |
2096 | 103 | 8 | |
4번 | 1795 | 96 | 17 |
1975 | 101 | 13 | |
2078 | 96 | 12 | |
5번 | 1704 | 105 | 11 |
1160 | 96 | 8 | |
1309 | 98 | 4 | |
6번 | 419 | 105 | 5 |
313 | 96 | 10 | |
평균 | 1580 | 100 | 9 |
표준편차 | 644 | 5 | 4 |
변동계수 | 41 | 5 |
재현성 시험 : n회의 실험들 동안의 시료(배치
C029
-025)의 활성 백분율의 결정
생물학적 시험의 경우에서, 15 내지 20%의 최대 변동계수는 유효한 실시험으로 받아들여진다. 따라서, 본 출원의 시험의 경우에서, 상기 수득된 변동계수(JCD16+ Phe 세포들에 대해 5%)는 상기 수용 수준(acceptance level) 이하이다. 따라서 통상적으로 이 시험의 사용은 시료들의 안정성을 감시하는 것을 가능하게 할 뿐만 아니라, 그의 정제 방법 동안의 시료의 활성의 수준을 입증하는 것이다.
실시예
3 :
CD16
와 마주하는 항체의 세포독성의 평가
면역글로불린들의 중연쇄들의 수준에서 존재하는 올리고당들의 푸코실화 수준이 항체들의 효과기 특성들에 영향을 준다는 것이 문헌들에서 입증되었다. 실제로, 낮은 푸코스 수준은 CD16에 결합하는 상기 항체의 능력을 증가시킨다. 더욱이, 이 메카니즘은 상기 CD16의 동질이상(polymorphism)에 전체적으로 독립적이 될 수 있다. 따라서, 이 조사에서, 본 발명자들은 상기 항체들의 기능적인 활성에 대한 상기 푸코스 수준의 강도(impact)에 관심을 가졌다. 엘에프비사(LFB)는 글리칸 연쇄들 상에 존재하는 그들의 푸코스 수준에 의해 특정되는 여러 모노클로날 항체 제제들을 갖고 있다. 100% 푸코실화된 항체는 면역글로불린에 대응하며, 중연쇄의 위치 297 내의 그의 2개의 글리칸 연쇄들은 완전히 푸코실화되어 있다. 여러 푸코스 수준들을 갖는 서로 다른 시료들이 목표 세포들이 존재하는 시험 및 목표 세포들이 존재하지 않는 시험에서 조사되었다:
- 100% 푸코스를 갖는 항-HIV Gp120,
- 100% 푸코스를 갖는 AD1 (항-D),
- 81% 푸코스를 갖는 T125 CHO (CHO 세포들 내에서 생산된 항-D),
- 64% 푸코스를 갖는 R270 (항-D),
- 40% 푸코스를 갖는 R297
- 33% 푸코스를 갖는 C029-025
- 25% 푸코스를 갖는 R297.
도 4a 및 도 4b들은 각각 시험 내에 목표 세포들을 갖는(도 4a) 그리고 목표 세포들은 갖지 않으나 F(ab')2를 사용하여 응집된 항체 제제들을 갖는(도 4b) 시험들에서 수득된 결과들을 나타낸다. 상기 시료들의 활성을 결정하기 위해 사용된 시험들에 불구하고, 상기 푸코스 수준이 증가하는 경우에 상기 CD16과 마주하는 상기 항체들의 기능성의 활성에서의 감소됨에 주목하였다. AD1 등과 같이 100% 푸코스 수준을 갖는 항체는 심지어 이 수용체와 마주하는 활성의 완전한 부재를 갖는다. 이 시험은 상기 푸코스 수준이 상기 CD16에의 상기 항체의 결합에 영향을 준다는 것을 확인하는 것을 가능하게 하였다. 중연쇄의 위치 297 내의 아스파라긴의 올리고당의 수준에서 완전히 푸코실화된 면역글로불린은 상기 항체와 상기 CD16의 어떠한 상호작용도 방해하고, 따라서 그의 활성화는 일어나지 않았다.
실시예
4 :
모노클로날
항체의 안정성의 감시의 시험
이 시험의 또 다른 응용은 변성 조건들 하에 놓여진 치료용 제제의 안정성의 촉진된 감시이다(도 5를 참조하시오). 이 감시는 매 월 마다 상기 시료의 활성을 측정하는 것에 의하여 수개월에 걸쳐 실시되었다. 이 시험은 40℃에 놓여진 시료 제05-081에 대하여 실시되었다. 목표 세포들을 갖는 시험 및 또한 상용 시험으로 불리우는 목표 세포들이 없는 시험들에서 그의 활성을 서로 다른 시간들(T0, T+1월 및 T+2월)에서 시험하였다. 대조 항체(목표 세포들을 갖는 시험에 대하여는 상기 시험 배치 R297 그리고 상기 상용 시험에 대하여는 파일럿 배치 C029-025)의 수단들에 의하여 100% 활성을 결정하였다.
이 시험은 고온에 노출되는 경우에 상기 시료의 활성의 손실을 검출하는 것을 가능하게 한다. 이 손실은 열에의 상기 시료의 노출의 기간에 비례한다. 이 시험은 또한 유사한 결과들이 2가지 시험들 모두에 대하여 얻어진다는 것을 나타내고 있다. 따라서, 이들 두 시험들은 치료용의 제제들의 시간에 걸친 안정성을 감시하는 데 사용될 수 있다.
실시예
5 : 열 또는 (
Fab
)'
2
IgG
단편에 대하여 지향되는 F(
ab
)'
2
단편에 의해 응집된 항체들에 의한
IL
-2의 특이의 생산의 비교
유전학적으로 재조합되어 CD16을 발현하는 유르카트 세포주에 의한 IL-2의 생산에 대하여 열(63℃에서 20분간)에 의해 또는 (Fab)'2 IgG 단편에 대하여 지향되는 F(ab)'2 둘 다에 의해 응집된항-D 모노클로날 항체 제제들의 용량 효과를 시험하였다.
IL-2를 상기 상층액 내로 투여하기에 앞서 상기 응집된 모노클로날 항체들을 유르카트 CD16+ 세포들과 함께 37℃에서 16시간 동안 배양시켰다.
그 결과들을 하기 표 7에 나타내었다:
모노클로날 Ab | IL-2의 특이의 생산 단위(pg/㎖) | |
항-D (ng/㎖) | 열에 의해 응집된 IgG | F( ab )' 2 로 응집된 IgG |
10,000 | 2,965 | 8,652 |
5,000 | 897 | 8,190 |
1,000 | 102 | 856 |
500 | 22 | 171 |
0 | < 12 | < 12 |
상기 표 7은 상기 모노클로날 항체들의 응집을 위해 사용된 방법과는 무관하게, 상기 상층액 내의 상기 세포들에 의해 분비된 IL-2의 양과 상기 시험 내에 존재하는 응집된 모노클로날 항체 농도 사이에 용량/효과 관계가 존재한다는 것을 나타내고 있다.
그러나, 열에 의해 응집된 모노클로날 항체들에 의해 분비된 IL-2의 양이 IgG anti-F(ab')2에 의해 응집된 항체들의 그것 보다 낮다는 것이 관측되었다.
본 발명은 치료용의 항체 제제의 분야에서 이용될 수 있다.
Claims (27)
- a) 항체들을 서로 응집시키는 단계;b) Fc 수용체를 발현하는 세포들을 상기 응집된 항체들과 접촉시키는 단계; 및c) 상기 항체들의 Fc 영역에 의한 상기 세포들의 상기 Fc 수용체의 활성화로부터 야기되는 상기 세포들의 반응을 측정하는 단계,를 포함하는 것을 특징으로 하는 Fc 수용체를 활성화시키기 위한 항체의 제조의 능력을 측정하기 위한 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 응집이 항-IgG F(ab')2 단편의 수단에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 Fc 수용체를 활성화시키기 위한 항체의 제조의 능력을 측정하기 위한 방법.
- 제 2 항에 있어서,상기 항-IgG F(ab')2 단편이 시험되는 항체 제조에 대향하여 지향되는 항-Fab 또는 항-F(ab')2 인 것을 특징으로 하는 Fc 수용체를 활성화시키기 위한 항체의 제조의 능력을 측정하기 위한 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 응집이 열에 의한 응집임을 특징으로 하는 Fc 수용체를 활성화시키기 위한 항체의 제조의 능력을 측정하기 위한 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 응집이 상기 Fab 영역들을 서로 가교화시키거나 또는 중연쇄들 및 경연쇄들을 서로 가교화시키는 것에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 Fc 수용체를 활성화시키기 위한 항체의 제조의 능력을 측정하기 위한 방법.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 Fc 수용체가 CD16 (FcγRIIIa 및 FcγRIIIb), CD32 (FcγRIIa 및 FcγRIIb) 및 CD64 (FcγRI)로부터 선택되는 것 임을 특징으로 하는 Fc 수용체를 활성화시키기 위한 항체의 제조의 능력을 측정하기 위한 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 Fc 수용체를 발현하는 상기 세포들이 상기 수용체를 엔코딩하는 유전자로 감염된 것임을 특징으로 하는 Fc 수용체를 활성화시키기 위한 항체의 제조의 능력을 측정하기 위한 방법.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 Fc 수용체를 발현하는 상기 세포들이 CD16을 발현하는 유르카트 세포들이고, 이 세포주는 PMA(포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트) 등과 같이 이들 세포들의 비특이성의 활성화제의 존재 중에서 배양되는 것을 특징으로 하는 Fc 수용체를 활성화시키기 위한 항체의 제조의 능력을 측정하기 위한 방법.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 항체들의 상기 Fc 영역에 의한 상기 세포들의 상기 Fc 수용체의 활성화로부터 야기되는 상기 세포들의 반응의 측정이 상기 Fc 수용체를 발현하는 상기 세포들에 의해 생산된 적어도 하나의 사이토카인의 양의 측정임을 특징으로 하는 Fc 수용체를 활성화시키기 위한 항체의 제조의 능력을 측정하기 위한 방법.
- 제 9 항에 있어서,상기 적어도 하나의 사이토카인의 측정이 상기 사이토카인의 mRNA들의 분석의 실행에 의해 유효화되는 것임을 특징으로 하는 Fc 수용체를 활성화시키기 위한 항체의 제조의 능력을 측정하기 위한 방법.
- 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, MCP-1, TNFalpha (TNFα) 및 IFNgamma (IFNγ) 로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인이 정량되는 것을 특징으로 하는 Fc 수용체를 활성화시키기 위한 항체의 제조의 능력을 측정하기 위한 방법.
- 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,인터루킨 IL-2가 정량되는 것을 특징으로 하는 Fc 수용체를 활성화시키기 위한 항체의 제조의 능력을 측정하기 위한 방법.
- 제 12 항에 있어서,분비된 인터루킨 IL-2의 수준이 ADCC-형 활성에 연관된 것임을 특징으로 하는 Fc 수용체를 활성화시키기 위한 항체의 제조의 능력을 측정하기 위한 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 세포 반응의 측정이 칼슘 유입, 포스포릴화, 전사 또는 세포사의 측정임을 특징으로 하는 Fc 수용체를 활성화시키기 위한 항체의 제조의 능력을 측정하기 위한 방법.
- 제 1 항 내지 제 14 항 어느 한 항에 있어서,CD16 수용체와의 상호작용이 가능한 모노클로날 항체를 생성하는 세포의 능력을 평가하기 위한 것임을 특징으로 하는 Fc 수용체를 활성화시키기 위한 항체의 제조의 능력을 측정하기 위한 방법.
- 제 15 항에 있어서,상기 항체-생산 세포가 CHO, YB2/0, SP2/0, SP2/0-AG14, IR983F, 나말바 인간 골수종, PERC6 세포, the CHO 세포주, 특히 CHO-K-1, CHO-Lec10, CHO-Lec1, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, 유르카트, 베로, Molt-4, COS-7, 293 -HEK, BHK, K6H6, NS0, SP2/0-Ag 14 및 P3X63Ag8.653들로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 Fc 수용체를 활성화시키기 위한 항체의 제조의 능력을 측정하기 위한 방법.
- 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,하나 또는 그 이상의 정제 단계들 후의 항체들의 상기 Fc 영역의 유효성 및 일체성을 평가하거나 또는 변성화 조건들 하에 놓여진 치료용의 제제의 안정성을 감시하기 위한 것임을 특징으로 하는 Fc 수용체를 활성화시키기 위한 항체의 제조의 능력을 측정하기 위한 방법.
- 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,항체의 상기 Fc 영역의 기능성을 측정하기 위한 것임을 특징으로 하는 Fc 수용체를 활성화시키기 위한 항체의 제조의 능력을 측정하기 위한 방법.
- 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,이식 식물들 또는 이식 포유동물들에 의한 모노클로날 항체들의 생산을 평가하기 위한 것임을 특징으로 하는 Fc 수용체를 활성화시키기 위한 항체의 제조의 능 력을 측정하기 위한 방법.
- 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,치료용의 처치를 위한 유효한 항체들을 선택하기 위한 것임을 특징으로 하는 Fc 수용체를 활성화시키기 위한 항체의 제조의 능력을 측정하기 위한 방법.
- 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,푸코스 함량이 65%, 바람직하게는 40% 이하인 항체 조성물들을 선택하기 위한 것임을 특징으로 하는 Fc 수용체를 활성화시키기 위한 항체의 제조의 능력을 측정하기 위한 방법.
- a) 항체를 발현시키기 위한 하나 또는 그 이상의 벡터들의 수단에 의하여 감염된 하이브리도마, 헤테로하이브리도마 또는 임의의 동물, 식물 또는 인간 세포주로부터 항체들을 수득하는 단계;b) 단계 a)에서 수득된 항체들을 항-IgG F(ab')2 단편으로 응집시키는 단계;c) 단계 b)에서 수득된 항체들을a. CD16 (FcγRIII) 수용체를 발현하는 세포들을 포함하는 효과기 세포들b. 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트를 포함하는 반응 혼합물에 첨가하는 단계;d) CD16을 발현하는 세포에 의해 생산된 적어도 하나의 사이토카인의 양을 측정하는 단계;e) 항체들이 존재하지 않거나 또는 부의 대조군으로서 주어진 항체의 존재 중에서의 대조군과 비교하여 0.5배, 1배, 2배, 5배, 10배, 100배 또는 500배 이상의 사이토카인의 양의 증가가 측정된 항체 조성물을 선택하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 CD16 (FcγRIII) 수용체를 활성화시킬 수 있는 모노클로날 항체 조성물의 제조를 위한 방법.
- 제 22 항에 있어서,CD16을 발현하는 상기 세포들에 의해 생성된 적어도 하나의 사이토카인의 양의 측정이 CD16을 발현하는 상기 세포에 의해 생산된 IL-2의 양을 측정하는 것임을 특징으로 하는 상기 CD16 (FcγRIII) 수용체를 활성화시킬 수 있는 모노클로날 항체 조성물의 제조를 위한 방법.
- (i) 상기 치료적 항체들을 응집시키기 위한 수단,(ii) Fc 수용체를 발현할 수 있는 세포들,(iii) 상기 세포들의 상기 Fc 수용체가 상기 항체들의 상기 Fc 영역에 의해 활성화되는 경우에 Fc 수용체를 발현할 수 있는 상기 세포들의 상기 반응을 측정하기 위한 수단들, 및(iv) 전술한 청구항들 중 어느 한 항에 따른 방법의 실행을 위해 필요한 다 른 구성요소들,을 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 치료용의 항체들의 활성을 측정하기 위한 생물학적 시험의 실행을 위한 키트.
- 제 24 항에 있어서,상기 세포들의 반응을 측정하기 위한 수단들이 상기 세포들에 의해 생성된 적어도 하나의 사이토카인의 양을 측정하기 위한 수단들임을 특징으로 하는 치료용의 항체들의 활성을 측정하기 위한 생물학적 시험의 실행을 위한 키트.
- 제 25 항에 있어서,적어도 하나의 사이토카인을 정량하기 위한 상기 수단들이 상기 사이토카인의 mRNAs를 분석하기 위한 수단임을 특징으로 하는 치료용의 항체들의 활성을 측정하기 위한 생물학적 시험의 실행을 위한 키트.
- 제 24 항에 있어서,상기 세포들의 상기 반응을 측정하기 위한 수단들이 칼슘 유입, 포스포릴화, 전사 인자들 또는 세포사를 측정하기 위한 수단들임을 특징으로 하는 치료용의 항체들의 활성을 측정하기 위한 생물학적 시험의 실행을 위한 키트.
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