WO2022136701A1 - Procédé de détermination de la présence de bactéries dans ou sur un composant gélosé - Google Patents

Procédé de détermination de la présence de bactéries dans ou sur un composant gélosé Download PDF

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WO2022136701A1
WO2022136701A1 PCT/EP2021/087643 EP2021087643W WO2022136701A1 WO 2022136701 A1 WO2022136701 A1 WO 2022136701A1 EP 2021087643 W EP2021087643 W EP 2021087643W WO 2022136701 A1 WO2022136701 A1 WO 2022136701A1
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WO
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agar
component
agar component
microorganisms
light
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Application number
PCT/EP2021/087643
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Marc Zelsmann
Pierre Marcoux
Emmanuel Picard
Original Assignee
Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives
Centre National De La Recherche Scientifique
Universite Grenoble Alpes
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Publication date
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    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
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    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N2021/7769—Measurement method of reaction-produced change in sensor
    • G01N2021/7783—Transmission, loss

Definitions

  • the technical field of the invention is the determination of the presence of bacteria in an agar or on the surface of an agar, by optical measurements.
  • Observation of bacterial colonies by imaging is a technique that has been known for a long time in the field of microbiology, for monitoring the development of microorganisms or cells.
  • a Petri dish it is possible to follow the development of colonies, for example of bacterial colonies, and to count them.
  • the shape of the colonies gives information on the type of microorganism.
  • by combining the use of different culture media, allowing or not allowing the development of colonies it is possible to identify the type of microorganism forming colonies.
  • Agarose-based structured optical fiber describes the use of an optical fiber to characterize a liquid in which the fiber is immersed. The fiber response depends on the refractive index of the liquid.
  • This publication also describes the use of an optical fiber in agarose gel, comprising cells. Optical fiber is used as waveguide, for guiding excitation light and fluorescence light from the cells. More precisely, the fiber makes it possible to evaluate the spectral response of the cells as a function of the environment.
  • Patent application US20200327306 describes a method allowing early detection of the development of bacteria in an agar, in particular an opaque agar. This is a method conferring a wide field of observation, and which can be implemented from a simple and inexpensive device.
  • the inventors propose another approach, suitable for agars having a certain level of transparency, and also making it possible to carry out a rapid determination of the presence of microorganisms in a sample.
  • a first object of the invention is a method for determining the presence of microorganisms in an agar component, the agar component being formed from an agar, the agar comprising nutrients favorable to the development of microorganisms, the method comprising:
  • agar component extending between a first end and a second end, the agar component being at least partially transparent to an illumination wavelength
  • agar component obtained during a), in contact with at least one ambient medium, the ambient medium having a refractive index lower than the refractive index of the agar, such that the agar component is adapted to confine a light, at the illumination wavelength, between the first end and the second end;
  • step c) repeating step c) at different times;
  • the transmittance of the agar component is greater than 0.1 (10%) between the first end and the second end.
  • step e) can comprise a measurement of a decrease in a quantity of light detected at different instants.
  • the agar contains a chromogenic agent, capable of inducing a change in color of the agar under the effect of the development of microorganisms;
  • step e) comprises detection of a variation of a wavelength of the detected light.
  • the ambient medium includes an analysis medium (2), which may include microorganisms;
  • the method comprises, following step e), a determination of the presence of microorganisms in the analysis medium.
  • the determination of the presence of microorganisms in the medium can in particular be carried out according to the evolution of the light detected at the different instants.
  • the agar component is formed from an agar potentially comprising microorganisms
  • the method comprises, following step e), a determination of the presence of microorganisms in the agar.
  • the determination of the presence of microorganisms in the agar can in particular be carried out according to the evolution of the light detected at the different instants.
  • the first end and the second end are two opposite ends of the agar component, the agar component forming a waveguide between the first end and the second end. According to such an embodiment,
  • the agar component extends along a direction of extension between the first end and the second end;
  • the agar component extends along a diameter or a greater diagonal less than one tenth of the length.
  • the surrounding medium contains water
  • the agar component is placed on an auxiliary agar
  • a layer of water is interposed between the auxiliary agar and the agar component.
  • the helper agar may include nutrients such that nutrients may migrate to the agar component through the water layer.
  • the waveguide has several second ends
  • the waveguide comprises several branches, each branch extending between the same section of the agar component, and each respective second end;
  • the section extends between the first end and each branch
  • the method comprises, following step e), a determination of the presence of microorganisms in the medium, the first medium and/or in the second medium.
  • the agar component extends between a base plane and at least one opposite face
  • the agar component is configured to reflect incident light, emitted by the light source, and reaching the base plane along an axis of incidence, forming, after propagation of the incident light through the agar component, a reflected light , the reflected light emanating from the base plane along a reflection axis.
  • the method comprises, following step e), a determination of the presence of microorganisms in the analysis medium.
  • the opposite face can be a hemispherical face.
  • the opposite face can comprise three elementary faces, each elementary face extending from the same vertex, the three elementary faces forming a trirectangle trihedron. The axis of reflection is then parallel to the axis of incidence.
  • a second object of the invention is a device for determining the presence of microorganisms in an agar component, the device comprising:
  • agar component extending between a first end and a second end, the agar component being at least partially transparent to an illumination wavelength
  • the agar component being configured to confine light, at the illumination wavelength, between the first end and the second end;
  • - a light source configured to illuminate the first end
  • a photodetector configured to detect light emanating from the second end after having propagated between the first end and the second end;
  • step e) of a method according to the first object of the invention so as to determine the presence of a microorganism in the agar component.
  • the agar component may have the characteristics as described in connection with the first object of the invention.
  • Figure IA shows an agar component according to a first embodiment.
  • Figure IB shows a top view of a device using the agar component shown in Figure IA.
  • Figure IC represents a possible implementation of the device described in connection with Figure IB.
  • FIG. 1D represents another possible implementation of the device described in connection with FIG. IC.
  • Figure 2A shows an example of agar component according to the first embodiment.
  • Figure 2B is a photograph of an agar component as described in connection with Figure 2A.
  • Figure 3 shows a variation of the intensity transmitted by a rectilinear agar component, respectively in the absence and in the presence of bacteria in the agar component.
  • FIG. 4A shows an agar component according to a second embodiment.
  • FIG. 4B represents a possible implementation of the agar component described in connection with FIG. 4A.
  • Figure 4C shows a variant of the second embodiment.
  • the invention exploits a variation in the optical properties of an agar component, under the effect of the development of microorganisms on the surface of the latter or in a volume delimited by the latter.
  • the agar component comprises an agar, comprising nutrients conducive to the growth of microorganisms.
  • microorganisms is meant, without limitation, bacteria, viruses, fungi, yeasts or microalgae.
  • the agar can in particular be formed from a hydrogel.
  • the agar can for example comprise agar-agar, according to a mass fraction of between 0.5% and 10% or 0.5% and 20%.
  • the agar is formed by adding a gelling agent, for example a cold gelling agent, to an aqueous solution.
  • the cold gelling agent is water-soluble. It is configured to gel when it is brought into contact with the aqueous solution, at room temperature, thus forming a hydrogel.
  • the cold gelling agent can be chosen from: water-soluble polysaccharide, carboxymethylcellulose, guar gum, gum arabic, gellan gum, xanthan gum, or a gelling agent obtained from animal bones, for example pork, beef, chicken.
  • the agar component is at least partially transparent, or considered so, to at least one illumination wavelength.
  • transmittance denotes a ratio between a light intensity transmitted by the agar component to a light intensity incident on the agar component, at the illumination wavelength.
  • Agar has a refractive index, the latter being generally greater than 1.33 (refractive index of water).
  • One aspect of the invention is to place the agar component in contact with an ambient medium, the refractive index of which is lower than the refractive index of the agar. Due to the variation in refractive index at the interface between the agar component and the ambient medium, the agar component allows confinement of a light propagating in the latter.
  • the agar component 10 extends between a first end 11 and a second end 12.
  • One aspect of the invention is to determine an evolution of the transmittance of the agar component, between the first end 11 and the second end 12, under the effect of growth of microorganisms in the agar component or at the interface between the agar component and the surrounding environment. In a complementary or alternative way, another aspect of the invention is to determine a temporal evolution of the wavelength of a light emanating from the second end.
  • FIGS. 1A to 1D A first embodiment of the invention has been shown in FIGS. 1A to 1D, in which the agar component 10 extends along a rectilinear direction of extension D.
  • the direction of extension D is parallel to a longitudinal axis Y, between the first end 11 and the second end 12.
  • the agar component extends along the direction of extension, between the first end and the second end .
  • the length of the agar component depending on the direction of extension, can be between 1 cm and a few tens of cm, for example 5 cm.
  • the diameter or the longest diagonal of the component 10 is preferably less than one tenth of the length.
  • the agar component extends in an elongated shape between the first end and the second end.
  • the agar component extends, parallel to the X axis, and parallel to the Z axis, along a dimension comprised between 5 ⁇ m and 100 ⁇ m.
  • the agar component 10 is placed in an ambient medium.
  • the ambient medium is formed of air 14 extending around the agar component 10, with the exception of a peripheral part of the component 10, at the level of which the ambient medium is a layer of water 15.
  • the ambient medium surrounding the agar component has a refractive index lower than the refractive index of the agar forming the agar component.
  • the agar component can then form a light guide, between the first end 11 and the second end 12.
  • the agar component 10 is placed in indirect contact with an auxiliary agar 17, the water layer 15 being interposed between the auxiliary agar 17 and the agar component 10.
  • the contact is said to be indirect because of the presence of water at the interface between agar component 10 and auxiliary agar 17.
  • Auxiliary agar 17 may be the same as or different from the agar from which agar component 10 was formed.
  • the agar and the auxiliary agar are hydrogels, the water layer 15 can spontaneously form between the two hydrogels.
  • the agar component 10 and the agar auxiliary 17 are prepared separately and then assembled together. For example, agar component 10 is cast onto helper agar 17 after helper agar 17 has solidified.
  • agar component 10 and auxiliary agar 17 are solidified separately and then joined together.
  • the agar component 10 and the auxiliary agar are not mechanically attached to each other.
  • the layer of water 15 is formed at the interface, by capillarity, the water diffusing from each of the hydrogels.
  • the auxiliary agar 17 constitutes a reserve of nutrients, the nutrients being able to diffuse, from the latter, towards the agar component 10, through the water layer 15.
  • the water layer 15 thus forms an interface between the agar component and the auxiliary agar 17. It is noted that the refractive index of the water layer 15 is lower than that of the agar component 10.
  • the presence of a layer of water 15 at all or part of the periphery of the agar component 10 also makes it possible to prevent the agar component from drying out during its use.
  • FIG. 1B shows, in top view, a device 1 enabling the invention to be implemented.
  • the device comprises a light source 21, placed opposite the first end 11.
  • the light source 21 is configured to emit light so as to illuminate the first end 11 in a wavelength illumination at which the agar component is considered to be at least partially transparent.
  • the light source 21 can be a laser light source, or a white light source, or a light emitting diode.
  • the light source 21 can be associated with an optical fiber, the optical fiber extending between the light source and the first end 11.
  • the light source emits light in an illumination spectral band.
  • a filter making it possible to adjust the spectral band of illumination, can be arranged between the light source 21 and the first end 11.
  • the spectral band of illumination according to which the first end 11 is illuminated, has a bandwidth preferably less than 100 nm. According to one possibility, several spectral illumination bands can be used successively or simultaneously.
  • the device 1 comprises a photodetector 22, configured to detect light emanating from the second end 12.
  • the photodetector 22 can be a photodiode or a pixelated photodetector, for example a CMOS or CCD type image sensor.
  • an incident light beam of incident intensity hn
  • the light is confined inside the agar component, the latter forming a waveguide between the first end 11 and the second end 12.
  • a light beam transmitted by the agar component, of intensity l or t propagates between the second end 12 and the photodetector 22.
  • the photodetector 22 detects the intensity l out of the light transmitted by the agar component 10.
  • the device 1 comprises a processing unit 30, connected to the photodetector 22, so as to perform the processing operations described below, in particular a monitoring of the intensity transmitted or a monitoring of a wavelength of the light beam transmitted.
  • the processing unit 30 may in particular comprise a microprocessor.
  • the agar component is illuminated at different instants, preferably according to the same incident intensity hn.
  • the photodetector 22 measures the intensity l out of the beam transmitted by the agar component.
  • the transmitted intensity I out decreases, under the effect of diffusion or absorption of light by the microorganisms.
  • the evolution, over time, of the transmitted intensity l or t makes it possible to determine the presence of microorganisms developing in the agar component, or at the interface between the agar component and the ambient medium.
  • microorganisms can also generate a morphological variation of the agar component 10, for example discontinuities at the level of the interface with the ambient medium. Such a modification of the surface condition can also lead to a gradual decrease in the transmitted intensity l out .
  • the agar component perpendicular to the direction of extension D, the better the sensitivity of the measurement. For example, when the height (along Z) and the width (along X) are between 5 and 12 ⁇ m, the agar component behaves like a monomode waveguide. The inventors consider that this configuration is particularly sensitive because the microorganisms develop on the surface and this configuration is more sensitive to the surface state.
  • Figure IC illustrates a first mode of implementation, according to which the agar, forming the agar component 10, constitutes an analyzed medium.
  • the temporal evolution of the intensity the output detected by the photodetector 22 is representative of a quantity of microorganisms initially present in the agar.
  • initially present is meant present upon formation of the agar component 10 from the agar.
  • the agar forming the agar component 10 may have been seeded with microorganisms.
  • the agar can comprise a known concentration of an agent which inhibits the development of microorganisms. It may be an agent specific to a given species of microorganisms.
  • the evolution of the intensity of the light beam transmitted can make it possible to determine a sensitivity of the microorganisms with regard to the inhibiting agent.
  • the temporal evolution of the intensity l out detected by the photodetector 22 is then representative of the ability of the microorganisms to develop in the presence of the inhibiting agent.
  • FIG. 1D illustrates a second mode of implementation, according to which the agar component 10 is brought into contact with an analyzed medium 2, the latter forming part of the ambient medium, in which the agar component 10 is placed.
  • the analyzed medium 2 extends around all or part of the agar component. When the analyzed medium contains microorganisms, the latter can develop at the level of the interface between the analyzed medium 2 and the agar component 10. This results in a diffusion or an absorption of the light propagating through the agar component 10. This results in a gradual decrease in the transmitted intensity l out .
  • the analyzed medium 2 can be gaseous or liquid.
  • the refractive index of the analyzed medium 2 is lower than the refractive index of the agar forming the agar component.
  • the temporal evolution of the intensity I out detected by the photodetector 22 is then representative of a quantity of microorganisms present in the analyzed medium.
  • the agar, forming component 10 may comprise a known concentration of an agent which inhibits the development of microorganisms. It may be an agent specific to a given species of microorganisms.
  • FIG. 2A represents a variant of the embodiment described above.
  • the agar component comprises several branches 13i, 132, each branch extending from the same initial section 13, respectively towards several second ends 12i, 122.
  • the agar component comprises two branches, but it can include more.
  • the initial section 13 extends, from the first end 11, towards each branch.
  • the branches converge towards the same point of the central section.
  • the optical paths between the first end 11 and respectively each second end 12i, 122, along each branch are identical.
  • component 10 extends along a non-rectilinear extension direction D between first end 11 and each second end 12i, 122.
  • the first branch 13i is brought into contact with a first analyzed medium 2i and the second branch 13 2 is brought into contact with a second analyzed medium 2 2 .
  • the intensities l out ,i, Lut, 2 respectively from the branches 13i and 132 can be used to compare the developments, on the agar component, of microorganisms present respectively from the first medium 2i and from the second medium 22.
  • FIG. 2B represents a photograph of a waveguide forming two branches, as schematized in FIG. 2A.
  • a light source 21 fibered, injecting an intensity light at the first end of the agar component.
  • This figure illustrates the ability of an agar component to guide light.
  • the agar component was TSA agar (Trypticase Soy Agar: trypticase soy medium).
  • the section of the waveguide was 1*1 mm 2 .
  • Figures 2A and 2B illustrate configurations in which the agar component does not extend straight between the first end 11 and the second end 12.
  • the direction of extension may be curved, or have straight portions and curved portions. . It can be in the form of a spiral, or a zig-zag, this type of geometry making it possible to obtain great lengths between the ends 11 and 12.
  • FIG 3 shows an experimental run, performed using a straight agar component, as depicted in Figures 1A and 1B.
  • the agar component was produced using TSA agar, with a section of 1 mm 2 , and a length of 2 cm.
  • the agar component was obtained by molding, in an aluminum mould, a liquid solution to which a gelling agent (agar-agar - Sigma Aldrich 11296) -concentration 15 g/liter - was added.
  • a gelling agent agar-agar - Sigma Aldrich 11296) -concentration 15 g/liter - was added.
  • the agar contained no bacteria.
  • the agar contained bacteria.
  • the bacterial species was Escherichia coli, initially present in suspension at 2.10 8 cfu/mL, cfu meaning colony forming unit, in physiological serum.
  • the agar of the agar component was inoculated en masse at 40° C. at 1/100 th from suspension, which corresponded to an initial microbial load of 2.10 th cfu/mL in the agar component.
  • the agar component was illuminated with a laser type fiber light source (wavelength 546 nm).
  • the intensity detected by a photodetector, optically coupled to the second end, was measured.
  • the photodetector was a image sensor, arranged in contact with the second end.
  • FIG. 3 shows the time course of the intensity detected respectively using agar without bacteria (curve a) and agar containing bacteria (curve b).
  • the ordinate axis corresponds to light intensity (gray levels), while the abscissa axis corresponds to time (unit: minute).
  • a clear and rapid decrease in light intensity is observed in the presence of bacteria in the agar.
  • This figure illustrates an important aspect of the invention: the use of an agar both to allow bacteria to grow, but also to guide light between two ends of the agar component, for analysis purposes.
  • Figure 4A shows another embodiment, in which the agar component 10 forms a half-ball.
  • the half ball extends between a base plane P and an opposite face F.
  • the opposite face F is hemispherical.
  • the first end 11 and the second end 12 are coplanar and formed on the base plane P.
  • a light source 21 emits an incident light beam of intensity l in towards the first end 11.
  • a photodetector 22 detects a transmitted light beam coming from the second end 12.
  • the transmitted light beam is a reflected light beam.
  • the light beam is reflected by successive internal reflections, on the hemispherical face F.
  • the intensity l out reflected by the agar component is attenuated, under the effect of diffusion or absorption light propagating through the agar component.
  • FIG. 4B an example of implementation has been shown in which the hemispherical face is placed in an analyzed medium 2, the latter possibly being gaseous or liquid.
  • the refractive index of the analyzed medium 2 is lower than the refractive index of the agar forming the agar component.
  • the analyzed medium 2 can be water or gas.
  • FIG. 4C a variant of this embodiment has been shown, in which the agar component extends between a base plane P and an opposite face F, the latter forming an isosceles trirectangle trihedron.
  • An isosceles trirectangle trihedron shape is known in the field of optics.
  • the opposite face F has three elementary faces Fi, F 2 , F 3 that are orthogonal, planar, secant at the same point, the latter forming a vertex S.
  • Each face forms a right-angled triangle, preferably isosceles, the right angle of which is located at the level of the vertex S.
  • the base plane P is perpendicular to a height of the trihedron passing through the vertex S.
  • the base plane P forms a base of the trihedron, opposite to the vertex S.
  • base of the trihedron we mean a plane s 'extending perpendicularly to a height from the vertex S of the trihedron.
  • the agar component behaves like a reflector: when an incident light beam propagates towards the plane of base P, parallel to an axis of incidence, the agar component forms a reflected wave which propagates, from the base plane P, along an axis of reflection parallel to the axis of incidence.
  • the transmitted light beam is a reflected light beam.
  • the light beam is reflected by successive internal reflections, on the faces Fi, F 2 and F 3 .
  • the intensity I out reflected by the agar component is attenuated, under the effect of the diffusion or absorption of the light propagating in the component.
  • the reflector represented in FIG. 4C can be used according to the embodiment described in connection with FIG. 4B.
  • the agar component can comprise a chromogenic substrate, configured to induce a variation in color of the agar in the presence of microorganisms.
  • the substrate can for example lead to a variation in color under the effect of the metabolism of the microorganisms.
  • the photodetector 22 is configured to detect a color variation of the light beam emanating from the agar component 10. The greater the quantity of bacteria present in the agar component, or on the surface of the agar component, the more the color change of the light is marked.
  • the detection of a development of microorganisms in the component, or on the surface of the latter can be carried out by measuring a change in the wavelength of the light emanating from the agar component.

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Abstract

Procédé de détermination d'une présence de microorganismes dans un composant gélosé (10), comprenant une gélose, la gélose comportant des nutriments propices au développement de 5 microorganismes, le procédé comportant : ‐ a) obtention du composant gélosé, s'étendant entre une première extrémité (11) et une deuxième extrémité (12), et étant au moins en partie transparent à une longueur d'onde d'illumination; ‐ b) disposition du composant gélosé obtenu lors de a), au contact d'un milieu ambiant (2, 10 14, 15), le milieu ambiant ayant un indice de réfraction inférieur à l'indice de réfraction de la gélose, de telle sorte que la gélose soit apte à confiner une lumière, à ladite longueur d'onde; ‐ c) illumination de la première extrémité par une source de lumière (21), et détection, par le photodétecteur (22), d'une lumière émanant de la deuxième extrémité après s'être propagée entre la première extrémité et la deuxième extrémité; ‐ d) répétition de l'étape c) en différents instants; ‐ e) à partir d'une évolution de la lumière détectée en différents instants, détermination d'une présence de microorganismes dans le composant gélosé.

Description

Description
Titre : procédé de détermination de la présence de bactéries dans ou sur un composant gélosé
DOMAINE TECHNIQUE
Le domaine technique de l'invention est la détermination de la présence de bactéries dans une gélose ou à la surface d'une gélose, par des mesures optiques.
ART ANTERIEUR
L'observation de colonies bactériennes par imagerie est une technique connue depuis bien longtemps dans le domaine de la microbiologie, pour effectuer un suivi du développement de de microorganismes ou de cellules. Dans une boîte de Pétri, il est possible de suivre le développement de colonies, par exemple de colonies bactériennes, et de les dénombrer. La forme des colonies donne une information sur le type de microorganisme. En outre, en combinant l'utilisation de différents milieux de culture, permettant ou ne permettant pas le développement de colonies, il est possible d'identifier le type de microorganisme formant des colonies.
La caractérisation de microorganismes sur des boîtes de Pétri est encore une méthode de référence, dont l'utilisation est fréquente dans le domaine de la microbiologie, du diagnostic, mais également dans le domaine de l'agroalimentaire ou de la cosmétique. Le principal inconvénient de cette méthode est sa lenteur, puisqu'il faut généralement attendre plusieurs journées pour obtenir un résultat exploitable. Un autre inconvénient est que cette méthode est difficilement automatisable, et requiert des opérateurs humains expérimentés.
La publication Jain A. « Gel-based optical waveguides with live cell encapsulation and integrated microfluidics" décrit le recours à un guide d'onde en gel d'agarose comportant des cellules. Le guide d'onde est utilisé pour guider une lumière d'excitation de fluorescence. Il est ainsi possible d'observer une lumière de fluorescence de cellules à travers le guide d'onde.
La publication Fujiwara E. "Agarose-based structured optical fibre" décrit l'utilisation d'une fibre optique pour caractériser un liquide dans lequel la fibre est plongée. La réponse de la fibre dépend de l'indice de réfraction du liquide. Cette publication décrit également l'utilisation d'une fibre optique en gel d'agarose, comportant des cellules. La fibre optique est utilisée en tant que guide d'onde, pour guider une lumière d'excitation et une lumière de fluorescence des cellules. Plus précisément, la fibre permet d'évaluer la réponse spectrale des cellules en fonction de l'environnement.
Récemment, des méthodes holographiques ont permis le dénombrement et la caractérisation de microorganismes, et constituent des alternatives prometteuses aux techniques existantes, en permettant une meilleure automatisation. La demande de brevet US20200327306 décrit un procédé permettant une détection précoce du développement de bactéries dans une gélose, en particulier une gélose opaque. Il s'agit d'un procédé conférant un large champ d'observation, et pouvant être mis en œuvre à partir d'un dispositif simple et peu onéreux.
Les inventeurs proposent une autre approche, adaptée à des géloses présentant un certain niveau de transparence, et permettant également d'effectuer une détermination rapide de la présence de microorganismes dans un échantillon.
EXPOSE DE L'INVENTION
Un premier objet de l'invention est un procédé de détermination d'une présence de microorganismes dans un composant gélosé, le composant gélosé étant formé à partir d'une gélose, la gélose comportant des nutriments propices au développement de microorganismes, le procédé comportant :
- a) obtention du composant gélosé, le composant gélosé s'étendant entre une première extrémité et une deuxième extrémité, le composant gélosé étant au moins en partie transparent à une longueur d'onde d'illumination ;
- b) disposition du composant gélosé, obtenu lors de a), au contact d'au moins un milieu ambiant, le milieu ambiant ayant un indice de réfraction inférieur à l'indice de réfraction de la gélose, de telle sorte que le composant gélosé soit apte à confiner une lumière, à la longueur d'onde d'illumination, entre la première extrémité et la deuxième extrémité ;
- c) illumination de la première extrémité par une source de lumière, dans la longueur d'onde d'illumination, et détection, par un photodétecteur, d'une lumière émanant de la deuxième extrémité après s'être propagée entre la première extrémité et la deuxième extrémité ;
- d) répétition de l'étape c) en différents instants ;
- e) à partir d'une évolution de la lumière détectée en différents instants, détermination d'une présence de microorganismes dans le composant gélosé. Par au moins en partie transparent, on entend que la transmittance du composant gélosé est supérieure à 0,1 (10%) entre la première extrémité et la deuxième extrémité.
Selon un mode de réalisation, l'étape e) peut comporter une mesure d'une diminution d'une quantité de la lumière détectée en différents instants.
Selon un mode de réalisation :
- la gélose comporte un agent chromogène, apte à induire un changement de couleur de la gélose sous l'effet du développement des microorganismes ;
- l'étape e) comporte une détection d'une variation d'une longueur d'onde de la lumière détectée.
Selon un mode de réalisation :
- au cours de plusieurs étapes c), le milieu ambiant comporte un milieu d'analyse (2) , susceptible de comporter des microorganismes ;
- le procédé comporte, suite à l'étape e), une détermination d'une présence de microorganismes dans le milieu d'analyse. La détermination de la présence de microorganismes dans le milieu peut notamment être effectuée en fonction de l'évolution de la lumière détectée aux différents instants.
Selon un mode de réalisation :
- lors l'étape a), le composant gélosé est formé à partir d'une gélose comportant potentiellement des microorganismes ;
- le procédé comporte, suite à l'étape e), une détermination d'une présence de microorganismes dans la gélose. La détermination de la présence de microorganismes dans la gélose peut notamment être effectuée en fonction de l'évolution de la lumière détectée aux différents instants.
Selon un mode de réalisation, la première extrémité et la deuxième extrémité sont deux extrémités opposées du composant gélosé, le composant gélosé formant un guide d'onde entre la première extrémité et la deuxième extrémité. Selon un tel mode de réalisation,
- le composant gélosé s'étend selon une direction d'extension entre la première extrémité et la deuxième extrémité ;
- la distance entre la première extrémité et la deuxième extrémité, selon la direction d'extension, forme une longueur du composant gélosé ;
- perpendiculairement à la direction d'extension, le composant gélosé s'étend selon un diamètre ou une plus grande diagonale inférieure au dixième de la longueur.
Selon une possibilité, - le milieu ambiant comporte de l'eau ;
- tout ou partie d'une périphérie du composant gélosé est mise en contact avec de l'eau.
Selon un mode de réalisation :
- le composant gélosé est disposé sur une gélose auxiliaire ;
- une couche d'eau est interposée entre la gélose auxiliaire et le composant gélosé.
La gélose auxiliaire peut comporter des nutriments, de sorte que des nutriments peuvent migrer vers le composant gélosé, à travers la couche d'eau.
Selon une possibilité :
- le guide d'onde comporte plusieurs deuxièmes extrémités ;
- le guide d'onde comporte plusieurs branches, chaque branche s'étendant à entre un même tronçon du composant gélosé, et chaque deuxième extrémité respective ;
- le tronçon s'étend entre la première extrémité et chaque branche ;
- au cours de plusieurs étapes c) :
• une première branche est mise en contact avec un premier milieu ;
• une deuxième branche, différente de la première branche, est mise en contact avec un deuxième milieu ;
- le procédé comporte, suite à l'étape e), une détermination d'une présence de microorganismes dans le milieu le premier milieu et/ou dans le deuxième milieu.
Selon un mode de réalisation,
- le composant gélosé s'étend entre un plan de base et au moins une face opposée ;
- la première extrémité et la deuxième extrémité sont disposées sur le plan de base ;
- le composant gélosé est configuré pour réfléchir une lumière incidente, émise par la source de lumière, et atteignant le plan de base selon un axe d'incidence, en formant, après propagation de la lumière incidente à travers le composant gélosé, une lumière réfléchie, la lumière réfléchie émanant du plan de base selon un axe de réflexion.
Selon ce mode de réalisation,
- lors de plusieurs étapes c), tout ou partie de la face opposée est mise en contact avec un milieu d'analyse, susceptible de comporter des microorganismes ;
- le procédé comporte, suite à l'étape e), une détermination d'une présence de microorganismes dans le milieu d'analyse.
La face opposée peut être une face hémisphérique. La face opposée peut comportée trois faces élémentaires, chaque face élémentaire s'étendant à partir d'un même sommet, les trois faces élémentaires formant un trièdre trirectangle. L'axe de réflexion est alors parallèle à l'axe d'incidence.
Un deuxième objet de l'invention est un dispositif, pour déterminer une présence de microorganismes dans un composant gélosé, le dispositif comportant :
- un composant gélosé, le composant gélosé s'étendant entre une première extrémité et une deuxième extrémité, le composant gélosé étant au moins en partie transparent à une longueur d'onde d'illumination ;
- le composant gélosé étant configuré pour confiner une lumière, à la longueur d'onde d'illumination, entre la première extrémité et la deuxième extrémité ;
- une source de lumière, configurée pour illuminer la première extrémité ;
- un photodétecteur, configuré pour détecter une lumière émanant de la deuxième extrémité après s'être propagée entre la première extrémité et la deuxième extrémité ;
- une unité de traitement, programmée pour mettre en œuvre l'étape e) d'un procédé selon le premier objet de l'invention, de façon à déterminer une présence d'un microorganisme dans le composant gélosé.
Le composant gélosé peut présenter les caractéristiques telles que décrites en lien avec le premier objet de l'invention.
L'invention sera mieux comprise à la lecture de l'exposé des exemples de réalisation présentés, dans la suite de la description, en lien avec les figures listées ci-dessous.
FIGURES
La figure IA représente un composant gélosé selon une premier mode de réalisation.
La figure IB montre une vue de dessus d'un dispositif utilisant le composant gélosé représenté sur la figure IA.
La figure IC représente une possibilité de mise en œuvre du dispositif décrit en lien avec la figure IB.
La figure 1D représente une autre possibilité de mise en œuvre du dispositif décrit en lien avec la figure IC.
La figure 2A montre un exemple de composant gélosé selon le premier mode de réalisation.
La figure 2B est une photographie d'un composant gélosé tel que décrit en lien avec la figure 2A.
La figure 3 montre une variation de l'intensité transmise par un composant gélosé rectiligne, respectivement en l'absence et en présence de bactéries dans le composant gélosé.
La figure 4A représente un composant gélosé selon un deuxième mode de réalisation. La figure 4B représente une possibilité de mise en œuvre du composant gélosé décrit en lien avec la figure 4A.
La figure 4C représente une variante du deuxième mode de réalisation.
EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS
L'invention exploite une variation des propriétés optiques d'un composant gélosé, sous l'effet du développement de microorganismes à la surface de ce dernier ou dans un volume délimité par ce dernier. Le composant gélosé comporte une gélose, comportant des nutriments propices au développement de microorganismes.
Par microorganismes, on entend, à titre non limitatif, des bactéries, des virus, des champignons, des levures ou des microalgues.
La gélose peut notamment être formée d'un hydrogel. La gélose peut par exemple comprendre de l'agar-agar, selon une fraction massique comprise entre 0.5% et 10% ou 0.5% et 20%. Selon une possibilité, la gélose est formée par l'adjonction d'un gélifiant, par exemple un gélifiant à froid, à une solution aqueuse. Le gélifiant à froid est hydrosoluble. Il est configuré pour gélifier lorsqu'il est mis au contact de la solution aqueuse, à température ambiante, formant alors un hydrogel. Le gélifiant à froid peut être choisi parmi : polysaccharide hydrosoluble, carboxyméthylcellulose, gomme de guar, gomme arabique, gomme gellane, gomme de xanthane, ou un gélifiant obtenu à partir d'os d'animaux, par exemple porc, bœuf, poulet.
Le composant gélosé est au moins en partie transparent, ou considéré comme tel, à au moins une longueur d'onde d'illumination. Par au moins en partie transparent, on entend que la transmittance du composant gélosé, est supérieure à 0.1, et de préférence supérieure à 0.3 ou 0.5. Le terme transmittance désigne un ratio entre une intensité lumineuse transmise par le composant gélosé sur une intensité lumineuse incidente au composant gélosé, à la longueur d'onde d'illumination.
La gélose présente un indice de réfraction, ce dernier étant généralement supérieur à 1.33 (indice de réfraction de l'eau). Un aspect de l'invention est de disposer le composant gélosé au contact d'un milieu ambiant, dont l'indice de réfraction est inférieur à l'indice de réfraction de la gélose. Du fait de la variation d'indice de réfraction à l'interface entre le composant gélosé et le milieu ambiant, le composant gélosé permet un confinement d'une lumière se propageant dans ce dernier. Le composant gélosé 10 s'étend entre une première extrémité 11 et une deuxième extrémité 12. Un aspect de l'invention est de déterminer une évolution de la transmittance du composant gélosé, entre la première extrémité 11 et la deuxième extrémité 12, sous l'effet du développement de microorganismes dans le composant gélosé ou au niveau de l'interface entre le composant gélosé et le milieu ambiant. De façon complémentaire ou alternative, un autre aspect de l'invention est de déterminer une évolution temporelle de la longueur d'onde d'une lumière émanant de la deuxième extrémité.
On a représenté, sur les figures IA à 1D, un premier mode de réalisation de l'invention, dans lequel le composant gélosé 10 s'étend selon une direction d'extension D rectiligne. Dans cet exemple, la direction d'extension D est parallèle à un axe longitudinal Y, entre la première extrémité 11 et la deuxième extrémité 12. Le composant gélosé s'étend selon la direction d'extension, entre la première extrémité et la deuxième extrémité. La longueur du composant gélosé, selon la direction d'extension, peut être comprise entre 1 cm et quelques dizaines de cm, par exemple 5 cm. Perpendiculairement à la direction d'extension D, le diamètre ou la plus grande diagonale du composant 10 est de préférence inférieure au dixième de la longueur. Ainsi, le composant gélosé s'étend selon une forme longiligne entre la première extrémité et la deuxième extrémité. Dans l'exemple représenté, le composant gélosé s'étend, parallèlement à l'axe X, et parallèlement à l'axe Z, selon une dimension comprise entre 5 pm et 100 pm.
Le composant gélosé 10 est disposé dans un milieu ambiant. Dans cet exemple, le milieu ambiant est formé d'air 14 s'étendant autour du composant gélosé 10, à l'exception d'une partie périphérique du composant 10, au niveau de laquelle le milieu ambiant est une couche d'eau 15. Ainsi, qu'il s'agisse d'air ou d'eau, le milieu ambiant entourant le composant gélosé présente un indice de réfraction inférieur à l'indice de réfraction de la gélose formant le composant gélosé. Le composant gélosé peut alors former un guide de lumière, entre la première extrémité 11 et la deuxième extrémité 12.
Dans le mode de réalisation représenté, le composant gélosé 10 est disposé en contact indirect avec une gélose auxiliaire 17, la couche d'eau 15 étant interposée entre la gélose auxiliaire 17 et le composant gélosé 10. Le contact est dit indirect du fait de la présence de l'eau à l'interface entre le composant gélosé 10 et la gélose auxiliaire 17. La gélose auxiliaire 17 peut être une gélose identique ou différente de la gélose à partir de laquelle le composant gélosé 10 a été formé. Lorsque la gélose et la gélose auxiliaire sont des hydrogels, la couche d'eau 15 peut se former spontanément entre les deux hydrogels. En effet, le composant gélosé 10 et la gélose auxiliaire 17 sont préparés séparément puis assemblés l'un à l'autre. Par exemple, le composant gélosé 10 est coulé sur la gélose auxiliaire 17 après que la gélose auxiliaire 17 a été solidifiée. Selon une autre possibilité, le composant gélosé 10 et la gélose auxiliaire 17 sont solidifiés séparément puis assemblés. Ainsi, le composant gélosé 10 et la gélose auxiliaire ne sont pas fixés mécaniquement l'un à l'autre. La couche d'eau 15 se forme à l'interface, par capillarité, l'eau diffusant depuis de chacun des hydrogels.
La gélose auxiliaire 17 constitue une réserve de nutriments, les nutriments pouvant diffuser, à partir de cette dernière, vers le composant gélosé 10, à travers la couche d'eau 15. La couche d'eau 15 forme ainsi une interface entre le composant gélosé et la gélose auxiliaire 17. On note que l'indice de réfraction de la couche d'eau 15 est plus faible que celui du composant gélosé 10.
D'une façon générale, la présence d'une couche d'eau 15 au niveau de tout ou partie de la périphérie du composant gélosé 10 permet également d'éviter un assèchement du composant gélosé au cours de son utilisation.
La figure IB représente, en vue de dessus, un dispositif 1 permettant une mise en œuvre de l'invention. Outre le composant gélosé 10 préalablement décrit, le dispositif comporte une source de lumière 21, disposée face à la première extrémité 11. La source de lumière 21 est configurée pour émettre une lumière de façon à illuminer la première extrémité 11 dans une longueur d'onde d'illumination à laquelle le composant gélosé est considéré comme au moins en partie transparent. La source de lumière 21 peut être une source de lumière laser, ou une source de lumière blanche, ou une diode électroluminescente. La source de lumière 21 peut être associée à une fibre optique, la fibre optique s'étendant entre la source de lumière et la première extrémité 11. La source de lumière émet une lumière dans une bande spectrale d'illumination. Un filtre, permettant d'ajuster la bande spectrale d'illumination, peut être disposé entre la source de lumière 21 et la première extrémité 11. La bande spectrale d'illumination, selon laquelle la première extrémité 11 est illuminée, a une largeur de bande de préférence inférieure à 100 nm. Selon une possibilité, plusieurs bandes spectrales d'illumination peuvent être utilisées successivement ou simultanément.
Le dispositif 1 comporte un photodétecteur 22, configuré pour détecter une lumière émanant de la deuxième extrémité 12. Le photodétecteur 22 peut être une photodiode ou un photodétecteur pixelisé, par exemple un capteur d'image de type CMOS ou CCD. Sous l'effet de l'illumination de la première extrémité 11 par la source de lumière 21, un faisceau lumineux incident, d'intensité incidente hn, pénètre dans le composant gélosé 10. Du fait du contraste d'indices de réfraction au niveau de l'interface entre le composant gélosé 10 et le milieu ambiant (eau ou air), la lumière est confinée à l'intérieur du composant gélosé, ce dernier formant un guide d'onde entre la première extrémité 11 et la deuxième extrémité 12. Un faisceau lumineux transmis par le composant gélosé, d'intensité lout, se propage entre la deuxième extrémité 12 et le photodétecteur 22. Le photodétecteur 22 détecte l'intensité lout de la lumière transmise par le composant gélosé 10.
Le dispositif 1 comporte une unité de traitement 30, reliée au photodétecteur 22, de façon à effectuer les opérations de traitement décrites par la suite, en particulier un suivi de l'intensité transmise ou un suivi d'une longueur d'onde du faisceau lumineux transmis. L'unité de traitement 30 peut notamment comporter un microprocesseur.
Le composant gélosé est illuminé à différents instants, de préférence selon une même intensité d'incidente hn. A chaque instant, la photodétecteur 22 mesure l'intensité lout du faisceau transmis par le composant gélosé. Lorsque des microorganismes se développent dans le composant gélosé, ou à la surface de ce dernier, l'intensité transmise lout diminue, sous l'effet d'une diffusion ou d'une absorption de la lumière par les microorganismes. Ainsi, l'évolution, dans le temps, de l'intensité transmise lout, permet de déterminer une présence de microorganismes se développant dans le composant gélosé, ou à l'interface entre le composant gélosé et le milieu ambiant.
Le développement de microorganismes peut également engendrer une variation morphologique du composant gélosé 10, par exemple des discontinuités au niveau de l'interface avec le milieu ambiant. Une telle modification de l'état de surface peut également entraîner une diminution progressive de l'intensité transmise lout.
Plus les dimensions du composant gélosé, perpendiculairement à la direction d'extension D, sont faibles, meilleure est la sensibilité de la mesure. Par exemple, lorsque que la hauteur (selon Z) et la largeur (selon X) sont comprises entre 5 et 12 pm, le composant gélosé se comporte comme un guide d'onde monomode. Les inventeurs estiment que cette configuration est particulièrement sensible car les microorganismes se développent en surface et cette configuration est plus sensible à l'état de surface.
La figure IC illustre une première modalité de mise en œuvre, selon laquelle la gélose, formant le composant gélosé 10, constitue un milieu analysé. Ainsi, l'évolution temporelle de l'intensité lout détectée par le photodétecteur 22 est représentative d'une quantité de microorganismes initialement présente dans la gélose. Par initialement présente, on entend présente lors de la formation du composant gélosé 10 à partir de la gélose.
Selon une application, la gélose formant le composant gélosé 10 peut avoir fait l'objet d'un ensemencement par des microorganismes. Selon cette modalité, la gélose peut comporter une concentration connue d'un agent inhibiteur du développement de microorganismes. Il peut s'agir d'un agent spécifique à une espèce donnée de microorganismes. L'évolution de l'intensité du faisceau lumineux transmis peut permettre de déterminer une sensibilité des microorganismes à l'égard de l'agent inhibiteur. L'évolution temporelle de l'intensité lout détectée par le photodétecteur 22 est alors représentative de l'aptitude des microorganismes à se développer en présence de l'agent inhibiteur.
La figure 1D illustre une deuxième modalité de mise en œuvre, selon laquelle le composant gélosé 10 est mis au contact d'un milieu analysé 2, ce dernier formant une partie du milieu ambiant, dans lequel le composant gélosé 10 est disposé. Le milieu analysé 2 s'étend autour de tout ou partie du composant gélosé. Lorsque le milieu analysé comporte des microorganismes, ces derniers peuvent se développer au niveau de l'interface entre le milieu analysé 2 et le composant gélosé 10. Il en résulte une diffusion ou une absorption de la lumière se propageant à travers le composant gélosé 10. Cela se traduit par une diminution progressive de l'intensité transmise lout. Le milieu analysé 2 peut être gazeux ou liquide. L'indice de réfraction du milieu analysé 2 est inférieur à l'indice de réfraction de la gélose formant le composant gélosé. L'évolution temporelle de l'intensité lout détectée par le photodétecteur 22 est alors représentative d'une quantité de microorganismes présents dans le milieu analysé.
De même que dans la première modalité, la gélose, formant le composant 10, peut comporter une concentration connue d'un agent inhibiteur du développement de microorganismes. Il peut s'agir d'un agent spécifique à une espèce donnée de microorganismes.
La figure 2A représente une variante du mode de réalisation précédemment exposé. Selon cette variante, le composant gélosé comporte plusieurs branches 13i, 132, chaque branche s'étendant à partir d'un même tronçon initial 13, respectivement vers plusieurs deuxièmes extrémités 12i, 122. Dans cet exemple, le composant gélosé comporte deux branches, mais il peut en comporter davantage. Le tronçon initial 13 s'étend, à partir de la première extrémité 11, vers chaque branche. De préférence, les branches convergent vers un même point du tronçon central. De préférence, les trajets optiques entre la première extrémité 11 et respectivement chaque deuxième extrémité 12i, 122, le long de chaque branche, sont identiques. Dans cet exemple, le composant 10 s'étend selon une direction d'extension D non rectiligne entre la première extrémité 11 et chaque deuxième extrémité 12i, 122.
Une possibilité de mise en œuvre est illustrée sur la figure 2A : la première branche 13i est mise au contact d'un premier milieu analysé 2i et la deuxième branche 132 est mise en contact avec un deuxième milieu analysé 22. Les intensités lout,i, Lut, 2 respectivement issues des branches 13i et 132 peuvent être utilisées pour comparer les développements, sur le composant gélosé, de microorganismes présents respectivement du premier milieu 2i et du deuxième milieu 22.
La figure 2B représente une photographie d'un guide d'onde formant deux branches, tel que schématisé sur la figure 2A. On a représenté une source de lumière 21, fibrée, injectant une lumière d'intensité à la première extrémité du composant gélosé. Cette figure illustre la capacité d'un composant gélosé à guider la lumière. Dans cet exemple, le composant gélosé était formé d'une gélose TSA (Trypticase Soy Agar : milieu trypticase soja). La section du guide d'onde était de 1*1 mm2.
Les figures 2A et 2B illustrent des configurations selon lesquelles le composant gélosé ne s'étend pas de façon rectiligne entre la première extrémité 11 et la deuxième extrémité 12. La direction d'extension peut être courbe, ou comporte des parties rectilignes et des parties courbes. Elle peut être en forme de spirale, ou en zig-zag, ce type de géométrie permettant d'obtenir de grandes longueurs entre les extrémités 11 et 12.
La figure 3 montre un essai expérimental, réalisé en utilisant un composant gélosé rectiligne, tel que décrit sur les figures IA et IB. Le composant gélosé a été réalisé en utilisant une gélose TSA, de section 1 mm2, et de longueur 2 cm. Le composant gélosé a été obtenu par moulage, dans un moule d'aluminium, d'une solution liquide à laquelle on a ajouté un gélifiant (agar-agar - Sigma Aldrich 11296) -concentration 15 g/litre. Au cours d'un premier essai, la gélose ne comportait pas de bactéries. Au cours d'un deuxième essai, la gélose comportait des bactéries. L'espèce bactérienne était Escherichia coli, initialement présente en suspension à 2.108 cfu/mL, cfu signifiant unité formant colonie (colony forming unit), dans du sérum physiologique. La gélose du composant gélosé a été ensemencée en masse à 40°C au l/100ieme à partir de suspension, ce qui correspondait à une charge microbienne initiale de 2. 10e cfu/mL dans le composant gélosé. Le composant gélosé a été illuminé avec une source de lumière fibrée de type laser (longueur d'onde 546 nm). On a mesuré l'intensité détectée par un photodétecteur, optiquement couplé à la deuxième extrémité. Dans cet exemple, le photodétecteur était un capteur d'image, disposé au contact de la deuxième extrémité. La figure 3 montre l'évolution temporelle de l'intensité détectée respectivement en utilisant la gélose sans bactérie (courbe a) et la gélose comportant des bactéries (courbe b). L'axe des ordonnées correspond à l'intensité lumineuse (niveaux de gris), tandis que l'axe des abscisses correspond au temps (unité : minute). On observe une nette, et rapide, décroissance de l'intensité lumineuse en présence de bactéries dans la gélose. Cette figure illustre un aspect important de l'invention : l'utilisation d'une gélose à la fois pour permettre un développement de bactéries, mais également pour guider une lumière entre deux extrémités du composant gélosé, à des fins d'analyse.
La figure 4A montre un autre mode de réalisation, dans lequel le composant gélosé 10 forme une demi-boule. La demi boule s'étend entre un plan de base P et une face opposée F. Dans cet exemple, la face opposée F est hémisphérique. Lorsque le composant gélosé est disposé dans un milieu ambiant dont l'indice de réfraction est suffisamment inférieur à celui de la gélose, le composant gélosé peut se comporter comme un réflecteur : lorsqu'un faisceau lumineux incident se propage vers le plan de base P, parallèlement à un axe d'incidence, à la périphérie du plan de base, le composant gélosé 10 forme, par réflexions internes, une onde réfléchie, qui se propage, à partir du plan de base P, selon un axe de réflexion.
Selon un tel mode de réalisation, la première extrémité 11 et la deuxième extrémité 12 sont coplanaires et formées sur le plan de base P. De même que décrit dans les modes de réalisation précédents, une source de lumière 21 émet un faisceau lumineux incident d'intensité lin vers la première extrémité 11. Un photodétecteur 22 détecte un faisceau lumineux transmis, issu de la deuxième extrémité 12. Dans ce mode de réalisation, le faisceau lumineux transmis est un faisceau lumineux réfléchi. Le faisceau lumineux est réfléchi par des réflexions internes successives, sur la face hémisphérique F. Lorsque le composant gélosé comporte des microorganismes, l'intensité lout réfléchie par le composant gélosée est atténuée, sous l'effet de la diffusion ou de l'absorption de la lumière se propageant dans le composant gélosé.
Sur la figure 4B, on a représenté un exemple de mise en œuvre dans lequel la face hémisphérique est placée dans un milieu analysé 2, ce dernier pouvant être gazeux ou liquide. L'indice de réfraction du milieu analysé 2 est inférieur à l'indice de réfraction de la gélose formant le composant gélosé. Lorsque des microorganismes sont présents dans le milieu analysé 2, ils se développent sur la face F. Il en résulte une modification des propriétés de réflexion interne, conduisant à une diminution de l'intensité réfléchie lout. Le milieu analysé 2 peut être de l'eau ou du gaz. Sur la figure 4C, on a représenté une variante de ce mode de réalisation, dans laquelle le composant gélosé s'étend entre un plan de base P et une face opposée F, cette dernière formant un trièdre trirectangle isocèle. Une forme en trièdre trirectangle isocèle, usuellement désignée « coin de cube », est connue dans le domaine de l'optique. La face opposée F comporte trois faces élémentaires Fi, F2, F3 orthogonales, planes, sécantes en un même point, ce dernier formant un sommet S. Chaque face forme un triangle rectangle, de préférence isocèle, dont l'angle droit est situé au niveau du sommet S. Le plan de base P est perpendiculaire à une hauteur du trièdre passant par le sommet S. Le plan de base P forme une base du trièdre, opposée au sommet S. Par base du trièdre, on entend un plan s'étendant perpendiculairement à une hauteur issue du sommet S du trièdre.
Selon cette variante, lorsque le composant gélosé est disposé dans un milieu ambiant dont l'indice de réfraction est suffisamment inférieur à celui de la gélose, le composant gélosé se comporte comme un réflecteur : lorsqu'un faisceau lumineux incident se propage vers le plan de base P, parallèlement à un axe d'incidence, le composant gélosé forme une onde réfléchie qui se propage, à partir du plan de base P, selon un axe de réflexion parallèle à l'axe d'incidence.
Le faisceau lumineux transmis est un faisceau lumineux réfléchi. Le faisceau lumineux est réfléchi par des réflexions internes successives, sur les faces Fi, F2 et F3. Lorsque le composant gélosé comporte des microorganismes, l'intensité lout réfléchie par le composant gélosée est atténuée, sous l'effet de la diffusion ou de l'absorption de la lumière se propageant dans le composant.
Le réflecteur représenté sur la figure 4C peut être utilisé selon le mode de réalisation décrit en lien avec la figure 4B.
Quel que soit le mode de réalisation, le composant gélosé peut comporter un substrat chromogène, configuré pour induire une variation de couleur de la gélose en présence de microorganismes. Le substrat peut par exemple entraîner une variation de couleur sous l'effet du métabolisme des microorganismes. Selon un tel mode de réalisation, le photodétecteur 22 est configuré pour détecter une variation de couleur du faisceau lumineux émanant du composant gélosé 10. Plus la quantité de bactéries présentes dans le composant gélosé, ou à la surface du composant gélosé, est importante, plus le changement de couleur de la lumière est marqué. Ainsi, la détection d'un développement de microorganismes dans le composant, ou à la surface de ce dernier, peut être effectuée par une mesure d'un changement de la longueur d'onde de la lumière émanant du composant gélosé.

Claims

Les substrats de la beta-D-glucuronidase, comme par exemple les dérivés indoxyles du beta-D- glucuronide, forment des substrats chromogéniques précipitant permettent de mettre en évidence spécifiquement Escherichia coli. Les substrats de l'alpha-glucosidase, comme par exemple les dérivés indoxyles du beta-D-glucuronide, permettent de mettre en évidence spécifiquement Staphylococcus aureus.
Quel que soit le mode de réalisation, un composant gélosé tel que précédemment décrit peut être obtenu par moulage d'une solution liquide à laquelle est ajouté un gélifiant à froid. Le moulage peut être effectué dans un moule métallique, par exemple en aluminium. Alternativement, la solution introduite dans le moule est une gélose chauffée au-delà d'une température de surfusion, par exemple entre 40°C et 60 °C. Outre le moulage, un composant gélosé peut être obtenu par usinage d'une gélose.
REVENDICATIONS Procédé de détermination d'une présence de microorganismes dans un composant gélosé (10), le composant gélosé étant formé à partir d'une gélose, la gélose comportant des nutriments propices au développement de microorganismes, le procédé comportant :
- a) obtention du composant gélosé, le composant gélosé s'étendant entre une première extrémité (11) et une deuxième extrémité (12), le composant gélosé étant au moins en partie transparent à une longueur d'onde d'illumination ;
- b) disposition du composant gélosé, obtenu lors de a), au contact d'au moins un milieu ambiant (2, 14, 15), le milieu ambiant ayant un indice de réfraction inférieur à l'indice de réfraction de la gélose, de telle sorte que le composant gélosé soit apte à confiner une lumière, à la longueur d'onde d'illumination, entre la première extrémité et la deuxième extrémité ;
- c) illumination de la première extrémité par une source de lumière (21), dans la longueur d'onde d'illumination, et détection, par un photodétecteur (22), d'une lumière émanant de la deuxième extrémité (12) après s'être propagée entre la première extrémité et la deuxième extrémité ;
- d) répétition de l'étape c) en différents instants ;
- e) à partir d'une évolution de la lumière détectée en différents instants, détermination d'une présence de microorganismes dans le composant gélosé, l'étape e) comportant une mesure d'une diminution de la lumière détectée en différents instants, sous l'effet d'une diffusion ou d'une absorption de la lumière par les microorganismes, ou sous l'effet d'une variation morphologique du composant gélosé induite par les microorganismes. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel :
- la gélose comporte un agent chromogène, apte à induire un changement de couleur de la gélose sous l'effet du développement des microorganismes ;
- l'étape e) comporte une mesure d'une variation d'une longueur d'onde de la lumière détectée. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel :
- au cours de plusieurs étapes c), le milieu ambiant comporte un milieu d'analyse (2) , susceptible de comporter des microorganismes ;
- le procédé comporte, suite à l'étape e), une détermination d'une présence de microorganismes dans le milieu d'analyse. 16
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel :
- lors l'étape a), le composant gélosé est formé à partir d'une gélose comportant potentiellement des microorganismes ;
- le procédé comporte, suite à l'étape e), une détermination d'une présence de microorganismes dans la gélose.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la première extrémité et la deuxième extrémité sont deux extrémités opposées du composant gélosé, le composant gélosé formant un guide d'onde entre la première extrémité et la deuxième extrémité.
6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel :
- le composant gélosé s'étend selon une direction d'extension (D) entre la première extrémité et la deuxième extrémité ;
- la distance entre la première extrémité et la deuxième extrémité, selon la direction d'extension, forme une longueur du composant gélosé ;
- perpendiculairement à la direction d'extension, le composant gélosé s'étend selon un diamètre ou une plus grande diagonale inférieure au dixième de la longueur.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, dans lequel :
- le milieu ambiant comporte de l'eau (15) ;
- tout ou partie d'une périphérie du composant gélosé est mise en contact avec de l'eau.
8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel :
- le composant gélosé est disposé sur une gélose auxiliaire (17);
- une couche d'eau est interposée entre la gélose auxiliaire (17) et le composant gélosé.
9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel la gélose auxiliaire comporte des nutriments, de sorte que des nutriments peuvent migrer vers le composant gélosé, à travers la couche d'eau.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, dans lequel
- le guide d'onde comporte plusieurs deuxièmes extrémités (12i, 122);
- le guide d'onde comporte plusieurs branches (13i, 182), chaque branche s'étendant à entre un même tronçon (13) du composant gélosé (10), et chaque deuxième extrémité respective ; 17
- le tronçon (13) s'étend entre la première extrémité (11) et chaque branche ;
- au cours de plusieurs étapes c) :
• une première branche (13i)est mise en contact avec un premier milieu (2i) ;
• une deuxième branche (132), différente de la première branche, est mise en contact avec un deuxième milieu (22);
- le procédé comporte, suite à l'étape e), une détermination d'une présence de microorganismes dans le milieu le premier milieu et/ou dans le deuxième milieu.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel :
- le composant gélosé s'étend entre un plan de base (P) et au moins une face opposée (F) ;
- la première extrémité et la deuxième extrémité sont disposées sur le plan de base ;
- le composant gélosé est configuré pour réfléchir une lumière incidente, émise par la source de lumière, et atteignant le plan de base selon un axe d'incidence, en formant, après propagation de la lumière incidente à travers le composant gélosé, une lumière réfléchie, la lumière réfléchie émanant du plan de base selon un axe de réflexion.
12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel :
- lors de plusieurs étapes c), tout ou partie de la face opposée est mise en contact avec un milieu d'analyse (2), susceptible de comporter des microorganismes ;
- le procédé comporte, suite à l'étape e), une détermination d'une présence de microorganismes dans le milieu d'analyse.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12, dans lequel la face opposée est une face hémisphérique.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12, dans lequel la face opposée comporte trois faces (Fi, F2, F3), chaque face s'étendant à partir d'un même sommet (S), les trois faces formant un trièdre trirectangle, l'axe de réflexion étant parallèle à l'axe d'incidence.
15. Dispositif, pour déterminer une présence de microorganismes dans un composant gélosé, le dispositif comportant :
- un composant gélosé, le composant gélosé s'étendant entre une première extrémité (11) et une deuxième extrémité (12), le composant gélosé étant au moins en partie transparent à une longueur d'onde d'illumination ; 18
- le composant gélosé étant configuré pour confiner une lumière, à la longueur d'onde d'illumination, entre la première extrémité (11) et la deuxième extrémité (12) ;
- une source de lumière (21), configurée pour illuminer la première extrémité ;
- un photodétecteur (22), configuré pour détecter une lumière émanant de la deuxième extrémité (12) après s'être propagée entre la première extrémité et la deuxième extrémité ;
- une unité de traitement (30), programmée pour mettre en œuvre l'étape e) d'un procédé selon l'une quelconque des revendication précédentes, de façon à déterminer une présence d'un microorganisme dans le composant gélosé.
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2792725A1 (fr) * 1999-04-23 2000-10-27 Junior Instruments Procede et dispositif pour la detection de variations de proprietes optiques d'un echantillon liquide dans un processus d'analyse
US20170238854A1 (en) * 2016-02-22 2017-08-24 Thomas L. Henshaw Wearable sweat sensor for health event detection
JP2018100949A (ja) * 2016-12-21 2018-06-28 エイブル株式会社 濁度測定装置
US20200327306A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Method for early observation of colonies of microorganisms

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2792725A1 (fr) * 1999-04-23 2000-10-27 Junior Instruments Procede et dispositif pour la detection de variations de proprietes optiques d'un echantillon liquide dans un processus d'analyse
US20170238854A1 (en) * 2016-02-22 2017-08-24 Thomas L. Henshaw Wearable sweat sensor for health event detection
JP2018100949A (ja) * 2016-12-21 2018-06-28 エイブル株式会社 濁度測定装置
US20200327306A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Method for early observation of colonies of microorganisms

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AADHAR JAIN ET AL: "Gel-based optical waveguides with live cell encapsulation and integrated microfluidics", OPTICS LETTERS, OPTICAL SOCIETY OF AMERICA, US, vol. 37, no. 9, May 2012 (2012-05-01), pages 1472 - 1474, XP001575327, ISSN: 0146-9592, [retrieved on 20120424], DOI: 10.1364/OL.37.001472 *
BAGAL ET AL: "Fabrication of sucrose biosensor based on single mode planar optical waveguide using co-immobilized plant invertase and GOD", BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, ELSEVIER SCIENCE LTD, UK, AMSTERDAM , NL, vol. 22, no. 12, 16 May 2007 (2007-05-16), pages 3072 - 3079, XP022080445, ISSN: 0956-5663, DOI: 10.1016/J.BIOS.2007.01.008 *
FUJIWARA ERIC ET AL: "Abstract", vol. 10, no. 1, 27 April 2020 (2020-04-27), pages 7035, XP055836410, Retrieved from the Internet <URL:https://www.nature.com/articles/s41598-020-64103-3.pdf> DOI: 10.1038/s41598-020-64103-3 *
JOHN P HULME ET AL: "Simple leaky-waveguide devices for the detection of bacterial spores", SENSORS AND ACTUATORS B: CHEMICAL, ELSEVIER BV, NL, vol. 160, no. 1, 23 September 2011 (2011-09-23), pages 1508 - 1513, XP028111071, ISSN: 0925-4005, [retrieved on 20111001], DOI: 10.1016/J.SNB.2011.09.076 *

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