FR2891366A1 - Dispositif pour l'analyse par spectrofluorimetrie d'un materiel biologique - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un dispositif (1) pour l'analyse par spectrofluorimétrie, en périfusion et en milieu contrôlé, d'un matériel, de préférence biologique, fixé ou cultivé sur un support (47) plan, le dispositif (1) étant apte à être utilisé avec un spectrofluorimètre, ledit spectrofluorimètre étant destiné à émettre un faisceau d'excitation sur le support plan, et à détecter en retour un faisceau d'émission émis par le matériel. Le dispositif (1) selon l'invention se caractérise en ce qu'il comprend, sur sa face inférieure, un plan incliné (9) apte à recevoir et maintenir le support (47) selon ce plan.

Description

DISPOSITIF POUR L'ANALYSE PAR SPECTROFLUORIMETRIE D'UN MATERIEL BIOLOGIQUE

L'invention concerne un dispositif pour l'analyse par spectrofluorimétrie, en périfusion et en milieu contrôlé, d'un matériel, de préférence biologique.

Actuellement aucune cuve pour spectrofluorimètre ni aucun accessoire associé n'est commercialisé pour permettre l'étude par spectrofluorimétrie, en périfusion et en milieu contrôlé, de la biologie et/ou de la physiologie des cellules animales ou végétales cultivées ou fixées sur des lamelles de verre ou tout autre support transparent et non fluorescent. Ce constat concerne d'autres domaines comme exemple.

L'article de C.J. Methods. 2003 May; 125 15 pour spectrofluorimètre celui de la minéralogie par Feeney et al. (J. Neurosci.

(l-2) . 13-25) décrit une cuve équipée d'un dispositif permettant d'effectuer des mesures par fluorimétrie et/ou spectrofluorimétrie sur des cellules fixées sur une lamelle. Ce dispositif comprend une bague en matière plastique sur laquelle est fixée la lamelle, de sorte que, lorsque la bague est positionnée au dessus de la cuve, la lamelle plonge de manière verticale dans la cuve et dans la solution d'expérimentation qu'elle contient. Ce dispositif comprend également deux tuyaux traversant la bague, l'un alimentant l'intérieur de la cuve en solution d'expérimentation neuve, le second évacuant le trop plein de solution contenu dans la cuve, permettant ainsi un renouvellement continu de la solution d'expérimentation dans la cuve. Cette technique est appelée périfusion, la solution d'expérimentation est appelée solution de périfusion, et le volume de la cuve contenant la solution de périfusion et dans lequel baigne la lamelle supportant les cellules est appelé chambre de périfusion. Selon ce dispositif, la lamelle est maintenue à 45 par rapport au faisceau d'excitation émis par le spectrofluorimètre et à 45 par rapport au faisceau d'émission détecté par le spectrofluorimètre, l'un et l'autre étant perpendiculaires à une face verticale adjacente de la cuve.

Le dispositif décrit dans cet article présente plusieurs inconvénients. En particulier, 1) il n'est pas étanche, ce qui empêche toute expérience avec des solutions de périfusion dont la composition gazeuse serait différente de celle de l'air, 2) le volume de la chambre de périfusion est important ce qui engendre une grande consommation de solution de périfusion, et augmente considérablement le temps de renouvellement de cette solution à l'intérieur de la chambre de périfusion, limitant ainsi le champ d'investigation de cette technique de mesure par spectrofluorimètrie, 3) la solution technique utilisée pour positionner et maintenir la lamelle à l'intérieur de la cuve de spectrofluorimètrie n'est pas suffisamment précise pour garantir une bonne reproductibilité et fiabilité des mesures, 4) l'angle de 45 entre la lamelle et les faisceaux d'excitation et d'émission ne permet pas d'éviter l'effet spéculaire qui augmente significativement le bruit sur les mesures et donc la précision de ces dernières. Considérant ce qui précède, un problème que se propose de résoudre l'invention est de réaliser un dispositif pour permettre l'étude, par spectrofluorimétrie, en périfusion et en milieu contrôlé, de la biologie et/ou de la physiologie de matériel biologique cultivé ou fixé sur un support, qui ne présente pas les inconvénients exposés ci-dessus.

La solution proposée par l'invention à ce problème posé a pour objet un dispositif pour l'analyse, par spectrofluorimétrie, en périfusion et en milieu contrôlé, d'un matériel, de préférence biologique, fixé ou cultivé sur un support plan, le dispositif étant apte à être utilisé avec un spectrofluorimètre, ledit spectrofluorimètre étant destiné à émettre un faisceau d'excitation sur le support plan, et à détecter en retour un faisceau d'émission émis par le matériel, caractérisé en ce que le dispositif comprend, sur sa face inférieure, un plan incliné apte à recevoir et à maintenir le support selon ce plan.

Ainsi, le positionnement et le maintien du support de matériel biologique sont précis, le bruit de fond de mesure est très réduit et le volume de la chambre de périfusion est diminué.

De manière avantageuse, - le plan incliné comprend un matériau non fluorescent, de couleur noire, mate et opaque, physiologiquement neutre, possédant des caractéristiques chimiques, physiques, optiques et mécaniques au moins équivalentes à celles du polyméthacrylate de méthyle; -le plan incliné comprend une empreinte apte à recevoir et à maintenir le support; - le support est maintenu par la force de la tension superficielle d'une solution; - le dispositif est apte à maintenir le matériel au contact d'une solution périfusée dans une chambre de périfusion; - il est apte à être inséré dans une cuve de spectrofluorimètre et ladite chambre est définie comme l'espace délimité par les surfaces internes de la cuve et par la surface inférieure externe du dispositif; - la chambre de périfusion est définie comme l'espace délimité par un évidement réalisé dans le plan incliné et par le support fixé sur le plan incliné de manière à fermer l'évidement; - l'ensemble dispositif - cuve et/ou la chambre est étanche en condition d'utilisation; - le plan incliné est incliné par rapport à un plan orthogonal à l'axe central du faisceau d'excitation, et incliné par rapport à un plan passant par l'axe central du faisceau d'excitation et l'axe central du faisceau d'émission détecté ; - le plan incliné est incliné d'un angle y compris entre + 32 et + 65 qu'il forme avec un plan ayant pour vecteur normal l'axe central du faisceau d'excitation, et le plan incliné subit, sur le plan ayant pour vecteur normal l'axe central du faisceau d'excitation, une rotation d'un angle compris entre + 30 et + 60 autour de l'axe central du faisceau d'excitation, le dispositif étant considéré dans un repère direct dans lequel l'axe central du faisceau d'émission représente un axe ox, l'axe central du faisceau d'excitation représente un axe oy, et un vecteur normal à ox et oy représente un axe oz, avec o le point de rencontre de ces trois axes; - le dispositif comprend en outre un circuit thermostatique étanche, permettant de le maintenir à une température souhaitée, ledit circuit étant de préférence situé à la périphérie de la chambre de périfusion; - il comprend en outre un circuit de périfusion, ledit circuit comprenant un conduit d'entrée d'une solution de périfusion dans la chambre de périfusion et un conduit d'évacuation de ladite solution de périfusion vers l'extérieur de la chambre, ledit conduit d'entrée débouche dans la chambre par un orifice situé dans la partie inférieure de la chambre, un orifice, par lequel le conduit d'évacuation débouche dans la chambre, se situe dans la partie supérieure de ladite chambre, au dessus du support, et un obstacle est situé proche de la sortie de l'orifice; - le dispositif comprend en outre un circuit de gazage apte à maintenir constante la composition gazeuse de la solution de périfusion présente dans la chambre de périfusion, grâce au gaz injecté ; - le dispositif comprend deux parties, la première partie étant un corps et la seconde partie étant un connecteur, ledit connecteur étant connecté en permanence à un circuit externe de périfusion du dispositif, lesdites parties étant aptes à être connectées l'une à l'autre de façon étanche et souple, de préférence grâce à des joints toriques.

L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description non limitative qui va suivre, rédigée au regard des dessins annexés, dans lesquels: - la figure 1 est une vue de trois-quarts et en perspective du corps d'un dispositif selon l'invention; - la figure 2 est une coupe verticale passant par les conduits du circuit de périfusion du corps d'un dispositif selon l'invention; - la figure 3 est un connecteur d'un dispositif selon l'invention selon une coupe verticale (moitié droite) et selon une vue de face (moitié gauche) ; - la figure 4 est la partie supérieure du corps d'un dispositif selon l'invention, selon une coupe verticale (moitié droite) et selon une vue de face (moitié gauche) ; - la figure 5 est une vue de dessus de la surface inférieure du corps d'un dispositif selon l'invention; - la figure 6 est une vue en perspective du plan incliné d'un dispositif selon l'invention, dans un repère direct; la figure 7 est une vue de dessus de la surface supérieure du corps d'un dispositif selon l'invention; - la figure 8 est un autre mode de réalisation du corps d'un dispositif selon l'invention inséré dans une cuve pour spectrofluorimètre, selon une coupe verticale (moitié droite) et selon une vue de face (moitié gauche) ; - la figure 9 est une vue de trois-quarts et en perspective d'un autre mode de réalisation du corps d'un dispositif selon l'invention; et - la figure 10 est une coupe verticale d'un plan 5 incliné d'un dispositif selon le mode de réalisation de l'invention présenté à la figure 9.

La technique de mesure par spectrofluorimétrie consiste à exciter à l'aide d'un spectrofluorimètre une molécule au moyen d'un faisceau lumineux dit d'excitation, puis à détecter et mesurer une partie des photons émis lors de la fluorescence de cette molécule lorsqu'elle repasse de l'état excité à son état fondamental. Les longueurs d'ondes d'émission sont supérieures aux longueurs d'ondes d'excitation.

Généralement la molécule excitée est une sonde spécifique dont la fluorescence est fonction d'un paramètre physiologique. Deux types de spectrofluorimètres sont commercialisés, pour lesquels l'échantillon de matériel biologique à analyser est introduit dans une cuve de spectrofluorimétrie destinée à être placée dans le portoir pour cuve(s) du spectrofluorimètre, de préférence thermostaté. Lors de la mesure, l'échantillon est positionné automatiquement par le spectrofluorimètre de façon à pouvoir être excité par un faisceau d'excitation émis par l'appareil, mais aussi de façon à ce que le spectrofluorimètre puisse détecter et mesurer, en retour, une partie des photons émis par l'échantillon. Dans le présent exposé, nous appellerons faisceau d'émission cette partie des photons détectés par le spectrofluorimètre. Pour le premier type d'appareil, le faisceau d'excitation pénètre par le fond de la cuve, perpendiculairement à celui-ci. Pour le second, le faisceau d'excitation pénètre par l'une des quatre faces verticales de la cuve, perpendiculairement à celle-ci.

Dans ces deux cas, le faisceau d'émission est mesuré par un détecteur du spectrofluorimètre situé perpendiculairement à l'une des quatre faces verticales de la cuve de spectrofluorimétrie.

Le dispositif selon la présente invention est spécialement conçu pour le premier type de spectrofluorimètre décrit précédemment, mais il peut être adapté au second type de spectrofluorimètre. Il permet de réaliser des mesures par spectrofluorimétrie en périfusion et en milieu contrôlé sur du matériel, de préférence biologique et vivant, de manière précise, reproductible, et avec un bruit de fond très réduit. Il est en outre économique et facile d'utilisation. Il permet aussi de réduire le stress pré-expérimental du matériel biologique vivant grâce à sa simplicité et à sa rapidité de mise en oeuvre. En particulier, la solution technique retenue pour positionner et maintenir le support du matériel étudié sur le plan incliné du dispositif, ainsi que son connecteur et son étanchéité confèrent les principaux avantages de l'invention.

Le dispositif selon l'invention permet d'obtenir une chambre de périfusion, c'est-à-dire de circulation, dans laquelle est injectée, ponctuellement ou en continu, une ou des solutions d'expérimentation. Le matériel biologique étudié se trouve sur un support dans cette chambre de périfusion, et baigne ainsi en permanence dans la solution d'expérimentation. Ainsi, l'utilisateur peut tester successivement et pendant une même expérience, les effets biologiques et/ou physiologiques de plusieurs solutions d'expérimentation de compositions différentes sur le matériel biologique étudié.

Selon un premier mode de réalisation, le dispositif est destiné à être inséré dans une cuve pour spectrofluorimètre, éventuellement pour spectrophotomètre, selon un ajustement mécanique précis en hauteur, en largeur et en profondeur. Selon un autre mode de réalisation, le dispositif selon l'invention peut être avantageusement utilisé sans cuve. De façon préférée, dans les deux cas, l'ensemble dispositif-cuve et/ou le dispositif sont étanches en condition d'utilisation.

Le dispositif 1 selon l'invention comprend un corps 2, illustré aux figures 1 et 2, et un connecteur 3, illustré à la figure 3.

Ainsi que cela est montré aux figures 1 et 2, selon un premier mode de réalisation, le dispositif 1 selon l'invention comprend un corps 2 en un seul bloc. Ses dimensions et sa forme sont telles qu'elles permettent son insertion à l'intérieur d'une cuve pour spectrofluorimètre.

Le dispositif 1 peut être adapté et ajusté à différentes formes et tailles de cuves. De préférence, le dispositif 1 est utilisé avec des cuves en quartz synthétique (type QSO) ou des cuves en quartz Herasil de 10 mm de trajet optique.

Les pièces du dispositif 1 selon l'invention, et notamment le corps 2, peuvent être réalisées par usinage ou tout autre procédé de façonnage ou de moulage. Le matériau utilisé doit être biocompatible et/ou physiologiquement neutre et/ou de qualité alimentaire, non fluorescent, de couleur noire, mate et opaque. De préférence, il doit posséder des indices de réfraction et de réflexion optiques proches de ceux du verre, et des caractéristiques chimiques, physiques, optiques et mécaniques au moins équivalentes à celles du polyméthacrylate de méthyle (PMMA, verre acrylique), notamment en termes de résistance aux produits chimiques, d'absorption d'eau, d'adsorption, de coefficient de dilatation, de perméabilité aux gaz, de résistance aux rayons ultraviolets et de facilité de mise en oeuvre et d'entretien. De préférence, il possède une très faible perméabilité gazeuse (principalement 02 et CO2) et une capacité d'absorption d'eau inférieure ou égale à 0,3% (climat normal 23/50 DIN 50014).

De façon préférée, les pièces, et notamment le corps 2, du dispositif 1 sont réalisées en PMMA noir mate.

Ainsi que cela est montré aux figures 1, 2 et 4, le corps 2 du dispositif 1 comprend quatre faces latérales 4, 5, 6 et 7, une face supérieure 8 et une face inférieure comprenant un plan incliné 9, et éventuellement deux surfaces 10 et 11. De préférence, la face supérieure 8 est horizontale, les faces latérales 4 à 7 sont verticales, et les surfaces 10 et 11 de la face inférieure sont planes et horizontales. La forme et la taille de ces faces sont conditionnées par les dimensions de la cuve à laquelle le dispositif est adapté ainsi qu'à la forme et aux dimensions du support du matériel étudié. De préférence, lorsque le dispositif 1 est mis en place dans une cuve adaptée, ses parois latérales 4 à 7 sont parallèles aux parois latérales de la cuve, et très proches de celles-ci.

A titre d'exemple non limitatif, la face supérieure 8 est carrée ou rectangulaire, les faces latérales 4 et 6 ont une largeur de 9,9 cm, les faces latérales 5 et 7 ont une largeur de 9,2 cm, les faces latérales les plus hautes 4 et 5 ont une hauteur de 43,8 cm et la plus petite hauteur des faces latérales 6 et 7 est de 32,4 cm.

Ainsi que cela est montré aux figures 2 et 4, la partie supérieure du corps 2 peut comprendre un rebord 12 destiné à reposer sur le rebord supérieur des quatre faces verticales d'une cuve. Ceci permet d'assurer l'étanchéité de l'ensemble dispositif 1-cuve, si cela s'avère nécessaire. La longueur du corps 2 est telle que, lorsque le dispositif 1 est en place dans une telle cuve, sa partie inférieure se trouve à proximité immédiate du fond de la cuve, mais ne la touche pas (figure 2). Ainsi, le rebord 12 et la longueur du corps 2 assurent le positionnement précis en hauteur du plan incliné 9 dans la cuve, notamment par rapport aux fenêtres optiques du spectrofluorimètre utilisé. De préférence, la face inférieure du rebord 12 est continue et elle est ajustée pour entrer en contact avec la totalité du rebord supérieur des quatre faces verticales de la cuve. Selon un autre exemple, le rebord 12 vient en butée sur au moins deux des faces verticales de la cuve.

Le plan incliné 9 est apte à recevoir un support pour un matériel, de préférence biologique, à étudier. Ainsi que cela est montré aux figures 1 et 2, le plan incliné 9 comprend une empreinte 13 dont les dimensions et la forme sont adaptées et ajustées à celles du support qu'elle recevra.

Le support du matériel étudié est plan, transparent et non fluorescent. De préférence, il comprend une lamelle de verre, avantageusement ronde et de diamètre 10 ou 12 mm. Dans ce dernier cas, l'empreinte 13 est de préférence ronde, de diamètre 12,1 mm, et de profondeur 0,15 mm.

Le matériel biologique peut comprendre, selon des exemples non limitatifs, des cellules animales ou végétales cultivées ou fixées sur le support.

Le support de matériel biologique est positionné sur l'empreinte 13, avec sa face vierge de matériel orientée contre le corps 2, de sorte que sa face porteuse du matériel biologique est orientée vers une chambre de périfusion 14 et que le matériel biologique puisse être en contact permanent avec la solution de périfusion. Le support est fixé et immobilisé rapidement sur l'empreinte 13, de préférence grâce à la tension superficielle exercée, entre ces derniers, par une solution telle qu'une solution de périfusion, ou une huile bic- compatible telle qu'une huile de paraffine. Le choix de l'état de surface de l'empreinte 13, ainsi que la matière dans laquelle est réalisée l'empreinte 13, permettent d'améliorer significativement l'effet de tension superficielle. A titre d'exemple non limitatif, un état de surface de Ra = 7 et/ou l'usage d'une résine de PMMA fortement dosée en solvant, pour réaliser l'empreinte 13, permettent d'améliorer l'effet de tension superficielle.

Le dispositif 1 selon l'invention permet de définir une chambre de périfusion 14 dont le contenu peut être renouvelé ponctuellement ou en continu, grâce à un circuit de périfusion de solution d'expérimentation. Selon le mode de réalisation du dispositif 1 illustré aux figures 1 et 2, le volume de la chambre 14 est défini par l'espace compris entre les bords internes d'une cuve dans laquelle le dispositif 1 est inséré et les bords externes du dispositif 1, et notamment le plan incliné 9, les surfaces 10 et 11 le cas échéant, et la surface, porteuse de matériel biologique, du support positionné sur l'empreinte 13. De manière avantageuse, le volume de la chambre de périfusion 14 est faible, de préférence inférieur ou égal à 600 l.

Dans le cadre de la présente invention, on entend par plan incliné un plan qui forme un angle différent de 0 , 90 , 180 , 270 ou 360 par rapport aux plans horizontaux et verticaux définis par les trois axes ox, oy et oz référents de la géométrie tridimensionnelle. Cette définition convient particulièrement si on considère le dispositif 1 utilisé dans un spectrofluorimètre classique, dans lequel les faisceaux d'excitation et d'émission sont verticaux ou horizontaux.

La position du plan 9 se définit selon des angles y et R. Ainsi que cela est illustré à la figure 2, dans le cas d'un dispositif pour spectrofluorimètre du premier type selon la présente invention, l'angle y est défini entre le plan incliné 9 et le plan horizontal 15. L'angle y est compris entre 32 et 65 , mais différent de 45 et, de préférence compris entre 32 et 37 , ce qui permet d'éviter l'effet spéculaire, c'est-à-dire la réflexion directe du faisceau d'excitation en direction du détecteur du spectrofluorimètre.

Ainsi que cela est représenté aux figures 1 et 5, représentant un dispositif pour spectrofluorimètre du premier type selon la présente invention, l'angle (3 est défini sur la surface 11, entre son côté adjacent au plan incliné 9 et son côté adjacent à la face latérale 5.

L'angle (3 est compris entre 30 et 60 et, de préférence est égal ou environ égal à 45 . L'angle (3 permet d'augmenter la surface du plan incliné 9 qui peut être étudiée. Ces angles y et (3, ainsi que l'empreinte 13 sur le plan incliné 9, permettent de positionner précisément et dans les trois dimensions de l'espace la lamelle supportant le matériel biologique à étudier. De plus, les angles y et (3 sont choisis de manière à optimiser les conditions de mesure et le signal mesuré en fonction des caractéristiques dimensionnelles de la cuve et du support utilisés ainsi que des caractéristiques techniques intrinsèques du spectrofluorimètre.

Dans le cas des spectrofluorimètres du deuxième type 25 (faisceau d'excitation et d'émission perpendiculaires à l'une des quatre faces verticales de la cuve) les angles y et (3 doivent être inversés, l'effet spéculaire dépendant dans ce cas de l'angle R et l'augmentation de la surface du plan incliné 9 pouvant être étudié dépendant dans ce cas de l'angle y.

La position du plan incliné 9 peut également être définie de manière plus large, par rapport à un faisceau d'excitation émis par le spectrofluorimètre en direction du matériel biologique sur le plan incliné 9, et à un faisceau d'émission émis par ledit matériel et détecté par le détecteur du spectrofluorimètre.

On entend alors par plan incliné 9 un plan qui forme un angle différent de 0 , 90 , 180 , 270 ou 360 par rapport à un plan orthogonal à l'axe central du faisceau d'excitation, et par rapport à un plan passant par l'axe central du faisceau d'excitation et l'axe central du faisceau d'émission détecté.

Plus précisément, soit un repère direct illustré à la figure 6, dans lequel l'axe central du faisceau d'émission représente un axe ox 16, l'axe central du faisceau d'excitation représente un axe oy 17, et un vecteur normal à ox et oy représente un axe oz 18, avec o le point de rencontre de ces trois axes orientés, de sorte que, pour passer de ox 16 à oy 17 à oz 18 on tourne dans le sens inverse des aiguilles d'une montre (définition d'un repère direct). Si on considère le plan incliné 9 dans un tel repère, alors ledit plan 9 est incliné d'un angle y compris entre + 32 et +65 , mais différent de 45 et, de préférence compris entre 32 et 37 , qu'il forme avec un plan 19 ayant pour vecteur normal l'axe oy 17 (faisceau d'excitation), et ledit plan incliné 9 subit sur le plan 19 une 25 rotation d'un angle (3 compris entre + 30 et + 60 autour de l'axe oy 17 (faisceau d'excitation).

Ainsi que cela est représenté aux figures 1 à 4 et 7 à 9, le dispositif 1 comprend un circuit interne de périfusion. Celui-ci comprend l'orifice d'entrée 20, de préférence sur la face supérieure 8 du dispositif 1, qui se poursuit par le conduit 21 ménagé à l'intérieur du corps 2, lequel se termine par un orifice 22 débouchant dans la chambre de périfusion 14. L'orifice 22 est situé de préférence dans la partie la plus inférieure du corps 2, par exemple sur la surface 11, afin de chasser tout l'air présent dans la chambre de périfusion 14 lors de son remplissage avec la solution de périfusion. De plus l'orifice 22 débouche de préférence perpendiculairement à un obstacle, par exemple le fond de la cuve, afin de mieux répartir la solution de périfusion sur la totalité de la surface, principalement celle du plan 9, de mieux homogénéiser la solution de périfusion à l'intérieur de la chambre 14 et afin d'éviter de décoller le matériel biologique en raison d'un flux de solution trop puissant. Le circuit comprend également un orifice 23, de préférence situé sur la partie supérieure de la chambre 14, au-dessus du support 47, par exemple sur la surface 10, qui se poursuit par le conduit 24 dans le corps 2, lequel se termine par l'orifice 25 de sortie, se situant de préférence sur la face supérieure 8 du dispositif 1. Ainsi, lorsque le conduit d'entrée 21 est alimenté en solution de périfusion, celle-ci remplit la chambre 14 par l'orifice 22, puis s'écoule par l'orifice 23 et le conduit 24, pour être évacuée par l'orifice 25 après avoir chassé la totalité de l'air présent dans les conduits 21 et 24 et la chambre 14.

Le circuit interne de périfusion est alimenté par un circuit extérieur, qui assure l'injection de solution par l'orifice d'entrée 20 et son évacuation par l'orifice de sortie 25. Le circuit extérieur peut être de toute forme.

Selon un mode de réalisation, il comprend au moins une seringue, de préférence en verre pour limiter les échanges gazeux entre la solution de périfusion contenue dans la seringue et l'atmosphère extérieure, montée dans un pousse seringue automatique, de préférence à vitesse variable, reliée par une tubulure adaptée à l'orifice d'entrée 20, ou autant de seringues qu'il y a de solutions à périfuser. Il peut comprendre également une pompe péristaltique connectée à l'orifice de sortie 25, qui assure l'évacuation de la solution périfusée. De façon préférée, le débit d'évacuation de la solution est égal ou très légèrement supérieur à son débit d'injection, de manière à éviter tout débordement de solution à l'extérieur de la cuve. De préférence, la jonction du circuit interne à un circuit externe de périfusion est réalisée au moyen de tubulures en polytetrafluoréthylène (PTFE) et/ou en inox, car la très faible perméabilité aux gaz de ces matériaux permet de maintenir une composition gazeuse stable de la solution d'expérimentation périfusée, notamment si l'on travaille dans des conditions hypoxiques, hyperoxiques ou anoxiques. De plus, ces matériaux possèdent une très bonne résistance aux produits chimiques ainsi qu'un faible pouvoir d'absorption et d'adsorption et ils sont de qualité alimentaire. De préférence, le circuit de périfusion est thermostaté.

Ainsi que cela est montré à la figure 1, le dispositif 1 selon l'invention peut comprendre également un circuit de gazage interne, dont le rôle est de maintenir une atmosphère contrôlée dans la chambre 14, c'est-à-dire de maintenir constante la composition gazeuse de la solution de périfusion présente dans la chambre de périfusion 14, grâce au gaz injecté. Ce circuit comprend un orifice 26 situé de préférence sur la face supérieure 8 du dispositif 1, qui se poursuit par un conduit 27 dans le corps 2 puis par au moins un et de préférence quatre conduits 28 dans le corps 2 débouchant par au moins un et de préférence quatre orifices 29 sur au moins une et de préférence sur les quatre faces verticales 4 à 7 du dispositif 1. Ainsi, un gaz est injecté dans le conduit 27 par l'orifice 26, puis se trouve réparti uniformément entre les quatre faces verticales de la cuve et du dispositif 1 grâce aux conduits 28 et aux orifices de sortie 29. Ces conduits présentent par exemple un diamètre de 0,4 mm. La surface cumulée de tous les orifices 29 est, de préférence, équivalente à celle de l'orifice d'entrée de gaz 26. Le gaz s'évacue de la cuve par exemple par une arête 30 du corps 2 du dispositif 1 qui a été surfacée à 45 , du niveau des orifices 29 jusqu'au rebord 12 du corps 2 représenté aux figures 2 et 4, et/ou par l'orifice 23 et le conduit 24 de sortie de la solution de périfusion, grâce à l'arête 31 du corps 2 qui a été surfacée à 45 , du niveau des orifices 29 jusqu'à la chambre de périfusion 14. Ce deuxième circuit d'évacuation de gaz est particulièrementavantageux car il permet de compenser, par une sortie de gaz, un éventuel mauvais réglage, par excès, du débit de sortie de la solution de périfusion par rapport à son débit d'entrée. Le surfaçage des arêtes 30 et 31 pour l'évacuation du gaz injecté est particulièrement avantageux, notamment en terme de gain de place et de facilité de réalisation. De préférence, le circuit de gazage interne est connecté au niveau de l'orifice 26 à une arrivée de gaz extérieure par des tubulures en inox et/ou en PTFE. La connexion des circuits internes aux circuits externes de périfusion et de gazage peut être effectuée directement sur les orifices 20, 25 et, le cas échéant, 26, à la surface supérieure 8 du corps 2, tels que représentés aux figures 4 et 7.

De préférence, la connexion avec les circuits externes de périfusion et de gazage se fait au moyen d'un connecteur, ou bouchon 3 amovible, tel que celui représenté à la figure 3. Le bouchon 3, qui peut être de formes diverses, par exemple carrée ou rectangulaire, est relié en permanence aux tubulures des circuits externes de périfusion et de gazage. Il peut être connecté et déconnecté au corps 2 à volonté, de façon étanche et souple. Chaque tubulure fait corps avec le bouchon 3 et le traverse pour se terminer par un orifice sur sa face inférieure. La partie des tubulures qui traverse le bouchon 3 est de préférence en inox ou en PTFE. Lorsque le bouchon 3 est positionné sur la face supérieure 8 du corps 2 du dispositif 1, les orifices 20, 25 et 26 de la face supérieure 8 du corps 2 se trouvent connectés aux orifices complémentaires du bouchon 3, tel que l'orifice 32. De préférence et de manière avantageuse, les tubulures du circuit externe de périfusion du bouchon 3 sont connectées de manière étanche et souple au circuit interne de périfusion du corps 2 du dispositif 1 grâce à l'utilisation de joints toriques. Ainsi que cela est représenté aux figures 4 et 7, ces joints sont placés dans les logements 33 et 34, concentriques respectivement aux orifices 20 et 25, situés sur la face 8 du corps 2 du dispositif 1. Ces logements sont ajustés aux dimensions des joints toriques, eux même choisis en fonction du diamètre extérieur des tubulures du circuit externe de périfusion du bouchon 3. Ainsi, lors de la connexion du bouchon 3 sur le corps 2 du dispositif 1, les tubulures du circuit externe de périfusion du bouchon 3 s'insèrent de manière étanche et souple dans les joints toriques situés dans les logements 33 et 34 jusqu'aux butées 35 et 36 du corps 2. Le bouchon 3 comprend deux parties cylindriques 37 (figure 3), positionnées concentriquement à chacun des deux orifices 32 complémentaires aux orifices 20 et 25 du corps 2. Le diamètre extérieur des deux parties cylindriques 37 est ajusté au diamètre des logements 33 et 34 des joints toriques. Chacune de ces parties 37 permet de comprimer légèrement les joints toriques dans leurs logements 33 ou 34 lorsque le bouchon 3 est connecté au corps 2 du dispositif 1, ce qui assure une parfaite étanchéité entre les joints toriques et leurs logements. Deux chanfreins 38 et 39 (figures 4 et 7), de préférence à 30 , sont effectués sur la face supérieure 8 du corps 2, concentriquement aux orifices 20 et 25, afin d'éviter de détériorer les joints toriques lors de leur mise en place dans les logements 33 et 34. Encore de préférence, un système de détrompeur, par exemple la forme du bouchon et les emplacements des orifices 20 et 25 sur le corps 2 du dispositif 1, permet d'éviter toute erreur de connexion lors du montage du bouchon 3 sur le corps 2. La longueur et la largeur du bouchon 3 peuvent être ajustées, de préférence légèrement supérieures à celles de la face supérieure 8 du corps 2, afin de faciliter sa prise en main par l'utilisateur lors des phases de connexion et de déconnexion du bouchon 3 sur le corps 2 du dispositif 1.

Ainsi que cela est montré aux figures 1 et 2, le dispositif 1 selon l'invention comprend une rainure 40 continue sur les quatre faces latérales 4 à 7 du corps 2. De préférence, cette rainure 40 se trouve à proximité du bas des faces latérales 4 à 7 dans le mode de réalisation selon les figures 1 et 2. Lorsqu'un circuit de gazage est présent, en particulier lorsque l'ensemble dispositif 1-cuve n'est pas étanche, la rainure 40 est centrée sur le ou les orifices de sortie 29 du ou des conduits 28. Elle facilite alors la sortie du gaz par ces orifices. En effet, en l'absence de rainure 40, l'espace restreint entre le corps 2 du dispositif 1 et les faces verticales de la cuve favorise la remontée par capillarité de la solution de périfusion. La force de tension superficielle exercée par cette solution sur les orifices 29 peut empêcher alors le gaz de sortir.

De plus, cette rainure 40 permet de former une barrière de gaz homogène et uniforme sur la totalité de la circonférence du corps 2 du dispositif 1, lorsque celui-ci est inséré dans une cuve à laquelle il est adapté. Ainsi, la rainure 40 permet de maintenir constante la pression partielle des gaz (02, 002, N2...) de la solution périfusée à l'intérieur de la chambre 14, à condition que le gaz injecté soit de composition équivalente. De plus, la rainure 40 empêche aussi la remontée de la solution de périfusion par capillarité le long des faces latérales 4 à 7 du dispositif 1.

Selon un mode préféré de réalisation, l'ensemble dispositif 1-cuve est étanche en condition d'utilisation. Cette étanchéité peut être assurée au niveau du contact continu entre le rebord supérieur des quatre faces verticales d'une cuve et la face inférieure du rebord 12 du dispositif 1, par exemple grâce à l'application, sur la totalité de la surface inférieure du rebord 12, d'une graisse alimentaire multifonction ou d'un colloïde, ou encore grâce à un joint. En outre, une gorge 41 (figure 4) dont la coupe est préférentiellement de forme triangulaire, peut être réalisée sur la totalité de la circonférence du rebord 12, jointivement aux quatre faces verticales 4, 5, 6 et 7 du corps 2, afin de contenir l'excès de graisse ou de colloïde lorsque le dispositif 1 est en place dans la cuve.

La fiabilité de l'étanchéité au niveau de la surface de contact entre la cuve et le dispositif 1 peut être améliorée en augmentant cette surface, par exemple en utilisant une cuve aux parois plus épaisses, ou encore en réalisant une cuve à collerette de manière à obtenir un bord supérieur plus large. Bien entendu, dans ces cas, le rebord 12 peut être ajusté à ces nouvelles cuves. La modification de l'état de surface de la zone de contact, par exemple à l'image de celui d'un verre rodé, peut également améliorer l'étanchéité.

Ainsi que cela est montré à la figure 8, il est également possible d'utiliser un joint, par exemple torique. Pour cela, la partie supérieure du corps 2 peut comporter une partie 42 de préférence cylindrique, dans laquelle est ménagée un logement 43, par exemple une gorge rectangulaire, destiné à recevoir le joint torique. Une pièce additionnelle 44, faisant corps avec la partie supérieure d'une cuve 45, par exemple par collage étanche ou par soudage, assure l'étanchéité entre le dispositif 1 et la cuve 45. Plus précisément, la partie cylindrique interne de la pièce 44 est ajustée au diamètre externe du joint torique positionné dans le logement 43 selon les caractéristiques standards de conception des montages pour une utilisation statique du joint torique.

De façon avantageuse, dans le cas d'un dispositif 1 assurant une parfaite étanchéité avec la cuve 45, l'injection de gaz et les circuits associés ne sont plus nécessaires, de même que le surfaçage des arêtes 30 et 31, puisqu'il ne peut plus y avoir d'échanges gazeux avec l'atmosphère extérieure à la cuve. De plus, le système externe d'évacuation de la solution de périfusion, tel qu'une pompe péristaltique, peut être supprimé. En effet, l'injection de nouvelle solution à l'intérieur de la chambre 14, par un pousse seringue automatique par exemple, suffit à expulser, par l'orifice 23 et le conduit 24, l'excédent de solution hors de la dite chambre 14. Ainsi que cela est montré à la figure 9, la rainure 40 peut être réalisée plus haut sur les faces latérales 4 à 7. Cette rainure 40 est de dimensions plus petites que dans le premier mode de réalisation du dispositif 1 selon l'invention afin de diminuer le volume d'air enfermé dans la cuve lorsque le dispositif 1 est en place et de limiter ainsi les échanges gazeux avec la solution de périfusion. Ce faible volume d'air permet à l'opérateur de retirer plus facilement le dispositif 1 de la cuve en fin d'expérimentation en évitant les effets de plaquage et de succion dues à une absence d'air à l'intérieur de la cuve. Ce mode de réalisation est avantageux car plus facile et plus économique à fabriquer et à utiliser. De plus, il permet d'améliorer la stabilité du signal mesuré, en supprimant d'une part la création d'éventuelles bulles d'air dans la partie supérieure de la chambre de périfusion 14, notamment au niveau de la surface du plan 10, et d'autre part les pulsations dues à la pompe péristaltique. Il permet encore de diminuer le volume mort au dessus de la chambre 14.

La méthode d'utilisation du dispositif 1 selon le mode de réalisation illustré aux figures 1 à 7 comprend 10 les étapes suivantes: -remplissage des tubulures du circuit externe d'entrée de solution périfusée; - mise en place d'une goutte de liquide, telle que de la solution de périfusion ou de l'huile de paraffine, 15 sur le haut de l'empreinte 13 du dispositif 1; - mise en place de la face vierge d'un support de matériel biologique, par exemple une lamelle, sur l'empreinte 13 du corps 2 du dispositif 1, en commençant par le haut de l'empreinte, puis une fois le support en position, aspirer à l'aide d'une papier absorbant l'éventuel excès de liquide; - insertion du corps 2 dans une cuve de spectrofluorimètrie pour laquelle le dispositif 1 est adapté ; -mise en place de la cuve dans le portoir de cuve du spectrofluorimètre auquel elle est adaptée; - connexion du bouchon 3 à la face supérieure 8 du corps 2 du dispositif 1, le bouchon étant déjà connecté aux circuits externes de périfusion et de gazage; mise en route du circuit externe de périfusion de la solution d'expérimentation; de manière avantageuse, dans le cas d'un dispositif 1 non étanche, le système d'évacuation de la solution périfusée dans la chambre 14 est activé avant le système d'injection de cette solution, pour éviter tout débordement; - mise en route du circuit de gazage avant que la chambre 14 soit totalement remplie de solution de périfusion; - mise en route de l'expérimentation au niveau du 5 spectrofluorimètre et début des mesures.

La méthode d'utilisation du dispositif 1 selon le mode de réalisation suit avantageusement ces étapes dans l'ordre présenté ci-dessus, pour optimiser les conditions de mesure. Le démontage est avantageusement réalisé suivant ces étapes dans l'ordre inverse.

Les résultats de mesures de spectrofluorimétrie réalisées avec le dispositif 1 selon le mode de réalisation illustré aux figures 1 et 2 montrent un rapport signal/bruit acceptable lorsqu'un composant de la solution de périfusion légèrement fluorescent peut interférer sur les mesures, ou encore lorsque deux solutions, de caractéristiques optiques nettement différentes, sont injectées successivement dans la chambre de périfusion 14. Dans ce dernier cas, les résultats des mesures sont délicatement exploitables pendant au moins trois minutes après l'arrivée de la nouvelle solution périfusée dans la chambre 14, ce qui correspond, en fonction du débit d'entrée de la deuxième solution périfusée, au délai nécessaire à l'atténuation de l'interface entre les deux solutions. Le bruit de fond peut être cependant soustrait des résultats bruts en effectuant un blanc d'expérience.

Selon un autre mode de réalisation du dispositif 1 selon l'invention, illustré aux figures 9 et 10, la chambre de périfusion 14 est intégrée dans le plan incliné 9 du dispositif 1. Ce mode de réalisation du dispositif 1 permet d'effectuer des mesures en limitant très significativement les interférences, qualitatives ou quantitatives, sur les mesures liées aux solutions périfusées, puisque le volume de la chambre 14 et l'épaisseur du film de solution périfusée sont nettement plus petits que ceux décrits dans le premier mode de réalisation du dispositif 1 selon l'invention. Cet autre mode de réalisation du dispositif 1 selon l'invention est particulièrement adapté pour les expériences utilisant une ou plusieurs solutions périfusées dont un ou plusieurs composants fluorescents peuvent interférer sur les mesures.

Ainsi que cela est montré à la figure 9, le dispositif 1 selon cet autre mode de réalisation comprend un corps 2, une face supérieure 8, quatre faces latérales 4 à 7, une face inférieure comprenant un plan incliné 9 et un circuit de périfusion selon les mêmes caractéristiques que le dispositif 1 selon le premier mode de réalisation. Il comprend en outre une chambre de périfusion 14 intégrée dans le plan 9 du corps 2. Le support du matériel biologique à étudier est positionné de sorte que ce dernier se trouve vers l'intérieur de la chambre 14.

Ainsi que cela est montré à la figure 10, le plan incliné 9 comprend un évidement 46 destiné à être recouvert par un support 47, transparent, de matériel biologique. De préférence, une empreinte 13 ajustée au support 47 est ménagée sur le plan incliné 9 concentriquement à l'évidement 46, destinée à faciliter le positionnement précis et fixe du support 47. Une chambre de périfusion 14 est ainsi délimitée par l'évidement 46 et par le support 47 fixé sur l'empreinte 13 du plan incliné 9 de manière à fermer l'évidement 46.

Le support 47 doit donc être positionné avec sa surface portant le matériel biologique orientée vers l'évidement 46, de sorte que le matériel biologique peut être en contact permanent avec la solution de périfusion. Il peut être fixé sur le plan incliné 9, et de préférence sur l'empreinte 13, par la force de la tension superficielle d'une solution par exemple d'une solution de périfusion, ou d'une huile telle que, de préférence, une huile de paraffine, ou d'un colloïde. L'étanchéité de la chambre 14 peut être améliorée grâce à l'application d'une seconde lamelle 48 plus grande, évidée en son centre et sur la totalité de la surface de l'évidemment 46, par-dessus le support 47 et fixée sur le plan incliné 9 par exemple au moyen d'une graisse alimentaire multifonction tel que la graisse MultiFood de Samara . Une empreinte peut être ménagée sur le plan incliné 9 pour faciliter la mise en place de cette seconde lamelle 48. Selon le même principe, la lamelle 48 peut être remplacée par un ruban adhésif bio-compatible, mince et non fluorescent, tel qu'un adhésif Comfeel Plus de Coloplast ou VHB de 3M , évidé en son centre, sur la totalité de la surface de l'évidemment 46, afin de permettre le passage des faisceaux lumineux d'excitation et d'émission.

Selon ce second mode de réalisation, l'arrivée de la solution de périfusion dans la chambre 14 se fait, comme précédemment, à côté du support de matériel biologique.

Le volume de cette chambre de périfusion 14 est avantageusement inférieur à celui du premier mode de réalisation, et de préférence inférieur ou égal à 150 l, ou encore de préférence inférieur ou égal à 50 l.

De manière avantageuse, la chambre de périfusion 14 est étanche, l'étanchéité pouvant être assurée par les moyens de fixation du support sur le plan incliné 9 tels que décrits plus haut. Dans ce cas, le système externe d'évacuation de la solution d'expérimentation périfusée en continu, tel que la pompe péristaltique, peut être supprimé. La connexion des circuits internes et externes de périfusion se fait comme précédemment, soit directement dans les orifices correspondants à la surface 8 du dispositif 1, soit par l'intermédiaire d'un connecteur 3, assurant une jonction étanche et souple avec le corps 2 du dispositif 1.

De manière avantageuse, le conduit 21 et l'orifice 22 du circuit d'entrée de solution périfusée arrivent dans la chambre 14 parallèlement à la surface du fond de l'évidemment 46, centré sur le diamètre de ce dernier. Un obstacle proche de la sortie de l'orifice 22 permet de casser et répartir uniformément le flux de la solution périfusée sur la totalité du matériel biologique fixé sur le support 47. Le conduit 24 du circuit de sortie de solution périfusée débouche dans la chambre 14 par l'orifice 23. De préférence, cet orifice de sortie 23, également centré sur le diamètre de l'évidement 46, est situé en face de l'orifice d'entrée 22 et plus haut que ce dernier. Cette position de l'orifice 23 garantit l'évacuation de tout l'air présent dans la chambre 14 lors de son remplissage par la solution de périfusion.

Le dispositif 1 selon ce second mode de réalisation permet de réduire très significativement les interférences optiques sur les faisceaux lumineux. En effet, le faisceau d'excitation ne traverse pas la ou les solution(s) périfusée(s) avant d'entrer en contact avec le matériel biologique étudié. De plus, seule une faible proportion des faisceaux d'émission, ceux réfléchis sur le fond de la chambre 14, traverse la solution périfusée avant d'être mesurée par le détecteur du spectrofluorimètre.

De manière encore avantageuse, selon ce mode de réalisation, le dispositif 1 n'a plus besoin d'être inséré dans une cuve de spectrofluorimétrie, ce qui diminue le temps de montage et donc le stress cellulaire pré-expérimental et les coûts de mise en oeuvre. De plus, sans contrainte liée aux dimensions des cuves, un tel dispositif 1, ou tout autre dispositif conçu de préférence selon le principe de la chambre 14 décrite aux figures 9 et 10 selon l'invention, peut être facilement utilisé avec un spectrofluorimètre à fibres optiques. Par exemple, un adaptateur venant se fixer sur le dispositif 1 permet d'immobiliser, dans les trois dimensions de l'espace et toujours à la même place sur l'évidemment 46, de préférence en son centre, la fibre optique à 90 du plan 9 du dispositif 1.

Selon un autre mode particulier de réalisation, le dispositif 1 dispose d'un circuit thermostatique étanche, permettant de le maintenir à une température souhaitée, de préférence avec de l'eau. Ainsi, un tel dispositif 1 peut être utilisé hors d'un portoir de cuve thermostaté de spectrofluorimètre. Avantageusement, ce circuit est intégré dans la masse du dispositif 1, de préférence à la périphérie de la chambre 14, de sorte qu'il n'est pas traversé par les faisceaux lumineux d'excitation et d'émission, afin d'éviter toute interférence sur les mesures.

Claims (14)

REVENDICATIONS

1. Dispositif (1) pour l'analyse par spectrofluorimétrie, en périfusion et en milieu contrôlé, d'un matériel, de préférence biologique, fixé ou cultivé sur un support (47) plan, le dispositif (1) étant apte à être utilisé avec un spectrofluorimètre, ledit spectrofluorimètre étant destiné à émettre un faisceau d'excitation sur le support plan, et à détecter en retour un faisceau d'émission émis par le matériel, caractérisé en ce que le dispositif (1) comprend, sur sa face inférieure, un plan incliné (9) apte à recevoir et à maintenir le support (47) selon ce plan.

2. Dispositif (1) selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le plan incliné (9) comprend un matériau non fluorescent, de couleur noire, mate et opaque, physiologiquement neutre, possédant des caractéristiques chimiques, physiques, optiques et mécaniques au moins équivalentes à celles du polyméthacrylate de méthyle.

3. Dispositif (1) selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le plan incliné (9) comprend une empreinte (13) apte à recevoir et à maintenir le support (47) .

4. Dispositif (1) selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le support (47) est maintenu par la force de la tension superficielle d'une solution.

5. Dispositif (1) selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le dispositif est apte à maintenir le matériel au contact d'une solution périfusée dans une chambre de périfusion (14).

6. Dispositif selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il est apte à être inséré dans une cuve de spectrofluorimètre et en ce que ladite chambre (14) est définie comme l'espace délimité par les surfaces internes de la cuve et par la surface inférieure externe du dispositif (1) .

7. Dispositif (1) selon la revendication 5, caractérisé en ce que la chambre de périfusion (14) est définie comme l'espace délimité par un évidement (46) réalisé dans le plan incliné (9) et par le support (47) fixé sur le plan incliné (9) de manière à fermer l'évidement (46).

8. Dispositif (1) selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'ensemble dispositif (l)-cuve (45) et/ou la chambre (14) est étanche en condition d'utilisation.

9. Dispositif (1) selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le plan incliné (9) est incliné par rapport à un plan orthogonal (19) à l'axe central du faisceau d'excitation, et incliné par rapport à un plan passant par l'axe central du faisceau d'excitation et l'axe central du faisceau d'émission détecté.

10. Dispositif (1) selon la revendication 9, caractérisé en ce que le plan incliné (9) est incliné d'un angle y compris entre + 32 et + 65 qu'il forme avec un plan (19) ayant pour vecteur normal l'axe central du faisceau d'excitation, et en ce que le plan incliné (9) subit, sur le plan (19) ayant pour vecteur normal l'axe central du faisceau d'excitation, une rotation d'un angle (3 compris entre + 30 et + 60 autour de l'axe central du faisceau d'excitation, le dispositif étant considéré dans un repère direct dans lequel l'axe central du faisceau d'émission représente un axe ox, l'axe central du faisceau d'excitation représente un axe oy, et un vecteur normal à ox et oy représente un axe oz, avec o le point de rencontre de ces trois axes.

11. Dispositif (1) selon l'une des revendications

précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un circuit thermostatique étanche, permettant de le maintenir à une température souhaitée, ledit circuit étant de préférence situé à la périphérie de la chambre de périfusion(14).

12. Dispositif (1) selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un circuit de périfusion, ledit circuit comprenant un conduit (21) d'entrée d'une solution de périfusion dans la chambre de périfusion (14) et un conduit (24) d'évacuation de ladite solution de périfusion vers l'extérieur de la chambre (14), en ce que ledit conduit (21) d'entrée débouche dans la chambre (14) par un orifice (22) situé dans la partie inférieure de la chambre (14), en ce qu'un orifice (23), par lequel le conduit (24) d'évacuation débouche dans la chambre (14), se situe dans la partie supérieure de ladite chambre (14) , au dessus du support (47), et en ce qu'un obstacle est situé proche de la sortie de l'orifice (22).

13. Dispositif (1) selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un circuit de gazage apte à maintenir constante la composition gazeuse de la solution de périfusion présente dans la chambre de périfusion (14), grâce au gaz injecté.

14. Dispositif (1) selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend deux parties, la première partie étant un corps (2) et la seconde partie étant un connecteur (3), ledit connecteur (3) étant connecté en permanence à un circuit externe de périfusion du dispositif (1), lesdites parties (2 et 3) étant aptes à être connectées l'une à l'autre de façon étanche et souple, de préférence grâce à des joints toriques.