FR2831182A1

FR2831182A1 - Bio-reacteur pour le controle et/ou la culture en milieu liquide d'organismes vivants

Info

Publication number: FR2831182A1
Application number: FR0113518A
Authority: FR
Inventors: Gerald Thouand; Pascal Picart; Philippe Daniel; Laurent Jouvanneau
Original assignee: Universite de Nantes
Current assignee: Universite de Nantes
Priority date: 2001-10-19
Filing date: 2001-10-19
Publication date: 2003-04-25
Anticipated expiration: 2021-10-19
Also published as: FR2831182B1

Abstract

L'invention concerne un bio-réacteur (1) pour le contrôle et/ ou la culture en milieu liquide (23) d'organismes (22) vivants, émettant des radiations lumineuses dans certaines conditions. Ce bio-réacteur est caractérisé en ce que ses parois sont opaques à la lumière et en ce qu'il est équipé d'une part d'au moins une source (4) de radiation lumineuse disposée à l'extérieur de l'enceinte de réaction du réacteur (1) de manière à émettre une radiation lumineuse traversant le milieu de culture, d'autre part de moyens (5) de détection in situ, sans échantillonnage, de la radiation lumineuse émise par les organismes vivants pour déterminer l'intensité du signal émis et de la radiation lumineuse résultante de la radiation lumineuse émise par la source (4) de radiation et traversant le milieu de culture pour déterminer, en temps réel, la concentration en organismes vivants du milieu et de moyens de traitement (12) des deux informations détectées.

Description

Bio-réacteur pour le contrôle et/ou la culture en milieu liquide d'organismes vivants La présente invention concerne un bio-réacteur pour le contrôle et/ou la culture en milieu liquide d'organismes vivants, en particulier de micro-organismes, émettant des radiations lumineuses dans certaines conditions.

Elle concerne plus particulièrement un bio-réacteur du type constitué, de façon en soi connue, d'une cuve obturable contenant le milieu de culture et de moyens de mesure et de correction ou de maintien du milieu de culture et de l'atmosphère de l'enceinte du réacteur dans des conditions aptes à assurer une culture sur une durée prolongée desdits organismes.

Les organismes vivants, en particulier les microorganismes, émettant des radiations lumineuses dans certaines conditions, tels que les bactéries ou virus luminescents, les bactéries fluorescentes, les microorganismes génétiquement modifiés par introduction d'un

gène, virus ou autre sont aujourd'hui largement utilisés dans de nombreux domaines d'application tels que la santé, l'environnement ou l'agroalimentaire, notamment pour détecter la présence ou l'absence et/ou la quantification de substances minérales ou organiques ou d'organismes vivants dans des milieux liquides.

Ainsi, dans le domaine de l'environnement, de tels organismes vivants émetteurs de lumière peuvent être utilisés pour la détection ou la quantification de substances organiques ou minérales dans les eaux de sortie de station d'épuration ou de station de traitement des eaux, dans les eaux de piscine, dans les eaux de ports ou autres. Ces mêmes micro-organismes peuvent être utilisés dans le domaine de l'agroalimentaire pour la détection ou la quantification des bactéries pathogènes, de bactéries starter de process industriel, de résidus de lavage de surface de process présents dans les eaux de lavage. Enfin, dans le domaine de la santé, ces mêmes organismes sont utilisés pour la détection et/ou la quantification de bactéries de l'air en remplaçant l'air filtré par de l'air ambiant non filtré et barbotant dans le liquide du réacteur dans lequel se trouve un virus luminescent. Toutefois, de tels organismes sont sensibles à différents paramètres tels que pH, oxygénation, composition du milieu de culture, etc.

En conséquence, la mesure de signaux lumineux de tels organismes ne peut être fiable que lorsque de tels paramètres sont contrôlables. Par ailleurs, l'intensité des signaux lumineux émis est directement fonction du nombre d'organismes vivants dans les milieux de culture. Or, les dispositifs de mesure de la concentration en organismes vivants nécessitent fréquemment un prélèvement en continu d'une fraction du milieu de culture, ce qui aboutit à une mesure non représentative du milieu. D'autres solutions consistent à immerger des dispositifs de mesure amenant à

l'apparition de biofilms qui à nouveau faussent la mesure.

Un but de la présente invention est de proposer un bioréacteur dont la conception permet une interprétation fiable de signaux lumineux émis par des organismes vivants.

A cet effet, l'invention a pour objet un bio-réacteur pour le contrôle et/ou la culture en milieu liquide d'organismes vivants, en particulier de micro-organismes, émettant des radiations lumineuses dans certaines conditions, le bioréacteur étant constitué, de façon en soi connue, d'une cuve obturable délimitant une enceinte de réaction contenant un milieu de culture et de moyens de mesure et de correction ou de maintien du milieu de culture et de l'atmosphère de l'enceinte du réacteur dans des conditions aptes à assurer une culture sur une durée prolongée desdits organismes, caractérisé en ce que le bio-réacteur, dont les parois sont opaques à la lumière, est équipé d'une part d'au moins une source de radiation lumineuse disposée à l'extérieur de l'enceinte de réaction du réacteur de manière à émettre une radiation lumineuse traversant le milieu de culture, d'autre part de moyens de détection in situ, sans échantillonnage, de la radiation lumineuse émise par les organismes vivants pour déterminer l'intensité du signal émis et de la radiation lumineuse résultante de la radiation lumineuse émise par la source de radiation et traversant le milieu de culture pour déterminer, en temps réel, la concentration en organismes vivants du milieu et de moyens de traitement des deux informations détectées pour obtenir notamment le rapport intensité du signal lumineux émis par les organismes vivants/concentration en organismes vivants, ladite concentration étant déterminée à partir de l'application d'une Loi de décroissance exponentielle telle que la loi de Beer-Lambert.

L'invention sera bien comprise à la lecture de la description suivante d'exemples de réalisation, en référence aux dessins annexés dans lesquels : la figure 1 représente une vue schématique partielle d'un réacteur conforme à l'invention et les figures 2 à 7 représentent des vues schématiques du bio-réacteur couplé à différentes configurations de systèmes d'introduction, de collecte et de détection des signaux optiques, les figures 2 à 4 étant en outre associées à un chronogramme.

Le bio-réacteur 1, objet de l'invention, est, de manière en soi connue, constitué d'une cuve 2 obturable reposant sur un agitateur magnétique 24. Cette cuve 2 est constituée d'un corps 2A cylindrique généralement en acier et d'une enveloppe 2B intérieure amovible généralement en verre.

L'enveloppe 2B affecte la forme d'un cylindre à fond plat ou hémisphérique. La cuve 2 est fermée au moyen d'un couvercle 3. Le couvercle 3 et l'enveloppe 2B constituent l'enceinte de réaction destinée à contenir le milieu de culture 23 où sont disposés des organismes vivants 22, en particulier des micro-organismes, ces organismes 22 vivants émettant des radiations lumineuses dans certaines conditions. Le milieu de culture 23 peut être maintenu sous agitation par l'intermédiaire d'un barreau 28 aimanté annulaire muni de pales. Ce bio-réacteur comporte encore des moyens de mesure 10, 11 et de correction ou de maintien 8a, 8b, 9a, 9b du milieu de culture et de l'atmosphère de l'enceinte du réacteur 1. Ainsi, à titre d'exemple, les moyens de mesure du réacteur sont constitués d'une sonde 10 d'oxygène et de température et d'une sonde 11 de pH, les signaux de ces sondes étant adressables à des moyens 12 de traitement, qui seront décrits ci-après, en vue d'en

permettre leur contrôle. Les moyens de maintien ou de correction du milieu de culture et/ou de l'atmosphère de l'enceinte du réacteur sont quant à eux constitués d'une pluralité d'orifices 8a, 8b, 9a, 9b d'accès à l'enceinte du réacteur, ces orifices d'accès étant ménagés dans les parois, en particulier la paroi de dessus formant couvercle 3 de l'enceinte. Ces orifices 8a, 8b, 9a, 9b obturables autorisent un transfert de fluide ou de matière entre l'intérieur et l'extérieur de l'enceinte du réacteur.

Ainsi, les orifices 8a et 8b peuvent constituer respectivement une entrée et une sortie d'air tandis que les orifices d'accès 9a et 9b peuvent constituer respectivement une entrée et une sortie de substrat pour la culture continue. Le corps 2A du réacteur peut, sur au moins une partie de sa longueur, comporter une double enveloppe 20 pour ménager une enceinte périphérique thermostatée. A cet effet, la double enveloppe comporte une entrée 25 de liquide thermostaté et une sortie 26 de liquide thermostaté.

De manière caractéristique à l'invention, le réacteur 1, dont les parois sont opaques à la lumière, est équipé d'au moins une source 4 de radiation lumineuse disposée à l'extérieur de l'enceinte de réaction du réacteur 1 et couplée au corps du bio-réacteur pour émettre une radiation lumineuse traversant le milieu de culture. Ce réacteur 1 est encore équipé de moyens 5 de détection in situ sans échantillonnage d'une part de la radiation lumineuse émise par les organismes vivants pour déterminer l'intensité du signal émis et d'autre part de la radiation lumineuse résultante de la radiation lumineuse émise par la source 4 de radiation et traversant le milieu de culture pour déterminer, en temps réel, la concentration en organismes vivants du milieu. Dans les exemples représentés, la source 4 de radiation lumineuse est constituée d'une diode

électroluminescente ou d'une diode laser raccordée à une paroi de la cuve par l'intermédiaire d'au moins une fibre ou un faisceau 17 de fibres optiques. Tout autre système produisant des radiations lumineuses aurait pu être utilisé. La zone de raccordement de la source 4 de radiation lumineuse aux parois du réacteur peut être délimitée au moyen d'un collecteur 14 de radiation lumineuse qui sera décrit ci-après. Cette source 4 de radiation lumineuse est choisie pour émettre à une longueur d'onde située hors du spectre d'émission de la source de radiation lumineuse constituée par les organismes vivants 22. Cette longueur d'onde est généralement choisie voisine de 655 nm.

Dans le cas où la zone de raccordement de la source 4 de radiations lumineuses au réacteur se situe dans le couvercle 3 du réacteur, le fond du réacteur est muni d'un miroir 19 concave autorisant une détection réflectométrique des signaux comme cela sera décrit ci-après.

Dans le cas où la radiation lumineuse émise par la source 4 de radiation lumineuse ne débouche pas dans le collecteur 14 de radiation lumineuse, cette radiation lumineuse peut être amenée au moyen d'une fibre ou d'un faisceau 17 de fibres optiques, jusqu'au fond de la cuve du réacteur.

Cette variante de réalisation est plus particulièrement représentée aux figures 4 et 6. Dans ce cas, le faisceau 17 de fibre optique comporte sur son trajet des lentilles et un miroir 27 plan orienté à 450 pour obtenir un faisceau de lumière collimaté en direction du collecteur 14 de radiation lumineuse de manière à obtenir une détection transmétrique comme cela sera décrit ci-après.

Entre la source 4 de radiation lumineuse, constituée par une LED ou toute autre source de radiation lumineuse et

l'entrée 17 de la fibre optique, il est prévu également une lentille 21 et un filtre interférentiel 6A. Comme l'illustrent les figures, cette source 4 de radiation lumineuse est destinée à émettre un rayon lumineux traversant le milieu de culture généralement suivant un axe vertical. Des moyens 5 de détection sont prévus pour détecter la radiation lumineuse résultante de la radiation lumineuse émise par la source 4 de radiation et traversant le milieu de culture. Cette détection permet, à partir de l'application d'une Loi de décroissance exponentielle telle que la Loi de Beer-Lambert, de déterminer la concentration en organismes vivants du milieu. Bien évidemment, il convient, au moyen d'un tel réacteur, au départ, de déterminer un signal de référence qui est obtenu par mesure de l'intensité lumineuse lorsque le milieu est exempt d'organismes vivants 22. En effet, la loi de Beer-Lambert indique que l'intensité du faisceau sonde, I, mesurée par

les moyens de détection 5, est liée à l'intensité du signal sonde de référence, Io, par la relation suivante : I = ToeOù a = EC est l'atténuation linéique du milieu, exprimée en mm, s est le coefficient spécifique d'absorbance massique exprimée en g' mm-ll, C est la concentration exprimée en gel-l et z (exprimée en mm) est l'épaisseur totale de milieu que la lumière a traversé. L'atténuation linéique est obtenue par la mesure de l'intensité transmise dans le milieu, par aller simple (montage en transmission) ou par aller retour (montage en réflexion).

Si Zb est la hauteur de liquide dans le bio réacteur, on obtient :

1 T 1 1 - en transmission a =--InZb To

l r T - en réflexion a =--In- 2 Zb Io

La mesure de la DO est relative à l'épaisseur de milieu traversé par la relation

Il est à noter que dans tout ce qui précède et dans tout ce qui suit, on entend par concentration, la valeur du paramètre de la concentration ou la valeur de tout paramètre proportionnel à la concentration tel que la densité optique.

Ces moyens de détection peuvent affecter un grand nombre de formes comme l'illustrent les figures.

Par ailleurs, ces moyens 5 de détection permettent encore de détecter la radiation lumineuse émise par les organismes vivants 22 présents dans le milieu de culture pour déterminer l'intensité du signal émis par lesdits organismes. On note que l'ensemble des moyens 5 de détection permet une détection in situ sans échantillonnage, c'est-à-dire sans prélèvement. Il n'est donc absolument pas nécessaire de prélever une quantité déterminée du milieu de culture pour réaliser la détection qui s'effectue directement à partir du contenu de l'enceinte de réaction. Il en résulte une mesure fiable et non perturbée des radiations lumineuses. Par ailleurs, une telle détection peut s'effectuer en l'absence de tout opérateur. Les moyens 5 de détection seront de préférence positionnés à l'extérieur de l'enceinte du réacteur. Ainsi, au moins l'une des parois du bio-réacteur 1 comporte au moins un collecteur 14 des radiations lumineuses constitué

d'au moins une fenêtre optique 15 ou lentille 16 s'étendant au-dessus du niveau maximal de remplissage de la cuve 2 et à travers laquelle les radiations lumineuses sont amenées, directement ou par l'intermédiaire d'au moins une fibre ou d'un faisceau 17,17A, 17B de fibres optiques, aux moyens 5 de détection. Dans les exemples représentés, le collecteur 14 des radiations lumineuses affecte la forme d'un élément tubulaire 14A dont une extrémité 14B débouche dans l'enceinte du réacteur pour s'étendre au-dessus du niveau maximal de remplissage de la cuve 2. Cette extrémité 14B est munie d'une fenêtre optique 15 ou lentille 16. L'extrémité opposée du collecteur 14 est quant à elle couplée, directement ou par l'intermédiaire d'au moins une fibre ou d'un faisceau 17,17A, 17B de fibres optiques, aux moyens de détection et éventuellement à la source 4 de radiation lumineuse.

Dans les exemples représentés, la cuve 2 du réacteur 1 délimite une enceinte fermée par un couvercle 3, le collecteur 14 de radiations lumineuses étant ménagé dans le couvercle 3 du réacteur 1. La disposition de ce collecteur 14 de radiations lumineuses et la conception de sa fenêtre optique 15 ou de sa lentille 16, qui s'étendent au-dessus du niveau maximal de remplissage de la cuve 2, permettent d'éviter les inconvénients liés à la formation d'un biofilm à la surface de la fenêtre optique 15 ou de la lentille 16, comme cela est souvent observé dans le cas où les capteurs doivent être immergés dans le milieu de culture. Ainsi, dans les modes de réalisation représentés, l'absence de contact entre le collecteur 14 de radiation lumineuse et le milieu de culture 23 permet d'éviter toute interférence sur les moyens de détection 5.

Comme l'illustrent les figures 2 à 7, les moyens 5 de détection peuvent affecter un grand nombre de formes.

Ainsi, selon une forme de réalisation de l'invention, ces moyens 5 de détection de la radiation lumineuse, émise par les organismes vivants, et de la radiation lumineuse résultante de la radiation lumineuse, émise par la source 4 de radiation lumineuse et traversant le milieu de culture, sont communs. Un tel mode de réalisation peut se décliner de différentes manières qui sont particulièrement représentées aux figures 2 à 5. Dans le cas de la figure 5, les moyens 5 de détection peuvent être des moyens de détection synchrone desdites radiations lumineuses et sont constitués d'un détecteur linéaire ou matriciel 6 type CCD équipé de moyens de filtrage tels qu'un filtre interférentiel 6A et/ou un filtre passe-bande 6B. Un faisceau de fibres optiques est découplé pour comprendre une fibre optique 17B comportant sur son trajet, en direction du détecteur CCD, un filtre passe-bande 6B de largeur de bande incluant celle de la source de radiation lumineuse constituée par les organismes vivants 22. Cette largeur de bande peut inclure des valeurs de bande proches de 620 nm. Les signaux émis à travers cette fibre optique 17B permettront de mesurer l'intensité du signal lumineux émis par les organismes vivants. Une autre fibre optique 17A, issue du collecteur 14 de radiation, comporte sur son trajet, en direction du capteur 6 CCD, un filtre interférentiel 6A correspondant à la longueur d'onde de la source de radiation lumineuse 4, cette longueur d'onde pouvant être voisine de 655 nm. Les radiations lumineuses reçues par le capteur à partir de cette fibre optique correspondront quant à elles à la radiation lumineuse résultante de la radiation lumineuse émise par la source de radiation 4 et traversant le milieu de culture pour déterminer, en temps réel, la concentration en organismes vivants du milieu. On note que, dans cet exemple de réalisation de la figure 5, la source 4 de radiation

lumineuse et les moyens 5 de détection sont disposés à l'intérieur d'un boîtier et sont couplés respectivement par l'intermédiaire de fibres optiques 17,17A, 17B au collecteur de radiations lumineuses, lui-même communiquant avec l'enceinte du réacteur. Ce collecteur est dans ce cas équipé d'une fenêtre optique.

Dans les figures 2 à 4, les moyens 5 de détection sont constitués d'un photomultiplicateur 7 coopérant avec la source 4 d'émission de radiation lumineuse. Dans ce cas, la source 4 d'émission de radiation lumineuse fonctionne de manière discontinue pour détecter, de manière asynchrone, la radiation lumineuse résultante de la radiation lumineuse émise par la source 4 de radiation lumineuse et traversant le milieu et la radiation lumineuse émise par les organismes vivants. Ainsi, le chronogramme représenté illustre le fonctionnement d'une telle LED qui comporte un temps d'allumage représenté en TON et un temps d'extinction représenté en TOFF. Durant la période d'allumage TON de la source 4 de radiation lumineuse, il est mesuré sur le photomultiplicateur 7 la résultante de la radiation lumineuse émise par la source 4 de radiation lumineuse et traversant le milieu de culture. Cette dernière mesure est correcte si la source 22 de radiations lumineuses est d'une contribution nettement inférieure à la résultante de la source 4 au niveau de détecteur 7. A l'inverse, durant la période d'extinction TOFF de la LED, il est détecté par le photomultiplicateur 7 la radiation lumineuse émise par les organismes luminescents 22. Du fait que la période totale T du signal de pilotage de la LED correspondant à la somme du temps d'allumage de la LED et du temps d'extinction de la LED est extrêmement courte, il en résulte une détection qui, bien qu'asynchrone, peut s'apparenter à un système synchrone. On note que les figures 2 à 4 se distinguent uniquement par la conception du collecteur 14 de radiation

lumineuse et par le positionnement de l'entrée de la radiation lumineuse émise par la source 4 de radiation lumineuse dans la cuve du réacteur.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention représenté aux figures 6 et 7, les moyens 5 de détection de la radiation lumineuse émise par les organismes vivants et de la radiation lumineuse résultante de la radiation lumineuse émise par la source 4 de radiation et traversant le milieu de culture sont différenciés. Dans ces exemples correspondant aux figures 6 et 7, les moyens de détection de la radiation lumineuse émise par les organismes vivants sont constitués d'un photomultiplicateur 7 équipé d'un filtre passe-bande 6B et les moyens de détection de la radiation lumineuse résultante de la radiation lumineuse émise par la source 4 de radiation et traversant le milieu de culture sont constitués d'un photo-détecteur 18. A nouveau, les radiations lumineuses sont amenées respectivement au photo-détecteur et au photomultiplicateur par l'intermédiaire d'un faisceau de fibres optiques représenté en 17A et 17B. Sur le trajet entre fibres optiques et photomultiplicateur 7, il est prévu un filtre passe-bande. Sur le trajet entre fibre optique 17A et photodétecteur 18, il est prévu une lentille. Le filtre passe-bande permet d'éviter tout endommagement du photomultiplicateur en supprimant notamment toute radiation lumineuse résultante de la radiation lumineuse émise par la source 4 de radiation lumineuse.

Bien évidemment, à ces moyens de détection 5 sont associés des moyens de traitement. Ces moyens de traitement peuvent être constitués d'un micro-contrôleur interne aux moyens 5 de détection. Les moyens 12 de traitement peuvent être encore constitués d'un micro-ordinateur interfacé avec les moyens 5 de détection par l'intermédiaire par exemple d'une

liaison parallèle 13.

On note que, en ce qui concerne les moyens de détection, on peut parler de moyens de détection réflectométrique ou de moyens de détection transmétrique. En effet, dans le cas où la cuve 2 du réacteur 1 est munie, sur la face formant fond du réacteur, d'un miroir 19 concave (figure 1) ou plan (figure 7) de réflexion des signaux de la radiation lumineuse émise par la source 4 de radiation lumineuse, la radiation effectue un aller et retour à l'intérieur du milieu de culture lorsque la source de radiation lumineuse débouche dans l'enceinte du réacteur à travers le collecteur 14 de radiation lumineuse aménagé dans le couvercle du réacteur. Dans le cas des moyens de détection réflectométrique et plus particulièrement illustrés dans les figures 2 et 3, deux géométries sont possibles. Ainsi, dans la figure 2, le collecteur 14 de faisceau est constitué, à son extrémité saillante à l'intérieur du réacteur, simplement d'une fenêtre optique 15. A l'inverse, dans la figure 3, il est équipé à sa sortie d'une lentille 16 de focalisation. Dans le cas où il n'y a pas de lentille de focalisation (figure 2), la hauteur du collecteur 14 dans le bio-réacteur est déterminée de sorte que l'extrémité du collecteur soit placée au point conjugué objet du centre de courbure du miroir sphérique 19 à travers le système optique constitué par le milieu de culture 23 et l'enveloppe 2B en verre. Dans le cas où il y a une lentille de focalisation (figure 3), la lentille 16 et le collecteur 14 sont placés de sorte que le point de focalisation du faisceau lumineux corresponde au point conjugué objet du centre de courbure du miroir sphérique 19 à travers le système optique constitué par le milieu de culture 23 et l'enveloppe 2B en verre du réacteur. Le principe de détection est alors le suivant : à un volume donné de milieu de culture, le signal de référence est

obtenu par mesure de l'intensité lumineuse sur le détecteur après aller retour dans le bio-réacteur lorsque le milieu 23 est exempt d'organismes vivants 22. Dans ce cas, la détection peut être effectuée de trois façons différentes : - avec un photomultiplicateur, - avec un capteur type CCD ou - avec un photomultiplicateur couplé à un photodétecteur.

Dans le cas du système réflectométrique, il est nécessaire d'apporter une correction à la mesure de la concentration pour compenser l'influence de la lumière émise par la source 4 et réfléchie à l'interface air/milieu de culture 23. Cette correction peut être effectuée à l'aide d'une table après étalonnage du capteur.

Comme cela a d'ores et déjà été expliqué ci-dessus, dans le cas où les trajets des radiations optiques sont découplés, comme l'illustre la figure 5, un faisceau de fibres optiques sert au transport du signal émis par les organismes vivants et un autre pour celui issu de la source 4 de radiation lumineuse après traversée du milieu de culture. La suppression de la contribution parasite de la source 4 de radiation lumineuse sur le détecteur 6 est assurée par un jeu de filtres interférentiels et passebande qui élimine l'intensité lumineuse à la longueur d'onde de la source 4 de radiation lumineuse préjudiciable aux moyens de détection 5. La mesure de la quantité de lumière émise par la source 4 de radiation et ayant traversé le milieu de culture, en aller retour (figure 2) ou en aller simple (figure 3), et détectée par 5 est effectuée à l'aide d'une détection synchrone par modulation électrique de la source de radiation 4 pendant le temps ToN d'allumage de la source 4 de radiation lumineuse. Dans le cas où les moyens de détection 5 des radiations lumineuses issues des sources de radiations lumineuses 4 et 22 sont

communs, la mesure de chaque contribution est effectuée séquentiellement par modulation tout ou rien de période T de la source 4 de radiation lumineuse.

Comme cela a été expliqué ci-dessus, il est toutefois nécessaire, dans ce cas, que le signal de la source 4 d'émission de radiation lumineuse soit toujours très supérieur au signal émis par les organismes vivants pour que ce dernier n'affecte pas la mesure de la concentration cellulaire. Dans le cas des figures 4 et 6, les moyens de détection peuvent être dits de type transmétrique. En effet, il est prévu, dans le fond du bio-réacteur, un conduit par lequel se propage le faisceau lumineux sonde issu de la source 4 de radiation lumineuse. Le faisceau lumineux, issu de la source 4 de radiation lumineuse, est conditionné dans ce conduit pour produire un faisceau collimaté qui traverse le milieu de culture. Le faisceau de mesure et de transport du signal vers le détecteur, constitué par le collecteur 14 de radiation lumineuse, est situé dans l'axe du faisceau de la source 4 de radiation lumineuse. Le principe est le suivant : à un volume donné, le signal sonde de référence est obtenu par mesure de l'intensité lumineuse sur le détecteur après transmission dans le bio-réacteur lorsque le milieu est le milieu de culture exempt d'organismes vivants. Le signal sonde de mesure est obtenu par le même principe avec cette fois le milieu de culture contenant les organismes vivants. Ces deux valeurs donnent accès à l'atténuation linéique du milieu et donc aussi à l'absorbance (DO). Cet autre positionnement du conduit, par lequel circule le faisceau lumineux issu de la source 4 de radiation lumineuse, peut être appliqué indépendamment des moyens 5 de détection.

Un tel bio-réacteur permet donc, en l'absence de tout opérateur, d'obtenir, en temps réel et en continu, le

rapport intensité du signal lumineux émis par les organismes vivants présents dans le milieu de culture/concentration en organismes vivants du milieu de culture. Il en résulte des valeurs de mesure parfaitement fiables et dont l'interprétation est facilitée.

Claims

REVENDICATIONS 1. Bio-réacteur (1) pour le contrôle et/ou la culture en milieu liquide (23) d'organismes (22) vivants, en particulier de micro-organismes, émettant des radiations lumineuses dans certaines conditions, le bio-réacteur (1) étant constitué, de façon en soi connue, d'une cuve obturable délimitant une enceinte de réaction (23) contenant un milieu de culture et de moyens de mesure (10, 11) et de correction ou de maintien (8a, 8b, 9a, 9b) du milieu de culture et de l'atmosphère de l'enceinte du réacteur (1) dans des conditions aptes à assurer une culture sur une durée prolongée desdits organismes, caractérisé en ce que le bio-réacteur (1), dont les parois sont opaques à la lumière, est équipé d'une part d'au moins une source (4) de radiation lumineuse disposée à l'extérieur de l'enceinte de réaction du réacteur (1) de manière à émettre une radiation lumineuse traversant le milieu de culture, d'autre part de moyens (5) de détection in situ, sans échantillonnage, de la radiation lumineuse émise par les organismes vivants pour déterminer l'intensité du signal émis et de la radiation lumineuse résultante de la radiation lumineuse émise par la source (4) de radiation et traversant le milieu de culture pour déterminer, en temps réel, la concentration en organismes vivants du milieu et de moyens de traitement (12) des deux informations détectées pour obtenir notamment le rapport intensité du signal lumineux émis par les organismes vivants/concentration en organismes vivants, ladite concentration étant déterminée à partir de l'application d'une Loi de décroissance exponentielle telle que la Loi de Beer-Lambert.
2. Bio-réacteur (1) selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'au moins l'une des parois du bio-

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réacteur (1) comporte au moins un collecteur (14) des radiations lumineuses constitué d'au moins une fenêtre optique (15) ou lentille (16) s'étendant au-dessus du niveau maximal de remplissage de la cuve (2) et à travers laquelle les radiations lumineuses sont amenées directement ou par l'intermédiaire d'au moins une fibre ou d'un faisceau (17A, 17B) de fibres optiques, aux moyens (5) de détection.
3. Bio-réacteur (1) selon la revendication 2, caractérisé en ce que le collecteur (14) des radiations lumineuses affecte la forme d'un élément tubulaire (14A) dont une extrémité (14B) débouche dans l'enceinte du réacteur pour s'étendre au-dessus du niveau maximal de remplissage de la cuve (2), cette extrémité (14B) étant munie d'une fenêtre optique (15) ou lentille (16), l'extrémité opposée du collecteur (14) étant couplée, directement ou par l'intermédiaire d'au moins une fibre ou d'un faisceau (17,17A, 17B), de fibres optiques, aux moyens de détection et éventuellement à la source (4) de radiation lumineuse.
4. Bio-réacteur (1) selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que la cuve (2) du réacteur (1) délimite une enceinte fermée par un couvercle (3), le collecteur (14) de radiations lumineuses étant ménagé dans le couvercle (3) du réacteur (1).
5. Bio-réacteur (1) selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les moyens (5) de détection de la radiation lumineuse, émise par les organismes vivants (22), et de la radiation lumineuse résultante de la radiation lumineuse, émise par la source (4) de radiation lumineuse et traversant le milieu de culture, sont communs.

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6. Bio-réacteur (1) selon la revendication 5, caractérisé en ce que les moyens (5) de détection sont des moyens de détection synchrone desdites radiations lumineuses et sont constitués d'un détecteur linéaire ou matriciel (6) type CCD équipé de moyens de filtrage tels qu'un filtre interférentiel (6A) et/ou un filtre passebande (6B).
7. Bio-réacteur (1) selon la revendication 5, caractérisé en ce que les moyens (5) de détection sont constitués d'un photomultiplicateur (7) coopérant avec la source (4) d'émission de radiation lumineuse fonctionnant de manière discontinue pour détecter, de manière asynchrone, la radiation lumineuse résultante de la radiation lumineuse émise par la source (4) de radiation lumineuse et traversant le milieu et la radiation lumineuse émise par les organismes vivants (22).
8. Bio-réacteur (1) selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les moyens (5) de détection de la radiation lumineuse émise par les organismes vivants et de la radiation lumineuse résultante de la radiation lumineuse émise par la source (4) de radiation et traversant le milieu de culture sont différenciés.
9. Bio-réacteur (1) selon la revendication 8, caractérisé en ce que les moyens de détection de la radiation lumineuse émise par les organismes vivants (22) sont constitués d'un photomultiplicateur (7) équipé d'un filtre passe-bande (6B) et en ce que les moyens de détection de la radiation lumineuse résultante de la radiation lumineuse émise par la source (4) de radiation et traversant le milieu de culture sont constitués d'un photodétecteur (18).

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10. Bio-réacteur (1) selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la source (4) de radiation lumineuse est constituée d'une diode électroluminescente ou d'une diode laser raccordée à une paroi de la cuve par l'intermédiaire d'au moins une fibre ou un faisceau (17) de fibres optiques.
11. Bio-réacteur (1) selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la source (4) de radiation lumineuse émet à une longueur d'onde située hors du spectre d'émission de la source de radiation lumineuse constituée par les organismes vivants (22).
12. Bio-réacteur (1) selon l'une des revendications 1 à il, caractérisé en ce que la cuve (2) du réacteur (1) est munie d'un miroir (19) concave ou plan de réflexion des signaux de la radiation lumineuse émise par la source (4) de radiation lumineuse.
13. Bio-réacteur (1) selon la revendication 12, caractérisé en ce que le miroir (19) concave est disposé dans la face formant fond du réacteur.
14. Bio-réacteur (1) selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'il comporte une double enveloppe (20) pour ménager une enceinte périphérique thermostatée.
15. Bio-réacteur (1) selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que les moyens (12) de traitement sont constitués d'un micro-ordinateur interfacé avec les moyens (5) de détection.
16. Bio-réacteur (1) selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que les moyens de traitement sont constitués d'un micro-contrôleur interne aux moyens (5) de

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détection.
17. Bio-réacteur (1) selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que les moyens de mesure du réacteur sont constitués au moins de sondes (10, 11) d'oxygène, de pH ou de température dont les signaux sont adressables auxdits moyens (12) de traitement.
18. Bio-réacteur (1) selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que les moyens de maintien ou de correction du milieu de culture et/ou de l'atmosphère de l'enceinte du réacteur sont constitués d'une pluralité d'orifices (8a, 8b, 9a, 9b) d'accès à l'enceinte du réacteur, ces orifices d'accès étant ménagés dans les parois, en particulier la paroi de dessus formant couvercle (3) de l'enceinte, lesdits orifices (8a, 8b, 9a, 9b) obturables autorisant un transfert de fluide ou de matière entre l'intérieur et l'extérieur de l'enceinte du réacteur.